Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh trưởng, phát triển và hoạt tính amylase của chủng nấm men saccharomyces cerevisiae phân lập từ các nguồn tự nhiên

Đồ án tốt nghiệp

Đồ án tốt nghiệp
DANH MỤC VIẾT TẮT
DNS : 3.5 – dinitrosalicylic acid
OD
540nm
: Mật độ quang ở bước sóng 540nm
OD
620
: Mật độ quang ở bước sóng 620nm
U/ml : Đơn vị hoạt độ (tính theo đơn vị quốc tế: Unit International)
ml : mililit
µm : micromet

Đồ án tốt nghiệp
PHẦN 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Thủy phân tinh bột thì từ lâu người ta đã sử dụng acid vô cơ như HCl,
H
2
SO
4
. Nhưng kết quả cho thấy, thủy phân bằng acid rất khó kiểm soát và
thường tạo nhiều sản phẩm không mong muốn và không đáp ứng tiêu chuẩn an
toàn thực phẩm. Do đó, người ta đã nghiên cứu và tìm ra phương pháp ứng dụng
vi sinh vật vào trong công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là các loài như nấm mốc,
vi khuẩn, nấm men, nó giúp cho quá trình sản xuất được thuận lợi và tạo nhiều
sản phẩm có chất lượng và an toàn.
Từ lâu con người ta đã biết đến nấm men và ứng dụng của chúng trong
nhiều lĩnh vực đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm. Tuy nhiên trong thực tế,

chưa có nhiều nghiên cứu tập trung về nấm men phân giải tinh bột, nguyên nhân
có thể do trong tự nhiên có nhiều nhóm vi sinh vật tỏ ra ưu thế hơn so với nấm
men về khả năng sinh amylase. Chính vì vậy, việc khai thác nguồn vi sinh vật là
nấm men để thu nhận amylase có hoạt tính cao và nấm men có khả năng phân
giải tinh bột là vấn đề quan trọng để tạo ra các chế phẩm enzyme ứng dụng trong
công nghệ thực phẩm, giúp cho quá trình sản xuất được thuận lợi và tạo nhiều
sản phẩm có chất lượng và an toàn.
Amylase là enzyme thủy phân tinh bột thông qua việc xúc tác phân giải
liên kết glucosid trong tinh bột. Amylase cũng đã được nghiên cứu và khảo sát
một cách có hệ thống về các đặc điểm và cũng được phân lập và tách chiết từ
nhiều nguồn khác nhau. Hiện nay, các nhà sản xuất có thể sử dụng amylase có
khả năng chịu nhiệt cao mà không bị mất hoạt tính, chẳng hạn amylase được
tách chiết từ vi sinh vật và được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm,
đặc biệt là sản xuất rượu, bia, bánh mì,…Xuất phát từ những lý do trên, chúng
tôi chọn đề tài : ‘‘Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng
sinh trưởng, phát triển và hoạt tính amylase của chủng nấm men
Saccharomyces cerevisiae phân lập từ các nguồn tự nhiên’’.
- Mục tiêu của đề tài :
+ Tìm ra được các chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae có khả năng
sinh amylase từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên.
+ Trên cơ sở kết quả thu được, có thể ứng dụng các chủng này vào trong
quá trình sản xuất chế biến thực phẩm cũng như sản xuất các chế phẩm amylase,
đặc biệt trong ngành sản xuất rượu, bia, bánh mì,…

Đồ án tốt nghiệp
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về nấm men
2.1.1. Đặc điểm hình thái và cấu tạo
Nấm men có cấu tạo đơn bào, hình thái thay đổi phụ thuộc vào từng loài,

tuỳ điều kiện nuôi cấy và trao đổi giống. Do đó nấm men có hình thái đa dạng
như: hình trứng, hình bầu dục (Saccharomyces cerevisiae,
Saccharomycesellipsoideus,…), hình tròn (Candida utilis), hình ống dài
(Pichia), hình quả dưa chuột (Saccharomyces pastorianus), hình một đầu nhọn
(Brettanomyces), hình tam giác (Trigonopsis) và một số hình đặc biệt khác.
Một số nấm men có tế bào hình dài, nối tiếp nhau thành những dạng sợi
gọi là khuẩn ty (mycelium) hoặc khuẩn ty giả (pseudomycelium). Ở khuẩn ty giả,
các tế bào không nối liền nhau một cách chặt chẽ như ở khuẩn ty. Khuẩn ty và
khuẩn ty giả thường quan sát thấy ở các giống Endomycopsis, Candida,
Trichosporon…, nhiều loài nấm chỉ sinh khuẩn ty giả khi không được cung cấp
đủ oxy [40].
Kích thước nấm tương đối lớn, gấp 5- 10 lần so với tế bào vi khuẩn. Kích
thước nấm men thay đổi rất nhiều tuỳ thuộc vào từng giống, từng loài, nói chung
kích thước trung bình khoảng từ 3 – 5 x 5 – 10 µm [16].
Hình 2.1. Hình thái
tế bào nấm men [41]
2.1.2. Cấu tạo của tế
bào nấm men
Nấm men có cấu tạo tế bào khá phức tạp gần giống như tế bào thực vật.
Có đầy đủ cấu tạo thành tế bào, màng tế bào chất, tế bào chất, ty thể, riboxom,
nhân, không bào và các hạt dự trữ.
2.1.2.1. Vách tế bào

Đồ án tốt nghiệp
Khi còn non, vách tế bào nấm men tương đối mỏng, tuỳ theo thời gian
nuôi dưỡng mà vách tế bào dày lên. Thành phần hoá học của vách tế bào được
cấu tạo bởi hai lớp phân tử bao gồm 90% là glucan và manan. Phần còn lại là
protein, một ít lipit, đôi khi còn có poliphotphat, enzyme, sắc tố và một ít ion vô
cơ, đặc biệt vách tế bào còn có chứa chất kitin.
Trên thành tế bào có nhiều lỗ, qua đó các chất dinh dưỡng được hấp thu

