Phân lập và khảo sát khả năng kháng một số vi khuẩn và nấm bệnh của vi tảo scenedesmus quadricauda

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI





ðỖ VĂN TUÂN






PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG
MỘT SỐ VI KHUẨN VÀ NẤM BỆNH CỦA VI TẢO
SCENEDESMUS QUADRICAUDA







LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI - 2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI




ðỖ VĂN TUÂN






PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG
MỘT SỐ VI KHUẨN VÀ NẤM BỆNH CỦA VI TẢO
SCENEDESMUS QUADRICAUDA

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ: 60.42.02.01



NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. NGUYỄN ðỨC BÁCH






HÀ NỘI - 2014
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


i

LỜI CAM ðOAN

- Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung
thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào.
- Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã
được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn
gốc.
Hà Nội, ngày 01 tháng 5 năm 2014
TÁC GIẢ LUẬN VĂN

ðỗ Văn Tuân

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ của các
thầy cô giáo, các tập thể, cá nhân, gia đình cùng bạn bè đồng nghiệp.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Đức Bách đã tận tình
hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài cũng như hoàn chỉnh
luận văn.
Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô thuộc Bộ môn Sinh học
phân tử và Công nghệ Sinh học ứng dụng, đã giúp đỡ, đóng góp nhiều ý kiến quý
báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này.
Để hoàn thành khoá học này, tôi còn nhận được sự động viên hỗ trợ rất lớn
của gia đình, bạn bè đã tạo điều kiện về vật chất và tinh thần để tôi học tập và
nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn./.
TÁC GIẢ


Đỗ Văn Tuân


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

iii

MỤC LỤC


Lời cam đoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục các chữ viết tắt và kí hiệu v
Danh mục các bảng vi
Danh mục hình vii
PHẦN I MỞ ðẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục đích và yêu cầu 2
1.2.1 Mục đích 2
1.2.2 Yêu cầu 2
PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Giới thiệu chung về vi tảo 3
2.1.1 Hình thái cơ thể, cấu trúc và sinh sản 3
2.1.2 Vai trò của vi tảo 4
2.2 Khả năng kháng vi khuẩn và nấm bệnh của vi tảo 7
2.2.1 Khả năng kháng vi khuẩn của vi tảo 7
2.2.2 Khả năng kháng vi nấm của vi tảo 10
2.3 Tổng quan về vi tảo Scenedesmus quadricauda 12
2.3.1 Vị trí phân loại 12
2.3.2 Đặc điểm hình thái, cấu trúc và sinh sản của vi tảo Scenedesmus
quadricauda 12
2.3.3 Sự phân bố của vi tảo Scenedesmus quadricauda 13

2.4 Khả năng kháng vi khuẩn và nấm bệnh của vi tảo Scenedesmus
quadricaida 14
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


iv

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 16
3.1 Vật liệu, thời gian và địa điểm nghiên cứu 16
3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 16
3.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 16
3.2 Nội dung nghiên cứu 16
3.3 Phương pháp nghiên cứu 16
3.3.1 Phân lập và định danh vi tảo Scenedesmus quadricauda 17
3.3.2 Chiết dịch tảo bằng các dung môi khác nhau 22
3.3.3 Phân tách các thành phần dịch chiết bằng sắc ký lớp mỏng 24
3.3.4 Thử hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của dịch chiết 25
PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28
4.1 Kết quả phân lập tảo Scenedesmus 28
4.2 Đặc điểm sinh học tảo Scenedesmus sp. 29
4.3 Nhân vùng gene ITS-1 và xác định trình tự 30
4.4 Định danh bằng so sánh trình tự 32
4.5 Chiết rút các thành phần hợp chất và tách phân đoạn 33
4.6 Khả năng kháng vi khuẩn và nấm của dịch chiết 34
PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 39
5.1 Kết luận 39
5.2 Đề nghị 39
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU

S. quadricauda Scenedesmus quadricauda
X. oryzae pv oryzae Xanthomonas oryzae pv oryzae
R. solanacearum Ralstonia solanacearum
H. maydis Helminthosporium maydis
S. aureus Staphylococcus aureus
S. epidermidis Staphylococcus epidermidis
E. coli Escherichia coli
S. platensis Spirulina platensis
C. vulgaris Chlorella vulgaris
E. viridis Euglena viridis
C. reinhardtii Chlamydomonas reinhardtii
O. sancta Oscillatoria sancta
S. grantiana Spirogyra grantiana
D. olivaceous Desmococcus olivaceous
C. humicola Chlorococcum humicola
T. erythraeum Trichodesmium erythraeum
C. disperses Chroococcus disperses
C. ellipsoidea Chlorella ellipsoidea
C. grovesii Chara grovesii
C. callicoma Cladophora callicoma
H. reticulatum Hydrodictyon reticulatum
S. leibleinii Schizomeris leibleinii

P. corium Phormidium corium
S. bijugatus Scenedesmus bijugatus
S. obliquus Scenedesmus obliquus


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


vi

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT Tên bảng Trang

Bảng 2.1: Khả năng kháng vi khuẩn của dịch chiết một số loài vi tảo 9
Bảng 2.2: Khả năng kháng vi nấm của vi tảo 11
Bảng 2.3. Khả năng kháng vi khuẩn và nấm bệnh của vi tảo Scenedesmus 14



Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


vii

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

3.1 Vị trí đoạn ITS1 21

3.2 Cấu tạo của máy chiết Soxhlet 22
3.3 Chiết rút phân đoạn bằng n- hexan và ethyl ether 23
4.1 Phân lập tảo Scenedesmus 28
4.2 Hình thái của chủng tảo Scenedesmus sp. 29
4.3 Đồ thị sinh trưởng của tảo Scenedesmus sp. 30
4.4 Kết quả nhân đoạn ITS1 của tảo Scenedesmus sp. 30
4.5 Kết quả đọc trình tự vùng ITS1 32
4.6 Kết quả BLAST đoạn ITS1 tảo Scenedesmus sp. với cơ sở dữ liệu
NCBI 33
4.7 Thành phần các nhóm chất trong dịch chiết 34
4.8 Biểu đồ khả năng kháng vi khuẩn R. solanacearum của dịch chiết tảo
S. quadricauda trong các dung môi 35
4.9 Khả năng kháng vi khuẩn R. solanacearum của dịch chiết tảo S.
quadricauda 35
4.10 Biểu đồ khả năng kháng vi khuẩn X. oryzae pv oryzae của dịch chiết
tảo S. quadricauda 36
4.11 Khả năng kháng vi khuẩn X. oryzae pv oryzae của dịch chiết tảo S.
quadricauda 36
4.12 Biểu đồ khả năng kháng nấm H. maydis của dịch chiết tảo S. quadricauda 37
4.13 Khả năng kháng nấm H. maydis của dịch chiết tảo S. quadricauda 37



Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


1

PHẦN I
MỞ ðẦU

1.1. ðặt vấn ñề
Trong số các loài tảo được biết hiện nay, vi tảo (microalgae) chiếm tỉ lệ
lớn, đa dạng về thành phần loài và phân bố rộng trong đó có khoảng hơn 1400
loài tảo nước ngọt và 530 loài tảo nước mặn [Dương Đức Tiến, Võ Hành, 1997;
Phạm Bình Quyền et al., 2002]. Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy một số loài
vi tảo nước ngọt chứa các hoạt chất sinh học có tác dụng kháng virus, vi khuẩn
và nấm, trong đó bao gồm một số loài thuộc chi Scenedesmus [Beena et al.,
2011, Vinay Kumar et al., 2013], Spirulina [Justella et al., 2011; Sayda et al.,
2012, Hemtanon et al., 2005], Chlorella [Fabian et al., 2013]. Với sự phong phú
và đa dạng về thành phần loài, việc khai thác các hợp chất tự nhiên từ vi tảo có
thể mở ra hướng nghiên cứu sử dụng các hợp chất này chống lại vi khuẩn và nấm
gây bệnh, đặc biệt trong nông nghiệp.
Trong sản xuất nông nghiệp, nhất là đối với các cây trồng có ý nghĩa kinh tế
như lạc, cà chua, khoai tây vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh rất nghiêm
trọng. Đây là bệnh phổ biến và gây tổn thất nghiêm trọng làm giảm đáng kể đến
năng suất và chất lượng của nông sản phẩm [Nguyễn Tất Thắng et al., 2011]. Ngoại
trừ việc sử dụng một số chế phẩm kháng sinh và các biện pháp canh tác, cho đến
nay vẫn chưa có biện pháp phòng trừ bệnh héo xanh hiệu quả.
Một số tác nhân gây bệnh hại cây trồng nghiêm trọng khác hiện nay phải kể
đến đó là vi khuẩn X. oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lá lúa. Bệnh bạc lá lúa do vi
khuẩn X. oryzae pv oryzae đã trở thành một trong những bệnh tàn phá nghiêm
trọng những giống lúa hiện nay, cây lúa bị nhiễm bệnh trong giai đoạn đẻ nhánh
mạnh sẽ bị giảm năng suất từ 20 đến 40%, nếu nhiễm ở giai đoạn đầu gây suy giảm
năng suất lên đến 50% [Jeung Ju, 2006]. Nấm H. maydis gây bệnh đốm lá nhỏ ở
ngô làm tổn thương lá, gây ảnh hưởng đến khả năng quang hợp và làm giảm năng
suất [Abdel, 2012; Farhan et al., 2012]. Cho đến nay biện pháp phòng và trị bệnh
hiệu quả nhất là sử dụng thuốc hóa học. Tuy nhiên việc sử dụng thuốc hóa học hiện
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

2

nay đã gây ra hiện tượng kháng thuốc, ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng đến sức
khỏe con người.
Với sự đa dạng lớn về các loài vi tảo nước ngọt, việc nghiên cứu khả năng
kháng vi khuẩn và nấm của các hợp chất tự nhiên tách chiết từ các loài vi tảo sẽ góp
phần phát triển các chế phẩm ứng dụng trong bảo vệ thực vật. Trong số các loài tảo
nước ngọt, tảo S. quadricauda phân bố ở hầu hết các thủy vực nước ngọt và nước
lợ, có tốc độ sinh trưởng nhanh dễ thích nghi với các điều kiện môi trường tự nhiên
[Đặng Thị Thanh Hòa et al., 2007; Dương Đức Tiến, Võ Hành, 1997]. Ngoài ra tảo
S. quadricauda có khả năng sinh trưởng trong môi trường dinh dưỡng đơn giản, kể
cả trong các thủy vực ô nhiễm và dễ dàng nuôi trồng ở quy mô lớn. Xuất phát từ
thực tế đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Phân lập và khảo sát khả năng kháng một
số vi khuẩn và nấm bệnh của vi tảo Scenedesmus quadricauda”.
1.2. Mục ñích và yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Nghiên cứu này nhằm phân lập và khảo sát khả năng kháng vi khuẩn X.
oryzae pv oryzae, R. solanacearum và nấm H. maydis của các loại dịch chiết vi tảo
S. quadricauda.
1.2.2. Yêu cầu
- Phân lập và định danh được vi tảo S. quadricauda
- Đánh giá được khả năng kháng vi khuẩn X. oryzae pv oryzae, R.
solanacearum, và nấm H. maydis của các loại dịch chiết vi tảo S. quadricauda.
- Phân tách được nhóm chất kháng khuẩn có trong dịch chiết bằng sắc ký
lớp mỏng.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


