Sự hiện diện của các vi khuẩn kị khí ở các bệnh nhân bị chảy máu dạ dày ở việt nam

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1. HỆ VI SINH VẬT MICROBIOTA CỦA NGƢỜI 4
1.1.1. Các Microbiota bản địa 5
1.1.2. Các Microbiota bệnh 6
1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU MICROBIOTA 7
1.2.1. Phƣơng pháp cổ điển 7
1.2.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử 7
1.2.3. Kết hợp phƣơng pháp nuôi cấy cổ điển v phƣơng pháp hiện đại 9
1.3. MICROBIOTA DẠ DÀY NGƢỜI 9
1.3.1. Microbiota bản địa dạ dy ngƣời khỏe mạnh 10
1.3.2. Microbiota dạ dày của ngƣời bệnh 11
1.4. HỘI CHỨNG CHẢY MÁU DẠ DÀY 12
1.4.1. Các dấu hiệu nhận biết chảy máu dạ dày 12
1.4.2. Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ gây chảy máu dạ dày 13
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 16
2.2. PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 16
2.2.2. Hóa chất, thiết bị máy móc 16
2.2.3. Địa điểm thực hiện nghiên cứu 17
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.3.1. Khám lâm sàng 19
2.3.2. Nội soi và lấy bệnh phẩm 19
2.3.3. Đo pH dịch vị dạ dày 19


2.3.4. Nuôi cấy và phân lập chủng vi khuẩn 20

2.3.5. Nhuộm Gram v quan sát dƣới kính hiển vi thƣờng 21
2.3.6. Test Helicotest 21
2.3.7. Tách chiết ADN từ vi khuẩn và từ sinh thiết 21
2.3.8. Xác định HPstatus của các bệnh nhân 21
2.3.9. PCR nhân gen 23S rARN của H. pylori 22
2.3.10. PCR nhân gen 16S rARN của vi khuẩn 23
2.3.11. Giải trình tự 23
2.3.12. Định tên vi khuẩn 24
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25
3.1. ĐẶC ĐIỂM CÁC BỆNH NHÂN 26
3.1.1. Đặc điểm tuổi, giới, độ pH dạ dày 26
3.1.2. Hình ảnh nội soi dạ dày của các bệnh nhân 27
3.2. XÁC ĐỊNH HP STATUS CỦA CÁC BỆNH NHÂN 28
3.3. PHÂN LẬP CÁC VI KHUẨN Ở ĐIỀU KIỆN KỊ KHÍ 31
3.4. NGHIÊN CỨU CÁC VI KHUẨN 35
3.4.1. Xác định Gram của các chủng phân lập 35
3.4.2. Định tên vi khuẩn 35
KẾT LUẬN 44
KIẾN NGHỊ 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO 46






DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1. Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nhóm tuổi và giới tính ……………… 26
Bảng 2. Kết quả phân tích 4 gen chỉ thị của vi khuẩn H. pylori của 27 bệnh

nhân ………………………………………………… 30
Bảng 3. Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm vi khuẩn …………………………………………… 31
Bảng 4. Tên các loài vi khuẩn phân lập từ bệnh phẩm …………………………… 39
Bảng 5. Một số đặc điểm của các vi khuẩn phân lập ở điều kiện kị khí từ Microbiota dạ
dày của ngƣời bệnh bị viêm dạ dày cấp tính chảy máu …………………………… 42














DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1. Sự khác biệt giữa các Microbiota của ngƣời trẻ v ngƣời gi ……………… 5
Hình 2. Cấu trúc bậc hai của 16S rARN ……………………………………………… 8
Hình 3. Microbiota đƣờng tiêu hóa của ngƣời ……………………………………… 10
Hình 4. Hình ảnh nội soi niêm mạc dạ dày xuất huyết ………………………… 13
Hình 5. Đĩa môi trƣờng thạch máu dùng để nuôi cấy vi khuẩn …………………… 17
Hình 6. Hộp giấy đo pH 0~14 (EMD-Mỹ) ………………………………………… 19
Hình 7. Hệ thống bình nuôi cấy kị khí …………………………………………… 20
Hình 8. Xác định độ pH dịch dạ dày của 27 bệnh nhân bị chảy máu dạ dy ……… 27
Hình 9. Ảnh chụp dạ dày xuất huyết của 27 bệnh nhân …………………………… 28

Hình 10. Hình ảnh các khuẩn lạc vi khuẩn trên đĩa thạch máu của một số bệnh
nhân……………………………………………………………………………………31
Hình 11. Hình ảnh các khuẩn lạc đƣợc nhận định ban đầu giống với H. pylori … 32
Hình 12. H. pylori sau khi nhuộm Gram dƣới kính hiển vi quang học ………………33
Hình 13. Kết quả thử hoạt tính Urease bằng Helicotest …………………………… 33
Hình 14. Sản phẩm PCR khuếch đại gen 23S rARN xác định H. pylori …………… 33
Hình 15. Các chủng H. pylori phân lập ở điều kiện kị khí ………………………… 34
Hình 16. Một số chủng vi khuẩn đƣợc phân lập và làm sạch ở điều kiện kị khí ….….34
Hình 17. Ảnh chụp một số chủng vi khuẩn dƣới kính hiển vi Olympia …………… 35
Hình 18. Sản phẩm PCR khuếch đại từ gen 16S rARN ………………………………36
1

