Khảo sát đột biến gen EGFR và K-RAS trên bệnh nhân Việt Nam bị ung thư phổi không tế bào nhỏ

1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Yếu tố dịch tễ học – lâm sàng của ung thư phổi
Ung thư phổi chiếm tỷ lệ cao nhất và cũng là nguyên nhân tử vong hàng đầu trong
tất cả các bệnh ung thư. Về mặt chẩn đoán, ung thư phổi nguyên phát được chia thành
nhóm ung thư phổi không tế bào nhỏ (NSCLC: non-small cell lung cancer) và ung thư
phổi tế bào nhỏ. Trên thế giới, trong số khoảng 12,7 triệu trường hợp ung thư mới được
chẩn đoán hằng năm, ung thư phổi chiếm 1,61 triệu trường hợp (12,7% ), với 1,38 triệu
trường hợp tử vong
(1)
. Tại Mỹ, ước tính có khoảng 215.000 trường hợp bệnh mới và
161.000 bệnh nhân ung thư phổi chết trong năm 2008
(2)
. Điều đáng chú ý là ngày nay
phần lớn các trường hợp ung thư phổi được phát hiện tại các nước đang phát triển, với sự
gia tăng từ 31% trong tổng số ung thư phổi được chẩn đoán trên thế giới vào năm 1980
lên 55% vào thời điểm hiện nay
(1)
. Riêng tại khu vực Đông Nam Á, ung thư phổi chiếm
hàng đầu của ung thư ở nam giới, với tỷ xuất bệnh mới là 29,6/100.000 dân, xếp trên cả
ung thư gan (21,4/100.000) và ung thư đại trực tràng (15,2/100.000). Ở khu vực này, ung
thư phổi của nữ giới xếp hàng thứ tư (11,9/100.000 dân) sau ung thư vú, ung thư cổ tử
cung và ung thư đại trực tràng. Tuy nhiên, ung thư phổi có tiên lượng rất xấu, là nguyên
nhân tử vong hàng đầu do ung thư ở cả hai giới ở Đông Nam Á (ở nam là 26,3/100.000
dân, ở nữ là 10,4/100.000).
1.1 Nguyên nhân gây ung thư phổi
Khói thuốc lá, chứa hơn 60 loại chất sinh ung như nitrosamine và benzopyrene,
được xác định là nguyên nhân trực tiếp và quan trọng nhất gây nên ung thư phổi. Hút
thuốc lá là nguyên nhân của 85 – 90% trong tổng số các trường hợp ung thư phổi trên
toàn thế giới

(3)
. Nguy cơ trọn đời bị ung thư phổi của người không hút thuốc lá được ước
tính khoảng 1,3 – 1,4 %; nguy cơ này sẽ gia tăng thành 17,2% ở người nam hút thuốc lá
và 11,6% ở người nữ hút thuốc lá
(4)
. Tiếp xúc lâu dài với nicotine gây nên sự ức chế hoạt
động của đáp ứng miễn dịch chống lại sự tăng sinh ác tính trong các mô phổi. Các chất
2

sinh ung có trong khói thuốc lá gây ra hàng chục ngàn kiểu đột biến trên DNA của tế bào,
trong số đó có ít nhất 134 kiểu đột biến nằm trên các exon mã hóa protein
(5)
.
Ngoài khói thuốc lá, tiếp xúc nghề nghiệp với các chất như asbestos, nickel,
chromium và arsenic cũng làm tăng nguy cơ bị ung thư phổi. Các nghiên cứu cho thấy
tiếp xúc với khí radon trong không khí là nguyên nhân gây ung thư phổi quan trọng thứ
hai sau khói thuốc lá
(6)
. Khí radon không mùi vị, được tạo ra từ sự phân rã phóng xạ
radium vốn xuất phát từ uranium có trong lớp vỏ trái đất. Các sản phẩm phân rã phóng xạ
gây nên sự ion hóa các vật chất di truyền, từ đó xuất hiện các đột biến gen và ung thư.
Gần đây có những bằng chứng gợi ý vai trò của virus trong việc gây ra ung thư
phổi
(7)
. Các virus như human papillomavirus, simian virus 40 hay cytomegalovirus hiện
diện trong mô ung thư phổi, được cho là đã gây nên sự rối loạn chu kỳ tế bào và ức chế
quá trình chết tế bào theo lập trình, mở đường cho hiện tượng ung thư phổi xuất hiện. Chi
tiết về các cơ chế phân tử mà virus khởi phát trong tế bào ký chủ để tạo nên các dạng ung
thư, trong đó có ung thư phổi, là một lĩnh vực đang thu hút được rất nhiều nghiên cứu y
sinh học trong thời gian qua. Tỷ lệ HPV dương tính trong mẫu ung thư phổi trung bình là

24,5%, dao động từ 15% ở Châu Âu và Bắc Mỹ cho đến 35,7% ở Châu Á
(8)
. Tất cả các
kiểu ung thư phổi đều bị ảnh hưởng bởi các type virus nguy cơ cao là 16, 18, 31 và 33.
Nguyên nhân di truyền của ung thư phổi mới chỉ được chú ý nghiên cứu trong thời
gian gần đây. Ở cả người hút thuốc và không hút thuốc lá, tính đa hình thái của các gen
có vai trò điều hòa chuyển hóa các chất sinh ung, kiểm soát quá trình sửa sai DNA và chu
kỳ tế bào có thể có ảnh hưởng quan trọng vào tính mẫn cảm với ung thư phổi. Ví dụ, các
nghiên cứu đã tìm ra ít nhất 3 gen trên nhánh dài của nhiễm sắc thể 15 có liên quan với
nguy cơ mắc ung thư phổi, đó là các gen CHRNA3, CHRNA5 và CHRNB4, mã hóa cho
các tiểu đơn vị cấu trúc của thụ thể nicotinic acetylcholine
(9, 10)
. Một phân tích gộp của 23
nghiên cứu bao gồm 15.857 đối tượng cho thấy alen Proline tại codon 72 của P53 là một
yếu tố nguy cơ ung thư phổi, đặc biệt trên người Châu Á, người da trắng và người hút
thuốc lá
(11)
.
3

Chế độ ăn uống có thể cũng ảnh hưởng tới ung thư phổi. Ở chuột, thức ăn có nhiều
gốc phosphate có thể hoạt hóa đường truyền tín hiệu AKT trong tế bào gây nên kích thích
quá mức sự tăng sinh tế bào, thúc đẩy tiến triển của ung thư phổi
(12)
. Trái lại, một phân
tích gộp của 22 nghiên cứu cho thấy trà xanh giúp giảm nguy cơ ung thư phổi
(13)
.
1.2 Chẩn đoán và phân giai đoạn ung thư phổi
Các triệu chứng lâm sàng của ung thư phổi không hoàn toàn đặc hiệu, có thể cũng