3

PHẦN II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu chung về vi tảo
Vi tảo (Microalgae) bao gồm tất cả các loại tảo (Algae) có kích thước hiển
vi, phân bố rộng rãi trong các thủy vực từ nước ngọt đến nước mặn. Vi tảo rất đa
dạng, trong khoảng 50.000 loài tảo đã được trên thế giới thì vi tảo chiếm 2/3 tức là
khoảng 33.300 loài [Nguyễn Lân Dũng, 2000], được xếp chủ yếu vào 5 ngành sau:
(1) Ngành Tảo lục (Chlorophyta): gồm các chi Closterium, Coelastrum,
Dyctyosphaerium, Scenedesmus, Pediastrum, Staurastrum, Dunaliella,
Chlamydomonas, Haematococcus, Tetraselmis, Chlorella,
(2) Ngành Tảo lông roi lệch (Heterokontophyta): gồm các chi Melosira,
Asterionella, Cymatopleurra, Somphonema, Fragilaria, Stephanodiscus, Navicula,
Malomonas, Dinobryon, Peridinium, Isochrysis, Chaetoceros, Phaeodactylum,
Skeletonema, Nitzschia
(3) Ngành Tảo mắt (Euglenophyta): gồm các chi Phacus, Trachelomonas,
Ceratium
(4) Ngành Tảo đỏ (Rhodophyta): gồm các chi Porphyridium, Rhodella
(5) Vi khuẩn lam (Cyanophyta): gồm các chi Spirulina, Anabaena…
2.1.1. Hình thái cơ thể, cấu trúc và sinh sản
Hình thái cơ thể của vi tảo rất đa dạng, thông thường có 6 loại hình thái cơ
bản [Nguyễn Lân Dũng, 2000]:
- Kiểu Monad: Tảo đơn bào, sống đơn độc hay thành tập đoàn, chuyển động
nhờ lông roi.
- Kiểu Pamella: Tảo đơn bào, không có lông roi, cùng sống chung trong bọc
chất keo thành tập đoàn dạng khối có hình dạng nhất định hoặc không. Các tế bào
trong tập đoàn không có liên hệ phụ thuộc nhau.
- Kiểu Hạt: Tảo đơn bào , không có lông roi, sống đơn độc.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

4

- Kiểu Tập đoàn: Các tế bào sống thành tập đoàn và giữa các tế bào có liên
hệ với nhau nhờ tiếp xúc trực tiếp hay thông qua các sợi sinh chất.
- Kiểu Sợi: Cấu tạo thành tản (thallus) đa bào do tế bào chỉ phân đôi theo
cùng một mặt phẳng ngang, sợi có phân nhánh hoặc không.
- Kiểu Bản: Tản đa bào hình lá do tế bào sinh trưởng ở đỉnh hay ở gốc phân
đôi theo các mặtphẳng cả ngang lẫn dọc. Bản cấu tạo bởi một hay nhiều lớp tế bào.
Vi tảo bao gồm hai nhóm: nhóm có cấu tạo tế bào Prokaryote hay còn gọi là
vi khuẩn lam (Cyanobacteria) và nhóm có cấu tạo tế bào Eukaryote, sống chủ yếu
bằng hình thức quang tự dưỡng, một số dị dưỡng. Tế bào tảo chứa sắc lạp
(chromoplast) có cấu tạo như ở thực vật, bên trong là các túi thylakoid chứa sắc tố
và các enzyme để thực hiện quang hợp. Sắc tố quang hợp của vi tảo là diệp lục
chlorophyll và carotene, tuy nhiên nhiều loài vi tảo còn có xanthophyll và
phycobillin.
Hình thức sinh sản của vi tảo chủ yếu là vô tính bằng cách phân đôi, sinh
dưỡng hoặc bào tử. Ngoài sinh sản vô tính thì nhiều loài vi tảo còn có khăng sinh
sản hữu tính bằng cách tiếp hợp.
2.1.2. Vai trò của vi tảo
Tảo nói chung và vi tảo nói riêng có vai trò rất quan trọng trong tự nhiên và
trong đời sống nhân loại. Hàng năm tảo có thể tổng hợp ra trong đại dương 70-280
tỷ tấn chất hữu cơ, trong các thủy vực nước ngọt tảo cung cấp ôxy và hầu hết thức
ăn cho cá và các động vật thủy sinh khác. Tảo góp phần bảo vệ môi trường nuôi
thủy sản bằng cách tiêu thụ bớt lượng muối khoáng dư thừa. Đối với đời sống con
người tảo có rất nhiều vai trò đang được khai thác ứng dụng cũng như những tiềm
năng đang được nghiên cứu.
a, Nguồn dinh dưỡng từ vi tảo
Có rất nhiều loài vi tảo đang được khai thác làm nguồn thực phẩm cho con

người và vật nuôi. Điển hình là các loài tảo thuộc chi Spirulina, Chlorella với hàm
lượng protein cao dao động từ 51-71% trọng lượng khô (Spirulina) [Babadzhanov
et al., 2004], 45% (Chlorella) [Belasco and Warren, 1997]. Các nghiên cứu cho
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