và các sản phẩm của quá trình trao đổi chất được thải ra.
2.1.2.2. Màng nguyên sinh chất
Màng nguyên sinh chất có chiều dày khoảng 7 – 8µm cấu tạo chủ yếu là
protein, chiếm 50% khối lương khô, còn lại là lipit 40% và một ít polysaccarit.
Chức năng của màng cũng giống như màng nguyên sinh chất vi khuẩn, giúp vận
chuyển các chất dinh dưỡng vào trong tế bào và đào thải các chất không cần
thiết ra ngoài tế bào. Ngoài ra, nó còn có chức năng là giữ cho áp suất thẩm thấu
trong và ngoài tế bào ổn định, là nơi sinh tổng hợp của lớp vỏ nhầy, là nơi dự trữ
các chất dinh dưỡng của tế bào [16].
2.1.2.3. Ty thể
Ty thể có dạng hạt nhỏ, dạng que hoặc dạng sợi mảnh phân bố trong tế
bào chất ở khoảng giữa vỏ tế bào. Có thể thấy chúng ở tất cả các giai đoạn sinh
trưởng của tế bào nấm men: thời kỳ yên tĩnh, nảy chồi, sinh bào tử,… chiều dài
của sợi ti thể là 0,2 – 0,75µm. Hình dáng của nó có thể thay đổi trong quá trình
nuôi cấy, có thể là từ các hạt hoặc que hay sợi đơn đến kết thành chuỗi.
Bình thường số lượng ty thể trong tế bào nấm men dao động rất lớn: từ 1
đến 50. Nếu trong tế bào chỉ có một ty thể thì thể tích của nó chiếm không nhỏ
hơn 20% thể tích tế bào, ở S.cerevisiae có 1 ty thể chiếm tới 88% thể tích tế bào.
Trong môi trường có nồng độ glucose thấp tế bào nấm men có tới 100 – 200 ty
thể, nhưng ở nồng độ cao chỉ thấy 30 – 40 [14].

Đồ án tốt nghiệp
2.1.2.4. Riboxom
Số lượng riboxom thay đổi phụ thuộc vào từng loài, từng giai đoạn phát triển
và từng điều kiện nuôi cấy. Có 2 loại riboxom: loại riboxom 70S và loại 80S.
2.1.2.5. Các vật thể ẩn nhập khác
Không bào có chứa các enzyme thuỷ phân, polyphotphat, lipoit, ion kim
loại, các sản phẩm trao đổi chất và điều hoà các quá trình sinh trưởng và phát
triển của tế bào nấm men.
Ngoài ra còn chứa một số hạt dự trữ khác như: hạt lipit dưới dạng các hạt

nhỏ, các hạt glucogen, một ít hạt tinh bột [16].
2.1.2.6. Nhân
Nhân của tế bào nấm men có màng vỏ, hạch nhân (thể nhiễm sắc –
karyokon) và chất nhân (karyoplasma). Vỏ nhân tham gia vào điều hòa các qui
trình trong nhân bằng cách thay đổi tính thấm và thông báo trực tiếp giữa nhân
với môi trường bên ngoài tế bào, cũng như giữa nhân và tế bào chất.
Đường kính của nhân tế bào nấm men vào khoảng 2 µm. Phần lớn nhân
có dạng hình cầu hoặc hình elip. Sự phân bố của chúng trong nội bào có thể
thay đổi trong suốt quá trình sống của tế bào. Kích thước nhân tế bào nấm
men không đồng nhất không những ở các tế bào khác giống, mà ở tế bào cùng
một giống trong các trạng thái sinh lý khác nhau. Nhân to ở các giống
Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Saccharomycodes và dễ dàng nhìn thấy
dưới kính hiển vi [14].
2.1.3. Sinh sản của nấm men
Ở nấm men có 3 hình thức sinh sản
- Sinh sản sinh dưỡng
Là hình thức sinh sản đơn giản nhất của nấm men. Có hai hình thức sinh
sản sinh dưỡng: nảy chồi và hình thức ngang phân đôi tế bào như vi khuẩn.
Nảy chồi là hình thức sinh sản vô tính phổ biến nhất gặp ở hầu hết nấm
men. Ở điều kiện thuận lợi nấm men sinh sôi nảy nở rất nhanh. Khi một chồi
xuất hiện các enzym thủy phân sẽ làm phân giải phần polysaccharide của thành
tế bào làm cho chồi chui ra khỏi tế bào mẹ. Vật chất mới được tổng hợp sẽ được
huy động đến chồi và làm chồi phềnh to dần lên. Khi đó sẽ xuất hiện vách ngăn
giữa chồi và tế bào mẹ. Sau đó, chồi tách khỏi tế bào mẹ [13].

Đồ án tốt nghiệp
Hình thức nảy chồi là hình thức sinh sản phổ biến nhất ở nấm men, thường
gặp ở giống Saccharomyces, Candida, Torulopsis [40].
Lối phân cắt ở tế các bào nấm men cũng tương tự như ở vi khuẩn. Tế bào
dài ra, ở giữa mọc ra vách ngăn chia tế bào ra thành hai phần tương đương nhau

mỗi tế bào con có một nhân. Hình thức sinh sản này thường gặp ở nấm men
Schizosaccharomyces [13].
- Sinh sản đơn tính: đó là quá trình hình thành bào tử trực tiếp từ 1 tế bào
riêng lẻ không thông qua tiếp hợp. Gặp ở nhiều loài trong giống
Schiwanniomyces, Pichia [40].
- Sinh sản hữu tính
Sinh sản hữu tính ở nấm men thường ít xảy ra so với sinh sản sinh dưỡng,
tuy nhiên nhờ có sinh sản hữu tính mà các hiện tượng tái tổ hợp các đặc điểm di
truyền xảy ra.
Sinh sản hữu tính do hai tế bào nấm men kết hợp với nhau hình thành hợp
tử. Hợp tử phân chia thành các bào tử nằm trong nang, nang chín bào tử phát tán
ra ngoài. Nếu hai tế bào nấm men có hình thái kích thước giống nhau tiếp hợp
với nhau thì được gọi là tiếp hợp đẳng giao. Nếu hai tế bào nấm men khác nhau
thì gọi là tiếp hợp dị giao [5].
2.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của nấm men
2.1.4.1. Dinh dưỡng của nấm men
Chất dinh dưỡng từ môi trường nuôi cấy được thấm qua màng vào tế bào.
Khi môi trường nghèo hoặc cạn các chất dinh dưỡng thì những chất dự trữ nội
bào như glycogen, trehalose, lipit, các hợp chất chứa nitơ sẽ được sử dụng và
được gọi là dinh dưỡng nội bào.
Các chất dinh dưỡng khi được sử dụng hoặc là đi vào thành phần tế bào
để phục vụ cho sinh trưởng hoặc là cung cấp năng lượng cần thiết cho đời sống
của tế bào [14].
2.1.4.2. Dinh dưỡng Cacbon
Nguồn cacbon cung cấp cho nấm men là các loại đường khác nhau:
saccarose, lactose, glucose,… và dẫn xuất, các rượu, axit hữu cơ, axit amin,
Hầu hết các loài nấm men đều sử dụng được đường glucose.
Các loài nấm men dùng sản xuất men gia súc thuộc giống Candida,
Torulopsis có thể đồng hóa được đường peptone. Vì vậy, các men này có thể


