Đánh giá đặc tính enzyme lypase và protease của một số chủng bacillus và nhân dòng gen sinh protease của chủng DSM13

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI














THÂN THỊ HOA


ðÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ENZYME LIPASE VÀ
PROTEASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG Bacillus VÀ NHÂN
DÒNG GEN SINH PROTEASE CỦA CHỦNG DSM13




CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ : 60.42.02.01


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :

TS. NGUYỄN THÀNH TRUNG
GS.TS. NGUYỄN QUANG THẠCH




HÀ NỘI - 2013
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là
trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác.
Tôi cũng xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều
được ghi rõ nguồn gốc.

Học viên


Thân Thị Hoa

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ii

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này ñược thực hiện tại phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ Vi
sinh và Sinh học phân tử, Khoa Công nghệ Sinh học, trường ðại học Nông
nghiệp Hà Nội. ðể hoàn thành ñược luận văn này tôi ñã nhận ñược rất nhiều sự
ñộng viên, giúp ñỡ của nhiều cá nhân và tập thể.
Trước hết, tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng tới
GS.TS Nguyễn Quang Thạch và TS. Nguyễn Thành Trung người ñã tận tình chỉ
bảo, hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn
thày PGS.TS Nguyễn Thị Phương Thảo, TS nguyễn văn Giang ,Th.s Trần Thị
ðào, Ks Nguyễn Tràng Hiếu,Ks. Nguyễn Khắc Hải, Ks. ðỗ Hải Quỳnh ñã nhiệt
tình giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn ñến Ban Giám hiệu, Ban chủ nhiệm khoa Công
nghệ Sinh học, Ban Quản lý ðào tạo sau ñại học, các Thầy Cô giáo Khoa Công
nghệ Sinh học Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, ñã tạo mọi ñiều kiện và
giúp ñỡ tôi trong suốt 2 năm học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc ñến gia ñình, bạn
bè, ñồng nghiệp ñã luôn ñộng viên và khuyến khích tôi trong suốt quá trình học
tập và nghiên cứu.

Hà Nội, ngày 12 tháng 11 năm 2013
Học viên


Thân Thị Hoa






Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC BẢNG vi
DANH MỤC HÌNH vii
DANH MỤC ĐỒ THỊ viii
DANH MỤC VIẾT TẮT ix
TÓM TẮT 1
MỞ ðẦU 3
1. Đặt vấn đề 3
2. Mục đích, yêu cầu của đề tài 5
2.1. Mục đích của đề tài 5
2.2. Yêu cầu của đề tài 5
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6
1.1. Vi khuẩn Bacillus 6

1.1.1. Đặc điểm chung 6
1.1.2. Phân loại khoa học 6
1.1.3. Hệ enzym của Bacillus 11
1.2. Lipase 11
1.2.1. Giới thiệu 11
1.2.2. Cấu trúc lipase 11
1.2.3. Cơ chế phản ứng và tính đặc hiệu của lipase 12
1.2.4. Các nguồn thu nhận enzyme lipase 14
1.2.5. Ứng dụng của lipase 15
1.3. Protease 20
1.3.1. Tính chất, đặc điểm của protease 20
1.3.2 Các nguồn thu nhận enzyme protease 22
1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng lên hoạt tính của enzyme protease [1, 9, 10, 13] 25
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iv

1.3.4. Ứng dụng của protease 27
1.3.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng protease trong sản xuất ở Việt Nam 29
1.4. Tổng quan về công nghệ DNA tái tổ hợp 30
1.4.1. Giới thiệu chung 30
1.4.2. Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp trong sản xuất enzyme 30
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32
2.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 32
2.1.1. Đối tượng và vật liệu 32
2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 36
2.2. Phương pháp nghiên cứu 36
2.2.1. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme lipase và protease của các
chủng Bacillus 36
2.2.2 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme lipase 37
2.2.3. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme protease 39
2.2.4. Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn 42

2.2.5. Xác định các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh
enzyme 43
2.2.6. Khảo sát hoạt tính của enzyme protease 45
2.2.7 Tách chiết DNA genome từ chủng DSM13 45
2.2.8. Thu gen mục tiêu bằng phản ứng PCR 46
2.2.9. Tạo vector tái tổ hợp mang gen sinh protease 47
2.2.10. Biến nạp vector tái tổ hợp vào E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt 48
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49
3.1. Tuyển chọn chủng Bacillus có khả năng sinh enzyme lipase và protease cao 49
3.2. Xác định hoạt độ lipase và protease 51
3.3. Xác định đường cong tăng trưởng: 55
3.4. Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme 57
3.4.1. Nguồn cơ chất cảm ứng 57
3.4.2. Nồng độ cơ chất 60
3.4.3. pH của môi trường cảm ứng 61
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp v

3.4.4. Thời gian nuôi cấy 62
3.4.5. Nhiệt độ nuôi cấy 63
3.5. Khảo sát điều kiện hoạt động tối ưu của enzyme protease của DSM13 65
3.5.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt đông của protase 65
3.5.2. Khảo sát ảnh hưởng PH đến hoạt tính protease 66
3.5.3 Ảnh hưởng của các chất ức chế hoạt động của protease 67
3.5. Tách chiết DNA genome từ chủng DSM13 68
3.6. Nhân đoạn gen sinh protease bằng PCR 68
3.7. Nhân dòng gen mã hóa protease trong vi khuẩn E.coli DH5α 70
3.8. Giải trình tự gen Vpr 70
KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 75
1. Kết luận 75
2. Đề nghị 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO 77