5

thấy không phát hiện bất kỳ một độc tố nào trên các đối tượng tảo thuộc chi
Spirulina, Chlorella, Scenedesmus.
Ngoài protein, vitamin trong tảo cũng rất phong phú và có hàm lượng cao
hơn so với nhiều loài sinh vật khác. Khả năng tổng hợp một số loại vitamin ở tảo
mạnh hơn rất nhiều so với ở gan người, rau chân vịt, nấm men… như khả năng tổng
hợp vitamin ở S. platensis (Vitamin A – 840 mg/ngày, B1 – 44 mg/ngày, C – 80
mg/ngày), Scenedesmus quadricauda (Vitamin A – 554 mg/ngày, B1 – 11,5
mg/ngày, C – 396 mg/ngày) [Becker, 2004].
Phân tích 40 loài tảo thuộc 7 lớp (Bacillariophyceae, Chlorophyceae,
Prymnesiophyceae, Cryptophyceae, Eustigmatophyceae, Rhodophyceae, Prasino-
phyceae) đã xác định rằng trong các loài vi tảo trên hàm lượng protein dao động từ
6 – 52%; carbohydrate từ 5 – 23% và lipid từ 7 – 23%. Các lớp tảo khác nhau
không có sự khác biệt nhiều về hàm lượng protein và lipid, nhưng các loài trong lớp
tảo Chlorophyceae và Prymnesiophyceae giàu hàm lượng carbohydrate hơn các loài
thuộc các lớp tảo khác [Brown et al., 1997].
Giá trị dinh dưỡng của vi tảo có thể bị thay đổi rất lớn ở các pha phát triển và
dưới các điều kiện nuôi khác nhau [Enright et al., 1986; Brown et al., 1997]. Kết
quả một nghiên cứu khác chỉ ra rằng tảo phát triển đến cuối pha logarit thường chứa
30 – 40% protein, 10 – 20% lipid và 5 – 15% carbohydrate [Renaud et al., 1999].
Khi tảo được nuôi qua pha cân bằng thì hàm lượng này bị thay đổi rất lớn, ví dụ
như: khi nitrat giảm thì hàm lượng carbohydrate có thể tăng gấp 2 lần hàm lượng
protein. Mối liên quan giữa giá trị dinh dưỡng của tảo với hàm lượng lipid tổng

cộng, carbohydrat, và protein không được thể hiện rõ [Webb and Chu, 1981;
Brown, 2002], ví dụ 2 loài tảo Phaeodactylum tricornutum và Nannochloris atomus
giàu hàm lượng protein và carbohydrate nhưng các thành phần vitamin, lipid,
khoáng chất của chúng lại thấp.
Đến nay, tất cả các nghiên cứu đều xác định rằng mỗi loài tảo khác nhau thì
chúng có giá trị dinh dưỡng khác nhau. Một loài tảo có hàm lượng nhiều loại chất
dinh dưỡng cao nhưng có thể thiếu ít nhất là một thành phần dinh dưỡng cần thiết,
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


6

nên việc khai thác dinh dưỡng từ vi tảo đang có sự tập trung khai thác vào đối tượng
cụ thể với các thành phần dinh dưỡng nổi trội của chúng như: protein (Spirulina),
lipid (Scenedesmus)…
b, Nhiên liệu sinh học từ vi tảo
Trong bối cảnh sự cạn kiệt dần của năng lượng hóa thạch, nhiều giải pháp đã
được đưa ra đó là sản xuất nhiên liệu từ ngũ cốc: ngô, sắn, khoai, đậu nành… tuy
nhiên gây ảnh tăng giá lương thực và làm ảnh hưởng đến an ninh lương thực.
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh lipid có trong tảo có thể sử dụng làm nhiên liệu
sinh học, tuy nhiên việc chiết xuất lipid ra khỏi tế bào vi tảo gặp nhiều khó khăn.
Một số nước đã ứng dụng thành công sản xuất dầu sinh học từ vi tảo đó là Nhật Bản
và Mỹ.
Dầu sinh học sản xuất từ vi tảo có nhiều ý nghĩa to lớn và có tính phát triển
bền vững cao, một mặt sản xuất nhiên liệu làm năng lượng, một mặt tiêu hao lượng
khí thải CO
2
trong quá trình nuôi trồng. Một số chủng tảo có khả năng tổng hợp và
tích lũy lipid cao như C. vulgaris (40% trọng lượng khô), Scenedesmus (40 – 55% ),
Dunaliella salina (10 -20%) [Yusuf, 2007]. Ở một số điều kiện nuôi cấy, thành

phần lipid tích lũy trong tảo có thể lên tới 80% trọng lượng khô [Metting, 1996;
Spolaore et al., 2006], tạo điều kiện thuận lợi cho việc sản xuất dầu sinh học.
C, khai thác hoạt chất sinh học từ vi tảo
Nhiều báo cáo nghiên cứu thành phần các hợp chất có trong vi tảo rất phong
phú, trong đó nổi trội là các nghiên cứu về các hoạt chất có khả năng chống oxy hóa
như Astaxanthin. Tác dụng chống lão hóa của Astaxanthin được cho là mạnh hơn
550 lần so với vitamin E và 6000 lần so với vitamin C. Việc khai thác astaxanthin
hiện nay các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu vào đối tượng vi tảo
Haematococcus pluvialis, loại vi tảo này chứa hàm lượng hoạt chất astaxanthin rất
cao 5,7 mg/g tảo khô [Dragos et al., 2010].
Sử dụng ethanol để chiết các hợp chất tự nhiên của tảo C. vulgaris và S.
platensis, dich chiết sau đó được thử nghiệm và cho dương tính khả năng kháng
in vitro tế bào ung thư gan, ngăn chặn được sự sinh sản của các tế bào ung thư
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