Đồ án tốt nghiệp
nuôi cấy ở dịch thủy phân từ gỗ hoặc các nguồn giàu hemicellulose. Những
disacarit (maltose và saccarose) trước khi được nấm men sử dụng phải qua thủy
phân sơ bộ thành đường đơn nhờ enzyme tương ứng của nấm men [40].
Trong quá trình nuôi cấy glucose và fructose được sử dụng trước, kế tiếp là
axit béo tùy thuộc vào thành phần của axit này. Trong đó axit acetic và glucose được
sử dụng đồng thời. Nấm men sẽ sử dụng nguồn dinh dưỡng có lợi trước.
Ngày nay người ta đang nghiên cứu vai trò của CO
2
trong trao đổi chất
của nấm men, vì CO
2
là chất hoạt động sinh học. Những dạng liên kết với CO
2
đều cần thiết cho nấm men, như axit pyruvic, axit cacbonic, và hàng loạt axit
hữu cơ khác. [14]
2.1.4.3. Dinh dưỡng Nitơ
Nấm men không có men ngoại bào để phân giải protid, nên không thể
phân cắt albumin của môi trường mà phải cung cấp nitơ ở dạng hoà tan, có thể là
đạm hữu cơ hoặc vô cơ.
Nguồn nitơ vô cơ được nấm men sử dụng tốt là các muối amoni của axit
vô cơ cũng như hữu cơ. Đó là amoni sunphat, phosphat rồi đến các muối axetat,
lactat, malat và sucxinat.
Các nguồn nitơ hữu cơ thường là hỗn hợp các axit amin, các peptit, các
nucleotic, Trong thực tế người ta hay dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủy
phân protein tự nhiên (đậu tương, khô lạc, ) làm nguồn nitơ hữu cơ.
Nấm men tiêu hóa rất tốt các axit amin, còn pepton kém hơn và hoàn toàn
không sử dụng được protein. Nấm men chỉ sử dụng được các axit amin ở dạng
tự nhiên (L - axit amin). Trong quá trình nuôi cấy nấm men các axit amin vừa là
nguồn nitơ vừa là nguồn cacbon dinh dưỡng [14], [15].

2.1.4.4. Dinh dưỡng của các nguyên tố vô cơ
Các nguyên tố vô cơ là rất quan trọng. Trong đó nhu cầu photpho là được
quan tâm trước hết, sau đó là kali, magie, lưu huỳnh,…
Phospho chứa nhiều hợp chất quan trọng của tế bào. Nấm men sử dụng tốt
nguồn photpho vô cơ là ortophosphat. Thiếu phospho trong môi trường dẫn đến
sự thay đổi đáng kể sự trao đổi chất, phá hỏng nhu cầu và sự hấp thu cacbon,
nitơ [37].

Đồ án tốt nghiệp
Lưu huỳnh có trong protein và coenzyme A, nếu thiếu lưu huỳnh sẽ phá
hỏng sự trao đổi chất và tổng hợp protein, enzyme. Trong điều kiện kỵ khí, S bị
khử thành H
2
S.
Nguyên tố vi lượng cũng cần thiết cho quá trình sinh lý tế bào như:
mangan, đồng, sắt, kẽm,…[14].
2.1.5 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển của nấm men
Khi cấy nấm men hay vi sinh vật nói chung vào môi trường dinh dưỡng,
chúng sẽ sinh sản cho đến khi cơ chất dinh dưỡng cần thiết trong môi trường
giảm tới mức thấp nhất. Khi đó, sinh trưởng phát triển của chúng chậm dần và
ngừng hẳn, cũng có thể tế bào còn vài lần phân chia tiếp, nhưng sự phân chia
làm tăng sinh khối không đáng kể. Nếu trong cả quá trình nuôi cấy này ta không
bổ sung và loại bỏ các sản phẩm trao đổi chất thì ta có quần thể tế bào trong
không gian sống có giới hạn . Quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật
nói chung, trong đó có nấm men được chia làm 4 pha [14].
2.1.5.1. Pha tiềm phát
Vi sinh vật mới được cấy vào môi trường nên chưa tăng về mặt số lượng.
Đây là giai đoạn nấm men mới được cấy vào môi trường và chưa thực hiện quá
trình sinh sản. Vận tốc sinh trưởng xem như bằng không. Nguyên nhân chủ yếu
bao gồm hai loại:

- Nguyên nhân bên trong là điều kiện của bản thân loại vi sinh vật được
cấy vào trong môi trường. Nếu giống ở dạng bào tử thì bào tử cần một thời gian
thấm nước trương lên, các hệ enzyme chuyển từ trạng thái không hoạt động sang
hoạt động, bào tử nảy mầm, sinh trưởng. Nếu giống còn non thì sẽ tiếp tục sinh
trưởng đến khi đạt kích thước tối đa và đến tuổi sinh lý trưởng thành. Còn tế bào
trưởng thành cũng không thể sinh sản ngay được mà còn phải có thời gian làm
quen với môi trường, đồng thời tiến hành tích luỹ năng lượng chuẩn bị cho giai
đoạn sinh sản.
- Nguyên nhân bên ngoài là điều kiện môi trường gồm có chất dinh dưỡng, độ
pH môi truờng, độ ẩm, nhiệt độ,… Trong môi trường càng đầy đủ dinh dưỡng, giống
nấm men cấy vào càng non, khỏe thì pha tiềm phát càng ngắn [7].