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vi

DANH MỤC BẢNG
STT Tên bảng Trang
Bảng 1.1. Tóm tắt các loại phản ứng của lipase 13
Bảng 2.1: Các chủng Bacillus 32
Bảng 2.2: Danh mục máy móc sử dụng trong đề tài 33
Bảng 2.3: Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật 34
Bảng 2.4: Môi trường cảm ứng sinh lipase và protease 34
Bảng 2.5. môi trường khảo sát hoạt tính lipase và Protease 35
Bảng 2.6: Bảng hóa chất xác định hoạt độ lipase 38
Bảng 2.7: Nồng độ đường chuẩn tyrosine 40
Bảng 2.8: Tóm tắt các bước thực hiện 41
Bảng 3.1 : Hoạt tính enzyme lipase và protease của các chủng Bacillus 49
Bảng 3.2: Hoạt độ lipase của các chủng Bacillus 52
Bảng 3.3: Hoạt độ protease của các chủng Bacillus 53
Bảng 3.4: Đường cong sinh trưởng của chủng TH6 56
Bảng 3.5: Đường cong sinh trưởng của chủng DSM13 56
Bảng 3.6.Ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng đến sự sinh tổng hợp lipase
của
2 chủng TH6 và DSM13
58
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng đến sự sinh tổng hợp
lipase của 2 chủng TH6 và DSM13 59
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến sự sinh tổng hợp lipase của 2
chủng TH6 và DSM13 60
Bảng 3.9: Ảnh nhưởng của pH đến khả năng sinh lipase và protease của 2
chủng TH6 và DSM13 61

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của thời gian tới khả năng sinh enzyme lipase và
protease của 2 chủng TH6 và DSM13 63
Bảng 3.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh enzyme lipase và
protease của 2 chủng TH6 và DSM13 64
Bảng 3.12: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt đông của enzyme protease 65
Bảng 3.13 : ảnh hưởng của pH đền hoạt động của protease 66
Bảng 3.14: Ảnh hưởng cảu chất ức chết đến hoạt động của enzyme protease 67
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vii

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang
Hình 1.1 : Cấu trúc lipase……………………………………………………….12
Hình 1.2: Cấu trúc 3D của lipase 12
Hình 1.3: Phản ứng thủy phân triacylglycerol của enzyme lipase [23] 12
Hình 3.1: Hoạt tính lipase của các chủng Bacillus 50
Hình 3.2: Hoạt tính protease của các chủng Bacillus 51
Hình 3.3: Chủng TH6 và chủng DSM13 55
Hình 3.4: Genome tổng số của B. licheniformis DSM13 68
Hình 3.5.: Sản phẩm khuếch đại gen sinh protease(Vpr) 69
Hình 3.6: Map vector pJET 69
Hình 3.7: Khuẩn E.coli DH5 α tái tổ hợp
70
Hình 3.8: Vector pJET-Vpr 70

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp viii

DANH MỤC ðỒ THỊ
STT Tên ñồ thị Trang
Đồ thị 3.1: Hoạt độ lipase của các chủng Bacillus 52

Đồ thị 3.2: Hoạt độ protease của các chủng Bacillus 54
Đồ thị 3.3: Đường cong sinh trưởng của TH6 56
Đồ thị 3.4: Đường cong sinh trưởng của chủng DSM13 57
Đồ thị 3.5.Ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng đến sự sinh tổng hợp
lipase của 2 chủng TH6 và DSM13 58
Đồ thị 3.6: Ảnh hưởng của nguồn cơ chất đến khả năng sinh enzyme
protease của 2 chủng TH6 và DSM13 59
Đồ thị 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến sự sinh tổng hợp lipase của
2 TH6 và DSM13 60
Đồ thị 3.8: Ảnh hưởng pH đến khả năng sinh lipase và protease của 2
chủng TH6 và DSM13 62
Đồ thị 3.9: Ảnh hưởng của thời gian tới khả năng sinh enzyme lipase và
protease của chủng TH6 và DSM13 63
Đồ thị 3.10Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh lipase và protease của
2 chủng TH6 và DSM13 64
Đồ thị 3.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt đông của enzyme protease 65
Đồ thị 3.12: ảnh hưởng của pH đền hoạt động của protease 67

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ix

DANH MỤC VIẾT TẮT

B.subtilis Bacillus subtilis
B.mesentericus ruber Bacillus mesentericus ruber
B.mesenteruicus niger Bacillus mesenteruicus niger
B.mesentericus Bacillus mesentericus
B.anthracis Bacillus anthracis
B.mycoides Bacillus mycoides
B.thurigiensis Bacillus thurigiensis
B.cereus Bacillus cereus

E.coli Escherichia coli
PCR Polymerase Chain Reaction
OD Optic density
mM Millimolar
v/v Thể tích/ thể tích
w/v Khối lýợng/ thể tích
G Gravity (9,8 m/s
2
)
nm Nanometer
H
2
O Nước
t
0
Nhiệt ðộ
Bp Base pair
DNA Deoxyribonucleic acid
EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid
Kb Kilo base
Mb Mega base pair
NCBI
National Center for Biotechnology
Information
TE Tris – EDTA buffer