gặp trong các bệnh lý lành tính của phổi. Cần lưu ý rằng khoảng 10% trường hợp ung thư
phổi không hề có triệu chứng nào khi được chẩn đoán, chỉ được phát hiện tình cờ trên
phim phổi khi khám sức khỏe tổng quát. Khối u có thể phát triển bên trong khí đạo, gây
khó thở do tắc nghẽn. Sự tắc nghẽn cũng làm ứ đọng các chất tiết, tạo điều kiện cho viêm
phổi xuất hiện. Các khối u thường có hệ thống mạch máu cung cấp rất phong phú nhưng
lại dễ vỡ, gây nên triệu chứng ho ra máu. Các triệu chứng và dấu hiệu lâm sàng khác bao
gồm đau ngực, mệt mỏi, chán ăn, ngón tay dùi trống, tràn dịch màng phổi,…
Với các triệu chứng gợi ý của ung thư phổi, trước tiên bệnh nhân nên được chụp
X-quang phổi nhằm phát hiện các khối mờ hay hình ảnh dãn rộng trung thất (gợi ý sự
xâm lấn hạch), xẹp phổi, đông đặc phổi do viêm hoặc hình ảnh tràn dịch màng phổi.
Chẩn đoán xác định ung thư phổi chỉ được kết luận bằng kết quả khảo sát giải phẫu bệnh.
Để có được bệnh phẩm phù hợp, sinh thiết qua nội soi phế quản hoặc qua hướng dẫn của
chụp cắt lớp điện toán thường được sử dụng.
Dựa theo kết quả giải phẫu bệnh, ung thư phổi được chia thành 2 nhóm lớn với
tiên lượng và điều trị khác nhau. Ung thư phổi tế bào nhỏ chiếm 20%, hầu hết các trường
hợp đã có di căn xa vào thời điểm chẩn đoán và có tiên lượng rất xấu. Loại này thường
xuất phát từ các khí đạo lớn và có diễn tiến rất nhanh. Ung thư phổi không tế bào nhỏ
chiếm 80%, bao gồm carcinôm tế bào vẩy, carcinôm tuyến và carcinôm tế bào lớn.
Carcinôm tế bào vẩy thường xuất phát gần phế quản trung tâm, có hoại tử giữa khối u,
4

loại biệt hóa cao thường có tiến triển chậm hơn so với các dạng khác. Trái lại, carcinôm
tuyến thường xuất phát ở vùng ngoại vi của mô phổi.
PET-CT có thể được sử dụng cho phân giai đoạn ung thư phổi trong giai đoạn
sớm, nhằm hạn chế các trường hợp phẫu thuật không cần thiết. Trong một nghiên cứu
ngẫu nhiên so sánh PET-CT (98 bệnh nhân) với phương pháp phân giai đoạn truyền
thống dựa vào CT scan bụng và xương (91 bệnh nhân), có 38 bệnh nhân trong nhóm
PET-CT và 18 bệnh nhân trong nhóm còn lại không còn phẫu thuật được. Tổng cộng có
60 bệnh nhân trong nhóm PET-CT và 73 bệnh nhân trong nhóm còn lại được phẫu thuật
mở lồng ngực, trong đó có 21 trường hợp trong nhóm PET-CT và có tới 38 trường hợp

trong nhóm còn lại đã chịu phẫu thuật mở lồng ngực một cách vô ích (P = 0,05)
(14)
. PET-
CT cũng hơn hẳn xạ hình xương trong chẩn đoán di căn xương trên bệnh nhân NSCLC.
Ung thư phổi nguyên phát thường cho di căn sớm. Trên 75% trường hợp ung thư
phổi mới được chẩn đoán đã có di căn xa hoặc di căn vùng khiến cho tiên lượng rất
xấu
(15)
. Chính vì vậy,vấn đề chẩn đoán sớm ung thư phổi là một mục tiêu quan trọng mà
các nghiên cứu hiện nay đang hướng tới, bằng cách tập trung vào việc phát hiện các thay
đổi phân tử đặc hiệu cho ung thư phổi tại những vị trí có thể dễ dàng khảo sát như đường
thở hay trong máu của bệnh nhân. Trong một nghiên cứu so sánh các thay đổi nhiễm sắc
thể bằng kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang giữa nhóm bệnh nhân carcinôm tại chỗ và
nhóm loạn sản nặng do thuốc lá, hiện tượng lệch bội ở các nhiễm sắc thể 5p15.2, 7p12 và
8q24 xuất hiện trong 64% các trường hợp ung thư nhưng chỉ gặp ở 31% trong nhóm
chứng
(16)
. Trong một nghiên cứu khác, mất tính dị hợp tử của nhiễm sắc thể 3q liên quan
có ý nghĩa với sự phát triển ung thư phổi
(17)
. Các nghiên cứu này cho thấy khả năng xét
nghiệm phân tử có thể cho phép chẩn đoán sớm các trường hợp ung thư phổi ở những
người thuộc nhóm nguy cơ cao, như nhóm bệnh nhân bị bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính và
những người nghiện hút thuốc lá nặng.

5

1.3 Các yếu tố tiên lượng
Tiên lượng rất xấu của ung thư phổi là do chẩn đoán thường chỉ thực hiện được
trong giai đoạn trễ. Ở giai đoạn này, can thiệp phẫu thuật không còn khả thi hoặc hiệu

quả rất hạn chế do tế bào ung thư đã xâm lấn hay di căn xa, bệnh nhân chỉ còn trông chờ
vào các phác đồ hóa trị liệu dựa trên platinum, với nhiều tác dụng phụ đi kèm. Tỷ lệ sống
thêm 5 năm của bệnh nhân ung thư phổi chỉ khoảng 15%. Mặc dù cách phân giai đoạn
kinh điển dựa theo lâm sàng – giải phẫu bệnh (hệ thống phân giai đoạn TNM) có ý nghĩa
quan trọng cho tiên lượng và hướng dẫn điều trị, tuy nhiên trong ung thư phổi có rất
nhiều trường hợp bệnh tiến triển rất nhanh dù được chẩn đoán ở giai đoạn sớm. Các yếu
tố tiên lượng khác ở mức độ phân tử ngày càng được quan tâm nghiên cứu để tiên lượng
cho bệnh nhân một cách chính xác hơn.
Di căn hạch khiến cho tiên lượng của ung thư phổi không tế bào nhỏ xấu hơn.
Chẩn đoán sớm tình trạng di căn hạch cần có những kỹ thuật phân tử nhạy và chuyên biệt
cao. Trong những trường hợp di căn hạch ở giai đoạn rất sớm, khi mà lượng tế bào di căn
còn rất ít thì chẩn đoán giải phẫu bệnh có thể chưa phát hiện được. Với những loại vi di
căn hạch (0,2-2 mm), kỹ thuật giải phẫu bệnh thường quy khó phát hiện. Khi đó, chẩn
đoán tình trạng vi di căn hạch có thể được thực hiện nhờ các kỹ thuật sinh học phân tử. Ở
bệnh nhân NSCLC giai đoạn I, chẩn đoán tình trạng vi di căn hạch có thể được thực hiện
bằng khảo sát PCR định lượng cho RNA thông tin của gen CEACAM5 và PLUNC
(18)
.
Thời gian sống thêm của bệnh nhân có biểu hiện của RNA thông tin trong tế bào hạch
xấu hơn so với bệnh nhân không có biểu hiện 2 gen này. Tiềm năng di căn hạch và khả
năng tăng sinh mạnh mẽ của NSCLC cũng có liên quan tới biểu hiện của survivin trong
nhân tế bào
(19)
. Những bệnh nhân có survivin trong nhân âm tính và chỉ số Ki-67 thấp thì
tiên lượng sống thêm tốt nhất, đặc biệt nếu không thuộc loại carcinôm tế bào vẩy.
Tình trạng khuếch đại gen MET, được đánh giá bằng FISH, là một yếu tố tiên
lượng độc lập trong NSCLC
(20)
. Trong số 431 trường hợp NSCLC được phẫu thuật, thời
gian sống thêm trung vị cho nhóm có khuếch đại gen MET (gồm 48 bệnh nhân, 11%) chỉ