Đồ án tốt nghiệp
Hình 2.2. Các pha sinh trưởng của vi sinh vật theo thời gian [2].
2.1.5.2. Pha logarit
- Trong pha này nấm men sẽ phát triển số lượng tế bào theo cấp số nhân
với tốc độ sinh trưởng là cực đại. Trong pha này, nấm men có hoạt tính sinh lý
sinh hóa rất đặc trưng và chúng rất nhạy cảm với các nhân tố không thuận lợi
hơn các tế bào đã trưởng thành và ở trạng thái ổn định.
- Trong pha logarit tế bào phát triển ồ ạt, trong khi đó các chất dinh dưỡng
trong môi trường không phải là vô tận mà ngược lại ngày một giảm đi, hơn nữa
trong môi trường xuất hiện và tích tụ những sản phẩm trao đổi chất không cần
thiết đối với giống nuôi cấy. Như vậy trong quá trình chất dinh dưỡng cạn dần,
các sản phẩm sinh ra làm cho các điều kiện mất đi sự thuận lợi cho sinh trưởng
và quá trình chuyển sang pha ổn định [14].
2.1.5.3. Pha cân bằng
Trong pha này tổng số tế bào gần như không thay đổi nghĩa là trong một
đơn vị thời gian số tế bào sinh ra bằng số tế bào chết đi gọi là trạng thái cân
bằng động. Ở pha này chất dinh dưỡng trong môi trường giảm nhiều nên tế bào
sinh sản giảm, tế bào chết ngày càng tăng, đối với quá trình lên men rượu ở pha

này nấm men tích tụ nhiều sản phẩm trong môi trường nuôi cấy. Đây cũng là
giai đoạn kết thúc việc lên men [7].
2.1.5.4. Pha suy vong
Trong pha này tế bào sống giảm dần và tế bào chết tăng dần, một số tế
bào chất bị tự phân do các enzyme proteaza nội bào. Các tế bào sống trở nên già

Đồ án tốt nghiệp
đi, kích thước nhỏ lại, biến dạng và tế bào chất xuất hiện dạng hạt. Tế bào chất
bị tự phân trở nên trống rỗng và bên trong còn các hạt chất béo nhỏ [14].
2.1.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm men
2.1.6.1. Môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy thích hợp nhất cho nấm men cần có nguồn
hydratcacbon, nguồn nitơ, phospho, một số nguyên tố vi lượng như K, Na, Mg,
Ca và vitamin.
Saccharomyces cerevisiae có khả năng phát triển trên môi trường mà
nguồn cacbon duy nhất là tinh bột, phát triển dễ hơn trên môi trường đường với
nguồn nguyên liệu được nấu chín thì tốt hơn [40].
2.1.6.2. Nhiệt độ
Mỗi vi sinh vật đều có khoảng nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát
triển của chúng. Với Saccharomyces cerevisiae, nhiệt độ tối ưu là 28 – 30
o
C,
trên 43
o
C và dưới 28
o
C thì sự sinh sản của nấm men chậm hoặc ngừng hẳn.
Ở 30
o
C nấm men hoang dại phát triển nhanh hơn S. cerevisiae 2 – 3 lần, ở

35 – 38
o
C chúng phát triển nhanh hơn 6 – 8 lần.
Ở nhiệt độ cao hoạt tính của nấm men giảm nhanh; còn ở nhiệt độ thấp
khoảng 20 – 23
o
C, hạn chế được mức độ tạp nhiềm và khả năng lên men cao,
kéo dài hơn [40].
2.1.6.3. pH của môi trường
pH của môi trường nuôi vi sinh vật nói chung có ảnh hưởng tới đời sống
vi sinh vật rất lớn. Mỗi chủng vi sinh vật hay mỗi nhóm vi sinh vật có khoảng
pH thích ứng hay tối thích cho sinh trưởng và phát triển.
Ở nhóm nấm men, với các giống men rượu Saccharomyces cũng có những
pH tối thích khác nhau. pH tối ưu cho nấm men khoảng 4,5 – 5,6. Ở pH = 4, tốc
độ tích lũy sinh khối giảm, pH = 3 – 3,5 thì sinh sản của nấm men ngừng lại.
Đối với men rượu và men bia thuộc giống Saccharomyces pH ban đầu thích hợp
cho lên men là khoảng 5,5. Mức độ hấp thụ chất dinh dưỡng vào tế bào, hoạt
động của hệ thống enzyme, sự sinh tổng hợp protein đều bị ảnh hưởng bởi pH
nên chất lượng của nấm men giảm đi [14], [40]
2.1.6.4. Khí CO
2
Dưới áp lực khí quyển CO
2
hoàn toàn không ảnh hưởng ức chế đến sinh
trưởng của nấm men và lên men. Nếu loại bỏ CO
2
từ môi trường bằng nito hoặc
không khí quá trình lên men không tăng nhanh hơn. Khi bơm CO
2
vào môi

trường với các chủng nấm men có hoạt lực lên men mạnh kích thước tế bào sẽ
tăng lên, ngược lại với các chủng có hoạt lực lên men yếu sẽ nhỏ hơn [14].

Đồ án tốt nghiệp
2.2. Tổng quan về amylase
2.2.1. Định nghĩa
Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các
enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân
trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước.
RR’+H-OH RH + R’OH
Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose
và dextrin hạn chế. [8]
2.2.2. Phân loại
Theo tính chất và cách thức tác dụng lên tinh bột, có 3 loại amylase được
biết đến nhiều nhất là: α-amylase, β-amylase, γ-amylase(hay còn gọi là
glucoamylase ). β-amylase và glucoamylase là các enzym exo vì chúng xúc tác
giải phóng maltose và glucose từ α-glucan. Ngược lại, α-amylase là một enzyme
endo vì nó xúc tác phân giải bên trong mối liên kết glucosid của α-glucan để tạo
ra các oligosaccheride với các mức độ trùng hợp khác nhau.
2.2.2.1. α- amylase
- α-amylase (endo-1,4-α-D-glucan glucohydrolase) đóng một vai trò trung
tâm trong quá trình thủy phân tinh bột cả trong tự nhiên và trong công nghiệp.
Một lượng lớn enzyme trong nhóm này được thu nhận từ động vật, thực vật và
vi sinh vật.
- α-amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điểm giống nhau, chúng có
khả năng xúc tác thủy phân liên kết α-1,4-glucoside nội mạch ở bất kỳ vị trí nào
và không theo một trật tự nào trong phân tử tinh bột mà không thể phân cắt mối
kiên kết α-1,6 [17].