MỞ ĐẦU

Biến đổi khí hậu Toàn cầu đi kèm với suy thoái tài nguyên, ô nhiễm môi trƣờng
lm thay đổi toàn diện, sâu sắc các hệ sinh thái tự nhiên, dẫn đến sự thay đổi nhiều
bệnh đ biết cũng nhƣ sự xuất hiện của nhiều bệnh mới. Đây là những thách thức lớn
nhất của nhân loại trong thế kỷ 21.
Viêm dạ dày cấp tính chảy máu là một Hội chứng hay gặp ở ngƣời trƣởng thành
- lứa tuổi phải chịu nhiều áp lực từ công việc lao động, xã hội v gia đình cũng nhƣ dễ
nhiễm những thói quen sinh hoạt có hại cho sức khỏe nhƣ hút thuốc lá, nhậu nhẹt và
rƣợu chè. Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, cả những ngƣời 20 tuổi cũng bị chảy
máu dạ dày. Nguyên nhân sự dịch chuyển về tuổi tác của Hội chứng chƣa đƣợc xác
định.
Viêm dạ dày cấp tính chảy máu l đợt tiến triển cấp tính của viêm dạ dày mạn
tính, có thể biểu hiện bất ngờ và gây ảnh hƣởng nặng nề đến khả năng lao động cũng
nhƣ chất lƣợng cuộc sống của ngƣời bệnh. Hội chứng có tỷ lệ tái phát cao sau khi điều
trị. Nguyên nhân chính gây viêm dạ dày cấp tính chảy máu vẫn đang còn l vấn đề
tranh cãi [6], [30].
Mối liên quan giữa các bệnh lý viêm loét dạ dày và biến chứng chảy máu dạ dày

với vi khuẩn Helicobacter pylori đ đƣợc thừa nhận. Các bệnh nhân bị viêm dạ dày cấp
tính chảy máu đƣợc điều trị khỏi nhờ liệu pháp kháng sinh. Tuy nhiên thực tế y học
lâm sng đ xác nhận, có nhiều trƣờng hợp bệnh nhân bị viêm dạ dày cấp tính chảy
máu không nhiễm H. pylori, nhƣng khi phác đồ điều trị có kháng sinh thì mang lại kết
quả tốt. Vấn đề đặt ra là, ngoài H. pylori trong dạ dy ngƣời còn có thể có các loài vi
khuẩn nào khác liên quan mà khoa học chƣa biết?
Hiện tại, trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam chƣa có nhiều công trình nghiên
cứu về viêm dạ dày cấp tính chảy máu và vì thế có ít thông tin về thành phần
2

Microbiota dạ dày của ngƣời bệnh. Sự hạn chế ny có thể ảnh hƣởng rất nhiều đến hiệu
quả điều trị – theo dõi diễn biến bệnh cho bệnh nhân. Xuất phát từ nhu cầu hiểu biết và
phục vụ công tác chẩn trị các bệnh nhân bị viêm dạ dày cấp tính chảy máu, chúng tôi
tiến hnh đề tài nghiên cứu “Sự hiện diện của các vi khuẩn kị khí ở các bệnh nhân
bị chảy máu dạ dày ở Việt Nam", với mục tiêu là góp phần tìm hiểu thêm về các vi
khuẩn có mặt Microbiota dạ dày của nhóm bệnh nhân này.
Nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm:
1. Phân lập các loại vi khuẩn từ bệnh phẩm dạ dày chảy máu ở điều kiện kị khí.
2. Xác định tỷ lệ nhiễm H. pylori của các bệnh nhân.
3. Định tên các vi khuẩn bằng phƣơng pháp giám định gen 16S rARN.
4. Tham khảo các đặc tính của các vi khuẩn đƣợc phân lập qua các dữ liệu trên
Internet.

3







CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU












4

1. HỆ VI SINH VẬT MICROBIOTA CỦA NGƢỜI
Microbiota đƣợc định nghĩa l quần thể vi sinh vật sống trong cùng một ổ sinh
thái hoặc ở một giai đoạn địa lý riêng biệt. Trong cơ thể ngƣời, các Microbiota gồm
khoảng 1000 loài khác nhau. Số lƣợng vi khuẩn trong các ổ sinh thái cộng lại khoảng
10
14
tế bào vi khuẩn, có khối lƣợng khoảng 2 kg, nhiều gấp 10 lần số tế bo cơ thể
ngƣời.
Microbiota đƣợc hình thành trong quá trình phát triển của con ngƣời, đạt cao
điểm ở tuổi trƣởng thành và thoái hóa ở tuổi gi. Nhƣ đ biết, sự ra đời của trẻ sơ sinh
gắn liền với sự hình thành nhanh chóng của hệ vi sinh vật đƣờng tiêu hóa với số lƣợng
lên tới 10
11
vi khuẩn trên một gram phân: chỉ 24 tiếng sau khi sinh, các loài vi khuẩn
nhƣ Enterobacteriaceae, Enterococcus, Lactobacillus, vi khuẩn gây thối Clostridium
và Staphylococcus đ xuất hiện trong phân của trẻ. Hình 1 giới thiệu sự khác biệt của
các Microbiota ở ngƣời trẻ v ngƣời già trên 100 tuổi [24].
Thành phần các vi sinh vật trong các Microbiota có thể thay đổi dẫn đến bệnh
tật [24]. Chẳng hạn, các bệnh nhân bị tiểu đƣờng tuýp 2 có Microbiota đƣờng ruột bị
thoái hóa. Các vi khuẩn sản xuất butyrate, đóng vai trò quan trọng trong cung cấp năng
lƣợng cho các tế bo biểu mô v điều khiển các đáp ứng của tế bo chủ giảm đáng kể,
trong khi đó các vi khuẩn gây bệnh mang chức năng khử sulphate và kháng với stress
oxy hóa lại tăng [54].
Còn rất nhiều điều chƣa biết về thành phần các Microbiota của ngƣời, do
khoảng 99% các loài vi khuẩn không thể nuôi cấy đƣợc trong các phòng thí nghiệm
[12]. Hiện nay, các nhà khoa học đang áp dụng Metagenomic kết hợp với Genomic,
Tin sinh học để tiếp cận thế giới vi sinh vật. Metagenomics cho phép xác định các loài
vi sinh vật có trong quần thể vi sinh vật Microbiota phức tạp không cần nuôi cấy chúng.
Phân tích Metagenomic cho thấy, mặc dù các Microbiota có thể khác nhau về thành
phần do các chế độ ăn uống, nhƣng mỗi ngƣời đều mang một số vi khuẩn đặc trƣng v