7

trên đĩa nuôi cấy [Mohd Syahril et al., 2011]. Nhiều báo cáo khác cũng cho thấy
phát hiện trong các loài vi tảo chứa các hoạt chất có khả năng kháng các tế bào
ung thư, như loài tảo Phaedactylim tricornutum, Nannchloropsis oculata
[Samarakoon et al., 2013], Cladophora glomerata, Microspora floccose
[Ratiphan and Warawut, 2013]…
Gần đây, ngày càng có nhiều nghiên cứu chứng minh trong vi tảo còn chứa
nhiều hoạt chất sinh học có tác dụng như chất kháng sinh có khả năng kháng vi
khuẩn và vi nấm, đã mở ra một hướng nghiên cứu mới trong việc phòng trừ các
bệnh do vi khuẩn và vi nấm gây ra.
2.2. Khả năng kháng vi khuẩn và nấm bệnh của vi tảo
Từ những năm 40 của thế kỷ trước việc sử dụng các chất kháng sinh chiết
xuất từ nấm mốc, vi khuẩn đã tỏ ra hiệu quả trong việc trừ các vi khuẩn và nấm gây

bệnh. Tuy nhiên những năm gần đây, những chất kháng sinh cổ điển không còn hữu
dụng bởi sự gia tăng khả năng kháng lại kháng sinh của tác nhân gây bệnh. Phương
hướng giải quyết đó chính là tìm ra các loại kháng sinh mới, từ những nguồn cung
cấp mới thay vì sử dụng các nguồn cũ, và vi tảo là đối tượng đang được nhiều nhà
nghiên cứu quan tâm và ứng dụng trong việc sản xuất các chất kháng sinh mới.
2.2.1. Khả năng kháng vi khuẩn của vi tảo
Phát hiện về khả năng kháng vi khuẩn của vi tảo được Pratt công bố đầu tiên
vào năm 1944 khi ông nghiên cứu về tảo Chlorella. Pratt đã tiến hành sử dụng các
thành phần dịch chiết của tảo Chlorella và xử lý một số chủng vi khuẩn, kết quả cho
thấy một hỗn hợp các acid béo có trong tảo có khả năng đối kháng cả vi khuẩn
Gram – và Gram + [Pratt et al., 1944].
Đến năm 1994 đã phát hiện trên loài tảo Chlorococcum hs-101 chứa một
loại acid béo là linolenic có khả năng kháng lại vi khuẩn S. aureus. S. aureus là
loại vi khuẩn gây nhiễm trùng có khả năng kháng lại một số kháng sinh thông
thường [Ohta et al., 1994]. Cũng với nghiên cứu trên vi khuẩn S. aureus, một công
bố khác đã phát hiện thêm các acid béo có trong tảo Phaeodactylum tricornutum có
khả năng kháng với loài vi khuẩn này ở nồng độ rất nhỏ. Các acid béo đó là
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


8

palmitoleic, hexadecatrienoic và eicosapentaenoic [Desbois et al., 2008; Desbois et
al., 2009]. Dịch chiết bằng dung môi methanol từ Haematococcus pluvialis trong
giai đoạn đỏ (giai đoạn kích thích sinh tổng hợp astaxanthin) có hoạt tính chống lại
vi khuẩn E. coli và vi khuẩn S. aureus, điều này lại một lần nữa chứng minh có sự
hiện diện của acid béo chuỗi ngắn, cụ thể butanolic và methyllactic acid trong khả
năng kháng lại vi khuẩn [Santoyo et al., 2009].
Tuy nhiên không chỉ các acid béo có trong tảo mới có hoạt tính kháng khuẩn,
Rodríguez Meizoso đã chứng minh bằng thực nghiệm rằng các hợp chất terpene

như α- ionone, β-ionone, neophytadiene có trong loài vi tảo thuộc chi Phormidium
có khả năng kháng lại vi khuẩn, nấm men và nấm mốc [Meizoso et al., 2008].
Những năm gần đây có rất nhiều công trình nghiên cứu về khả năng kháng vi
khuẩn của vi tảo mà tác giả chủ yếu sử dụng các dung môi để tiến hành chiết và thu
dịch chiết có khả năng kháng với đối tượng thử nghiệm. Kết quả đã có nhiều báo
cáo về khả năng kháng vi khuẩn của dịch chiết các loài vi tảo đã được công bố (Thể
hiện ở bảng 2.1). Những dung môi thường được sử dụng thu dịch chiết đó là
methanol, acetone, diethyl ether, hexan, nước… Các kết quả cho thấy thành phần
các chất trong vi tảo rất phong phú, việc lựa chọn ra dung môi thích hợp để thu
được dịch chiết có khả năng kháng với đối tượng thử nghiệm mang tính chất quyết
định đến kết quả của thí nghiệm.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


9

Bảng 2.1: Khả năng kháng vi khuẩn của dịch chiết một số loài vi tảo
Loài tảo Loại dịch chiết ðối tượng vi khuẩn Tài liệu tham khảo
E. viridis
Dịch chiết hữu
cơ
Pseudomonas,
Aeromonas,
Edvardsiella, Vibrio,
E. coli
[Das et al., 2005]
C. reinhardtii
C. vugaris
Methanol và
hexane