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.3. Cấu trúc không gian của α-amylase [42]
2.2.2.2. β-amylase
β-amylase (α-1,4-glucan maltosehydrolase) được phát hiện sau α-amylase
và chỉ có mặt trong các loài thực vật. Cơ chế tác dụng của β-amylase: β-amylase
xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4-glucan trong tinh bột, glycogen,
polysaccharide đồng loại, phân cắt tuần tự từng gốc maltose một từ đầu không
khử của mạch. Theo đặc tính tác dụng lên tinh bột, β-amylase hầu như không thủy
phân lên hạt tinh bột nguyên mà lại thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột. β-amylase
phân giải 100% amylose thành maltose và 54-58% amylopectin thành maltose.
β-amylase có ái lực với liên kết α-1,4-glucoside cách đầu không khử của
mạch một liên kết α-1,4. Khác với α-amylase, β-amylase vẫn giữ được hoạt tính
khi không có canxi. β-amylase kém bền dưới tác dụng của nhiệt độ cao, β-amylase
bị vô hoạt hoàn toàn ở nhiệt độ 70
o
C, nhiệt độ tối thích trong dịch tinh bột thuần
khiết là 40 - 50
o
C song trong dịch nấu nhiệt độ tối thích là 60 - 65
o
C. Đa số β-
amylase hoạt động mạnh hơn trong môi trường pH = 4,5-5. β-amylase chỉ phổ biến
trong thế giới thực vật, đặc biệt có nhiều trong các hạt nảy mầm [17], [38].
2.2.2.3. Glucoamylase
Glucoamylase (α-1,4-glucan glucohydrolase) hay còn gọi là γ-amylase
hoặc amyloglucosidase được phát hiện ra vào năm 1950 khi các nhà nghiên cứu
Nhật Bản khảo sát về amylase của nấm. Amylase mới này được sử dụng để sản
xuất glucose từ tinh bột như là sản phẩm duy nhất.

Đồ án tốt nghiệp
Ở nồng độ tinh bột cao (40%), enzyme này xúc tác phản ứng ngưng tụ để

sản xuất maltose và isomaltose. Phản ứng này bảo vệ được 100% năng suất của
glucose ở giai đoạn đường hóa tinh bột trong công nghiệp.
Đa số glucoamylase đều thuộc loại enzyme acid thể hiện hoạt lực tối đa ở
vùng pH = 3,5-5,5. Nhiệt độ hoạt động tối thích của glucoamylase là 50-60
o
C.
Hầu hết glucoamylase bị mất hoạt tính khi đun nóng trên 70
o
C. So với α-
amylase, glucoamylase bền với acid hơn nhưng lại kém bền dưới tác dụng của
etylic, axeton [17], [38].
2.2.3. Ứng dụng amylase
2.2.3.1. Ứng dụng amylase trong việc sản xuất các sản phẩm thủy phân từ tinh bột.
Trong những năm gần đây, amylase đã được sử dụng trong quá trình sản
xuất maltodextrin, xiro glucose và fructose.
Trong quá trình sản xuất công nghiệp, người ta thường sử dụng α-amylase
chịu nhiệt làm tác nhân thủy phân để phân cắt một phần tinh bột, làm giảm độ nhớt.
So với phương pháp thủy phân bằng acid (HCl hoặc axalic acid) thì việc
thủy phân bằng α-amylase chịu nhiệt làm giảm các sản phẩm phụ tạo thành và
chi phí cho quá trình tinh chế và phục hồi thấp hơn.
Sự thủy phân nửa vời là bước đầu tiên và quan trọng nhất trong chế biến
tinh bột. Mục đích là để làm giảm độ nhớt giúp phù hợp với quá trình chế biến.
Nếu quá trình thủy phân nửa vời không tốt quá trình lọc sẽ khó khăn [17].
2.2.3.2. Ứng dụng của amylase trong sản xuất bia
Trong công nghiệp sản xuất bia truyền thống, các nước phương tây chủ
yếu sử dụng enzyme amylase của malt để thủy phân tinh bột trong malt, sau đó
đến giai đoạn rượu hóa bởi nấm men Saccharosemyces sp. Cơ sở của việc sử
dụng amylase của malt ở chỗ, khi đại mạch chuyển từ trạng thái hạt sang trạng
thái nảy mầm, amylase sẽ được tổng hợp và khi đó enzyme này sẽ thủy phân
tinh bột có trong hạt tạo ra năng lượng và vật chất cho sự tạo thành nảy mầm.

Như vậy việc đường hóa tinh bột trong hạt nhờ enzyme của chính nó. Khi đó hạt
chỉ tổng hợp ra lượng amylase vừa đủ để thủy phân tinh bột có trong hạt. Như
thế cần rất nhiều mầm đại mạch để sản xuất bia ở quy mô lớn, dẫn đến chi phí
cao cho sản xuất và sản phẩm.
Để khắc phục điều này thì hiện nay ở nhiều nước trên thế giới người ta
thay thế từ 25-50% malt bằng các nguyên liệu phi malt, nghĩa là bằng các hạt đại

Đồ án tốt nghiệp
mạch chưa nảy mầm như đại mạch loại hai, loại ba, ngô đã lấy hết chất béo,…
[39].
2.2.3.3. Ứng dụng amylase trong sản xuất cồn
Để sản xuất cồn từ nguồn nguyên liệu tinh bột, mỗi nước sử dụng các loại
nguyên liệu khác nhau. Ví dụ, ở Mỹ người ta sử dụng nguyên liệu từ bột ngô để sản
xuất, ở Brazin lại sử dụng khoai mỳ, các nước khác sử dụng gạo hoặc tấm từ gạo.
Người Nhật đã biết sử dụng enzyme của nấm mốc trong quá trình đường
hóa để sản xuất rượu sake từ cách đây hơn 1700 năm.
Người trung quốc thì đã sử dụng nhiều loại nấm mốc để đường hóa rượu
cách đây hơn 4000 năm. Còn người Việt Nam đã biết sản xuất rượu gạo từ cách
đây hàng ngàn năm
Quá trình sản xuất cồn trải qua hai gai đoạn: giai đoạn đường hóa và giai
đoạn rượu hóa.
Thông thường, ở giai đoạn đầu (giai đoạn đường hóa) người ta thường sử
dụng enzyme amylase để thủy phân tinh bột. Sau đó đến giai đoạn rượu hóa
người ta lại sử dụng nấm men để lên men tạo rượu. Chế phẩm amylase thường
dùng ở dạng thô không phải qua tinh chế [43], [39].
2.2.3.4. Ứng dụng của amylase trong chế biến thức ăn gia súc
Amylase có chức năng phân giải tinh bột thành đường. Do đó, chúng có
vai trò quan trọng trong việc hấp thụ chất dinh dưỡng từ thức ăn đối với động
vật. Trong chế biến thức ăn gia súc, thành phần ngũ cốc chiếm một khối lượng
rất lớn. Trong đối tượng này, thành phần tinh bột rất cao. Để tăng hiệu suất sử

dụng năng lượng từ nguồn tinh bột, người ta thường cho thêm amylase vào.
Amylase sẽ tham gia phân giải tinh bột thành đường, giúp cho quá trình tiêu hóa
tinh bột diễn ra tốt hơn, giúp cho gia súc dễ tiêu hóa, dễ hấp thụ thức ăn, đặc biệt
cho gia súc con. Nhằm làm cho gia súc tăng trọng nhanh, tăng khả năng sinh
sản, giảm lượng thức ăn, nâng cao hiệu quả kinh tế cho người chăn nuôi [39].
2.3. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới liên quan đến đề tài
2.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu quan trọng tìm ra các chủng nấm
men có khả năng phân giải tinh bột góp phần quan trọng trong một số ngành
công nghiệp thực phẩm. Nấm men tiết amylase phân giải tinh bột ở nhiều mức
độ, mạnh mẽ khác nhau (De Mot và cộng sự, 1984a, 1984b). Theo nghiên cứu