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
1

TÓM TẮT

Bacillus có khả năng sản xuất các enzyme ngoại bào hữu dụng có tầm
quan trọng trong công nghệ sinh học. Protease và lipase là hai enzyme được sử
dụng nhiều trong mọi lĩnh vực: công nghiệp, xử lý môi trường, y học, dược
phẩm, Hiện nay một tỷ lệ lớn protease có giá trị thương mại được sản xuất từ
các chủng Bacillus. Trong các loài vi sinh vật, Bacillus là chủng có khả năng sinh
tổng hợp protease và lipase cao, đồng thời là chủng dễ nuôi và dễ phân lập. Tuy
nhiên, hiện nay, giá thành protease và lipase cao. Do đó, việc nghiên cứu tìm ra
các chủng Bacillus có khả năng sinh lipase và protease cao là cần thiết. Vì vậy,
đề tài “ðánh giá khả năng sinh enzyme lipase và protse của một số chủng
Bacillus và nhân dòng gen sinh protease của chủng DSM13” được thực hiện
với mục đích đánh giá khả năng sinh protease và lipase của các chủng Bacillus
để tìm ra chủng Bacillus sinh lipase và protease mạnh bổ sung vào chế phẩm để
sử lý môi trường giàu protein và lipid, cũng như phục vụ sản xuất công nghiệp
các enzym này .
Luận văn này tập trung vào nghiên cứu khả năng sinh enzyme lipase và
protease ngoại bào của 20 chủng Bacillus do phòng thí nghiệm công nghệ vi sinh
– khoa Công nghệ sinh học trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội cung cấp . Kết
quả khảo sát sơ bộ cho thấy 14 chủng Bacillus có khả năng sinh lipase và
protease ngoại bào, trong đó chủng TH6 và DSM13 có khả năng sinh lipase và
protease cao. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp lipase và
protease ngoại bào bao gồm thành phần môi trường nuôi như cơ chất cảm
ứng,nồng độ cơ chất cảm ứng, pH, nhiệt độ, thời gian nuôi đã được khảo sát.
Hiệu quả sinh tổng hợp lipase và protease ngoại bào được đánh giá dựa trên hoạt
độ lipase và hoạt độ protease (U/ ml dịch nuôi cấy). Đối với tất cả các chủng
nghiên cứu, khi cảm ứng bằng dầu olive cho hiệu quả sản xuất lipase cao, cảm
ứng bằng casein cho hiệu quả sản xuất protease cao. Ở 2 chủng nghiên cứu,
lượng lipase và protease ngoại bào đạt cao nhất sau 36 – 48 giờ nuôi cấy. Nhiệt
độ nuôi cấy ảnh hưởng rõ rệt đến lượng lipase và protease ngoại bào. Nhiệt độ tối
ưu của TH6 và DSM13 trong khoảng 30 – 37

0
C. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
2

cho thấy môi trường trung tính hơi kiềm (pH 7,0 – 7,5) phù hợp cho các chủng
Bacillus. Khảo sát khả năng hoạt động của enzyme protease do DSM13 sinh ra
thấy protease hoạt động ở PH kiềm (pH =8)và hoạt động ở nhiệt độ 60
0
. Từ đó,
chúng tôi đã nhân dòng gen sinh rotease trong DSM13 trong E.coli DH5α. Để
chuẩn bị cho việc tạo chủng vi khuẩn tái tổ hợp mang gen sinh protease phục vụ
cho sản xuất protease ở qui mô công nghiệp.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
3

MỞ ðẦU

1. ðặt vấn ñề
Công nghiệp đóng vai trò rất quan trọng trong nền kinh tế ở Việt nam.
Công nghiệp hiện nay đang phát triển rất mạnh với nhiều ngành nghề như: công
nghiệp điện tử, công nghiệp chế biến,…Ngoài ra, các làng nghề ở Việt Nam cũng
rất phát triển góp phần không nhỏ cho phát triển đất nước.
Tuy nhiên, một trong những thách thức đang đặt ra đối với ngành công
nghiệp và các làng nghề là vấn đề môi trường và sức khỏe của người lao động,
của cộng đồng dân cư đang bị ảnh hưởng nghiêm trọng từ những hoạt động sản
xuất đó.
Rác thải, nước thải là nguồn chính gây nên ô nhiễm môi trường dẫn tới mất
cân bằng sinh thái và phá hủy môi trường sống, đe dọa tới sức khỏe và cuộc sống
con người. Thành phần hữu cơ chính trong rác thải và nhất là trong nước thải của

ngành công nghiệp chế biến và các làng nghề giết mổ chủ yếu là protein và lipid,
nên việc sử dụng công nghệ vi sinh trong xử lý rác thải, nước thải cải thiện môi
trường có ý nghĩa lớn. Ngoài việc bổ sung trực tiếp vi sinh vật vào bể ủ để xử lý
rác thải, bể nước thải thì việc tạo ra các chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật
sinh nhiều proease và lipase đã được nghiên cứu, ứng dụng và đã thu được kết
quả cao.
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các
chế phẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các
lĩnh vực. Trong đó, protease và lipase là hai loại enzyme thủy phân được ứng
dụng trong nhiều lĩnh vực như công nghệ thực phẩm, hóa chất, y dược, xử lý
môi trường (Seitz, 1974; Sharma và cộng sự, 2001; Sangeetha và cộng sự, 2011,
Joo HS và cộng sự, 2003).
Lipase là enzyme xúc tác thủy phân các nối ester của lipid thành các axid
béo phục vụ cho công nghiệp và phục vụ cho xử lý môi trường. Protease là
enzyme xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptide thành các acid amin. Protease
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
4