S. aureus, S.
epidermidis, Bacillus
subtilis, E. coli,
Salmonella typhi
[Ghasemi et al.¸2007]


S. platensis

Methanol
S.aureus, E. coli,
Salmonella typhi,
Pseudomonas
aeruginosa
[Kaushik and
Chauhan, 2008]
Methanol
S. aureus, Proteus
vulgaris, Pseudomonas
mirabilis
Ethanol S.aureus
O. sancta
Hexane S.aureus
S. grantiana Ethanol
E. coli, Proteus
vulgaris, Pseudomonas
mirabilis
[Justella et al., 2011]
Scenedesmus sp.
Nước, ethanol,

diethyl ether,
hexane
Shigella sp.,
Pseudomonas sp.,
Xanthomonas oryzae
[Beena et al., 2011]
D. olivaceous, C.
humicola
Acetone, ethanol,
methanol
Klebsiella pneumonia,
Pseudomonas sp.,
Vibrio cholera,
Streptococcus
pyogenes, E. coli, S.
aureus
[Uma et al., 2011]
T. erythraeum
Hexane, ethyl
acetate
Erwinia amylovora,
Klebsiella pneumonia,
Enterococcus faecalis
[Kasinathan et al.,
2009]
C. disperses, C.
reinhardtii, C.
ellipsoidea
Methanol,
hexane

S. aureus, S.
epidermidis, Bacillus
subtilis
[Ghasemi et al., 2007]
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


10

Ngoài việc thử khả năng kháng khuẩn của dịch chiết vi tảo, một số tác giả
còn so sánh với tác dụng của kháng sinh. Younes Ghasemi đã thử nghiệm và so
sánh khả năng kháng khuẩn của dịch chiết loài vi tảo Chroococcus disperses với hai
loại kháng sinh ampicillin và Gentamicin. Kết quả cho thấy dịch chiết methanol và
hexane của tảo có khả năng kháng mạnh hơn hai loại kháng sinh trên khi xử lý với
các chủng vi khuẩn S.aureus, S. epidermidis, Bacillus subtilis, E. coli, Samonella
staphy [Ghasemi et al., 2007].
2.2.2. Khả năng kháng vi nấm của vi tảo
Việc nghiên cứu về khả năng kháng nấm không có nhiều bước tiến so với
nghiên cứu về khả năng kháng vi khuẩn, nguyên nhân có thể là do những năm trước
đây các tác nhân gây bệnh bắt nguồn từ vi nấm không được công nhận là quan
trọng. Tuy nhiên càng về sau tác hại của nấm càng thể hiện rõ ràng trên người cũng
như cây trồng và vật nuôi, đặc biệt là sau khi con người sử dụng tràn lan các kháng
sinh phổ rộng và sự suy giảm miễn dịch do nhiễm virus HIV. Sự gia tăng các bệnh
liên quan đến vi nấm ngày một nhiều và khó điều trị hơn, đòi hỏi một nỗ lực tìm
kiếm những chất có khả năng ức chế nấm bệnh an toàn và hiệu quả hơn.
Khả năng đối kháng vi nấm của vi tảo mới được nghiên cứu rộng rãi trong
những năm gần đây, một số kết quả đáng chú ý được trình ở bảng 2.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

11

Bảng 2.2: Khả năng kháng vi nấm của vi tảo
Loài tảo Hoạt chất ðối tượng vi nấm Tài liệu tham khảo
C. reinhardtii
Dịch chiết
methanol
Cadida kefir,
Aspergillus niger,
Aspergillus fumigatus
[Ördög et al., 2004]
Amphidinium sp. Karatungiol
Aspergillus niger,
Trichomonas foetus
[Washida et al., 2006]
C. dispersus
Dịch chiết
Methanol,
hexane
Cadida albicans,
Aspergillus niger,
Aspergillus fumigatus,
Cadida kefir
[Ghasemi et al., 2007]
C. pyrenoidosa, S.
quadricauda
Dịch chiết
Ethanol, Diethyl
ether, methanol,
acetone

Aspergillus niger,
Aspergillus flavus,
Penicillium herquei,
Fusarium moniliforme,
Helminthosporium sp.,
Alternaria brassicae,
Saccharomyces
cerevisiae, Cadida
albicans
(Abedin et al., 2008)
H. pluvialis
Acid butanoic và
methyl lactate
Cadida albicans [Santoyo et al., 2009]
C. grovesii, C.
callicoma, H.
reticulatum, S.
leibleinii, P.
corium
Dịch chiết bằng
nước
Altermaria altermate,
Aspergillus flavus,
Curvularia lunata,
Fussarium roseum,
Trichodema
harzianum
[Kamble et al., 2012]