Đồ án tốt nghiệp
của McCann và Barnet (1984), chủng Filobasidiuim capsuligenum là có khả
năng thủy phân tinh bột rất mạnh [33], [34].
Năm 1988, Laluce nghiên cứu chủng nấm men có khả năng lên men tinh
bột và dextrin thành ethanol đã được phân lập từ các mẫu thu thập được từ nhà
máy tinh bột sắn của Brazil. Kết quả cho thấy rằng họ đã phân lập được các
chủng nấm men có khả năng phân giải tinh bột. Đặc điểm hình thái và đặc tính
sinh lý đã được mô tả và DNA - DNA tương đồng cho thấy chủng này được gọi
là Saccharomyces cerevisiae [25].
Năm 2013, trong nghiên cứu về phân lập và sản xuất amylase từ nấm men,
H Tansel đã phân lập được 25 chủng nấm men từ năm nguồn khác. Sau khi ủ
trong môi trường có chứa tinh bột để sàng lọc sản xuất amylase, rằng đã tìm
thấy có 12 chủng nấm men sản xuất amylase và trong số đó có 3 chủng cho thấy
hoạt động amylase cao nhất. Các chủng có hoạt động cao nhất được xác định là
S. fibuligera. Các chủng cho thấy việc sản xuất amylase cao nhất ở 30
o
C và pH
5,5. Nghiên cứu cho thấy rằng các điều kiện lên men thuận lợi và lựa chọn các

thông số thích hợp cho tăng trưởng đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất
amylase [31].
Gần đây nhất, Tofighi và cộng sự (2014) đã nghiên cứu phân lập nấm men
từ nước thải của một nhà máy sản xuất tinh bột. Việc phân lập được xác định bởi
đặc tính phân tử. Đặc điểm của các chủng phân lập được xác định ở mức 30, 35,
40 và 45
o
C trong 48h. Kết quả phân lập được 50 chủng nấm men có khả năng
phát triển tốt trong đĩa thạch trong một khoảng nhiệt độ từ 30 – 45
o
C. Nấm men
được chọn, chỉ định là AT-3, chủng cho thấy khả năng keo tụ với hiệu quả sản
xuất athanol cao hơn và lớn nhanh hơn so với phần còn lại. Các men được chọn
đã xác định là một chủng mới của nấm men Saccharomyces cerevisiae [22].
2.3.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước.
Amylase là một enzyme có khả năng thủy phân mối liên kết glucosid của
phân tử tinh bột. Amylase có thể được tìm thấy trong nhiều nguồn khác nhau.
Đặc biệt, nó được tìm thấy trong một loạt sinh vật sống, từ vi sinh vật bao gồm
nấm men, nấm mốc, vi khuẩn đến thực vật và cả con người.
Năm 1996, Nguyễn Khắc Tuấn đã nghiên cứu và tuyển chọn được một số
chủng nấm men từ bánh men cổ truyền để sản xuất một số chế phẩm sinh học sử
dụng trong chăn nuôi lợn. Đã tiến hành trên 31 mẫu bánh men rượu nổi tiếng và
trên 31 mẫu đó đã phân lập được 105 chủng nấm men. Kết quả cho thấy các
chủng nấm men phân lập được chỉ thuộc về 10 giống trong tổng số 39 giống

Đồ án tốt nghiệp
thuộc khóa phân loại của Lodder J (1971). Trong đó giống có mẫu phân lập
được lớn nhất là Saccharomyces tiếp theo là các giống Candida, Torulopsis và
Endomycopsis [20].
Năm 2006, nấm men và giả nấm men thuộc giống

Candida,Saccharomyces cũng tạo amylase. Đặc biệt người ta đã tuyển chọn
được chủng Endomycopsis species có khả năng tổng hợp mạnh mẽ
glucoamylase, α-amylase, glucoziltransferase và invertase [14].
Năm 2007, đã có một số nghiên cứu khảo sát sự sinh trưởng của
Sacchromyces sp. trên môi trường cám gạo, rỉ đường và một số yếu tố ảnh
hưởng đến sức sống của chúng trong chế phẩm. Kết quả cho thấy, 4 chủng nấm
men phân lập được từ 4 nguồn mẫu khác nhau nuôi trong môi trường cám gạo
và rỉ đường. Số lượng tế bào Saccharomyces cerevisiae cao hơn trong môi
trường rỉ đường và về thời gian thu hoạch số lượng tế bào Sacchromyces
cerevisiaeở thời điểm 48 giờ cao hơn 60 và 36 giờ [40].
Năm 2012, Nguyễn Hữu Thanh cùng một số tác giả khác nghiên cứu khảo
sát một số đặc tính sinh học và định danh nấm men được phân lập từ bánh men
rượu ở Đồng Bằng sông Cửu Long. Kết quả cho thấy rằng, 128 chủng nấm men
được phân lập đều có khả năng chịu nhiệt ở 30
o
C và 40
o
C do nhiệt độ môi
trường ở vùng này phổ biến ở 30 – 32
o
C. Trong đó phát hiện được 30 chủng
chịu nhiệt ở 50
o
C đồng thời chịu cồn 17ml/L, sinh bào tử và lắng tốt, 10 chủng
trong đó không sinh H
2
S. Giải trình tự 10 chủng, 7 chủng xác định là
Saccharomyces cerevisiae, 3 chủng là Clavispora lusitaniae. Nếu so với kết quả
nghiên cứu của Guimaraes và cộng sự (2006) phân lập nấm men Saccharomyces
cerevisiae tại các vùng sản xuất rượu nho ở Brasil chỉ có 2 chủng nấm men chịu

nhiệt ở 45
o
C trong 15 dòng thử nghiệm, thì nấm men trong bánh men rượu ở
vùng Đồng Bằng sông Cửu Long có khả năng chịu nhiệt cao hơn ở Brasil [19].