không thay đổi theo thời gian, bao gồm 400 loại ở ngƣời khỏe mạnh [36].
5















Hình 1. Sự khác biệt giữa các Microbiota của ngƣời trẻ v ngƣời già [24]

Các Microbiota đƣợc chia thành hai loại dựa theo tiêu chí, liệu chúng có gây hại
hay không đối với con ngƣời:
- Các Microbiota bản địa, bao gồm các vi sinh vật cộng sinh cƣ trú thƣờng xuyên ở mắt
v da, đƣờng hô hấp trên, đƣờng tiêu hóa trên v dƣới, đƣờng tiết niệu v sinh sản của
phụ nữ v nam giới, dịch cơ thể v máu.
- Các Microbiota bệnh, bao gồm các vi sinh vật cơ hội gây hại cho ngƣời.
Các loài vi khuẩn sống trong các Microbiota có thể l loi cƣ trú thƣờng xuyên,
loi vng lai v loi đi ngang qua ổ sinh thái. Trong một số điều kiện đặc biệt, các vi
sinh vật cơ hội có thể xuất hiện.
1.1.1. Các Microbiota bản địa
Microbiota của ngƣời khỏe mạnh hay còn đƣợc gọi là bản địa bao gồm các vi

Một số vi
khuẩn tạo
butyrate và
loại gây
bệnh
Nhiều vi
khuẩn
tạo
butyrate
Ngƣời trẻ
24-40 tuổi
Ngƣời trăm
tuổi 99-104
tuổi
Một số vi
khuẩn tạo
butyrate và
loại gây
bệnh
Nhiều vi
khuẩn
tạo
butyrate
Ngƣời trẻ
24-40 tuổi
Ngƣời trăm
tuổi 99-104
tuổi
6

sinh vật không gây bệnh, chủ yếu là vi khuẩn và một vài loại nấm, prostist sống ở
khoang miệng, thực quản, đƣờng tiêu hóa, mũi, họng, da và vùng gần quanh mắt. Các
loài vi sinh vật ny giúp đỡ bảo vệ cơ thể ngƣời chống lại các loài vi sinh vật gây bệnh
do:
i. ganh đua gắn với các tế bào biểu bì hoặc tế bào niêm mạc của ngƣời.
ii. tranh giành vị trí sinh thái.
iii. tranh giành thức ăn để sống.
iv, tiết ra các chất giết các loài gây bệnh.
Các vi sinh vật trong quần thể Microbiota bản địa gồm (i) các loài vi sinh vật
cƣ trú thƣờng xuyên không gây hại v có mối quan hệ tƣơng hỗ với ngƣời; (ii) các vi
sinh vật vãng lai bao gồm các vi sinh vật chỉ tồn tại một thời gian ngắn từ một vi ngy
đến vi tuần trong cơ thể ngƣời do không thể cạnh tranh với các vi sinh vật cƣ trú thƣờng
xuyên, bị hệ miễn dịch của chủ tấn công v các điều kiện ở mới thích hợp cho sự phát
triển của chúng; (iii) các vi sinh vật đi ngang qua một Microbiota đến một Microbiota
khác.
1.1.2. Các Microbiota bệnh
Trong điều kiện bình thƣờng, các vi sinh vật cƣ trú thƣờng xuyên, các vi sinh
vật vng lai cũng nhƣ các vi sinh vật đi ngang qua Microbiota bản địa không gây tác
hại cho con ngƣời. Tuy nhiên khi Microbiota bản địa thay đổi do nhiều lý do nhƣ bị tổn
thƣơng trong các trƣờng hợp viêm nhiễm và các bệnh tự miễn (bệnh Crohn, bệnh loét
ruột kết, bệnh viêm khớp, bệnh tiểu đƣờng loại 1, bệnh đa khớp, bệnh béo phì ), một vi
trong số các vi sinh vật cƣ trú thƣờng xuyên, các vi sinh vật vng lai v ngay đến các vi
sinh vật đi ngang qua Microbiota có thể trở thnh vi sinh vật cơ hội gây bệnh.
Theo y học hiện đại, các nguyên nhân dẫn đến sự hình thành Microbiota bệnh
mang các vi sinh vật cơ hội gây bệnh gồm ba khả năng:
1. Hệ miễn dịch của con ngƣời làm việc sai lệch, các quần thể bản địa có thể phát triển
vƣợt và chuyển đến các vùng khác của cơ thể. Ví dụ Escherichia coli thƣờng sống
7

trong ruột non, một khi đi vo bng quang sẽ gây các bệnh đƣờng tiết niệu.