6

là 25,8 tháng so với 47,5 tháng của nhóm không có khuếch đại gen MET (gồm 383 bệnh
nhân, 89%).
Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF: vascular endothelial growth factor)
đóng vai trò quan trọng trong sự tân tạo mạch và di căn của tế bào ung thư
(21)
. Trong cả
NSCLC và SCLC, biểu hiện quá mức của VEGF là yếu tố tiên lượng xấu, làm giảm thời
gian sống thêm của bệnh nhân được chẩn đoán sớm trong giai đoạn I. Sử dụng VEGF để
tiên lượng ung thư phổi trong giai đoạn sớm có thể giúp chọn bệnh nhân phù hợp cho hóa
trị tấn công hoặc hóa trị bổ trợ sau phẫu thuật
(22)
.
2. Các cơ chế bệnh sinh phân tử của ung thư phổi không tế bào nhỏ
Đột biến EGFR trong NSCLC được báo cáo lần đầu tiên năm 2004 trên những bệnh
nhân có đáp ứng với gefitinib
(23, 24)
. Gen EGFR nằm trên nhiễm sắc thể số 7, mã hóa cho
protein cùng tên. Protein EGFR là một thụ thể ở màng tế bào, có hoạt tính tyrosine
kinase khi được gắn và hoạt hóa bởi yếu tố tăng trưởng biểu bì (epidermal growth factor:
EGF). Trong tế bào bình thường, sự hoạt hóa EGFR cần thiết cho nhiều chức năng quan
trọng của tế bào như quá trình tăng sinh và biệt hóa tế bào. Tuy nhiên, sự hoạt hóa quá
mức do đột biến của gen có thể dẫn đến tăng sinh bất thường cũng như sự chuyển dạng tế
bào. Quan trọng hơn nữa, những rối loạn hoạt động của EGFR do đột biến có thể dẫn đến
bệnh lý ác tính. Đột biến xảy ra tại các exon 18 – 21, khiến cho protein EGFR luôn trong
trạng thái hoạt hóa không phụ thuộc chất truyền tín hiệu là EGF. Do các đột biến rất đa
dạng, kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA được coi là tốt nhất để khảo sát các đột biến
EGFR. Thường gặp nhất là đột biến mất đoạn (deletion) xảy ra trên exon 19, kế đến là
đột biến điểm L858R tại exon 21. Các đột biến thêm đoạn (duplication) trên exon 20 hay

đột biến điểm trên exon 18 ít gặp hơn. Đặc biệt, đột biến hầu như chỉ gặp trên loại
carcinôm tuyến, rất hiếm khi tìm thấy ở carcinôm gai – tuyến
(25, 26)
. Hơn nữa, tỷ lệ bệnh
nhân có mang đột biến EGFR rất khác nhau giữa các chủng tộc: Tỷ lệ này chỉ xấp xỉ 3%
ở người Mỹ, nhưng lên đến khoảng 32% ở người Nhật
(24)
, 36,4% ở Hàn Quốc
(27)
, 55% ở
Đài Loan
(28)
và 57,4% ở Thái Lan
(29)
. Đột biến cũng thường tìm thấy hơn trên bệnh nhân
7

nữ so với bệnh nhân nam, trên bệnh nhân không có tiền căn hút thuốc lá so với người
từng hút thuốc lá. Tỷ lệ đột biến cao tìm thấy trên người châu Á phù hợp với quan sát
trong những thử nghiệm lâm sàng trước đây, trong đó bệnh nhân châu Á có đáp ứng cao
hơn hẳn với điều trị đặc hiệu so với bệnh nhân Âu - Mỹ.
Phương pháp thường được sử dụng nhất để phát hiện đột biến gen EGFR là giải trình
tự chuỗi DNA
(30, 31)
. Đoạn gen quan tâm được khuếch đại bằng PCR nhờ những đoạn mồi
đặc hiệu, sau đó trình tự DNA được phát hiện bằng máy giải trình tự tự động. Kỹ thuật
này đòi hỏi phải có khoảng 30% DNA mang đột biến trong mẫu thử thì mới có thể phát
hiện được
(25)
. Cần lưu ý là các tiêu bản mô bệnh học thường chứa các thành phần tế bào

không đồng nhất gây khó khăn trong phân tích kết quả. Ngoài ra, một số bệnh nhân có u
phổi đa ổ. Chính vì thế, việc lựa chọn vùng tế bào ung thư phù hợp cho phân tích kết quả
đột biến gen là vai trò quan trọng của các chuyên gia giải phẫu bệnh. Nhờ đó quần thể tế
bào có mang đột biến được làm giàu thêm, giúp tăng cơ hội phát hiện được đột biến gen
bằng giải trình tự DNA. Mô cố định trong formalin và được vùi nến thường được chọn
cho khảo sát đột biến, nhưng cần lưu ý bảo quản bệnh phẩm đúng quy cách để có kết quả
chính xác. Các bệnh phẩm cố định trong ethanol hoặc khử canxi, cũng như những bệnh
phẩm có chứa quá nhiều mô hoại tử thì không nên dùng để phân tích đột biến gen.
Các phương pháp khác bao gồm PCR phân tích tính đa hình chuỗi đơn (PCR-single-
strand conformational polymorphism analysis), phân tích sản phẩm PCR dựa trên tính
nóng chảy (high resolution-melting amplicon analysis), Scorpions amplified refractory
mutation system,… So với giải trình tự chuỗi DNA, các phương pháp này có lợi điểm
nhanh hơn và đảm bảo độ nhạy cũng như độ đặc hiệu khá cao. Tuy nhiên, các phương
pháp này có thể bỏ sót các đột biến mới và cần đến giải trình tự chuỗi DNA để khẳng
định lại các đột biến
(25, 32, 33)
.
Erlotinib (biệt dược Tarceva của Roche) và gefitinib (biệt dược Iressa của
Astrazeneca) là thuốc ức chế hoạt tính tyrosin kinase của EGFR. Trên bệnh nhân châu Á,
Iressa tỏ ra rất hiệu quả, đặc biệt nếu bệnh nhân có mang đột biến của EGFR. Một nghiên
8

cứu trên bệnh nhân Nhật Bản công bố năm 2008 cho thấy tỷ lệ sống thêm 1 năm là
79%
(34)
. Tháng 5/2008, nhóm tác giả của Mỹ công bố kết quả rất khả quan về hiệu quả
của gefitinib khi được chỉ định ưu tiên cho bệnh nhân có mang đột biến của EGFR, với tỷ
lệ sống thêm 1 năm là 73% và thời gian sống thêm trung vị là 17,5 tháng
(35)
. Ngay cả