Đồ án tốt nghiệp
PHẦN 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng nghiên cứu.
- Các chủng nấm men được phân lập từ các nguồn nguyên liệu như: gạo,
bã bia, nước thải bã sắn.
3.2. Nội dung nghiên cứu
3.2.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men thuộc chi Saccharomyces
từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên (gạo, nước thải bã sắn, bã bia).
- Phân lập và xác định một số đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế
bào của chủng nấm men phân lập được.
- Xác định khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm men phân lập được.
- Định danh chủng nấm men.
3.2.2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng, phát triển
và hoạt tính amylase của chủng Saccharomyces cerevisiae.
- Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng, phát triển và hoạt
tính maylase của chủng Saccharomyces cerevisiae.
- Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng, phát triển và hoạt
tính maylase của chủng Saccharomyces cerevisiae.
- Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng, phát tiển và hoạt tính
maylase của chủng Saccharomyces cerevisiae.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp phân lập
Nguyên lí: một lượng nhỏ vi sinh vật được pha loãng trước được dàn đều
lên trên bề mặt hộp peptri có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp.

Tiến hành: Chuẩn bị một dãy ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý
0.85% đã được khử trùng. Đồng nhất gạo, bã bia, nước thải bã sắn và lấy 1ml
dịch cho vào ống nghiệm, cứ tiếp tục làm tương tự để pha loãng đến nồng độ
cao hơn. Lấy từ 3-4 ống nghiệm cuối cùng của mức độ pha loãng và dùng pipet
hút 1ml dịch huyền phù cho vào đĩa peptri có đổ môi trường Hansen đã được
khử trùng và làm nguội đến 50
o
C vào, xoay nhẹ và đều tay hộp peptri để môi
trường phân bố đều trong đĩa. Đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 30
o
C ± 2
o
C. Sau 24 - 36h
lấy ra quan sát khuẩn lạc.

Đồ án tốt nghiệp
Các thao tác pha mẫu, đổ môi trường được thực hiện trong buông cấy vô
trùng, bên cạnh ngọn lửa đèn cồn. Tìm trên các đĩa peptri những khuẩn lạc có
các đặc điểm hình thái khác nhau. Mỗi khuẩn lạc được phân lập trên hai đĩa
peptri chứa môi trường Hansen đặc. Việc phân lập được lập lại 3-4 lần cho đến
khi thu được khuẩn lạc đồng nhất thì tiến hành giữ giống. [20], [4], [10], [9]
3.3.2. Phương pháp định tính xác định khả năng phân giải tinh bột của các
chủng nấm men phân lập được
Để lựa chọn chủng nấm men có khả năng phân giải tinh bột thì chúng tôi
tiến hành phương pháp định tính bằng cách nuôi cấy theo phương pháp chấm
điểm trên môi trường Hansen đã được thay glucose bằng tinh bột, nuôi cấy ở
nhiệt độ 30
o
C. Tiến hành nuôi trong 3-5 ngày. Sau đó, nhuộm màu bằng dung
dịch thuốc nhuộm Lugol. Quan sát đường kính vòng thủy phân tinh bột xung

quanh khuẩn lạc nấm men. Nếu thuốc thử Lugol không bắt màu quanh vết cấy
thì chứng tỏ nấm men đó có khả năng phân giải tinh bột [18], [6].
3.3.3. Phương pháp cấy chuyền và giữ giống
Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc từ ống thạch nghiêng chứa môi trường
Hansen đặc vào ống nghiệm chứa Hansen lỏng. Nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ
35
o
C ± 2
o
C. Sau 24 giờ dùng que cấy đã được vô trùng nhúng vào dịch nuôi rồi
cấy lên đĩa thạch chưa môi trường Hansen. Nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 30
o
C
trong vòng 48 giờ cho khuẩn lạc phát triển. Chọn những khuẩn lạc riêng lẽ cấy
ria vào ống thạch nghiêng, Giống được bảo quản trong ống thạch nghiêng ở 3 -
4
o
C trong vòng 1 tháng [4], [10], [9], [18].
3.3.4. Phương pháp xác định đặc điểm hình thái tế bào của chủng nấm men
có khả năng phân giải tinh bột phân lập được
Bằng cách soi tiêu bản sống: dùng que cấy vô trùng lấy tế bào vi sinh vật
từ ống giống, dàn đếu trên giọt nước vô trùng đã nhỏ sẵn trên phiến kính, hơ trên
ngọn lửa đèn cồn cho khô bề mặt kính. Nhỏ vài giọt xanh metylen lên phiến
kính và tiếp tục hơ trên đèn cồn đến khô và đậy lamel. Quan sát tiêu bản dưới
kính hiển vi điện tử [4], [11].
3.3.5. Phương pháp định danh
Các chủng nấm mốc nghi ngờ được tiến hành định danh bằng phương
pháp giải trình tự gen 28S rRNA trên hệ thống ABI 3130XL, CEQ 8000 và tra
cứu trên BLAST SEARCH.


Đồ án tốt nghiệp
Nguyên tắc: để giải trình tự rRNA 16S, người ta dùng phương pháp điện
di trên gel agarose sản phẩm PCR của DNA. Với phương pháp đánh dấu mồi thì
sau khi điện di, người ta phát hiện các vạch điện di và từ các vạch này giải được
trình tự của đoạn RNA. Sau đó đối chiếu với ngân hàng gen để định danh chủng.
3.3.6. Phương pháp định lượng xác định hoạt tính amylase: phương pháp Bernfeld
3.3.6.1. Nguyên tắc
Dùng dung dịch tinh bột làm cơ chất để xác định hoạt độ thủy phân của
amylase trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành bằng phản ứng màu với thuốc
thử tạo màu Dinitrosalisylic.
Độ hấp thụ ánh sáng (OD) của dung dịch tạo màu thu được đo trên máy so
màu ở bước sóng 540nm.
3.3.6.2. Cách tiến hành
Hỗn hợp phản ứng 0,1ml dung dịch tinh bột 1% (hòa tan 1g tinh bột và
0,035g NaCl trong dịch đệm photphat, pH 7,0 đun sôi cho đến tan, để nguội và
dẫn đến 100ml) và 0,1ml dung dịch enzym. Ủ hỗn hợp này ở 30
o
C, 10 phút.
Tiếp tục cho vào hỗn hợp trên 0,2ml dung dịch Dinitrosalisylic 1% và ủ ở 100
o
C
trong 10 phút. Sau đó ủ hỗn hợp này trong nước đá 10 phút. Bổ sung vào hỗn
hợp 2ml nước cất trước khi đưa đi so màu ở bước sóng 540nm.
Tiến hành làm mẫu trắng song song với mẫu chuẩn bằng cách vô hoạt
enzym bởi nhiệt (đun trong nước sôi 10 phút) và acid Dinitrosalisylic 1% trước
khi tiến hành các bước tiếp theo như trên [20].
3.3.6.3. Cách lập đường chuẩn để xác định hoạt độ amylase
- Hóa chất
+ Dung dịch maltose chuẩn nồng độ 0,01M
+ Thuốc thử tạo màu

+ Nước cất
- Cách tiến hành
Cách tiến hành lập đường chuẩn để xác định hoạt độ amylase được trình
bày ở bảng 3.1.