2. Sự mất cân bằng của các vi sinh vật bản địa xảy ra khi các bệnh nhân dùng kháng
sinh phổ rộng.
3. Các vi sinh vật bản địa di dời vo vùng trƣớc kia chúng không ở nhƣ trƣờng trong
các vết thƣơng phẫu thuật.

1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU MICROBIOTA
1.2.1. Phƣơng pháp cổ điển
Để nghiên cứu một hệ vi sinh vật, phƣơng pháp tiếp cận đầu tiên thƣờng đƣợc
sử dụng là nuôi cấy và phân lập các vi sinh vật, sau đó dựa trên các đặc điểm kiểu hình
cũng nhƣ đặc điểm hình thái, các đặc tính sinh lý, sinh hóa… m định tên và sắp xếp
chúng vào các nhóm [38].
Trong y học, nuôi cấy thnh công đƣợc coi là tiêu chuẩn vng để xác định sự
có mặt của một loài vi khuẩn no đó trong bệnh phẩm. Mặt khác, qua nuôi cấy có thể
thu đƣợc các chủng vi khuẩn dùng cho các nghiên cứu hệ gen vi khuẩn, xác định tính
kháng thuốc của vi khuẩn
1.2.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử
Vào những năm 1960, các nh khoa học chú ý đến gen 16S rARN vì chúng bảo
tồn cao ở các loài vi khuẩn và cổ khuẩn [20]. Các nghiên cứu cho thấy, đột biến của
gen 16S rARN xảy ra với tần số thấp [57]. Ngoài ra, các nhà khoa học còn phát hiện
trên gen 16S rARN có một vùng riêng đặc thù cho vi khuẩn và một vùng chung đặc
trƣng cho tất cả các sinh vật sống. Gen 16SrARN còn chứa 9 vùng siêu biến, ký hiệu
V1, V2, V3, V4, V5, V6, V7, V8 và V9 cung cấp các tín hiệu để định danh vi khuẩn.
Vùng siêu biến VI có nghĩa trong phân loại.
Dựa trên tính chất ny, ngƣời ta thiết kế một vài cặp mồi để khuếch đại gen 16S
rARN từ bất cứ loài vi khuẩn nào [19]. Sản phẩm PCR là một đoạn ADN có phân tử
lƣợng khoảng 1,5 kb. Phân tích, so sánh trình tự của gen 16S rARN của một chủng vi
8

khuẩn các gen đ biết trên Genbank cung cấp l cơ sở để xác định tên của chủng cũng
nhƣ xác định quan hệ phát sinh chủng loại của các taxon bậc trên loài [39].

Hình 2. Cấu trúc bậc hai của 16S rARN

Giám định gen 16S rARN nhằm định tên vi khuẩn là một phƣơng pháp tốt và
hữu ích, nhƣng vẫn có những nhƣợc điểm nhất định. Đôi khi, các loi vi khuẩn khác
nhau có cùng một trình tự gen 16S rARN. Do vậy, khi quyết định tên vi khuẩn cần cân
nhắc cẩn thận các kết quả nhận đƣợc sau khi giải trình tự gen. Trong các trƣờng hợp
chƣa rõ rng, để định tên chủng vi sinh vật có trình tự gen 16S rARN tƣơng tự 100%
với gen tƣơng ứng của các loài khác, các nghiên cứu thêm bao gồm các đặc điểm hình
9

thái, các đặc điểm sinh lý sinh hóa, giải trình tự toàn bộ một phần hoặc toàn bộ genome
của vi khuẩn cần đƣợc tiến hành bổ sung nếu thấy cần thiết.
Theo các nhà khoa học: hơn 99% các loi vi khuẩn trong môi trƣờng tự nhiên

chƣa đƣợc định tên do không thể nuôi cấy đƣợc bằng các phƣơng pháp cổ điển trong
phòng thí nghiệm [12]. Hiện nay, kỹ thuật Metagenomic kết hợp Genomic, Tin sinh
học đang đƣợc sử dụng để tiếp cận thế giới vi sinh vật. Đây l kỹ thuật mới và mạnh
nhất cho phép giải mã thông tin di truyền các quần thể vi sinh vật phức tạp không cần
thông qua nuôi cấy và phân lập từng sinh vật đơn lẻ.
1.2.3. Kết hợp phƣơng pháp nuôi cấy cổ điển và phƣơng pháp hiện đại
Định tên vi sinh vật bằng phƣơng pháp sinh học phân tử có nhiều ƣu điểm
nhƣng vẫn có những nhƣợc điểm nhất định do khó phân biệt các ADN có nguồn gốc từ
các vi sinh vật sống hay chết. Các nhà khoa học đánh giá cao việc phối hợp sử dụng cả
hai phƣơng pháp truyền thống (nuôi cấy) lẫn hiện đại (Metagenomic) để định tên các vi
sinh vật, qua đó nghiên cứu thành phần của Microbiota [19].
Tác giả Clarridge J. (2004) lƣu ý một số điểm sau khi định tên vi sinh vật [19]:
- Khi đối tƣợng định tên là các vi sinh vật mới tìm thấy, cần thiết giải toàn bộ trình
tự gen 16S rRNA của vi khuẩn và trình tự không chứa hơn 1% các base không xác
định.
- Trình tự 16S rRNA quyết định chủ yếu tên của chủng vi khuẩn. Đối với một chủng
chƣa biết, khi mối tƣơng quan giữa trình tự gen 16S rRNA v các đặc điểm kiểu
hình (đặc tính sinh hóa, hình thái vi khuẩn…) không thống nhất, trình tự gen quyết
định tên và vị trí phân loại của chủng xem xét.