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

12

Khả năng kháng vi nấm của tảo bản chất là do hoạt chất Steroid, phenolic và
polyketide, các hoạt chất này có tác dụng lên thành tế bào nấm gây ức chế các kênh
vận chuyển ở màng tế bào của cả nấm men và nấm mốc (Mayer et al., 2009). Trong
thử nghiệm khác đã tiến hành so sánh khả năng kháng nấm của vi tảo với một loại
kháng sinh kháng nấm là amphotericin B. Kết quả thử nghiệm trong phòng thí
nghiệm cho thấy các loại dịch chiết của vi tảo có khả năng kháng nấm mang tính
tương đối chọn lọc, nhiều loại dịch chiết vi tảo cho kết quả đối kháng mạnh hơn so
với amphotericin B, và có phổ tác động hẹp hơn so với loại kháng sinh này
[Ghasemi et al., 2007].
Những nghiên cứu về khả năng kháng nấm của vi tảo đang dần định ra
hướng sản xuất các loại hoạt chất kháng nấm có phổ hẹp, hoạt lực mạnh, sẽ là một
bước tiến quan trọng trong nỗ lực tìm kiếm các hoạt chất chống lại bệnh do nấm
một cách bền vững và an toàn.
2.3. Tổng quan về vi tảo Scenedesmus quadricauda
2.3.1. Vị trí phân loại
S. quadricauda là một loài thuộc chi Scenedesmus, họ Scenedesmaceae, bộ
Chlorococcales, lớp Chlorophyceae, ngành tảo lục Chlorophyta, giới thực vật. Cấu
tạo cơ thể vi tảo S. quadricauda dạng cộng đơn bào, không có roi, sinh sản vô tính
bằng tự bào tử và không có khả năng di động.
2.3.2. ðặc ñiểm hình thái, cấu trúc và sinh sản của vi tảo Scenedesmus
quadricauda
Cơ thể vi tảo S. quadricauda có cấu trúc dạng cộng đơn bào gồm 2 - 4 – 8, ít
khi là 16 tế bào là bản phẳng hoặc cong, hình thành từ 2 – 8, ít khi là 16 tế bào. Tế
bào hình trụ, ovan hoặc ovan kéo dài xếp thành cùng một hàng, kích thước mỗi tế
bào dài từ 5-22µm, rộng từ 2,5 - 9 µm, đầu tế bào nằm ngoài có 1 hoặc 2 gai thẳng.
Tế bào tảo S. quadricauda có cấu tạo giống như tế bào các loài tảo khác

thuộc bộ tảo lục Chlorococcales, bao gồm 3 phần chính: Thành tế bào, tế bào chất
và nhân tế bào. Thành tế bào tảo S. quadricauda được cấu tạo từ cellulose và không
phân lớp rõ ràng. Tế bào chất là nơi thực hiện các trao đổi chất giữa các phần sống
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


13

của tế bào, chứa hơn 50% là nước, hợp chất hữu cơ chính là protein, ngoài ra còn
chứa lipid, carbonhydrate, vitamin và một số chất vô cơ. Cũng giống như cấu tạo tế
bào nhân thực khác, tế bào chất tảo S. quadricauda chứa các bào quan: khung tế
bào, ty thể, thể golgi, lạp thể, ribosome, mạng lưới nội chất. Lục lạp là bào quan
thực hiện chức năng quang hợp của tảo, bên trong lạp lục chứa diệp lục Chlorophyl
a,b,c,d và e giống như ở thực vật bậc cao, chỉ khác về hình dạng bào quan và sự sắp
xếp của các lớp màng thylakoid trong lục lạp [Dương Đức Tiến, Võ Hành, 1997].
Tảo S. quadricauda sinh sản chủ yếu theo hình thức sinh sản vô tính bằng
các tự bào tử (autospore). Các tự bào tử ở trong tế bào mẹ tập hợp thành một
coenobium hoặc rời rạc thành các tế bào đơn. Sau khi màng tế bào mẹ vỡ ra toàn bộ
các tự bào tử chui ra ngoài thành các cơ thể mới giống tế bào mẹ. Các gai cũng
được hình thành ngay trong cơ thể mẹ trước khi các tự bào tử được giải phóng.
Hình thức sinh sản hữu tính rất hiếm khi xuất hiện [Francis, 1996].
2.3.3. Sự phân bố của vi tảo Scenedesmus quadricauda
Vi tảo S. quadricauda phân bố dưới dạng trôi nổi và đáy của các thủy vực
nước ngọt và nước lợ khắp nơi trên thế giới. Những nghiên cứu về sự phân bố của
tảo thuộc chi Scenedesmus nói chung và loài S. quadricauda nói riêng được thực
hiện từ những năm 80 của thế kỷ XX. . Ở Tây Ban Nha có nhiều nghiên cứu đã
công bố sự có mặt của loài tảo này trên các thủy vực nước ngọt [Aboal et al., 1984;
Aboal Sanjurjo et al., 1988]. Một số các nước khu vực Bắc Mỹ và Nam Mỹ có
thành phần vi tảo thuộc chi Scenedesmus phong phú, trong đó có sự có mặt của vi
tảo S. quadricauda [Smith et al., 2010; Helbling et al., 2001]. Nhiều vùng ở khu

vực Châu Á như Trung Quốc, các nước Đông Nam Á có điều kiện thuận lợi cho sự
sinh trưởng và phát triển của tảo S. quadricauda, sự có mặt loài tảo này ở đây rất
phổ biến và mật độc cũng cao [Hu Wei et al., 2006; Phạm Minh Nguyệt et
al.,2011].
Ở Việt Nam, tảo S. quadricauda phân bố chủ yếu ở các thủy vực nước đứng,
và ít gặp hơn ở các thủy vực nước chảy [Dương Đức Tiến, Võ Hành, 1997]. Các
phát hiện về sự có mặt của tảo S. quadricauda ở Việt Nam cho thấy sự có mặt của
loài tảo này phổ biến ở các thủy vực nước ngọt và nước lợ trong nước: Hà Nội, Hà
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


14

Tĩnh, Quảng Bình, Tây Nguyên, Quảng Trị, Tuyên Quang [Dương Đức Tiến, Võ
Hành, 1997], Đà Lạt [Dương Đức Tiến, Trần Thị Tình, 2001]…
2.4. Khả năng kháng vi khuẩn và nấm bệnh của vi tảo Scenedesmus
quadricaida
Tảo thuộc chi Scenedesmus hiện nay đang được quan tâm nghiên cứu nhiều
về khả năng sản xuất dầu sinh học (Biofuel), theo Prabakaran (2012) tảo
Scenedesmus có thể sinh ra lượng lipid chiếm đến 27,4% trọng lượng khô, sẽ là
hướng giải quyết đầy hứa hẹn vấn đề năng lượng trong tương lai gần. Những nghiên
cứu gần đây còn chứng minh rất nhiều loài tảo thuộc chi Scenedesmus có khả năng
kháng khuẩn, một số kết quả tiêu biểu được trình bày ở bảng 2.3.
Bảng 2.3. Khả năng kháng vi khuẩn và nấm bệnh của vi tảo Scenedesmus
Loài tảo ðối tượng Hoạt chất
Tài liệu tham
khảo
S. bijugatus
Staphylococcus
aureus, Escherichia

coli and Candida albicans
Methyl este
[Ali et al.,
2012]
Scenedesmus sp.
Shigella sp., Pseudomonas
sp., Xanthomonas oryzae
Dịch chiết acetone,
methanol, ethanol,
diethyl ether,
dichloro methane,
hexane, nước nóng
và nước lạnh.
[Beena et al.,
2011]
S. obliquus 019
Staphylococcus aureus,
Bacillus subtilis, Salmonella
typhi, Candida kefyr,
Aspergillus fumigatus,
Aspergillus niger.
Dịch chiết
methanol
[Ghasemi et al.,
2007]
Scenedesmus sp.
S25;
Scenedesmus sp.
S39;
Scenedesmus sp.

S59
Bacillus cereus RSKK863
Candida albicans
Dịch chiết
methanol, dịch
chiết nước
[Sahlan Ozturk
et al.,2006]
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


15

Tảo S. quadricauda cũng là một trong các loài thuộc chi Scenedesmus đã
được nghiên cứu về khả năng kháng vi khuẩn và nấm bệnh. Một số loại dịch chiết
tảo S. quadricauda được tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng một số loài vi khuẩn
và nấm bệnh trong điều kiện phòng thí nghiệm, kết quả cho thấy các loại dịch chiết
acetone, diethyl ether và methanol đều cho hoạt tính kháng các loại vi khuẩn E. coli,
B. subtilis, S. aureus, P. aeruginosa và các loại nấm A. niger, A. flavus, Penicillium
herquei, F. monilifome, Helminthosporium sp., Alternaria brassicae,
Saccharomyces cerevisiae, C. albicans. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết tảo
được so sánh với một số loại kháng sinh phổ rộng và nhiều loại dịch chiết cho hoạt
tính kháng mạnh hơn các loại kháng sinh erythromycin, tetracyline, amoxicillin,
itraconazole và polynoxylin khi xử lý với một số đối tượng [Abedin et al., 2008].
Một nghiên cứu khác vào năm 2011 đã tiến hành chiết dịch tảo S.
quadricauda bằng nước cất vô trùng, sau đó dịch chiết được tiến hành xử lý với 4
chủng nấm Trichophyton rubrum, A. flavus, Microsporium canis và Cryptococcus
neoformans. Kết quả cho thấy ở các nồng độ dịch chiết 400, 600, 1000 và 1500
µg/ml đều cho hoạt tính kháng với các chủng nấm trên. Hoạt tính kháng mạnh nhất
của dịch chiết thể hiện ở nồng độ 1500 µg/ml khi xử lý với nấm Cryptococcus

neoformans với vòng kháng khuẩn là 33mm [Hussain, 2011]. Dịch chiết của chủng
tảo S. quadricauda phân lập tại sông Pennsilvania, Hoa Kỳ cũng được nghiên cứu
hoạt kháng in vitro vi khuẩn Bacillus thuringiensis [Stephens et al., 2004].
Nhiều báo cáo cho thấy khả năng kháng khuẩn của Scenedesmus có được là
do các acid béo, tuy nhiên bằng việc sử dụng các dung môi khác nhau để thu dịch
chiết nội và ngoại bào của tảo này thì vẫn cho kết quả kháng khuẩn. Như vậy ngoài
các hoạt chất kháng khuẩn là acid béo, tảo Scenedesmus còn chứa nhiều loại hoạt
chất khác có khả năng kháng nhiều loại vi khuẩn và nấm khác nhau.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


16

PHẦN III
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1. Vật liệu, thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu
3.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Vi tảo S. quadricauda được phân lập ở xã Cổ Bi, huyện Gia Lâm, thành phố
Hà Nội.
Một số chủng vi khuẩn, nấm bệnh:
- Vi khuẩn X. oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lá ở lúa và Nấm H. maydis gây
bệnh đốm lá ở ngô.
- Vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh ở cà chua được cung cấp
bởi Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ ứng dụng, Khoa Công nghệ sinh học,
Đại học Nông nghiệp Hà Nội.
Các vật liệu tác dòng bao gồm chủng vi khuẩn E. coli DH5α, vector tách
dòng pJET2.1.
3.1.2. ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu

Các nội dung nghiên cứu được tiến hành tại Bộ môn Sinh học phân tử và
Công nghệ ứng dụng, khoa Công nghệ sinh học và Trung tâm Bảo tồn và phát triển
nguồn gen cây trồng, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội.
Thời gian thực hiện nghiên cứu từ tháng 01 tháng 5 năm 2013 đến 01 tháng 3
năm 2014.
3.2. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Phân lập và định danh vi tảo S. quadricauda
Nội dung 2: Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn X. oryzae pv oryzae, R.
solanacearum và nấm H. maydis của các loại dịch chiết vi tảo S. quadricauda.
Nội dung 3: Phân tách và xác định các nhóm hoạt chất kháng khuẩn bằng sắc
ký lớp mỏng.
3.3. Phương pháp nghiên cứu