 !"#$
%& '() '*+#,
-%!.
/#0 1213(!4! !05!6
!7( !8 !9:.
; <=>5?!!3@
AB!C!
D!
17 EF1<F.
Đồ án tốt nghiệp
Bảng 3.1. Cách tiến hành lập đường chuẩn để xác định hoạt độ amylase
Cho vào ống nghiệm Mẫu chuẩn
Nước cất 0,16ml 0,12ml 0,08ml 0,04ml 0ml
Dung dịch maltose chuẩn 0,04ml 0,08ml 0,12ml 0,16ml 0,2ml
Thuốc thử tạo màu 0,2ml 0,2ml 0,2ml 0,2ml 0,2ml
Lắc nhẹ, đặt trong nước sôi 10 phút, làm nguội trong chậu nước đá
Nước cất 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml
Trộn đều, đọc mật độ quang ở bước sóng 540nm
Vẽ đường chuẩn maltose với trục tung là mật độ quang, trục hoành là
nồng độ maltose.
Hình 3.1. Đường chuẩn maltose
3.3.6.4. Tính kết quả
- Hoạt độ amylase được tính theo công thức
(U/ml)

- Trong đó:
10: Thời gian phản ứng
0,1: Thể tích dịch enzyme đem phản ứng
3.3.7. Bố trí thí nghiệm
3.3.7.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men thuộc chi Saccharomyces
từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên.
Từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên (gạo, bã bia, nước thải bã sắn), chúng
tôi tiến hành phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men thuộc chi
Saccharomyces trên môi trường Hansen. Quá trình phân lập được thực hiện theo
sơ đồ sau:

: G(
H!CB!,I(,
JCB!K!7 L(.
-%M!N .
J;L(.
;(=
#O(.
-%M!N .
-10M!N
%!@=(&
;!'(,#,',@#,P
Q) '*+#,OR#K!7 L.
)&$
@STM!N .
! 17 !*M+.
H!*
!!!@=!
M+
UUUU@=

! 17
@=%
A(V 17 <=
#O(.
Đồ án tốt nghiệp
Hình 3.2. Sơ đồ tiến hành phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men thuộc chi
Saccharomyces.
3.3.7.2. Khảo sát ảnh hưởng của một yếu tố đến khả năng sinh trưởng, phát triển và
hoạt tính amylase của chủng Saccharomyces cerevisiae B1
Sau khi định danh được chủng nấm men B1 là Saccharomyces cerevisiae
,chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh
trưởng, phát triển và hoạt tính amylase của chủng này theo sơ đồ như sau:

Đồ án tốt nghiệp
Hình 3.3. Sơ đồ tiến hành khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng
sinh trưởng, phát triển và hoạt tính amylase của chủng nấm men
Saccharomyces cerevisiae B1
3.3.8. Phương pháp xử lý số liệu
Sử dụng phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) để xác định sự sai
khác giữa các trung bình bằng phần mềm SAS 9.1.
PHẦN 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn chủng nấm men thuộc chi Saccharomyces
từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên.
4.1.1. Kết quả phân lập và quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế
bào của các chủng nấm men phân lập được
Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành phân lập các chủng trên môi
trường Hansen từ các nguồn nguyên liệu là gạo, nước thải bã sắn, bã bia. Quá
trình phân lập được tiến hành nhiều lần cho đến khi khuẩn lạc xuất hiện đồng


Đồ án tốt nghiệp
nhất trên bề mặt thạch đĩa. Dựa vào đặc điểm hình thái, môi trường phân lập đặc
chủng thì chúng tôi chọn ra được 7 chủng có hình thái khuẩn lạc khác nhau.
Chúng tôi ký hiệu các chủng này như là: G1, G2, G3, T1, T2, T3, B1.
Từ các khuẩn lạc phân lập được chúng tôi tiến hành quan sát đặc điểm
hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng nấm men phân lập được.
Kết quả được trình bày ở bảng 4.1 và hình 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả phân lập các chủng
Nguồn
phân lập
Ký hiệu
khuẩn lạc
Đặc điểm khuẩn lạc
Gạo
G1 Đốm trắng sữa, viền nhẵn, bóng lồi
G2 Đốm tròn trắng sữa, viền răng cưa
G3 Đốm trắng sữa, viền răng cưa, phẳng
Nước thải
bã sắn
T1 Đốm tròn trắng ngà, viền nhẵn bóng
T2 Đốm tròn trắng sữa, viền nhẵn bóng
T3 Đốm tròn trắng sữa, viền nhẵn bóng, lồi
Bã bia B1 Đốm tròn trẵng sữa, viền nhẵn bóng, lồi

Đồ án tốt nghiệp
B1 G2
Hình 4.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thài tế bào của một số chủng
nấm men phân lập được
Qua bảng 4.1, chúng tôi nhận thấy hầu hết các chủng nghi ngờ là nấm men
có màu sắc khuẩn lạc chủ yếu là trắng sữa, viền nhẵn bóng (G1, T2, T3, B1)

hoặc trắng ngà, viền nhẵn bóng (T1) hoặc trắng sữa, viền răng cưa (G2, G3).
Sau khi soi tế bào dưới kính hiển vi chúng tôi nhận thấy rằng hầu hết các
chủng nấm men có tế bào hình bầu dục, hình cầu, có kích thước lớn (hình 4.1).
Điều này phù hợp với các nghiên cứu về cấu trúc kích thước tế bào của nấm
men [5], [14]. Do đó, chúng tôi nhận định rằng các chủng này có thể là nấm
men.
Để lựa chọn những chủng có khả năng phân giải tinh bột, chúng tôi tiến
hành phương pháp định tính xác định khả năng phân giải tinh bột của các chủng
trên, giữ lại các chủng có khả năng phân giải tinh bột phục vụ cho mục đích
nghiên cứu.
4.1.2. Kết quả định tính khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm men
phân lập được