1.3. MICROBIOTA DẠ DÀY NGƢỜI
Hệ tiêu hóa của ngƣời bao gồm nhiều ngăn với các hệ vi sinh vật Microbiota
khác nhau. Số lƣợng và chủng loại các vi sinh vật trong Microbiota hệ tiêu hóa tăng
dần khi đi xuống phần dƣới, với số lƣợng nhiều nhất ở manh tràng, trực tràng và ít nhất
10

ở dạ dày-nơi có độ pH khoảng 1-2 do dịch dạ dày tiết ra [47], [48] (Hình 3).

Hình 3. Microbiota đƣờng tiêu hóa của ngƣời [47]

Microbiota dạ dy đóng vai trò quan trọng đối với đời sống con ngƣời nhƣ hỗ
trợ tiêu hóa, khử độc, đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh… Tuy nhiên, sự thành phần
của Microbiota bản địa dạ dày có thể bị biến đổi do nhiều nguyên nhân nhƣ ngoại cảnh,
điều kiện môi trƣờng, tuổi tác, chế độ ăn uống, các yếu tố miễn dịch, việc sử dụng
kháng sinh, thuốc điều trị [33].
1.3.1. Microbiota bản địa dạ dày ngƣời khỏe mạnh
Môi trƣờng dạ dy đƣợc coi là quá khắc nghiệt đối với các loài vi sinh vật do
dịch vị dạ dày (pH 1-2) quá axit, các loài vi sinh vật trôi rửa từ phía trên thực quản và
khoang miệng cũng nhƣ từ phía dƣới ở tá tràng không thể xâm nhập và tồn tại trong dạ
dy. Trƣớc kia dạ dy đƣợc coi là vô khuẩn, nhƣng năm 1984, Helicobacter pylori
đƣợc chứng minh là loại vi khuẩn cƣ trú thƣờng xuyên trong Microbiota bản địa dạ dày
[45]. Ngoài ra, Microbiota bản địa dạ dày còn chứa các vi sinh vật khác nhƣ Veillonella
sp., Lactobacillus sp., và Clostridium sp. [68], [13].
11

Bằng phƣơng pháp giám định gen 16S rARN, một tập hợp các loài vi khuẩn

phong phú đa dạng hơn đƣợc tìm thấy trong dạ dày. Các chi vi khuẩn khác không phải
là Helicobacter pylori bao gồm các chi Lactobacillus, Streptococcus, Prevotella,
Veillonella, Stomatococcus [50] và Rothia [14], [43]. Lactobacilli và streptococci là hai
trong những loi đƣợc nuôi cấy từ dạ dày và cả hai chi ny đều bao gồm các loài chịu
đƣợc pH thấp [55], [56], [43].
Tóm lại, ở ngƣời trƣởng thành có chế độ tiết dịch axit bình thƣờng, ngoài H.
pylori còn có vô số các loại vi khuẩn khác sống trong Microbiota bản địa dạ dày [64],
trong đó chủ yếu là các vi khuẩn sinh axit lactic chịu axit.
1.3.2. Microbiota dạ dày của ngƣời bệnh
Lớp chất nhày (mucus) trong dạ dày là hàng rào bảo vệ ngăn chặn vi khuẩn
làm tổ ở lớp biểu mô cũng nhƣ ngăn chặn sự khuếch tán của các hóa chất độc và axit
dạ dy đến bề mặt biểu mô. Do đó, một khi vi khuẩn xâm nhập vào lớp chất nhày hoặc
lớp chất nhày bị phân hủy thì viêm nhiễm của đƣờng tiêu hóa xẩy ra [60]. Tính di động
và khả năng xâm nhập vào lớp chất nhày phụ thuộc rất cao vào sự vận động và hình
dạng của vi khuẩn [61] và khả năng phân hủy chất nhày của chúng [22].
Nhiễm H. pylori thời gian dài dẫn đến thay đổi cấu trúc niêm mạc dạ dày, làm
giảm tiết axit, tạo ra môi trƣờng kiềm , dẫn đến sự xâm nhập và phát triển vƣợt trội của
các vi sinh vật khác trong dạ dày. Khi pH dạ dày trở nên kiềm, độ nhớt của lớp chất
nhầy giảm, dễ dng để các vi sinh vật thâm nhập [32].
Theo Giáo sƣ Zboril (2002), Microbiota dạ dày bản địa của ngƣời bình
thƣờng khỏe mạnh không chứa vi khuẩn kị khí [67]. Từ dạ dày của các bệnh nhân
nhiễm H. pylori lâu ngày và bị viêm, loét, ung thƣ dạ dày, các loại vi sinh vật nhƣ nấm,
vi khuẩn đ đƣợc phân lập [51], [14], [23]. Năm 1990-1991, vi khuẩn Gastrospirillum
hominibee đƣợc phát hiện trong dạ dy ngƣời bệnh viêm dạ dày mạn tính [44], [65].
Ở Việt Nam, năm 2004, GS. Giao và cộng sự đ công bố một số vi khuẩn phân lập ở
điều kiện kỵ khí từ sinh thiết dạ dày của ngƣời bệnh Việt Nam [5]. Nấm Candida
12

krusei, trƣớc kia đƣợc cho l chỉ có ở các bệnh nhân bị HIV/AIDS đ đƣợc tìm thấy trong
thƣợng v hạ vị của các bệnh nhân bị chảy máu dạ dy [29]. Nấm Candida parapsilosis

cũng đ đƣợc tìm thấy trong Microbiota dạ dày của các bệnh nhân bị viêm dạ dày mãn
tính [10].