những trường hợp đã có di căn não, erlotinib và gefitinib cũng tỏ ra có hiệu quả trên bệnh
nhân có mang đột biến EGFR
(36)
. Cả erlotinib và gefitinib đều có khả năng gắn lên vùng
tyrosine kinase của phân tử EGFR để cạnh tranh với ATP, vì vậy ngăn cản được sự
phosphoryl hóa của phân tử đích. Các kết quả nghiên cứu nhằm tìm ra những chỉ điểm
sinh học cho đáp ứng với thuốc ức chế đặc hiệu EGFR cho thấy tình trạng đột biến gen
EGFR chính là yếu tố tiên đoán chính xác nhất, trong khi đó hóa mô miễn dịch để đánh
giá biểu hiện protein lại không cho thông tin có ý nghĩa nào cho tiên đoán đáp ứng điều
trị
(37, 38)
. Những đột biến nhạy với thuốc thường gặp nhất là mất đoạn của exon 19, đột
biến điểm của exon 21 (L858R, L861Q và L861R), đột biến điểm của exon 18
(G719A/C/S) và đột biến điểm của exon 20 (V765A, T783A và S768I). Tuy nhiên, đột
biến chèn đoạn của exon 20 (D770_N771insNPG, D770_N771insSVQ và
D770_N771insG) và đột biến điểm của exon 20 (V769L và N771T) lại gây ra kháng
thuốc
(39, 40)
.
Mặt khác, trong những con đường truyền tín hiệu nội bào của thụ thể EGFR, có sự
tham gia của trục RAS/RAF/MAPK
(41)
. Trong đó KRAS là một gen rất quan trọng của
quá trình này. KRAS là một thành viên của gia đình gen RAS, mã hóa cho một guanosine
triphosphate GTPase vốn có hai trạng thái: trạng thái bất hoạt có gắn GDP và trạng thái
hoạt động có gắn với GTP. Là một chất truyền tin hạ nguồn của EGFR, KRAS có vai trò
quan trọng trong việc khởi phát và tiến triển của một số ung thư như carcinôm tuyến của
đại tràng, phổi và tụy. Khi đột biến xảy ra sẽ làm mất hoạt tính ATPase và giữ phân tử
protein KRAS ở trạng thái gắn ATP liên tục, dẫn đến hậu quả là các phân tử truyền tin hạ
nguồn luôn hoạt động để duy trì tín hiệu tăng sinh tế bào

(42)
.
9

Nếu KRAS ở trạng thái bình thường (wild-type KRAS), hoạt động của nó phụ thuộc
vào hoạt tính của thụ thể EGFR. Trái lại, khi có đột biến của KRAS, nó sẽ tự hoạt hóa
không phụ thuộc EGFR. KRAS đột biến đóng vai trò quan trọng cả trong hình thành ung
thư cũng như sự đề kháng với điều trị. Bệnh nhân NSCLC mang đột biến codon 12 của
gen KRAS có tiên lượng xấu hơn, với thời gian sống toàn bộ và thời gian sống không
bệnh ngắn hơn
(43)
. Nhiều nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng trong NSCLC cũng như trong
ung thư đại trực tràng đã chứng minh rằng điều trị bằng thuốc ức chế hoạt tính tyrosin
kinase của EGFR chỉ có hiệu quả trong những trường hợp không kèm theo đột biến tại
KRAS
(44, 45)
.
Gen tổ hợp EML4-ALK được hình thành từ sự đảo đoạn của nhánh ngắn nhiễm sắc thể
số 2. Trong nhóm bệnh nhân NSCLC không có mang đột biến EGFR và KRAS, 33 –
44,8% bệnh nhân có mang gen tổ hợp này
(46, 47)
. Ngày 26/8/2011, Cơ quan quản lý thuốc
– thực phẩm của Mỹ (U.S. FDA) đã phê chuẩn crizotinib trong điều trị bệnh nhân
NSCLC có mang gen tổ hợp EML4-ALK, mở ra thêm cơ hội điều trị cho bệnh nhân.
3. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Tại Việt Nam, ung thư phổi nguyên phát có xuất độ cao, đặc biệt ở nam giới, với tỷ lệ
24,6 bệnh nhân/ 100.000 dân tại khu vực Thành Phố Hồ Chí Minh và – 38,8 bệnh nhân/
100.000 dân tại khu vực Hà Nội
(48)
. Trong giai đoạn 2 năm từ 2005 -2006, trong 93.719

trường hợp tử vong do ung thư có 22.209 do ung thư phổi
(49)
. Đã có nhiều nghiên cứu về
dịch tễ học, lâm sàng và giải phẫu bệnh của ung thư phổi, nhưng thiếu các nghiên cứu đi
sâu tìm hiểu cơ chế phân tử của căn bệnh phổ biến này.
Điều trị nhắm trúng đích phân tử cho một số bệnh ung thư đã bắt đầu được chỉ định
tại Việt Nam. Trong ung thư vú, kháng thể đơn dòng Herceptin được chỉ định khi bệnh
nhân có tăng biểu hiện gen HER2/neu qua khảo sát bằng kỹ thuật lai tại chỗ gắn huỳnh
quang (FISH) hoặc tăng biểu hiện protein HER2/neu qua đánh giá bằng hóa mô miễn
dịch. Trong u mô đệm đường tiêu hóa, thuốc ức chế đặc hiệu phân tử c-kit là imatinib
10

mesylate (Gleevec) cũng đã được chỉ định tại Bệnh viện Ung Bướu TP.HCM nhưng chưa
dựa trên phân tích đột biến gen c-kit.
Đã có những báo cáo về đáp ứng lâm sàng của bệnh nhân NSCLC được điều trị bằng
erlotinib tại Việt Nam
(50, 51)
. Tuy nhiên các chỉ định này đều dựa theo các chỉ số lâm sàng,
vẫn thiếu các bằng chứng về sinh học phân tử là tình trạng đột biến của gen EGFR và
KRAS.
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm mục tiêu xác định tần suất đột biến gen
EGFR và KRAS ở bệnh nhân Việt Nam bị NSCLC, qua đó giúp dự đoán đáp ứng lâm
sàng với thuốc ức chế hoạt tính tyrosin kinase của EGFR.
Ung thư phổi thường được chẩn đoán trễ, với tiên lượng xấu, thời gian sống thêm chỉ
tính bằng tháng với những mô thức trị liệu kinh điển. Nhu cầu của bệnh nhân về một mô
thức điều trị nhắm trúng đích phân tử trong thời gian tới sẽ đi kèm với yêu cầu chẩn đoán
được những dấu ấn sinh học giúp lựa chọn bệnh nhân hiệu quả. Nghiên cứu xác định đột
biến gen EGFR và KRAS trong ung thư phổi sẽ giúp ích thiết thực cho việc ứng dụng
điều trị nhắm trúng đích phân tử trên bệnh nhân Việt Nam.
11