được sử dụng nhiều nhất hiện nay, chiếm 60-65% thị trường enzyme công
nghiệp trên toàn thế giới (Banerjiee CU và cộng sự, 1999; Johnvesly and
Naik,2001; H.Genckal và C.Tari,2005). Hai enzyme này được sinh tổng hợp từ
rất nhiều nguồn khác nhau như động vật, thực vật và vi sinh vật. Tuy nhiên,
nguồn enzyme ở vi sinh vật là phong phú nhất, có hầu hết ở các vi sinh vật như:
Nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn Trong đó, Bacillus là chủng có khả năng sinh tổng
hợp protease và lipase cao, đồng thời là chủng vi khuẩn dễ nuôi và dễ phân lập
có thể sống được ở nhiều môi trường khác nhau, sinh sinh trưởng, phát triển
nhanh
Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung
cấp Protease và lipase đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được
tạo ra nhiều hơn. Tuy nhiên giá thành protease và lipase còn khá cao, do đó cũng

hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất và càng hạn chế sử dụng
enzyme trong xử lý môi trường [6]. Vì vậy, việc đánh giá hoạt tính protease và
lipase trong một số chủng Bacillus để tìm ra chủng sinh nhiều protease và lipase
bổ sung vào chế phẩm là cần thiết . Do đó, việc thực hiện đề tài “ðánh giá hoạt
tính enzyme lipase và protse của một số chủng Bacillus và nhân dòng gen
protease của chủng DSM13 ” sẽ góp phần tuyển chọn được các chủng Bacillus
sinh lipase và protease mạnh để bổ sung vào chế phẩm sử lý môi trường giàu
protein và lipit. Đề tài cũng nghiên cứu nhân dòng gen sinh protease có hoạt
tính cao nhằm chuẩn bị cho việc tạo các vi sinh vật tái tổ hợp chứa gen tạo
protease phục vụ cho việc sản xuất enzym protease ở qui mô công nghiệp.
Các nội dung chính sau được thực hiện trong luận văn này :
1. Đánh giá khả năng sinh protease và lipase của một số chủng Bacillus
2. Đánh giá ảnh hưởng các đều kiện môi trường đến khả năng sinh enzyme
protease và lipase của chủng Bacillus sinh protease và lipas cao.
3. Đánh giá khả năng hoạt động của enzyme protease
4. Nhân dòng gen sinh protease của chủng DSM13
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
5

2. Mục ñích, yêu cầu của ñề tài
2.1. Mục ñích của ñề tài
- Chọn lọc được chủng Bacillus có khả năng sinh enzyme lipase và
protease ngoại bào cao.
- Nghiên cứu nhân dòng gen sinh protease của chủng DSM13 trong E.coli
DH5α.
2.2. Yêu cầu của ñề tài
Xác định được khả năng sinh enzyme lipase và protease ngoại bào của
một số chủng Bacillus, đánh giá được ảnh hưởng của các thành phần môi trường
tới khả năng sinh enzyme lipase và protease ngoại bào của chủng Bacillus có
hoạt tính mạnh, Xác định được ảnh hưởng các yếu tố môi trường đến sự hoạt

động của protease của chủng DSM13. Nhân dòng gen sinh protease của chủng
DSM13 trong E.coli DH5α.

















Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
6

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Vi khuẩn Bacillus
1.1.1.ðặc ñiểm chung
Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương. Thuộc chi
Bacillaceae, có nội bào tử hình ovan có khuynh hướng phình ra ở một đầu.
Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh nội bào tử khác bằng hình
dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí không

bắt buộc. Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc chuỗi và chuyển động bằng tiêm
mao. Nhờ khả năng sinh bào tử nên vi khuẩn Bacillus có thể tồn tại trong thời
gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau và rất phổ biến trong tự nhiên nên
có thể phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, trầm tích biển,
thức ăn, sữa, nhưng chủ yếu là từ đất nơi mà đóng vai trò quan trọng trong
chu kỳ C và N [ 19 ]
Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại sinh
nhờ sử dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid hữu cơ,
Một vài loài có thể lên men carbohydrat tạo thành glycerol và butanediol; một
vài loài như Bacillus megaterium thì không cần chất hữu cơ để sinh trưởng,
một vài loài khác thì cần acid amin, vitamin B. Hầu hết đều là loài ưa nhiệt
trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30 – 45
o
C, nhưng cũng có nhiều loài ưa nhiệt
với nhiệt độ tối ưu là 65
o
C (Rosovitz và cs, 1998)
Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 – 10
như Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2 – 6 như Bacillus
acidocaldrius
Bacillus có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease,
cellulase…), do đó chúng được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp,
trong bảo vệ môi trường, …
1.1.2. Phân loại khoa học
Sau đây là một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
7

Bacillus subtilis
Bacillus subtilis được nhà khoa học cùng thời với Robert Koch tên là

Ferdinand Cohn phát hiện và đặt tên năm 1872 [40] .
Bacillus subtilis được gọi là trực khuẩn cỏ khô vì nó phân bố nhiều trong
đất và đặc biệt là ở cỏ khô.
Chúng phân hủy pectin và polysaccarit ở mô thực vật và góp phần gây
nên các nốt trên củ khoai tây bị u. Chúng sinh trưởng trên môi trường nguyên
thủy xác định mà không cần bổ sung thêm yếu tố kích thích sinh trưởng. Sự
sinh trưởng phát triển của chúng góp phần làm hỏng các nguyên liệu có nguồn
gốc động thực vật. Chúng không sinh trưởng trên thực phẩm có tính axit ở điều
kiện tối ưu. Chúng là nguyên nhân gây hư hỏng bánh mì. Phần lớn thông tin
chúng ta có về đặc điểm sinh học, hóa sinh, di truyền của các vi khuẩn Gram
dương khác đều nhận được từ việc nghiên cứu Bacillus subtilis [40].
Chúng là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước ( 3 – 5) x 0,6
µm. Chúng phát triển riêng rẽ như những sợi đơn bào ít khi kết chuỗi sợi [40].
Khuẩn lạc khô, vô màu hay xám nhạt, có thể màu trắng hơi nhăn hoặc tạo ra lớp
màng mịn lan trên bề mặt thạch, mép nhăn hoặc lồi lõm nhiều hay ít, bám
chặt vào môi trường thạch.
Bacillus subtilis sinh trưởng tốt nhất ở 36
0
C – 50
0
C, tối đa khoảng

60
0
C. Là loại ưa nhiệt cao. Bào tử của Bacillus subtilis cũng chịu được
nhiệt khá cao.
Bào tử hình bầu dục, kích thước 0,6µm – 0,9µm. Phân bố không theo
nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm. Chúng phát
tán rộng rãi. Chúng là một thể nghỉ sinh ra vào cuối thời kỳ sinh trưởng
phát triển của vi khuẩn. Chúng không có khả năng trao đổi chất nên có thể sống

được vài năm đến vài chục năm, thậm chí đến 200 – 300 năm
[2].

Vi khuẩn Bacillus subtilis được xem là vi sinh vật điển hình vì có những
đặc tính tiêu biểu không gây hại nên đây là một trong những vi khuẩn được
sử dụng để sản xuất enzyme và các hóa chất đặc biệt như: amylase, protease,
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
8

inosine, ribosides, acid amin, subtilisin [41]. Ngoài ra nhờ khả năng bám dính
proton lên bề mặt mà B. subtilis có thể loại bỏ được chất thải phóng xạ như
Thorium (IV) và Plutonium (IV) (Schallemey và cs, 2004). Đặc biệt, B.subtilis
được sử dụng trong lên men Natto của Nhật –thực phẩm chức năng rất bổ
dưỡng cho sức khỏe [42].
Bacillus megaterium
Megaterium có nghĩa là “ con thú lớn” [13]. Tế bào của nó khá lớn
khoảng gấp hơn 2 lần tế bào của Bacillus subtilis, chiều ngang (1,2 –
1,5)µm có thể đến 2 µm, dài từ 3 – 12 µm, ở các ống nuôi già thì tế bào ngắn
hơn, tròn hơn, đôi khi hình thoi với đầu hẹp lại. Tế bào chứa nhiều hạt nhỏ và
chất dinh dưỡng dự trữ (hạt mỡ, glycogen) [11].
Bào tử lớn hình ovan hay bầu dục, kích thước 1,5 x (0,7-1)µm, bào tử
lớn nhất có đường kính từ 1,2 đến 1,5 )µm [13]. Chúng nằm lệch tâm thường
theo chiều ngang hoặc xiên của tế bào.
Khuẩn lạc tròn đều không thùy, không nếp, mép tròn đều hoặc hơi lượn
sóng, trông giống giọt bạch lạp, lồi nhẵn, nhưng thường có vòng viền quanh
đồng tâm trên bề mặt, màu trắng sữa hay đục.
Sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng đơn giản không cần thêm bất
kỳ một yếu tố sinh trưởng nào. Bacillus megaterium cũng sản sinh ra các
enzyme tương tự B.subtilis, do đó nó cũng được ứng dụng nhiều trong
công nghiệp

Bacillus mensentericus
Bacillus mensentericus còn được gọi là trực khuẩn khoai tây do nó có
mặt chủ yếu trên khoai tây. Trực khuẩn gần giống Bacillus subtilis, mảnh
dài hoặc ngắn ( 3- 10 ) x ( 0,5 – 0,6 ) µm, có thể đứng riêng rẽ hoặc chuỗi dài.
Bào từ hình bầu dục và kéo dài 0,5 – 0,9 µm, nằm ở vị trí bất kỳ trong tế
bào, tế bào Bacillus mensentericus không bị phình to khi mang bào tử. Khuẩn
lạc bám chặt vào môi trường thạch, có khi dính vào môi trường, mỏng, nhăn
nheo, xám nhạt – trắng, có thể màu Crem, vàng nâu, hồng hoặc đen như
Bacillus mensentericus niger ( đen ), Bacillus mensentericus ruber (hồng).
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
9

Bacillus mensentericus sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 36 – 45
0
C
tối đa 50 – 55
0
C. pH = 4,5 – 5 thì nó ngừng phát triển.Bacillus mensentericus có
hoạt tính amylase và protease lớn hơn hẳn Bacillus subtilis, nhưng lên men
đường lại kém hơn. Hai loại trực khuẩn này rất phổ biến trong tự nhiên, chúng
lây nhiễm làm hư hỏng thực phẩm, nhất là các thực phẩm có chứa nitơ và
các sản phẩm giàu đường ( bánh kẹo, hoa quả) đây cũng là loại được ứng dụng
vào ngành công nghệ sản xuất enzyme protease, amylase… Ngoài ra, nó còn
sinh ra một loại hợp chất có hoạt tính kháng với một số vi khuẩn khác ( như
Vibrio) gọi là bacterioxin, ở Bacillus subtilis gọi là subtilin hay Iturin A, B
Bacillus cereus .
Đây là loại có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, Bacillus
mycoides, Bacillus thuringiensis. Bào tử của chúng phát tán khắp nơi, trong đất,
không khí… Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể
sinh ra độc tố làm cho thực phẩm hư hỏng. Chúng được áp dụng đểsản xuất

kháng sinh, giống Bacillus này có độc tính, gây ngộ độc thực phẩm [40].
Tế bào Bacillus cereus dày, kích thước (1 – 1,5) x (3 – 5)µm, có khi dài
hơn, chúng đứng riêng rẽ hay xếp chuỗi. Bào tử hình bầu dục kích thước
0,9 x (1,2 – 1,5)µm nằm lệch tâm, tế bào chất của nó chứa các hạt và không bào
[11]. Khuẩn lạc của Bacillus cereus phẳng, khá khuyếch tán, hơi lõm, trắng đục,
mép lồi lõm [5] .
Bacillus pumilus
Bào tử phát tán rộng khắp mọi nơi, thường B.pumilus có mặt trong đất
nhiều hơn subtilis. Khuẩn lạc nhỏ, xung quanh viền mờ lan không ranh giới. Tế
bào của nó gần giống tế bào B.subtilis.
Bacillus polymyxa
Bacillus polymyxa có khuẩn lạc vô màu, phẳng hoặc lồi , trơn, nhày, lan
dần ra xung quanh, mép đôi khi có thùy.
Tế bào của Bacillus polymyxa có kích thước (0,6 – 1) x (2 – 7)µm, đứng
riêng rẽ hay xếp thành đôi, chuỗi ngắn. Khi hình thành bào tử tế bào đó sẽ
phồng lên hình quả chanh [5].
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
10

Bào tử hình bầu dục kéo dài, trên bề mặt cắt ngang như hình sao. Chúng
phát tán rộng, kích thước dài khoảng (1,7 – 2,6)µm, nằm giữa tế bào [40]. Loại
vi khuẩn này làm giảm pectin và polysacharit trong cây. Chúng còn có khả năng
cố định đạm.
Chúng thường sinh trưởng phát triển trên thực vật đang bị hỏng. Vì vậy
người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm. Môi trường kem và những môi
trường có tính axit yếu phù hợp với loại vi khuẩn này. Chúng là nguồn để sản
xuất kháng sinh polymyxin. Đây là một loại vi khuẩn rất phổ biến và có ích
Bacillus brevis
Người ta thường tìm thấy và phân lập chúng từ đất và thực phẩm. Khuẩn
lạc của chúng màu trắng, đôi khi có sắc vàng, lồi hoặc phẳng lấp lánh, mép răng

cưa giống dạng mỡ đặc.
Bacillus brevis là trực khuẩn kích thước (0,7 – 1) x (3 – 5)µm.
Chúng thường đứng riêng rẽ. Bào tử hình bầu dục, có kích cỡ ( 0,8 – 1) µm,
nằm cuối tế bào làm cho đầu tế bào hơi phồng to lên [5].
Về nhu cầu dinh dưỡng, Bacillus brevis yêu cầu một hỗn hợp axit
amin cho sinh trưởng và phát triển, không cần bổ sung vitamin [40]
Bacillus simplex
Khuẩn lạc giống khuẩn lạc B.cereus, phẳng, khá khuyếch tán, với bề mặt
hơi xù xì (dạng bột hoặc hạt nhỏ), hơi lõm, màu đục, mép lồi lõm. Đặc biệt
khuẩn lạc của Bacillus simplex có khả năng sinh sắc tố lục nhạt, vàng và tiết
vào môi trường [5].
Tế bào của nó nhỏ bé, có kích thước (2 – 5) x 0,6µm, thường đứng riêng rẽ
không kết thành chuỗi. Bào tử hình bầu dục, có kích thước 0,6 x 0,9 µm, nằm lệch .
Bacillus lincheniformis
Chúng được áp dụng trong việc sản xuất loại vỏ bao poly D-
glutamate và phẩm đỏ cùng với nhiều chủng khác.
Bào tử của chúng phát tán chủ yếu trong đất. Chúng sinh trưởng phát triển
trên các loại thực phẩm. Đặc biệt chúng có khả năng sản xuất ra bacitracin, một
kháng sinh có ích trong y học, nên chúng được ứng dụng phổ biến trong công
nghiệp dược [40].
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
11

1.1.3. Hệ enzym của Bacillus
Vi khuẩn Bacillus tạo ra rất nhiều enzym ngoại bào như: amylase,
protease, cellulase,lipase………rất quan trọng vì chúng được sử dụng phổ biến
và có nhiều ứng dụng to lớn.
1.2. Lipase
1.2.1. Giới thiệu
Lipase (triacylglycerol acylhydrolase – EC 3.1.1.3), thuộc nhóm phụ

enzyme thủy phân có serine của họ enzyme thủy phân α/β, xúc tác thủy phân các
nối ester của triacylglycerol. Chúng hiện diện rộng rãi và tham gia vào sự chuyển
hóa sinh học của lipid trong tự nhiên. Nét đặc trưng chuyên biệt giúp phân biệt
lipase với các enzyme esterase khác là khả năng hoạt động tại bề mặt phân cách
giữa pha nước với các pha không hòa tan chứa cơ chất. Bên cạnh hoạt tính thủy
phân lipid, enzyme lipase còn có hoạt tính thủy phân và tổng hợp ester [21]
Lipase được tổng hợp bởi nhiều vi sinh vật và các sinh vật nhân chuẩn.
Vi sinh vật sinh tổng hợp lipase bao gồm vi khuẩn, nấm men, nấm mốc và xạ
khuẩn được tìm thấy rộng rãi trong các môi trường như: nước thải công nghiệp,
nhà máy chế biến dầu thực vật, sữa, đất lẫn dầu, hạt có dầu, thực phẩm thối rữa,
than đá, suối nước nóng, Hầu hết lipase ứng dụng thương mại có nguồn gốc
từ vi khuẩn [6],
[14].

1.2.2.Cấu trúc lipase
Cấu trúc không gian (3D) của lipase từ nấm Rhizomucor miehei và lipase
từ tuyến tụy của người đã được xác định vào năm 1990, từ đó đến nay có hơn 11
cấu trúc lipase nữa được xác định. Ngoại trừ lipase từ tuyến tụy của người, tất cả
các lipase còn lại đều từ vi sinh vật. Các lipase này có khối lượng phân tử
(19 – 60) kDa, đều biểu hiện đặc tính xoắn cuộn như xoắn α/β-hydrolase. Lõi
trong của lipase được cấu thành từ phiến β trung tâm bao gồm 8 chuỗi β khác
nhau (β1 – β8) nối với
6 xoắn α (A – F) [26]
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
12



Hình 1.1 : Cấu trúc lipase Hình 1.2: Cấu trúc 3D của lipase
1.2.3.Cơ chế phản ứng và tính ñặc hiệu của lipase

Lipase xúc tác cho nhiều phản ứng khác nhau bao gồm: phản ứng thủy
phân, phản ứng tổng hợp ester, phản ứng chuyển ester (gồm có phản ứng rượu
hóa (alcoholysis) và thủy phân glicogen (glycolysis)), phản ứng trao đổi ester
(gồm có phản ứng acid hóa (acidolysis) và trao đổi ester) và phản ứng amin hóa
(aminolysis)
Các phản ứng do lipase xúc tác đều là các phản ứng thuận nghịch và
chiều hướng của phản ứng phụ thuộc vào lượng nước tham gia vào phản ứng.
Lấy phản ứng thuỷ phân triacylglycerol làm minh họa, ta có:

TAG = triacylglycerols, DAG =
diacylglycerols, MAG = monoacylglycerols,
FFA = free fatty acids.
Hình 1.3: Phản ứng thủy phân triacylglycerol của enzyme lipase [23]
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
13

Khi cung cấp đầy đủ nước, phản ứng thủy phân xảy ra (theo chiều thuận).
Ngược lại, trong điều kiện thiếu nước, phản ứng ester hóa xảy ra và tổng hợp lại
glyceride từ acid béo tự do và glycerol (theo chiều nghịch). Các phản ứng này
xảy ra tại bề mặt phân cách giữa cơ chất và pha nước nên gây khó khăn cho việc
phân tích động học và khảo sát hoạt tính của lipase. Lipase thủy phân
triacylglycerols (TAG) theo từng bậc, tạo ra diacylglycerols (DAG),
monoacylglycerols (MAG) và acid béo tự do (FFA), rồi cuối cùng thủy phân
hoàn toàn tạo ra glycerol và acid béo tự do [23],[24].
Bảng 1.1. Tóm tắt các loại phản ứng của lipase

Trong số các phản ứng trên, được quan tâm nhiều nhất là phản ứng
chuyển ester hóa, acid hóa (acidolysis) và rượu hóa (alcoholysis). Sự chuyển
ester hóa là sự chuyển nhóm acyl giữa 2 ester, có thể là giữa hai triglyceride
hoặc giữa một triglyceride và một acid béo. Acid hóa (acidolysis) là sự

chuyển nhóm acyl giữa một acid và một ester. Rượu hóa (alcoholysis) là phản
ứng giữa rượu và ester [24]
Trong tự nhiên, lipase có từ nhiều nguồn gốc khác nhau. Chính sự đa
dạng này đã ảnh hưởng đến tính đặc hiệu trong các phản ứng chúng xúc tác. Khi
xét đến tính đặc hiệu đối với các acid béo trong phân tử triglyceride thì một số
lipase có ái lực với triglyceride chứa các gốc acid béo chuỗi ngắn (acetic,
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
14

butyric, capric, caproic, caprylic, ), số khác lại đặc hiệu cho triglyceride gồm
những acid béo chưa bão hòa (oleic, linoleic, linonic, ). Trong trường hợp là
sườn glycerol của triglyceride, lipase có tính đặc hiệu theo vị trí và phân cắt acid
béo liên kết với C1 hoặc C3 của phân tử glycerol hoặc ở cả 2 vị trí trên nhưng
không tác động đến acid béo ở vị trí C2 của glycerol. Bên cạnh đó nhiều lipase
không có tính đặc hiệu và sẽ cắt ngẫu nhiên các acid béo từ triglyceride [24].
Do lipase chỉ hoạt động ở bề mặt phân cách giữa hai pha dầu - nước, nên
lượng dầu tồn tại ở mặt phân cách sẽ quyết định hoạt tính của lipase. Điều
này có thể khắc phục theo hướng tăng diện tích ở bề mặt tiếp xúc giữa hai pha
bằng cách tạo thể nhũ tương dầu bởi sự khuấy động mạnh với tác nhân nhũ hóa.
Hoạt tính của lipase có thể tăng rõ rệt khi sử dụng thể nhũ hóa dầu. Do đó, cần
áp dụng phương pháp nhũ hóa thích hợp để làm tăng diện tích tiếp xúc của các
tế bào nhũ hóa [24].
Lipase có ứng dụng thương mại thường là enzyme ngoại bào, được thu từ
nhiều vi sinh vật khác nhau. Nhiều lipase hoạt động trong dung môi hữu cơ, xúc
tác một số phản ứng có lợi gồm tạo ester, chuyển ester, gắn acyl chọn lọc vị trí
của glycol và menthol, tổng hợp peptid và các hóa chất khác. Triển vọng là
lipase sẽ trở thành một enzyme công nghiệp quan trọng như protease và
carbohydrase hiện nay [6].
1.2.4. Các nguồn thu nhận enzyme lipase
Lipase được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau : lipase từ thực vật,

lipase từ động vật và lipase từ vi sinh vật, đặc biệt là từ vi khuẩn và nấm, đã có
một vài lipase thu nhận từ vi sinh vật có giá trị thương mại [6].
Nguồn lipase từ động vật quan trọng nhất là từ tụy tạng của bò, cừu và
lợn. Lipase từ tụy tạng lợn là một trong những lipase được biết đến sớm nhất và
khá thông dụng. Hạn chế của lipase từ tụy tạng là chúng chứa những hợp chất có
mùi và vị khó chịu như trypsine, tạo vị đắng nên không được ưa chuộng. Bên
cạnh đó, nguồn lipase này còn có khả năng lây truyền virus từ động vật sang
người nên hiện nay xu hướng sử dụng lipase từ vi sinh vật đang được ưa
chuộng do đặc tính đa dạng, dễ tách chiết và nguyên liệu vô hạn [6].
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
15

1.2.4.1. Lipase từ vi khuẩn
Lipase từ vi khuẩn được nghiên cứu từ khá sớm và đầy đủ (Jaeger và
cộng sự (1999)). Đa số lipase của vi khuẩn là các glycoprotein, nhưng một số
lipase ngoại bào là lipoprotein hay còn gọi là lipase thật (EC 3.1.1.3). Các
nghiên cứu cũng chỉ ra rằng lipase vi khuẩn được biết cho tới nay thường
không đặc hiệu và chỉ có một số ít có tính bền nhiệt. Trong số các vi khuẩn thì
Acromobacter sp., Alcaligenes sp., Arthrobacter sp., Pseudomonas sp. và
Chromobacterium sp. đã được đưa vào sản xuất lipase công nghiệp [21].
1.2.4.2. Lipase từ nấm
Lipase từ nấm đã được nghiên cứu từ những năm 1950. Ưu điểm của loại
lipase này là dễ thu nhận, tính ổn định theo pH và nhiệt độ, tính đặc hiệu với cơ
chất và khả năng hoạt động trong dung môi hữu cơ.
Lipase thương mại thường được sản xuất bởi Aspergillus niger, Candida
cylindracea, Hummicola lanuginosa, Mucor miehei, Rhizopus arrhizus,
Rhizopus delemar, Rhizopus japonicus, Rhizopus niveus và Rhizopus oryzae.
Lipase sản xuất bởi Candida rugosa đã nhanh chóng trở thành một trong
những enzyme được dùng nhiều nhất trong công nghiệp do hoạt tính cao về
khả năng thủy phân cũng như tổng hợp [19].

1.2.5. Ứng dụng của lipase
Trong khoảng cuối thế kỷ 20, lipase được ứng dụng rộng rãi trong công
nghệ sinh học, dược phẩm, protein đơn bào, xử lý chất thải và các chế phẩm
sinh học khác. Lipase trở thành một phần quan trọng trong ngành công
nghiệp thực phẩm hiện đại và được sử dụng rộng rãi trong quá trình chế biến
nhiều loại sản phẩm như: nước trái cây, rau quả, các sản phẩm từ sữa, Lipase
cũng được dùng trong ngành công nghiệp thuộc da và giặt tẩy [14],[39].
1.2.5.1. Công nghiệp chất tẩy [14],[39].
Ứng dụng thương mại quan trọng nhất của lipase là làm phụ gia trong
công nghiệp chất tẩy rửa và bột giặt gia đình, hàng năm có khoảng 1 000 tấn
lipase được cho vào 13 tỉ tấn chất tẩy rửa. Để tăng khả năng tẩy rửa, các chất tẩy
hiện đại đều chứa một hoặc nhiều loại enzyme như protease, amylase, cellulase