1.4. HỘI CHỨNG CHẢY MÁU DẠ DÀY
Viêm dạ dày cấp tính chảy máu là hậu quả của các tổn thƣơng viêm loét dạ dày
cấp hoặc mn tính không đƣợc điều trị triệt để. Y học hiện đại cho rằng, viêm dạ dày
cấp tính chảy máu không phải là một bệnh mà là một hội chứng. Chảy máu ở đây
thƣờng khởi phát đột ngột, ồ ạt, diễn biến nhanh, có thể nguy hiểm đe dọa tính mạng
ngƣời bệnh, do đó đòi hòi phải theo dõi kỹ cng để xử trí kịp thời [16].
1.4.1. Các dấu hiệu nhận biết chảy máu dạ dày [9], [16], [30]
* Triệu chứng lâm sàng
a, Xuất huyết tiêu hóa: Khi chảy máu dạ dy xảy ra, bệnh nhân có thể nôn ra máu đỏ hoặc
mu c phê, đi ngoi phân đen.
b, Rối loạn tiêu hóa, chán ăn, buồn nôn, nôn.
c, Đau vùng thƣợng vị: Tùy trƣờng hợp m bệnh nhân có thể bị đau tức, cồn co nóng rát
đến đau bụng quặn thnh cơn dữ dội.
d, Hiện tƣợng chóng mặt có thể xảy ra, bệnh nhân mệt mỏi v yếu, nhợt nhạt, thở ngắn,
mạch nhanh v huyết áp giảm.
* Triệu chứng cận lâm sàng
Dịch dạ dy đục, niêm mạc phù nề, có các vùng trợt v xuất huyết. Xuất huyết có
thể l những nốt hoặc đốm xảy ra riêng lẻ hoặc tập trung tạo thnh những đám, mảng
máu tụ đen hoặc hơi rỉ máu trên niêm mạc. Vị trí chảy máu phân bố lan tỏa khắp niêm
mạc hoặc phân bố khƣ trú ở thân vị v hang vị. Hình 4 giới thiệu hình ảnh nội soi một số
trƣờng hợp chảy máu dạ dy của một số bệnh nhân Việt Nam (a, b, c) v nƣớc ngoi (d,
e, f).
13

a b c

d e f







Hình 4. Hình ảnh nội soi niêm mạc dạ dày xuất huyết
của các bệnh nhân Việt nam (a,b,c) v nƣớc ngoài (d,e,f)

1.4.2. Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ gây chảy máu dạ dày
Chảy máu dạ dày có nhiều nguyên nhân, trong thực tế thƣờng khó xác định chắc
chắn vì trên một bệnh nhân có thể có sự phối hợp của nhiều yếu tố. Đó l:
a) Loét và viêm dạ dày
Loét và viêm dạ dy thƣờng gặp ở các bệnh nhân nhiễm H. pylori. Chảy máu do
loét hoặc viêm dạ dày gây mất nhiều máu, có thể dẫn đến tình trạng thiếu máu trầm
trọng. Các bệnh nhân mang hội chứng di truyền Zollinger-Ellison tiết quá nhiều acid dạ
dày gây loét dẫn đến chảy máu dạ dày [30].
b) Ung thư dạ dày
Các bệnh nhân ung thƣ dạ dày có thể nôn máu đen, khối lƣợng máu ít nhƣng
14

nhiều lần. Chảy máu thƣờng tiềm tng, phân đen hay gặp hơn l nôn ra máu [9].
c) Do dùng thuốc
Các loại thuốc giảm đau, chống viêm, hay gặp nhất l aspirin thƣờng gây chống

đau, nhất là, khi dùng aspirin với liều 1g/24 giờ, có tới 50% bệnh nhân bị tổn thƣơng
dạ dày. Các thuốc chống viêm không steroid cũng gây tổn thƣơng niêm mạc dạ dày và
tá trng, theo cơ chế ức chế enzyme cylo-oxygenase và giảm sự tổng hợp prostaglandin
[7], [31]. Khi dùng thuốc chống viêm không steroid phối hợp với các loại thuốc
corticoid, thuốc chống đông thì tỷ lệ nguy cơ chảy máu tiêu hóa cng tăng, có thể gấp
2-3 lần.
d) Do các chất ăn mòn niêm mạc dạ dày như rượu, axit hoặc kiềm
Có 20% ngƣời nghiện rƣợu xuất huyết tiêu hóa là do viêm dạ dày xuất huyết do
tăng thẩm thấu ở niêm mạc dạ dày [7]. Khi bệnh nhân uống phải dung dịch axit (nhƣ
HCl, H
2
SO
4
) hoặc dung dịch kiềm đặc (nhƣ x phòng giặt) cũng gây tổn thƣơng dạ
dày, thực quản, thậm chí gây thủng thực quản.
e) Stress
Trạng thái stress trong một số bệnh nhƣ suy hô hấp, bỏng, chấn thƣơng sọ não,
nhiễm khuẩn huyết, trụy tim mạch, suy gan, suy thận có thể gây viêm dạ dày xuất
huyết. Các stress tinh thần nhƣ lo âu, mất ngủ, làm việc căng thẳng, tình trạng trầm
cảm kéo di cũng l nguyên nhân. Tổn thƣơng v xuất huyết dạ dy thƣờng xảy ra
trong vòng 18 giờ sau stress [6].
g) Viêm nhiễm
Nhiễm H. pylori hiện nay đƣợc coi là nguyên nhân chính gây ra các bệnh về dạ
dy, trong đó có chảy máu dạ dày [9].