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Đối tượng
Bệnh nhân được chẩn đoán ung thư phổi và có bệnh phẩm lưu trữ tại Bộ môn Giải
Phẫu Bệnh - Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh trong giai đoạn từ 11/2009 đến 11/2012.
2.1.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu
Tất cả các mẫu bệnh phẩm đều được chẩn đoán xác định bằng nhuộm
Hematoxylin – Eosin (HE) thường quy, thuộc 1 trong các thể giải phẫu bệnh sau:
carcinôm tuyến, carcinôm tế bào gai, carcinôm gai – tuyến và carcinôm tế bào lớn.
2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ: Ung thư phổi tế bào nhỏ hoặc ung thư phổi không tế bào
nhỏ nhưng bệnh phẩm sinh thiết có tỷ lệ tế bào ung thư dưới 30% trong tổng số tế bào
quan sát được trên tiêu bản giải phẫu bệnh.
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả loạt ca.
2.2.2 Các bước thực hiện
Quy trình chung (Phụ lục 1): Tách chiết genomic DNA (từ mô vùi nến)  PCR 
Tinh sạch sản phẩm PCR  Cycle sequencing  Kết tủa ethanol  Đọc trình tự DNA
tự động  Phân tích kết quả
Tách chiết genomic DNA: Bệnh phẩm là mô vùi nến đã dùng để chẩn đoán giải
phẫu bệnh. Trường hợp là bệnh phẩm phẫu thuật, vùng mô ung thư được đánh dấu trên
tiêu bản giải phẫu bệnh để phân biệt với vùng mô lành xung quanh (từ 5 – 10 tiêu bản),
rồi được cạo vào tube ly tâm 1,5 mL bằng các lưỡi dao phẫu thuật riêng biệt. Những
trường hợp bệnh phẩm sinh thiết quá nhỏ không thể đánh dấu phân biệt vùng ung thư và
12

mô lành nên được thu toàn bộ vào tube ly tâm (đã được bác sĩ giải phẫu bệnh nhận định
có ít nhất 30% số tế bào ung thư). Xylene (Merck, Đức) được thêm vào tube ly tâm 2 lần
để khử nến, sau đó được rửa lại bằng ethanol tuyệt đối và để khô trước khi ủ với
proteinase K (Invitrogen, Mỹ) trong dung dịch đệm ở 48

0
C trong 14 – 16 giờ. Tinh sạch
sản phẩm DNA sau khi ủ proteinase K được thực hiện bằng phenol – chloroform
(Invitrogen, Mỹ). Cuối cùng, kết tủa DNA bằng ethanol tuyệt đối trong muối NH
4
OAC.
DNA được pha loãng trong 25 – 50 µL nước cất và định nồng độ DNA bằng
spectrophotometer.
Khuếch đại các exon bằng PCR: Các đoạn mồi (Bảng 2.1) được thiết kế bằng
phần mềm Oligo 4.1 dựa trên trình tự chuẩn của EGFR mang accession number
NG_007726 trong GenBank và của KRAS mang accession number NG_007524. Trong
mỗi tube PCR có tổng thể tích 50 µL, các thành phần gồm có PCR buffer, dNTP (250
µM cho mỗi loại), 2 loại mồi xuôi và ngược (0,5 µM cho mỗi loại), 1,25 unit TaKaRa
Taq
TM
HotStart Polymerase (Takara, Nhật Bản) và 20 ng genomic DNA. Chu kỳ luân
nhiệt được thực hiện trên máy GeneAmp
®
PCR system 9700 (Applied Biosystems, Mỹ)
bao gồm giai đoạn biến tính ban đầu ở 98
0
C trong 2 phút, theo sau bằng 40 chu kỳ gồm
biến tính ở 98
0
C trong 10 giây, gắn mồi ở 60
0
C trong 15 giây, tổng hợp chuỗi DNA ở
72
0
C trong 1 phút và kết thúc bằng giai đoạn kéo dài sản phẩm ở 72

0
C trong 5 phút. Sản
phẩm PCR được phát hiện bằng điện di trên thạch agarose 1,5% có nhuộm ethidium
bromide và quan sát dưới màn soi gel Pringraph (Atto, Nhật Bản). Sản phẩm PCR được
tinh sạch bằng QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen, Mỹ) và được kiểm tra lại bằng điện
di trên thạch agarose 1,5%. Trong mỗi đợt thực nghiệm luôn có một tube chứng âm,
trong đó genomic DNA được thay bằng nước cất đã dùng để pha master mix.
ASO-PCR (allele specific oligonucleotide PCR): Khuếch đại alen mang đột biến
DelE746_A750 của exon 19 và L858R của exon 21 được thực hiện bằng ASO-PCR với
các cặp mồi đặc hiệu dựa theo Dahse và cộng sự
(52)
. Cặp mồi dùng để phát hiện đột biến
DelE746_A750 bao gồm mồi xuôi 19P (5-GTAACATCCACCCAGATCACTG-3’) bổ
13

sung với chuỗi DNA bình thường của intron 18 và mồi ngược 19B (5’-
GTTGGCTTTCGGAGATGTTTTGATAG-3’) trên exon 19 có phần 3’ và 5’ ngăn cách
nhau bởi 15 bp đã bị mất đi trong đột biến này. Cặp mồi để phát hiện đột biến L858R
gồm mồi xuôi 21P (5’-AGGGTCTTCTCTGTTTCAGGGCAT-3’) bổ sung với chuỗi
DNA bình thường của vùng tiếp giáp intron 20 – exon 21 và mồi ngược 21B (5’-
CGCACCCAGCAGTTTGGTTC-3’) đã được thay đổi 3 nucleotide ở đầu 3’ để cho phép
chỉ khuếch đại alen đột biến. Chu kỳ luân nhiệt cho cả hai phản ứng bao gồm giai đoạn
biến tính ban đầu ở 98
0
C trong 2 phút, theo sau bằng 40 chu kỳ gồm biến tính ở 98
0
C
trong 10 giây, gắn mồi ở 58
0
C trong 30 giây, tổng hợp chuỗi DNA ở 72

0
C trong 40 giây
và kết thúc bằng giai đoạn kéo dài sản phẩm ở 72
0
C trong 5 phút. Sản phẩm PCR được
phát hiện bằng điện di trên thạch agarose 1,5% có nhuộm ethidium bromide.
Bảng 2.1: Các đoạn mồi dùng trong nghiên cứu
Tên mồi
Trình tự (5’ 3’)
Exon được
khuếch đại
Sản phẩm
PCR (bp)
EGFR.18F
CATGGTGAGGGCTGAGGTGA
18 (EGFR)
252
EGFR.18R
CTTGCAAGGACTCTGGGCT
EGFR.19F
GCATGTGGCACCATCTCACA
19 (EGFR)
217
EGFR.19R
GAGAAAAGGTGGGCCTGAGG
EGFR.20F
ACCTGGAAGGGGTCCATGTG
20 (EGFR)
341
EGFR.20R

TGCTATCCCAGGAGCGCAGA
EGFR.21F
TCACAGCAGGGTCTTCTCTGTTT
21 (EGFR)
212
EGFR.21R
ATGCTGGCTGACCTAAAGCC
KRAS.E2F
AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATA
2 (KRAS)
178
KRAS.E2R
CTGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC


Thực hiện giải trình tự chuỗi DNA: Sản phẩm PCR đã được tinh sạch sẽ được
thực hiện phản ứng cycle sequencing với BigDye Terminator Version 3.1 từ Applied
Biosystems (Mỹ), theo 2 chiều xuôi và ngược cho mỗi exon. Sản phẩm sau đó được kết
tủa bằng ethanol, hòa tan trong Hi-Di formamide, biến tính ở 95
0
C trong 2 phút trước khi
làm lạnh đột ngột. Trình tự DNA được đọc bằng máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với
POP-7 polymer và capillary 50 cm (Applied Biosystems, Mỹ). Kết quả được phân tích
14

bằng phần mềm SeqScape, so sánh với trình tự tham chiếu của EGFR và KRAS để chẩn
đoán tình trạng đột biến của các exon. Quy trình chẩn đoán đột biến gen được thực hiện
tại Trung tâm Y Sinh học Phân tử, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh.
Xử lý số liệu: Số liệu được nhập và xử lý bằng phần mềm SPSS 16.0. Phép kiểm
chi bình phương được sử dụng để so sánh tỉ lệ của biến số nhị giá ở hai nhóm. Các giá trị

so sánh được coi là khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.