15

CHƢƠNG II
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU












16

2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Hai mƣơi bảy bệnh nhân đƣợc chẩn đoán viêm dạ dày cấp tính chảy máu qua hình
ảnh nội soi tại khoa Nội tiêu hóa, bệnh viện Bƣu Điện v 10 ngƣời khỏe mạnh không
có bệnh gì về dạ dy đồng thuận đƣợc lựa chọn cho nghiên cứu.
Tiêu chuẩn chọn lựa bệnh nhân nghiên cứu:
- Trƣớc nội soi một tháng không dùng các thuốc kháng sinh, thuốc ức chế tiết axit.
- Nội soi có hình ảnh chảy máu dạ dày.
- Không phân biệt tuổi tác, nghề nghiệp, nơi ở.
- Tự nguyện tham gia vào nghiên cứu.

2.2. PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
2.2.2. Hóa chất, thiết bị máy móc
a, Hóa chất
Các hóa chất dùng trong thí nghiệm mua của các hng nƣớc ngoài (Amersham
Pharmacia Biotech; Amersham Life Science; Eurogen; Promega; Sigma…) có độ tinh
khiết cao.
b, Thiết bị máy móc
- Máy nội soi dạ dày video OLYMPUS Evis EXERA 160 và các dụng cụ kèm theo
- Máy lắc ổn nhiệt nuôi cấy tế bo (Multitron, Đức).
- Máy PCR 9700 (Applied Biosystems, Mỹ)
- Máy điện di và máy UV soi ADN (Mupid, Nhật Bản).
- Máy ly tâm lạnh bé
- Bể ổn nhiệt (Memmert, Đức).
- Máy giải trình tự gen tự động - ABI Prism 3100 Sequencer (Applied Biosytems, Mỹ).
- Máy đo quang phổ (Shimadzu, Nhật Bản)
- Máy NanoDrop 1000 Spectrophotometer (Thermo Scientific, Mỹ).
c, Dung dịch và môi trường sử dụng
17

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn kị khí (1 lit)
- 39,5 g Campylobacter base
- 5%-10% máu ngựa
- Nystatin: 1 µg/ml
- Agar
- Nƣớc cất vừa đủ 1 lít, pH 7

Hình 5. Đĩa môi trƣờng thạch máu dùng để nuôi cấy vi khuẩn

Dung dịch để giữ chủng vi khuẩn
Dung dịch (1 lit) chứa 28 g Brucella Broth (BB), bổ sung thêm 30% glycerol
(v/v), bảo quản ở -80
o
C.
2.2.3. Địa điểm thực hiện nghiên cứu
- Soi và sinh thiết dạ dy đƣợc thực hiện tại phòng Nội soi, bệnh viện Bƣu Điện.
- Các phân tích sau đƣợc thực hiện tại trƣờng Đại học tổng hợp New York, NY, Mỹ:
+ Nuôi cấy và phân lập các chủng vi khuẩn kị khí.
+ Xác định HP status của các bệnh nhân.
+ Giải trình tự gen 16S rARN để định tên các chủng vi khuẩn.


18

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU

Xác định HPstatus
Bệnh nhân có các dấu hiệu chảy
máu dạ dày
Nội soi lấy sinh thiết
dạ dày
- Khám lâm sng, đáp ứng
đầy đủ các tiêu chuẩn
- Đồng ý tham gia nghiên
cứu
Nuôi cấy, phân lập vi
khuẩn trong điều kiện kị
khí

Định tên các chủng vi
khuẩn phân lập
Nghiên cứu hình thái
học các vi khuẩn
19

2.3.1. Khám lâm sàng
Các bệnh nhân đƣợc thăm khám lâm sng, hỏi bệnh và tiền sử theo mẫu phiếu
thu thập số liệu thống nhất bao gồm các thông tin: tên; tuổi; giới tính; triệu chứng lâm
sng (đau thƣợng vị, cồn cào nóng rát, ợ hơi, ợ chua, buồn nôn, nôn, đầy bụng, rối loạn
đại tiện ); tiền sử bệnh (bản thân, gia đình); tiền sử uống rƣợu bia, thuốc lá, uống
thuốc kháng sinh hay thuốc ức chế axit; yếu tố stress; dị ứng
2.3.2. Nội soi và lấy bệnh phẩm
Việc nội soi, chụp ảnh và lấy mẫu sinh thiết dạ dày cho các nghiên cứu đƣợc
thực hiện theo thƣờng qui bởi các bác sĩ Nội khoa tiêu hóa cùng trang thiết bị của bệnh
viện. Bệnh nhân đƣợc chẩn đoán bị viêm dạ dày xuất huyết (về các mặt gồm vị trí tổn
thƣơng, hình ảnh tổn thƣơng, mức độ tổn thƣơng) sẽ đƣợc sinh thiết 2 mảnh, trong đó 1
mảnh ở hang vị, 1 mảnh ở thân vị. Những mẫu bệnh phẩm ny đƣợc cho vào ống
nghiệm vô trùng và bảo quản trong bình N
2
lỏng cho đến khi sử dụng vào các nghiên
cứu tiếp theo.
2.3.3. Đo pH dịch vị dạ dày
Giấy đo pH đƣợc tẩm với nhiều chất chỉ thị màu khác nhau và hộp giấy có đính
kèm bảng mu để so sánh khi đọc kết quả (Hình 6).