15

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Nội dung 1-3: Thiết lập quy trình chẩn đoán đột biến gen EGFR và KRAS
3.1.1 Tách chiết DNA từ mô vùi nến
Chúng tôi đã thiết lập quy trình sử dụng proteinase K để tách chiết genomic DNA
từ mô vùi nến. Đây là giai đoạn rất quan trọng trong toàn bộ quy trình chẩn đoán đột biến
gen. Trong thời gian từ tháng 11/2010 – 11/2012, có 135 mẫu bệnh phẩm đã được sử
dụng thành công cho việc tách chiết genomic DNA phù hợp để khuếch đại các exon cần
nghiên cứu, bệnh phẩm được lưu trữ lâu nhất là 21 tháng. Trong thực tế lâm sàng, thời
gian lưu trữ bệnh phẩm ung thư phổi cho đến khi có nhu cầu cần được chẩn đoán đột biến
gen để giúp quyết định điều trị thường chỉ vài tháng, đảm bảo cho tách chiết DNA bằng
proteinase K có tỷ lệ thành công cao trong hầu hết các trường hợp.
Kỹ thuật tách chiết DNA bằng proteinase K không đòi hỏi nhiều phương tiện tốn
kém nhưng có một số điểm cần tuân thủ để đảm bảo kết quả chẩn đoán đột biến gen được
chính xác:
+ Việc bảo quản và xử lý mô cần theo tiêu chuẩn nghiêm ngặt của chẩn đoán giải
phẫu bệnh. Bệnh phẩm được cố định trong formol 10% đệm trung tính. Sau đó các mẫu
mô được xử lý bằng máy tự động Citadel hay Microm và đúc khối nến. Cắt mỏng tiêu
bản bằng máy Microm HM325 với độ dày 3 – 5 µm. Việc sử dụng nến không đúng chất
lượng ảnh hưởng đến quá trình khử bằng xylene, gây khó khăn cho việc tách chiết DNA.
+ Việc thu hoạch được tế bào ung thư là khâu quyết định cho chẩn đoán chính xác
đột biến gen bằng giải trình tự chuỗi DNA. Tỷ lệ tế bào ung thư so với tế bào bình
thường càng cao thì sản phẩm PCR có mang alen đột biến sẽ càng rõ khi phân tích trên
hình ảnh giải trình tự. Các trường hợp là bệnh phẩm phẫu thuật phải được khoanh vùng
phân biệt mô u với mô lành trên tiêu bản nhuộm HE. Sau đó vùng có tế bào ung thư từ 5

– 10 tiêu bản sẽ được thu hoạch vào tube ly tâm để tiến hành tách DNA. Các bệnh phẩm
sinh thiết chỉ được chọn khi có ít nhất 30% tế bào ung thư trong tiêu bản. Như vậy, quá
16

trình chẩn đoán đột biến gen từ các bệnh phẩm vùi nến trong ung thư nên có sự phối hợp
giữa bác sĩ giải phẫu bệnh và người thực hiện phân tích đột biến gen.
+ Thời gian ủ proteinase K nên đủ dài: Sau khi các mô vùi nến đã được xử lý bằng
xylene thật kỹ, thời gian ủ với proteinase K nên dài hơn 14 giờ. Chúng tôi đã thất bại
trong việc tách DNA khi chỉ ủ trong 4 – 6 giờ ở 48
0
C.
3.1.2 Chuẩn hóa điều kiện PCR với các đoạn mồi đặc hiệu để khuếch đại các
exon 18 – 21 của gen EGFR và exon 2 của gen KRAS
Khuếch đại thành công các đoạn gen đặc hiệu cần khảo sát đột biến là khâu quan
trọng nhất trong toàn bộ quy trình chẩn đoán đột biến gen. Hình 3.1 minh họa kết quả
điện di trên thạch agarose 1,5% sau khi khuếch đại các exon của EGFR và KRAS.

Hình 3.1: Kết quả PCR. (A) Vị trí các cặp mồi dùng để khuếch đại các exon của
gen EGFR. (B) Kết quả điện di trên thạch agarose 1,5% các sản phẩm PCR.
17

Có nhiều loại polymerase có độ trung thực cao để dùng cho giải trình tự DNA, tuy
nhiên khi sử dụng các polymerase khác nhau thì có thể cần điều chỉnh lại điều kiện PCR
để có được sản phẩm đặc hiệu. Trong quá trình chuẩn hóa điều kiện phản ứng PCR,
chúng tôi chọn cố định các thông số về nồng độ các đoạn mồi (0,5 µM) và dNTP (250
µM) rồi tiến hành thử nghiệm tính hiệu quả và tính đặc hiệu của từng cặp mồi ở các nhiệt
độ bắt cặp khác nhau. Takara Taq
TM
HotStart polymerase, Code No. R007A (Takara,
Nhật Bản) đã được tối ưu hóa các thành phần đệm của phản ứng trong buffer kèm theo.

Với mỗi cặp mồi, nhiệt độ bắt cặp được thử nghiệm bắt đầu từ 55
0
C, tăng thêm 1
0
C nếu
có xuất hiện sản phẩm không đặc hiệu. Qua quá trình chuẩn hóa, chúng tôi đã xác định
được cả 5 cặp mồi đều cho sản phẩm đặc hiệu và hiệu quả khuếch đại tốt nhất (độ đậm
của sản phẩm khi điện di kiểm tra sản phẩm) trong khoảng 58 – 60
0
C.
3.1.3. Tiến hành chẩn đoán đột biến gen bằng giải trình tự chuỗi DNA của các
sản phẩm PCR
Các sản phẩm PCR sau khi đã được tinh sạch bằng QIAquick Gel Extraction kit đã
được kiểm tra lại bằng điện di trên thạch agarose 1,5%. Phản ứng cycle sequencing được
thực hiện theo 2 chiều xuôi và ngược cho mỗi exon. Hình 3.2 minh họa kết quả giải trình
tự DNA của exon 21 theo 2 chiều xuôi và ngược.
18


Hình 3.2: Hình ảnh trình tự chuỗi DNA của exon 21 theo hai chiều xuôi (A) và
ngược (B). Mũi tên chỉ vị trí đột biến L858R.
Trình tự chuỗi DNA của gen EGFR và KRAS được tìm kiếm trong GenBank với
accession number tương ứng là NG_007726 và NG_007524. Phần mềm SeqScape được
sử dụng để so sánh trình tự chuỗi DNA của bệnh nhân với trình tự chuẩn của các exon
tương ứng. Những trường hợp dòng mang đột biến chiếm ưu thế (major clone), sóng của
alen đột biến thường biểu hiện rõ ràng và dễ dàng được phần mềm nhận diện có sự khác
biệt so với chuỗi DNA chuẩn (Hình 3.3A). Tuy nhiên, với những trường hợp dòng mang
đột biến chiếm tỷ lệ nhỏ (minor clone), các sóng của alen đột biến thấp hơn nhiều so với
sóng của alen bình thường nên có thể không được phần mềm SeqScape phát hiện. Trong
tất cả các trường hợp, chúng tôi dùng SeqScape như bước sàng lọc ban đầu để tìm những

điểm thay đổi. Với những exon mà SeqScape chưa cho thấy có bất thường, chúng tôi phải
19

kiểm tra lại bằng mắt thường cho từng vị trí nucleotid để không bỏ sót các đột biến điểm
(Hình 3.3B)

Trong bước xây dựng quy trình kỹ thuật này, giai đoạn đầu tiên chúng tôi đã sử
dụng 4 mẫu bệnh phẩm từ 4 bệnh nhân có đáp ứng với erlotinib để kiểm tra khả năng
phát hiện được đột biến gen EGFR. Kết quả đã phát hiện 3 trường hợp có mang đột biến
trên các exon 18, 19 và 21 của gen EGFR
(53)
.
3.2. Nội dung4: Tổng hợp kết quả.
3.2.1. Đặc điểm lâm sàng – giải phẫu bệnh
Trong thời gian từ tháng 11/2010 – 11/2012, chúng tôi đã tiến hành phân tích đột
biến gen EGFR và KRAS cho 135 trường hợp, bao gồm 81 bệnh nhân nam và 54 nữ, tỷ lệ
nam/nữ là 1,5/1.
Tuổi trung bình của bệnh nhân là 60 tuổi (khoảng tuổi 20 - 85). Đa số bệnh nhân
được chẩn đoán carcinôm tuyến, với các giai đoạn xâm lấn và di căn. Các dạng mô bệnh
học khác bao gồm carcinôm tế bào gai, carcinôm tế bào lớn và carcinôm phế quản phế
nang. Tiền căn hút thuốc lá không được ghi nhận đầy đủ trong hồ sơ bệnh án.
3.2.2. Đột biến gen EGFR
20

Các nghiên cứu trước đây đều cho thấy đột biến EGFR trong ung thư phổi tập
trung tại 4 exon 18 – 21. Chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật giải trình tự DNA để khảo sát 4
exon này cho 135 bệnh nhân, phát hiện 55 trường hợp có đột biến EGFR (40,7%), trong
đó có 1 bệnh nhân mang 2 đột biến ở exon 18 (K714R) và 21 (V851A). Tỷ lệ này tương
đồng với số liệu trong các nghiên cứu của Nhật Bản và Hàn Quốc
(24, 27)

, nhưng có phần
thấp hơn số liệu từ Thái Lan và Đài Loan
(28, 29)
. Chúng tôi không thấy có mối liên quan
giữa đột biến EGFR với giới tính (P = 0,29) hay loại mô học của NSCLC (P = 0,52).
Trong 106 trường hợp carcinôm tuyến có 45 mang đột biến EGFR (42,5%); trong khi
các loại mô bệnh học khác cũng mang đột biến với tỷ lệ 34,5% (Bảng 3.1).
Bảng 3.1: Tương quan đột biến gen với đặc điểm lâm sàng – giải phẫu bệnh

EGFR
Bình thường
(n = 80)
Đột biến
(n = 55)
P
Giới tính:




Nam
51
30
0,29

Nữ
29
25
Loại mô học:

Carcinôm tuyến
61
45
0,52

Khác *
19
10
KRAS:




Bình thường
32
39
0,14

Đột biến
23
12
Các kết quả này gợi ý rằng trong thực hành lâm sàng, mọi trường hợp NSCLC có
kế hoạch điều trị bằng thuốc ức chế EGFR như gefitinib và erlotinib đều nên được chẩn
đoán đột biến EGFR, không xét tới các yếu tố lâm sàng – giải phẫu bệnh. Thậm chí có
những báo cáo phát hiện đột biến EGFR trong cả ung thư phổi tế bào nhỏ
(54)
. Việc xác

định đột biến EGFR có ý nghĩa quyết định trong chọn lựa điều trị. Trong nhóm 261 bệnh
nhân có đột biến EGFR, thời gian sống thêm không bệnh dài hơn có ý nghĩa khi điều trị
bằng gefitinib so với carboplatin/paclitaxel; trong khi nhóm 176 bệnh nhân không có đột
biến cho kết quả hoàn toàn ngược lại: bệnh nhân điều trị bằng carboplatin/paclitaxel có
thời gian sống thêm không bệnh dài hơn
(55)
. Hiệp hội Ung thư Châu Âu hướng dẫn nên
21

khảo sát đột biến gen EGFR để chọn lựa bệnh nhân NSCLC phù hợp với điều trị bước ưu
tiên bằng thuốc kháng EGFR
(56)
.

*Bao gồm carcinôm tế bào gai, carcinôm gai –tuyến và carcinôm tế bào lớn
Kết quả nghiên cứu cho thấy các đột biến rất đa dạng, phân bố cả vùng exon và
intron, bao gồm các đột biến điểm, mất đoạn và chèn đoạn (Hình 3.4 và Phụ lục 3). Để
phát hiện được tất cả các đột biến này, kỹ thuật giải trình tự DNA là phù hợp nhất. Một
số kỹ thuật khác dựa trên nguyên tắc ASO-PCR (allele specific oligonucleotide) hoặc
ARMS-PCR (amplification refractory mutation system) chỉ tập trung phát hiện những đột
biến đã biết trước, có thể sẽ bỏ sót những đột biến mới. Tuy nhiên, kỹ thuật giải trình tự
DNA đòi hỏi phải có ít nhất 30% số tế bào ung thư trong mẫu ly trích DNA thì mới có
thể phát hiện được đột biến
(25)
. Như vậy những trường hợp mẫu mô quá nhỏ không thể
đánh dấu phân biệt vùng mô lành và mô u sẽ có thể có kết quả âm tính giả. Trong thực
hành, với những mẫu sinh thiết nhỏ, cần xác định có ít nhất 30% tỷ lệ tế bào ung thư trên
tiêu bản giải phẫu bệnh mới có thể tiến hành xác định tình trạng đột biến bằng giải trình
tự chuỗi DNA. Kỹ thuật chẩn đoán đột biến gen bằng pyrosequencing cũng cho phép đọc
tất cả các kiểu đột biến trong vùng khảo sát và có độ nhạy cao hơn kỹ thuật giải trình tự

chuỗi DNA hiện đang ứng dụng trong nghiên cứu này. Tuy nhiên, hiện tại kỹ thuật
pyrosequencing vẫn chưa được ứng dụng rộng rãi tại Việt Nam. Gần đây, kỹ thuật
COLD-PCR (co-amplification at lower denaturation temperature) có thể cho phép khuếch
đại ưu thế dòng alen mang đột biến, giúp cải thiện độ nhạy của kỹ thuật giải trình tự
chuỗi DNA
(57)
. Trong kỹ thuật này, sau khoảng 10 chu kỳ luân nhiệt đầu tiên với kỹ thuật
PCR chuẩn, người ta sử dụng nhiệt độ biến tính thấp trong khoảng 80 – 90
0
C đủ cho chỉ
các mạch đôi dị hợp tử có mang đột biến trong sản phẩm PCR duỗi ra để được ưu tiên
khuếch đại. Mỗi cặp mồi sẽ phải được chuẩn hóa một điều kiện nhiệt độ biến tính thích
hợp. Với những điều kiện tối ưu hóa, COLD-PCR có thể giúp cho giải trình tự DNA đạt
độ nhạy 1,5%, tương đương pyrosequencing mà không cần trang bị thêm hệ thống
mới
(58)
.
22

Trong những đột biến được phát hiện, đột biến tại exon 19 và exon 21 chiếm tỷ lệ
cao tương đương nhau. Mỗi exon có 22 đột biến, chiếm 39,3%. Exon 18 và 20 ít bị đột
biến hơn (7 trường hợp ở exon 18 và 3 trường hợp ở exon 20, tương ứng với 12,5 % và
5,4%). Chúng tôi cũng phát hiện 2 đột biến trong vùng cắt nối của intron 18 (IVS18-
3T>C và IVS18-1G>T). Đây là những đột biến có thể ảnh hưởng tới quá trình nối ghép
RNA của EGFR, nhưng chúng tôi không thể khẳng định được chính xác kiểu nối ghép sai
vì không có mẫu mô phù hợp cho khảo sát ở mức RNA.

Hình 3.4: Phân bố các đột biến trên gen EGFR. Các trường hợp đột biến điểm
được biểu thị bằng chấm tròn đen, đột biến mất đoạn bằng chấm tam giác đen và đột
biến chèn đoạn bằng hình vuông đen.

Chúng tôi đã phát hiện 2 kiểu đột biến thường gặp nhất là delE746_A750 của exon
19 và L858R của exon 21. Chỉ tính riêng hai kiểu đột biến này đã chiếm 57% trường hợp
có đột biến của gen EGFR. Theo nhiều nghiên cứu trước đây thì cả 2 đột biến này đều là
những đột biến nhạy với thuốc ức chế hoạt tính tyrosin kinase của EGFR và có thể được
23

phát hiện bằng kỹ thuật ASO-PCR dựa theo các đoạn mồi đã được mô tả bởi Dahse và
cộng sự
(52)
. Chúng tôi kiểm tra 15 trường hợp có đột biến delE746_A750 và 17 trường
hợp L858R bằng kỹ thuật ASO-PCR và thấy hoàn toàn phù hợp với kết quả giải trình tự
DNA. Hình 3.5 minh họa các kết quả có đột biến L858R với kích thước băng 142 bp bên
cạnh một băng chứng nội tại với kích thước 278 bp do khuếch đại một đoạn genomic
DNA của gen beta-actin, trong khi đó các mẫu đột biến delE746_A750 có băng đột biến
152 bp đi kèm băng chứng nội tại.
Đột biến chèn đoạn D770_N771insSVD của exon 20 chỉ gặp trên một bệnh nhân.
Đây được coi là đột biến kháng với thuốc ức chế hoạt tính tyrosin kinase của EGFR, vì
thế bệnh nhân cần được theo dõi tính đáp ứng với thuốc một cách chặt chẽ.
Trong số những đột biến được phát hiện, có 3 đột biến chưa được báo cáo trong cơ
sở dữ liệu COSMIC (Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer) là L692R và K714R
của exon 18 và D770Y của exon 20. Tuy nhiên các đột biến khác tại các codon 692, 714
và 770 đã được ghi nhận, như L692P, K714N và D770N.
Hơn phân nửa số bệnh nhân trong nghiên cứu này không có đột biến gen EGFR,
cơ chế phân tử vì vậy chưa được làm sáng tỏ. Các nghiên cứu gần đây cho thấy trong số
những bệnh nhân thực sự không có mang đột biến gen EGFR thì có 33 – 44,8% trường
hợp mang gen tổ hợp EML4-ALK, là đích điều trị của crizotinib
(59)
. Chúng tôi đang tiếp
tục khảo sát sự hiện diện của gen tổ hợp này trên những bệnh nhân không có đột biến gen
EGFR bằng kỹ thuật FISH.

24

3.2.3. Đột biến gen KRAS
Trong các nghiên cứu lâm sàng, đột biến codon 12 và 13 của KRAS đã được chứng
minh là yếu tố gây kháng nguyên phát với các thuốc ức chế EGFR
(44, 45)
. Hơn 95% trường
hợp đột biến KRAS xảy ra ở codon 12 và 13 của exon 2; các đột biến KRAS tại codon 61
và 146 rất hiếm gặp và ý nghĩa lâm sàng cũng chưa rõ ràng
(60, 61)
. Trong nghiên cứu này,
chúng tôi giải trình tự exon 2 của gen KRAS, là vùng có chứa codon 12 và 13. Trên 106
bệnh nhân đã được khảo sát KRAS, có 26 trường hợp mang đột biến ở codon 12 hay
codon 13 được phát hiện, chiếm 24,5%. Tỷ lệ này tương đồng với nhiều nghiên cứu trước
đây
(62, 63)
. Ngoài codon 12 và 13, chúng tôi còn phát hiện 9 trường hợp có đột biến tại các
codon 9, 10, 14, 15, 18, 22 và 33 (Phụ lục 4). Các kết quả này đều được khẳng định bằng
cách lập lại thí nghiệm 2 lần từ bước PCR. Một số trong các đột biến này cũng đã được
báo cáo trong cơ sở dữ liệu COSMIC, tuy nhiên ý nghĩa trong lâm sàng vẫn chưa được
tìm hiểu. Đột biến vô nghĩa của codon 22 (Gln22X: CAG>TAG) được báo cáo trong một
trường hợp ung thư đại tràng. Đột biến G10E (c.29G>A) được báo cáo trong một trường
hợp ung thư đại tràng. Đột biến V14I (c.40G>A) được báo cáo trong 7 trường hợp ung
thư đại tràng và một trường hợp bệnh ác tính về máu. Đột biến G15D (c.44G>A) gặp
trong một trường hợp bệnh ác tính về máu; đột biến G15S (c.43G>A) gặp trong một
trường hợp ung thư buồng trứng và một trường hợp di căn tuyến ức. Đột biến A18V chưa
từng được báo cáo, tuy nhiên A18D và A18T có gặp trong ung thư phổi và ung thư
đường tiêu hóa. Đột biến D33H chưa từng được báo cáo.
Trong số 35 bệnh nhân có mang đột biến KRAS (33%), 7 trường hợp đột biến ở

hai codon, phù hợp tính đa dòng tế bào trong ung thư nói chung và ung thư phổi nói
riêng
(64)
. Một điểm rất đáng quan tâm là chúng tôi phát hiện đột biến KRAS trong cả
nhóm có mang đột biến EGFR lẫn nhóm không có đột biến EGFR (Bảng 3.1). Các
nghiên cứu trước đây thường ghi nhận rằng đột biến EGFR và đột biến KRAS loại trừ lẫn
nhau
(45, 62)
. Tuy nhiên, khi ứng dụng kỹ thuật có độ nhạy cao để phát hiện đột biến KRAS,
như kỹ thuật mutant-enriched sequencing, cũng có những nghiên cứu ghi nhận đột biến
25

KRAS gặp trong những trường hợp có đột biến EGFR và là nguyên nhân kháng thuốc
nguyên phát
(63)
. Vì có những trường hợp đột biến KRAS được ghi nhận đồng thời với đột
biến EGFR trong nghiên cứu này, chúng tôi kiến nghị nên khảo sát cả 2 đột biến gen
EGFR và KRAS cho những bệnh nhân NSCLC để chọn lựa điều trị bước ưu tiên bằng
thuốc kháng EGFR. Những bệnh nhân có mang đột biến KRAS cần được theo dõi tình
trạng kháng thuốc nếu quyết định điều trị bằng thuốc ức chế đặc hiệu EGFR. Một số tác
giả đã đề xuất nên xác định tình trạng đột biến codon 12 và 13 của gen KRAS trước khi
khảo sát đột biến gen EGFR trong chuỗi lưu đồ chẩn đoán phân tử NSCLC nhằm chọn
lựa bệnh nhân phù hợp với chỉ định thuốc ức chế hoạt tính tyrosin kinase của EGFR
(65)
.