Hình 6. Hộp giấy đo pH 0~14 (EMD-Mỹ)
20

2.3.4. Nuôi cấy và phân lập chủng vi khuẩn
Hai mảnh sinh thiết dạ dày (1 mảnh lấy ở hang vị và 1 mảnh lấy ở thân vị)
đƣợc lấy ra từ bình nitơ v đƣợc đặt vo trong đá khoảng 20 phút để cân bằng nhiệt độ,
sau đó đƣợc nghiền kỹ trong 0,5 ml dung dịch muối sinh lý (0,9% NaCl) vô trùng.
Khoảng 30 – 50 l dịch nghiền của sinh thiết đƣợc nhỏ và trải đều trên bề mặt đĩa môi
trƣờng thạch. Đặt các đĩa petri vo bình Jar với một bao khí BBL GasPak Plus (BD,
Mỹ) để tạo điều kiện kị khí (10% CO
2
) (Hình 7). Đặt bình Jar vào tủ ấm ở 37
0
C v đọc
kết quả trong vòng 48 - 72 giờ.
Mỗi khuẩn lạc có hình thù đặc trƣng đƣợc nuôi riêng rẽ trên các đĩa thạch khác
nhau. Các đĩa nuôi đƣợc ghi tên, nguồn gốc bệnh nhân rõ ràng. Quá trình phân lập
đƣợc thực hiện cho đến khi nhận đƣợc các khuẩn lạc riêng rẽ và thuần nhất .

Hình 7. Hệ thống bình nuôi cấy kị khí

Sau khi đƣợc phân lập, từng chủng vi khuẩn đƣợc nuôi trong môi trƣờng lỏng
Brucella Broth (BB) qua đêm để tăng lƣợng vi khuẩn. Ly tâm thu tế bào vi khuẩn trong
điều kiện vô khuẩn 4
o
C để lấy sinh khối. Hòa tế bào vi khuẩn trong môi trƣờng lỏng
BB có bổ sung 30% glycerol (v/v) rồi chia vào các ống giữ giống, giữ ở -80
o
C.

21

2.3.5. Nhuộm Gram và quan sát dƣới kính hiển vi thƣờng
Vi khuẩn phết lên lam kính đƣợc cố định nhanh trên ngọn lửa đèn cồn và bằng
tím kết tinh (2 g tím kết tinh trong 20 ml ethanol 95%, 0,8 g ammonium oxalate trong
80 ml nƣớc cất) trong 1 phút. Rửa tiêu bản bằng nƣớc và nhuộm tiếp bằng dung dịch
Lugol (1 g Iod, 2 g KI trong 300 ml nƣớc cất) trong 1 phút. Sau khi rửa lại tiêu bản
bằng nƣớc, phủ lên tiêu bản một lớp cồn 95% và rửa tiếp tiêu bản bằng nƣớc. Nhuộm
bổ sung tiêu bản bằng dung dịch safranin 0,5% trong 1 phút. Rửa tiêu bản bằng nƣớc
cất và xem tiêu bản dƣới kính hiển vi thƣờng có độ phóng đại 100 lần. Vi khuẩn Gram
dƣơng bắt màu tím, vi khuẩn Gram âm bắt mu đỏ.
2.3.6. Test Helicotest
Mảnh sinh thiết đƣợc cho vào giếng thử, sau đó nhỏ dung dịch thử vào giếng
cho ngập mảnh sinh thiết. Phản ứng thử cho kết quả sau khoảng 10-20 phút. Nếu màu
của dung dịch thử chuyển từ màu vàng sang màu hồng cánh sen thì mẫu phẩm có H.
pylori.

2.3.7. Tách chiết ADN từ vi khuẩn và từ sinh thiết
ADN đƣợc tách chiết từ sinh thiết dạ dày bằng Bộ Kít QIA-gene (Blood and
Tissue Kit); từ vi khuẩn dùng Bộ Kít Genomic DNA purification Kit (Fermentas).
ADN đƣợc đƣợc hòa trong 100-200 µl 1x TE. Nồng độ v độ tinh sạch của chế phẩm
ADN đƣợc kiểm tra trên máy NanoDrop1000, Thermo scientific.
2.3.8. Xác định HPstatus của các bệnh nhân
HPstatus của các bệnh nhân đƣợc xác định nhờ phân tích các chỉ thị phân tử của
H. pylori nhƣ gen glmM, gen hspA, gen cagA, gen 23S rARN [23]. Bệnh nhân đƣợc xác
định nhiễm H. pylori (HPstatus +) nếu cho kết quả dƣơng tính với tất cả hoặc ít nhất là
3/4 gen nghiên cứu của vi khuẩn. Các mồi dùng trong phân tích đƣợc trình bày ở bảng
dƣới đây: