Tiểu luận Sắc ký lớp mỏng Điều chế


Đề Tài: Sắc ký lớp mỏng Điều chế
Giáo viên hướng dẫn
Giáo viên hướng dẫn
:
:




Sinh viên thực hiện
Sinh viên thực hiện
:
:


Lớp
Lớp
:
:



, ngày tháng năm
I. SẮC KÝ LỚP MỎNG ĐIỀU CHẾ
Nguyên tắc – yêu cầu:
Sắc ký lớp mỏng điều chế (Preparative thin layer chromatography – PTLC) là một phương
pháp sắc ký được sử dụng để tách một lượng nhỏ đơn chất (10 – 1000 mg) từ một hỗn hợp
đơn giản (chỉ gồm vài cấu tử). Trong PTLC, một dung dịch mẫu thử được chấm trên một
lớp chất hấp phụ (thường là silica gel, nhôm oxyd) có độ dày từ 0,5 – 2,0 mm tráng trên nền
phẳng (kính, kim loại, chất dẻo) đóng vai trò là một pha tĩnh. Một dung môi khai triển (pha

động) di chuyển dọc theo bản mỏng sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử theo một vận
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
Trang 1
tốc khác nhau tạo thành một sắc ký đồ gồm nhiều vết có Rf khác nhau. Sau khi khai triển, ta
có thể thu được những cấu tử đặc trưng bằng cách cạo vùng chất hấp phụ chứa vết ra khỏi
bản và phản hấp phụ chất ra khỏi giá hấp phụ bằng một dung môi thích hợp. Hợp chất thu
được từ bản mỏng có thể được tinh khiết hóa tiếp tục bằng sắc ký lớp mỏng (Thin layer
chromatography – TLC) hay các phương pháp sắc ký khác hoặc hợp chất này đã đạt độ tinh
khiết để tiến hành định tính, xác định cấu trúc bằng các phương pháp phân tích cơ bản hay
bằng phép đo quang phổ, nghiên cứu hoạt tính sinh học, nghiên cứu tổng hợp hóa học, sử
dụng như chất chuẩn đối chiếu.
1. Ưu nhược điểm của PTLC:
Ưu điểm:
Phương pháp tiến hành của PTLC nhìn chung tương tự như TLC chỉ khác ở việc sử dụng
những bản mỏng dày hơn so với TLC: PTLC 0,5 – 2 mm, có thể dày đến 10 mm tùy yêu
cầu sử dụng; TLC 0,2 – 0,25 mm.
So với sắc ký cột:
Nhanh và thuận tiện hơn so với sắc ký cột cổ điển.
Dễ tìm được dung môi thích hợp để tách các chất.
Vùng chứa chất tụ thành lớp mỏng dễ phát hiện, dễ cô lập
Tỉ lệ giữa silicagel và chất tách cao nên tách tốt hơn
Rẻ, đơn giản hơn so với HPLC. Thiết bị, thao tác đơn giản dễ nắm bắt và áp dụng.
Sử dụng một lượng nhỏ dung môi → có thể triển khai nhiều lần để thu được kết quả phân
tách tốt hơn, dễ dàng tách các vùng chứa chất hấp phụ ra khỏi bản mỏng, có thể triển khai
đồng thời các chất chuẩn đối chiếu trong cùng một điều kiện xác định giúp tạo thuận lợi cho
việc xác định hợp chất mong muốn.
Nhược điểm:
Các hợp chất kém bền chấm trên bề mặt bản mỏng có thể bị phân hủy khi tiếp xúc với
không khí và ánh sáng.
Sự hiện diện đồng thời của tạp chất khi phản hấp phụ chất mong muốn ra khỏi giá hấp phụ.

2. Ứng dụng:
Dùng để tách các chất với hàm lượng nhỏ (10 – 1000 mg) trong trường hợp không thể tách
bằng các phương pháp khác.
Có thể phân lập được các đơn chất tinh khiết với khối lượng đủ từ các polymer tổng hợp,
các sản phẩm tự nhiên từ nuôi cấy mô hay từ dược liệu, các sản phẩm chuyển hóa từ dịch
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
Trang 2
sinh học, phân biệt cấu hình hoá học của các sản phẩm thiên nhiên hay tổng hợp.để khảo sát
điểm chảy, phổ UV, IR, khảo sát cấu trúc và làm chất chuẩn.
3. Pha tĩnh:
Pha tĩnh hay sử dụng trong PTLC là các chất hấp phụ, các chất hấp phụ này phần lớn có
trộn thêm chất kết dính như CaSO4 5 – 15 %, tinh bột 2 – 5 %, dextran, nhưng cũng có
trường hợp không dùng chất kết dính.
3.1. Silica gel:
Là một chất phân cực, hoạt động chủ yếu theo cơ chế hấp phụ, trung tâm hấp phụ là các
nhóm – OH silanol → hấp phụ các chất có tính kiềm (alkaloid base ) hơn là các chất có
tính acid (polyphenol )
Mật độ nhóm silanol càng cao (VD: hạt càng mịn), khả năng hấp phụ của silica gel sẽ càng
lớn.
Khả năng hấp phụ của silica gel phụ thuộc vào phụ thuộc vào tình trạng ngậm nước của hệ
thống → khi dùng silica gel làm chất hấp phụ thì nên sấy silica gel ở 1050C trong 2h là đủ,
đừng nung quá 4500C
3.2. Nhôm oxyd:
Có 3 dạng: oxyd nhôm kiềm, trung tính, acid.
Là một chất hấp phụ phân cực mạnh, có tính trao đổi ion lưỡng tính
Trung tâm hấp phụ là các nhóm OH, khi các trung tâm hoạt động này bị hút ẩm, oxyd nhôm
sẽ giảm hoạt tính. Muốn hoạt hóa nó, người ta sấy để loại bỏ lượng nước hấp phụ này đi.
Nhiệt độ sấy càng cao, lượng nước hấp phụ càng giảm đi, oxyd nhôm càng hoạt động.
Oxyd nhôm có nhiều cỡ hạt, hạt càng bé khả năng hấp phụ càng cao.
3.3. Cellulose:

Cellulose chủ yếu có cơ chế phân bố, thường được dùng để tách những chất phân cực mà
khó tách hoặc không thể tách được bằng cơ chế hấp phụ.
Là chất cao phân tử thiên nhiên được dùng dưới dạng bột mịn và thường không cần chất kết
dính.
3.4. Silica gel ghép:
Là silica gel mà nhiều nhóm Si-OH silanol được biến đổi thành nhóm Si-R, Si-O-R hay Si-
O-Si-R
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
Trang 3
Khi –R là mạch hydrocarbon kém phân cực (2C, 6C, 8C, 18C) ta có silica gel ghép pha đảo,
đây là các chất phân bố không phân cực.
Khi –R là mạch phân cực ta có silica gel ghép pha thuận, đây là các chất hấp phụ yếu nếu so
với các silica gel không ghép.
3.5. Các pha tĩnh khác:
Polyamid, nhựa trao đổi ion loại ionit vô cơ – hữu cơ, Kieselguhr.
4. Dung môi:
Chọn dung môi:
Có độ tinh khiết cao, tránh chứa các vết kim loại
Dung môi không quá dễ bay hơi
Thay đổi dung môi:
Khả năng tách riêng các hợp chất bằng PTLC tùy thuộc tỉ lệ phân phối của các hợp chất này
giữa chất hấp phụ và dung môi ly giải
Thường ly giải với hỗn hợp dung môi nhưng tránh sử dụng hỗn hợp dung môi có nhiều hơn
2 cấu tử (vì hỗn hợp phức tạp dễ dẫn đến việc thay đổi pha khi thay đổi nhiệt độ)
Để thay đổi khả năng tách có thể thay đổi dung môi hoặc thành phần dung môi
5. Chuẩn bị mẫu sắc ký:
Chuẩn bị lớp mỏng chế hóa:
Các bản mỏng chế hóa có thể tự làm trong phòng thí nghiệm (bản mỏng tự tráng) hoặc sử
dụng những bản mỏng tráng sẵn.
Độ dày của bản mỏng PTLC thường sử dụng là 0,5 – 2,0 mm, kích thước bản mỏng thường

là 5 × 20, 10 × 20, 20 × 20, 20 × 40 hay có thể đến 20 × 100 cm tùy yêu cầu sử dụng.
Dùng các chất hấp phụ tạo hỗn dịch bền trong nước (có thể thêm một lượng nhỏ chất trơ
như thạch cao để kết dính nếu cần) rồi tráng lên tấm kính phẳng thành các bản có độ dày 0,5
– 2,0 mm (có thể dày đến 10 mm) tùy yêu cầu sử dụng.
Để khô bản ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày, sau đó sấy sơ bộ 600C trong 2h rồi mới sấy hoạt
hóa ở 1200C trong 2h.
Chuẩn bị mẫu thử (dịch chấm):
Mẫu thử (đã được sơ bộ loại tạp) được cô ở áp suất giảm đến khô, sau đó hòa vào trong một
lượng vừa đủ dung môi (phải hòa tan tốt mẫu thử và dễ bay hơi) rồi chấm lên bản mỏng.
Chấm mẫu thử:
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
Trang 4
Đánh dấu đường xuất phát cách mép dưới 1 – 2 cm.
Dùng ống mao quản hay micropipette chấm dung dịch mẫu thử lên bản mỏng thành băng
liên tục, băng có thể dày từ 1 – 2 mm, cách mép bản 1,5 – 2 cm.
Khi chấm không được làm thủng lớp mỏng, vết chấm phải gọn (nên chấm dưới một nguồn
nhiệt), chứa lượng chất thử khoảng 1 – 10 µg.
Khai triển sắc ký:
Đặt bản mỏng đã chấm vào bình, đậy nắp bình. Sau khi dung môi chạy đến cách đầu trên
của bản khoảng 1 – 2 cm thì lấy ra, đánh dấu mức dung môi trên kính, để khô.
Lưu ý:
Cấu tử nghiên cứu phải dễ phát hiện (tốt nhất là phát hiện được bằng đèn UV)
Những điều kiện để phân tách thành công trên bản mỏng chế hóa:
Bản mỏng phải đồng nhất.
Lượng mẫu chấm trên bản mỏng phù hợp.
Bình triển khai sắc ký được bão hòa tốt: quan trọng nhất vì một hợp chất di chuyển trên bản
mỏng với sự thay đổi vận tốc phụ thuộc vào tỷ lệ bay hơi của dung môi, nó di chuyển nhanh
hơn trên bề mặt của bản mỏng và chậm hơn ở phần bản mỏng gần với giá mang, hiện tượng
này được giảm thiểu tối đa trong một bình sắc ký đã được bão hòa hoàn toàn.
Lượng chất hấp phụ trên bản mỏng thay đổi tùy theo từng trường hợp, đối với silica gel cần

20 – 25 g/ bản mỏng kích thước 20 × 20 cm, dày 1mm, những bản mỏng dày có thể bị nứt
trong quá trình sấy do đó phải giảm lượng nước trong hỗn dịch hay hỗn hợp bột nhão của
chất hấp phụ, tăng lượng chất kết dính (thạch cao CaSO4), tăng thời gian sấy hoặc có thể
sấy bằng tia hồng ngoại.
Vết chấm phải thẳng, hẹp và phải cách 2 mép hai bên của bản mỏng ít nhất 1 – 3 cm để
tránh hiệu ứng viền thường làm dung môi chuyển động nhanh hơn hoặc chậm hơn bình
thường ở hai mép của bản mỏng hơn là ở trung tâm của bản mỏng.
Mẫu thử được hòa tan trong một dung môi không phân cực, dễ bay hơi ở một nồng độ mà
tất cả các cấu tử của mẫu thử được hấp phụ không chỉ trên bề mặt mà phải xuyên suốt chiều
dày của bản mỏng. Có thể chấm bằng tay bằng cách sử dụng micropipette hay syringe và
thước kẻ hoặc có thể sử dụng những dụng cụ được thương mại hóa phục vụ cho việc chấm
mẫu.
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
Trang 5
6. Cách phát hiện trong sắc ký lớp mỏng điều chế:
6.1. Soi UV:
Ưu điểm:
Nhanh, tiện lợi
Không bị hao hụt mẫu như phun xịt bản
Nhược điểm:
Mắt nhìn thấy vị trí biểu kiến khác vị trí thực của vết → đánh dấu trật vết và không thu
được chất khi cạo rồi ly giải
Phun xịt bản với thuốc thử đặc trưng:
Tiến hành:
Dùng tấm kiếng hoặc tấm nilon che 1 phần bản
6.2. Phun thuốc thử lên phần không bị che
Dựa vào những vết hiện trên bản, dùng spatule cạo phần silicagel để thu hợp chất
Ưu điểm:
Biết chính xác vị trí vết
Nhược điểm:

Thuốc thử tạo phức với hợp chất không thể sử dụng để cạo bản, cô lập hợp chất
6.3. Sử dụng hơi iod:
Tiến hành:
Đặt bản trong buồng hơi iod
Khi thấy vết lấy bản ra khỏi buồng
Đánh dấu vị trí vết
Phơi bản ngoài quạt gió để bay hơi iod
Cạo bản để thu chất
II. SẮC KÝ CỘT ĐIỀU CHẾ
Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha động và tĩnh.
Có nhiều nguyên nhân đưa đến sự phân bố khác nhau của các chất, nhưng chính sự lặp đi
lặp lại hiện tượng hấp phụ - phản hấp phụ của các chất khi dòng pha động chuyển động qua
pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc ký.
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
Trang 6
1. CÁC CÁCH TIẾN HÀNH PHÂN TÍCH SẮC KÝ
Tuỳ thuộc chế độ đưa mẫu vào hệ thống sắc ký cũng như các thao tác tiến hành sắc ký,
người ta chia cách tiến hành sắc ký thành ba loại:
1.1. Phương pháp tiền lưu
Đây là phương pháp sắc ký đơn giản nhất. người ta cho hỗn hợp, ví dụ, hai chất A và B liên
tục chảy qua cột có nạp sẵn các các chất hấp phụ. Người ta xác định nồng độ các cấu tử
trong dung dịch chảy ra khỏi cột và xây dựng đồ thị theo hệ toạ độ: nồng độ cấu tử- thể tích
dung dịch chảy qua cột. đồ thị này thường gọi là sắc ký đồ hay đường cong thoát (có tác giả
gọi là đường cong xuất). Do các cấu tử bị hấp phụ lên cột, nên trước hết từ cột chỉ chảy ra
dung môi. Sau đó trong dung dịch thoát sẽ có cấu tử bị hấp phụ yến hơn trên cột, ví dụ cấu
tử A, sau đó đến phần dung dịch chứa hỗn hợp A+B, đường cong thoát theo phương pháp
tiền lưu cho trên hình dưới. Trong phương pháp tiền lưu, ta chỉ thu được dung dịch thoát có
cấu tử A tinh khiết ở lúc đầu, sau đó là hỗn hợp A+B. Phương pháp tiền lưu không cho
phép tách hoàn toàn các cấu tử ra khỏi nhau nên thực tế ít được dùng vào mục đích phân
tích các chất.

1.2. Phương pháp
rửa giải
Trong phương pháp
rửa giải, đầu tiên người
ta cho Vml dung dịch
chứa hỗn hợp các cấu
tử (ví dụ, hỗn hợp hai
cấu tử A và B, trong đó A có ái lực với cột nhỏ hơn B) chạy qua cột. Các cấu tử A, B chứa
trong Vml trước hết sẽ bị giữ lại ở phần trên của cột. Sau đó cho dung dịch rửa (thường là
dung môi hoà tan các cấu tử) chảy qua cột. Lúc đó các cấu tử bị giữ ở phần trên của cột sẽ
bị dung môi “rửa” và đưa dẫn xuống phía dưới. Cấu tử A có ái lực với cột nhỏ hơn B nên
chuyển động xuống phía dưới nhanh hơn B. Nếu cột đủ dài và chế độ chảy của dung dịch
rửa thích hợp thì sau một thời gian cho chảy dung dịch rửa, các cấu tử tách ra thành từng
vùng. Các vùng này sẽ tuần tự thoát ra khỏi cột, mỗi vùng lại được cách nhau bằng một
phần dung môi. Hình bên dưới biểu diễn đường cong thoát của quá trình rửa giải. Trong
phương pháp rửa giải, người ta cũng hay dùng những dung dịch chứa một cấu tử có ái lực
với cột nhưng phải nhỏ hơn ái lực của các cấu tử cần tách với cột.
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
Trang 7
1.3. Phương pháp rửa đẩy
Trong phương pháp rửa đẩy, sau khi đưa mẫu vào cột, ta cho chảy qua cột một dung dịch
rửa chứa chất có ái lực với pha tĩnh lớn hơn các cấu tử cần tách. Các cấu tử cần tách sẽ bị
chuyển dần xuống phía dưới khi ta tiến hành quá trình rửa cột và tuần tự thoát ra khỏi cột.
Cấu tử thoát ra khỏi cột đầu tiên là cấu tử tương tác với pha tĩnh yếu nhất, sau đó dần dần
đến các cấu tử có ái lực với cột mạnh dần. Khác với phương pháp rửa giải, nồng độ các cấu
tử không giảm qua quá trình sắc ký. Một nhược điểm quan trọng của phương pháp rửa đẩy
là rất khó phân biệt các phần riêng của các cấu tử trong dung dịch thoát vì ở đây giữa các
phần dung dịch thoát chứa các cấu tử không tách nhau bằng các thể tích dung dịch rửa.
2. Cột sắc ký
Cột sắc ký làm bằng thép không rỉ , thủy tinh đặc biệt hoặc chất dẻo

2.1. Cột phân tích
Dài: 10-30cm
Đường kính trong: 4-10mm
Cỡ hạt pha tĩnh: 5-10µm
N=40.000-60.000 đĩa /met
Cột nhỏ (microcolumn): 3-7.5cm, 1-2mm, 3-5µm, N=100.000 đĩa/mét
2.2. Chất nhồi cột:
Silica (silic dioxyd) kết tụ thành silicagel
Silicagel bao lớp mỏng hữu cơ liên kết ( hóa học hoặc vật lý) với bề mặt
Nhôm oxyd, polymer, nhựa trao đổi ion
2.3. Cột chế hóa
Dài 25-100cm
Đường kính trong 6-50mm, tránh được hiệu ứng thành của cột.
Tốc độ dòng lớn hơn cột phân tích
Sử dụng trong dược liệu để sơ bộ tách các nhóm hợp chất
3. Pha tĩnh
3.1. Silicagel(hay kieselgel của acid silicic) pha thuận
- Chất hấp phụ được sử dụng rộng rãi hiện nay. Là một chất phân cực, thường được dùng
làm pha tĩnh để phân tách các chất. phù hợp với hầu hết các pha động. nó có thể chạy với
những lượng mẫu rất nhỏ như trong sắc ký lớp mỏng.
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
Trang 8
- Ngày nay, Silicagel có kích thước các lỗ là 40,60 và 100Å(Si-40, Si-60, Si-100) được
dùng tron sắc ký điều chế . Si-60 thường được sử dụng nhất. Trong một vài trường hợp,
kích thước hạt quá nhỏ làm giảm hiệu quả của sự chiết tách.
- Silicagel có diện tích bề mặt từ 0.4-0.6g/cm3, và nhiều nhất là 2.2g/cm3.
Có nhiều kích cỡ silicagel khác nhau phụ thuộc vào nhà sản xuất. Đối với sắc ký chế hóa sử
dụng cho những lượng mẫu trong phòng thí nghiệm thường sử dụng loại có kích thước 15-
25µm,25-40µmhay 40-63µm.
- Tính hấp phụ của silicagel do các nhóm OH trên bề mặt quyết định. Nhóm OH là các

trung tâm hấp phụ
- Để Silicagel hấp phụ được tốt thì cần hoạt hóa trước khi sử dụng: Sắt kim loại được loại
bỏ bằng cách đun sôi với HCl đặc, dùng nước rửa sạch ion clorid và lắng gan loại các hạt
nhỏ lơ lửng, sau đó sấy 120oC trong 48 giờ.( đối với các bảng tráng sẵn thì không cần hoạt
hóa) . Không sấy quá lâu tránh làm mất nhóm silanol→bất hoạt.
- Tùy chất cần phân tích mà hoạt hóa silicagel khác nhau. Ví dụ : khi chạy tịnh dầu thì sấy
silicagel cần lâu càng tốt. còn đối với các chất phân cực mạnh thì sấy hoạt hóa ít đi, them
một ít nước để giảm hoạt tăng Rf.
- Tuỳ theo việc chọn các dung môi thích hợp cá thể dùng silicagel để tách các hợp chất
base(alkaloid) hay các hợp chất ưa dầu. Phân tách các chất có độ phân cực gần với nó.
Silicagel là sự lựa chọn tốt nhất làm pha tĩnh khi phân tách cá chất có khối lượng phân tử
nhỏ(<2000Da)
- Khả năng tách của silicagel tốt hơn khi tẩm nó bằng dung dịch bạc nitrat10-12%, dung
dịch acid boric , ammoniac, dung dịch đệm phosphate
3.2. Nhôm oxyd
- Ít được sử dụng hơn silicagel. Thường được dùng trong sắc ký hấp phụ
- Là chất hấp phụ phân cực.
- Trong sắc ký có 3 dạng nhôm oxyd: nhôm trung tính, acid, base.Tùy vào chất cần tách mà
lựa chọn loại oxyd nhôm sử dụng cho phù hợp(chiết các acid amin có tính base cần dùng
oxyd nhôm base, khi cần tách các chất trung tính thì dùng oxyd nhôm trung bình)
- Để tách tốt hơn người ta xử lý nhôm với các dung dịch acid hoặc base.
Hoạt tính của nhôm oxyd tùy thuộc lượng nước nó chứa, hoạt tính sẽ giảm đi khi lượng
nước gia tăng. Trước khi dùng cần hoạt hóa ở 120oC trong 1 giờ.Bậc hoạt tính của nhôm
được chia làm 5 bậc:
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
Trang 9
Bậc hoạt
tính
I II III IV V
% nước 0 3 6 10 15

- Diện tích bề mặt của oxyd nhôm khoảng 0.9g/cm3 đến khoảng 4.0g/cm3.
- Oxyd nhôm phân tách tốt các chất phân cực yếu đến trung bình, thường dùng để phân tách
các hợp chất thơm( có ái lực mạnh với OH phenol) và các hợp chất đồng phân của nó. Oxyd
nhôm còn được dùng để tách các chất : hydrocacbon, alkaloid, chất màu thực phẩm, lipid.
3.3. Kieselguhr
- Ở dạng bột , chứa khoảng 70-95% SiO2 phần còn lại là các oxyd kim loại.
- Là một chất phân cực yếu, dùng để tách các chất phân cực như đường, các triglyceric, các
acid béo bậc cao, cetoacid, lacton. Nhưng thường được dùng chủ yếu làm giá mang cho pha
tĩnh trong sắc ký phân bố.
3.4. Polyamide
- Ít được dùng làm chất hấp phụ , chủ yếu được dùng để tách các chất có chứa nhóm chức
phenol( flavon) , đường.
3.5. Silicagel pha đảo
- Có nhiều loại mẫu kị nước như các peptid, thì sắc ký pha đảo thường là phương pháp được
lựa chọn sử dụng cột silicagel C-18.
- Trong sắc ký pha đảo thì pha tĩnh có bản chất khác với pha động(pha tĩnh không phân
cực , phân động phân cực)
- Đây là silicagel có gắn một chuỗi carbon dài thường là 18C(c-18) hay 8C(C-8) :Si-O-Si-
nối Carbon.
- Các hợp chất được rửa giải ra khỏi theo thứ tự: hợp chất chứa nhóm _COOH→
alcol/phenol →amin→ eter/aldehyd→ cetone→hợp chất halogen→alkan
- Mặc dù sắc ký pha đảo có mắc tiền hơn sắc ký pha thuận nhưng nó có nhiều ưu điểm hơn
như:
Không cần phải hoạt hóa trước khi dùng.
Hệ được thiết thiết lập cân bằng nhanh chóng
Dung dịch thân nước có thể đi qua
Tách tốt đối với các chất phân cực
- Thường được áp dụng trong HPLC
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
Trang 10

3.6. Pha tĩnh cho sắc ký rây phân tử
- Rây phân tử thường dùng các chất như :dextran, agarose hay polyacrylamide( Sephadex,
Sepharose, Fraktogel, Bio-gel…)
- Có các loại gel như gel cứng và gel bán cứng. Các gel cứng được cấu tạo từ các hợp chất
vinyl và divinyl styren polymer. Còn các gel cúng thì được cấu tạo bởi các hạt thủy tinh xốp
và silicagel xốp. Tùy vào tính chất của từng loại gel ma chia ra hai loại là gel thân nước
(hydrophilic gel) và gel thân dầu (lipophilic gel)
- Các Shephadex thông dụng:
Sephadex G(20.50.75)
Sephadex LH-20
3.7. Cellulose
- Là chất cao phân tử thiên nhiên có công thức [C6H7O2(OH)3]3, dạng bột mịn , dùng
không cần chất kết dính.
- Tách các hợp chất thân nước.
- Tăng hoạt tính của cellulose xử lý với hỗn hợp methanol, acid formic và nước hoặc bằng
isopropanol, acid acetic và nước.
Nhược điểm của cellulose không thể phát hiện vết sắc ký bằng các thuốc thử mạnh như
NaOH, H2SO4.
4. Kỹ thuật nhồi cột sắc kí
4.1. Dụng cụ:
- Cột sắc kí (giống giống như cái buret, gồm 1 ống thủy tinh và 1 cái khóa, nhưng không
cần vạch chia độ)
- Chất nhồi cột (pha tĩnh, stationary phase, thường dùng silicagel, có 2 loại là silicagel pha
thuận và silicagel pha đảo, silicagel pha thuận thường dùng hơn, gồm Si có đính các nhóm
OH, silicagel pha đảo gồm Si có đính các dây alkan R, ngoài ra còn dùng alumin) Chất nhồi
cột quyết định quá trình sắc kí.
- Nếu dùng pha thuận, silicagel có gắn nhóm OH thì nó sẽ giữ chặt các chất phân cực, các
chất không phân cực sẽ liên kết với silicagel yếu hơn nên sẽ ra trước, các chất phân cực hơn
sẽ ra sau. Ngoài ra tùy thuộc vào lượng mẫu có mà sẽ dùng lượng silicagel bao nhiêu, từ đó
sẽ chọn kích cỡ cột sắc kí. Dùng lượng silicagel gấp 20, 30 hay 50 lần lượng mẫu. Chú ý

lượng silicagel phải đổ đến khoảng gấp 10 lần đường kính cột thì quá trình tách sẽ diễn ra
tốt. Dung môi: thông thường chọn dung môi phụ thuộc vào chất nhồi cột.
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
Trang 11
- Nếu dùng silicagel pha thường (phân cực) thì chọn dung môi đi từ không phân cực đến
phân cực (ví dụ từ chloroform đếm methanol), thông thường dùng hỗn hợp dung môi. Chú ý
dung môi chạy sắc kí cột phải phân cực hơn một chút so với dung môi chạy bản mỏng vì hạt
silicagel dùng cho cột sắc kí sẽ to hơn hạt trên bản mỏng nên khả năng tách sẽ kém hơn một
chút.
(sắc kí cột là phương pháp để tách chất sau khi đã có tất cả thông tin trên bản mỏng, TLC,
thin layer chromatography, là biện pháp đầu tiên dùng để "dò tìm" thông tin về hỗn hợp của
mình cũng như biện pháp tách chất cần lấy).
4.2. Thực hiện
Bước 1: nhồi cột.
Sau khi đã chọn cột, làm khô và cân silicagel cần dùng, pha dung môi chạy hệ rồi thì hòa
tan silicagel vào dung môi đó trong một erlen. Lấy một miếng nhỏ bông gòn nhồi dưới đáy
cột để chặn silicagel lại, nếu cột quá dài thì dùng 1 dây kẽm thọt bông gòn xuống, chú ý
dùng ít bông gòn. Với những cột có sẵn miếng xốp hay lọc thủy tinh để chặn silicagel rồi thì
không cần làm việc này, tuy nhiên miếng xốp có nhược điểm là sau khi chạy cột xong ta
phải rửa lại nhiều lần cho sạch, rất mất thời gian so với việc nhồi bông gòn, khi chạy cột
xong chỉ cần vứt bông gòn.
Sau khi nhồi chặt bông gòn thì tiến hành khuấy silicagel trong dung môi (không phân cực)
đã pha sẵn rồi rót nhẹ nhàng vào cột. Trong lúc rót thì nên mở khóa để silicagel lắng đều,
nhớ để 1 erlen bên dưới để thu hồi dung môi, tiếp tục làm như vậy đến khi cho hết lượng
silicagel vào, tiến hành rót thêm dung môi (từ erlen bên dưới) để ổn định hệ, chế đi chế lại
nhiều lần đến khi hệ ổn định, cột không bị nứt hay gãy thì xem như việc nhồi cột đã hoàn
thành. Khóa cột lại.
Bước 2:
Nạp mẫu chất vào. Có 2 loại nạp mẫu là nạp mẫu khô và nạp mẫu ướt. Nạp mẫu ướt là hỗn
hợp chất phân tích cũng tan trong dung môi chạy cột nên chỉ cần cho mẫu vào. Còn nếu

mẫu không tan trong dung môi chạy cột thì phải hòa tan mẫu vào dung môi gián tiếp trong 1
erlen. Sau đó dùng lượng ít silicagel cho vào erlen để hấp thu mẫu, sau đó cho hết vào bình
cô quay để cô quay đuổi dung môi đi thu được silicagel khô có chứa mẫu. Lúc này nạp hết
silicagel đó vào cột và cho dung môi chạy cột vào: gọi là nạp mẫu khô. Khi cô quay thì nhớ
lót miếng bông gòn ở miệng bình cô quay để tránh silicagel bay lên. Cô quay là chưng cất
trong áp suất kém (chân không).
Bước 3:
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
Trang 12
Sau khi hoàn tất việc nạp mẫu rồi thì lót 1 miếng bông gòn ở bên trên mẫu chất để ổn định
hệ rồi tiếp tục châm dung môi vào, từ từ thay đổi độ phân cực của hệ, chú ý không được
thay đổi đột ngột cũng như chuyển từ không phân cực sang phân cực rồi lại quay lại không
phân cực, làm như vậy sẽ gãy cột và phải nhồi lại từ đầu.
Bước 4:
Mở khóa, lúc này cột bắt đầu tách chất, hứng lượng dung môi chảy ra có kém theo chất đã
tách được bằng ống nghiệm nhỏ, mỗi lần hứng khoảng 1/3ống nghiệm. Sau đó đem chấm
bản các ống nghiệm, những ống có vệt tương tự nhau sẽ được gom lại, đó là 1 chất. Tiếp tục
như vậy thì cuối cùng ta sẽ tách được các chất mong muốn.
Ghi chú
- Mỗi lần tách cần khoảng 50-200ống nghiệm, thời gian tách từ 2 đến 7 ngày.
Dùng khóa để điều chỉnh tốc độ dòng chảy dung môi, ra chậm hay nhanh, việc này quyết
định quá trình tách có tốt hay không. Nếu thận trọng quá cho chạy chậm thì phải chờ lâu,
nếu nôn nóng quá cho chảy nhanh thì silicagel chưa kịp tách đã phải cho ra chất, như vậy
cũng không tách được.
Có những hệ phải tách rất lâu, cho dù đã mở khóa hết cỡ vẫn không chảy xuống nhanh thì
dùng máy đẩy (máy sục oxi dùng để nuôi cá). Nó sẽ sục không khí vào để tăng tốc quá trình
đẩy dung môi xuống (chỉ dùng khi tốc độ dòng dưới khoảng 3 giọt/phút). Chú ý chất không
dễ bị oxi hóa thì mới dùng phương pháp này được. Nếu không oxi không khí sẽ oxi hóa hết
chất phân tích.
- Nếu dùng silicagel pha đảo thì cột không cần khóa vì pha đảo chạy rất chậm, nhưng nhược

điểm là phải ngồi canh nó liên tục. Chú ý khi đã chạy pha đảo thì không được dùng máy
đẩy, vì bản chất pha đảo là chậm. Nếu dùng máy đẩy thì như đã nói ở trên, silicagel không
tách được.Khi chạy cột thì điều tối kị là khóa cột lại quá lâu. Dĩ nhiên chạy cột 2-3 ngày thì
phải khóa cột lại ở cuối ngày, nhưng hôm sau phải lên làm ngay, nếu để quá lâu thì chất bị
giữ lại trong cột lâu sẽ khó tách ra hơn.
5. Pha động
Pha động là một thông số dễ điều chỉnh nhất khi tối ưu hóa hệ thống sắc ký. Trong khảo sát
pha động, vấn đề đặt ra là làm sao để tìm dung môi hoặc hỗn hợp dung môi phù hợp nhất
trong thời gian ngắn nhất có thể và sử dụng ít nhất vật liệu.
5.1. Lựa chọn dung môi:
Dung môi lựa chọn không được ảnh hưởng tới kết quả của phương pháp phát hiện.
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
Trang 13
Thường dùng hỗn hợp dung môi nên cần phải chú ý đến khả năng trộn thành hỗn hợp của
các dung môi:
Điểm sôi của
các dung môi
cũng là một yếu
tốt rất quan
trọng. Nhiệt độ
sôi thấp sẽ dễ
dàng và tiết
kiệm cho việc
thu hồi. Tuy
nhiên dung môi sử dụng không nên có điểm sôi quá thấp (T
s
> 40
0
C) nhằm tránh sự bay hơi
trong quá trình phân lập.

Dung môi với độ nhớt thấp cũng được ưu tiên vì giúp giảm áp lực phải đặt lên cột.
Tính bền vững và tính trơ phải được quan tâm để tránh hư mẫu.
Độc tính thấp,
khả năng cháy
nổ và giá cả
cũng cần quan
tâm.
Độ mạnh của
dung môi
Snyder dựa trên
giá trị thực
nghiệm đưa ra
bảng giá trị độ
mạnh của dung
môi:
Độ phân cực
của dung môi
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
Trang 14
Độ phân cực của dung môi có thể lựa chọn dựa trên tam giác chọn lọc được xây dựng bởi
Snyder:
Độ tinh khiết của
pha động:
Không có hoạt
chất nào 100% tinh
khiết. Độ tinh
khiết càng cao, giá
càng cao. Cần phù
hợp yếu tố chi phí
với độ tinh khiết

nhằm đưa các ảnh
hưởng của nó về giới hạn phù hợp.
5.2. Dung môi cho sắc ký pha thuận:
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
Trang 15
5.3. Dung môi cho sắc ký pha đảo:
5.4. Dung môi cho sắc ký gel:
(Theo cơ chế rây phân tử, trao đổi ion, ái lực)
Ngược lại với các loại sắc ký khác, sắc ký gel không cho phép người dùng tác động lên tính
tan do sự thay đổi pha động. Pha động chỉ được chọn theo 3 tiêu chí:
Khả năng hòa tan tốt mẫu
Độ nhớt thấp (= áp lực tác động lê gel thấp)
Không làm phá hủy pha tĩnh.
Tài liệu cung cấp từ nhà sản xuất gel cần phải được nghiên cứu kĩ lưỡng nhằm tránh cho gel
bị phá hủy do tương tác với dung môi không phù hợp.
6. Cách
phát hiện
trong sắc
ký cột
điều chế:
Phương phát ghi
nhận sắc ký bằng
detector UV
thường được sử
dụng nhất. Trong khi việc phun thuốc thử giống để phát hiện là không khả thi thì sử dụng
máy đo UV lại tỏ rõ hiệu quả, sự chọn lọc và tính khả dụng.
6.1. UV detector
Áp dụng được cho các hợp chất có nhân thơm, có nối đôi liên hợp, nhóm carbonyl, có chứa
iod, brom, sulfur,…
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3

Trang 16
Nhìn chung UV detector có thể sử dụng được cho sắc ký gel mà không cần rửa giải.
6.2. Refractive detector (RI)
Bộ phận phát hiện nhờ chỉ số khúc xạ. Bộ phận phát hiện này tuy có độ nhạy thấp hơn so
với bộ phát hiện UV nhưng nó có ứng dụng nhất định trong sắc ký điều chế. Với độ nhạy
thấp, khi lựa chọn dung môi sẽ dựa vào RI để lựa chọn được loại dung môi nào chạy ra kết
quả có nồng độ cao nhất.
7. Định tính một cột sắc ký
Vì nhiều lý do, cần thiết phải có sự đánh giá những đặc thù nhất định của cột tự làm.
Thông tin nào quan trọng nhất cho việc đánh giá một cột sắc ký chế hóa?
Thông tin về hiệu lực cột, thông tin này cho phép đưa ra kết luận về kết quả phân lập của
sắc ký.
7.1. Sắc ký đồ
Nếu đầu ra của cột được ghi nhận bởi một bộ phận phát hiện thích hợp trong quá trình phân
lập sắc ký, và tín hiệu từ bộ phận phát hiện được ghi nhận dạng nồng độ theo thời gian, sẽ
ghi nhận được đường cong điển hình. Đường cong Gausian
Toàn bộ các ghi nhận của các tín hiệu được gọi là sắc ký đồ. Dữ liệu sau đâu có thể thu trực
tiếp từ một sắc ký đồ:
t
o
= thời gian chết
của cột, thời gian
cần thiết cho dung
môi chảy qua hết
cột với tốc độ dòng
xác định
t
R
= Thời gian lưu,
thời gian từ khi

triển khai mẫu đến pic cực đại
W = Độ rộng cơ bản của pic
B
0,5
= độ rộng pic tại ½ chiều cao.
Sẽ không thực sự hợp lý nếu đánh giá một cột dựa vào thời gian lưu hoặc độ rộng của pic.
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
Trang 17
Những thông số này phụ thuộc vào quá nhiều yếu tố như tốc độ dòng, thành phần dung môi,
chiều dài cột… Tuy nhiên, việc đánh giá cột một cách thích hợp đối với sắc ký điều chế là
dựa vào SI (symmetry index - chỉ số đối xứng) và số đĩa lý thuyết hay chiều cao đĩa lý
thuyết.
SI mô tả sơ lược hình dáng của pic và do đó là một thông số có ích cho việc đánh giá đặc
tính chảy của cột. SI được định nghĩa:
SI = b/a
Sự bất đối xứng trở nên rõ ràng, tuy nhiên, một điều kiện tiên quyết cho loại thử nghiệm
này phải sử dụng đối với chất có khả năng tách rửa tốt nhất.
Ví dụ của một pic tốt
(trái) và một pic xấu
(phải)
SI được đo không
phải tại đường nền mà
ở vị trí 5% hoặc 10%
của chiều cao pic.
(trong ví dụ này là 5%)
7.2. Số đĩa lý thuyết
Một thông số dùng để so sánh khác là số đĩa lý thuyết N của cột
Công thức tính N có được dựa trên giả định rằng pic có hình dạng đường cong Gaussian.
Để đơn giản tính toán, các pic được thừa nhận có hình dạng Gaussian.
Số N lớn tương ứng với cột tốt.

Khoảng cách lý thuyết cho một quá trình giải hấp phụ - hấp phụ là một đĩa lý thuyết do đó
nó là thông số đại diện tốt nhất cho các thông số khác (kích thước pha hấp phụ, tốc độ dòng,
chiều dài cột,…)
7.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến số đĩa lý thuyết:
Các yếu tố do pha động:
Độ nhớt
Hóa chất tự nhiên
Tốc độ đưa vào cột
Tốc độ khuếch tán vào pha tĩnh
Các yếu tố hòa tan
Hóa chất tự nhiên
Mẫu nạp vào cột
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
Trang 18
Dung môi nạp mẫu
Nồng độ của mẫu
Tốc độ khuếch tán ở mỗi pha
Yếu tố dung tích k’
Yếu tố do pha tĩnh
Đường kính cột
Kích thước hạt
Phân bố hạt
Hình dạng hạt
Bề mặt
Kích thước và hình dạng lỗ
Các yếu tố thuộc tính toán
Hình dạng pic
Độ bất đối xứng của pic
Phương pháp tính toán
Độ chính xác và độ đúng của các phương pháp đo, ghi

nhận
Các yếu tố thuộc về máy móc thiết bị
Tính đồng nhất của cấu trúc lớp nhồi cột
Khoảng trống và các kênh giữa các lớp nhồi cột
Thể tích chết quá mức trong hệ thống LC
7.4. Chiều cao tương ứng với một đĩa lý thuyết
Để có thể so sánh các cột có chiều dài khác nhau, cần thiết phải tính chiều cao của đĩa lý thuyết
H (H=L/N với L là chiều dài của cột)
7.5. Chiều cao đĩa lý thuyết đã làm giảm
Nhằm so sánh các cột có kích cỡ khác nhau, thông số thích hợp nhất là chiều cao đã làm giảm h
h = H/d (d là đường kính của cột)
Trong một vài trường hợp, số đĩa lý thuyết phụ thuộc chặt chẽ và hoạt chất sử dụng để kiểm tra.
Thông tin chính xác về chất thử và điều kiện thử cần phải được cung cấp.
7.6. Độ phân giải
Độ phân giải mô tả mối liên hệ của 2 pic, đây là thông số đóng vai trò quan trọng trong việc
phân lập một hỗn hợp các chất.
R = 2(t
R2
– t
R1
)/(w
1
+ w
2
) = 1,177(t
R2
– t
R1
)/(b
0,5(1)

+ b
0,5(2)
)
7.7. Thể tích chết
Thể tích chết V
0
được định
nghĩa là khoảng trống trong cột
sắc ký.
V
0
= t
R
. F
m
(F
m
là tốc độ phân
phối hay lưu lượng dòng)
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
Trang 19
G. Helmchen và B.Glatz đã đề nghị một phương pháp khác để tính V
0

Cột được làm đầy với một dung môi thứ nhất (tỉ trọng d1), đóng kín và cân (G1). Cột sau khi
triển khai được phục hồi lại bằng một dung môi thứ hai (d2), cũng đóng kín và cân (G2). V
0
được tính theo công thức
V
0

= (G2 – G1)/(d2 – d1)
Biết được V
0
có thể tính toán được thời gian chết t
o

t
o
= V
0
/ F
m
8. Phân lập kết quả sắc ký:
Khi yếu tố phân giải giảm và các pic trở nên gần nhau hơn, việc phân lập trở nên khó khăn
Mặc dù không lý tưởng nhưng sự
phân lập của các chất tinh khiết vẫn
có thể thực hiện được với độ phân
giải R = 0.6 nhưng việc này đòi hỏi
một điểm cắt trong các phân đoạn
thu được. Chỉ các phân đoạn rìa tùy
theo mỗi pic được thu thập và phần
còn lại nằm giữa chúng có thể được
thu hồi và tái phân lập.
Trường hợp tiến hành sắc ký quá tải
có thể xảy ra hiện tượng kéo đuôi,
cần có sự điều chỉnh vị trí thu thập
để tránh lẫn phần kéo đuôi của pic
trước.
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
Trang 20

8.1. Yếu tố phân giải alpha
α = (t
R2
– t
0
) / (t
R1
– t
0
)
(t
R2
>= t
R1
)
Nếu hai thời gian lưu bằng nhau, α = 1 khi đó không thể phân lập được. Giá trị α càng lớn, việc
phân lập càng dễ dàng.
9. Sắc ký cột nhanh (FC – Flash Chromatography)
Giới thiệu
Vào giai đoạn đầu của kỹ thuật sắc ký, những cột đơn giản bằng thủy tinh được sử dụng, hoạt
động nhờ vào áp lực thủy tĩnh của dung môi. Trong một ấn phẩm năm 1978 Clark W.Still khám
phá ra khả năng tăng tốc quá trình phân lập trên cột thủy tinh, từ đó gia tăng hiệu lực của
phương pháp sắc ký. Kết quả hết sức thuyết phục và trở nên một phương pháp tinh chế không
ngờ trong hóa học chế hóa.
Ngày nay sắc ký cột nhanh càng được phát triển với nhiều thiết bị hỗ trợ và sự tiện dụng.
Sắc ký cột nhanh trở nên phổ biến vì chúng đơn giản dễ sử dụng, tiện lợi và có thể trang bị ở
mọi phòng thí nghiệm.
9.1. Nguyên tắc:
Sự phân lập sắc ký dựa trên một trạng thái cân bằng giữa các thành phần cần phân lập, một tác
nhân hấp phụ trong cột (pha tĩnh) và một dung môi chảy xuyên qua nó (pha động).

Khi một thành phần phân tán vào pha tĩnh được định nghĩa là sự hấp phụ, sự tách ra bởi pha
động được định nghĩa là sự phản hấp phụ. Khả năng hấp phụ cao giữa các thành phần và pha
tĩnh đồng nghĩa với sự lưu giữ của các chất này, được xem như chậm trong sự rửa giải cột. Sự
phân lập của một hỗn hợp ra các thành phần riêng biệt chỉ có thể thực hiện khi mỗi thành phần
này có đặc tính hấp phụ và phản hấp phụ khác nhau.
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
Trang 21
9.2. Lựa chọn pha tĩnh phù hợp
Có thể tiến hành sắc ký trên cả pha tĩnh phân cực và không phân cực, độ hấp phụ tùy thuộc vào
mỗi nhà sản xuất.
Sắc ký chuẩn yêu cầu sử dụng pha tĩnh phân cực như silica gel và dung môi không phân cực.
Các thành phần riêng lẻ bị lưu giữ là do tương tác giữa nhóm chức phân cực của nó với chất hấp
phụ. Các chất phân cực yếu được rửa giải ra trước, tiếp sau đó là các chất phân cực mạnh hơn.
Trong sắc ký pha đảo, pha tĩnh là chất không phân cực và sự rửa giải được thực hiện bởi dung
môi phân cực. Những pha tĩnh này được thiết kế bằng cách thay đổi silica gel với nhóm không
phân cực nhưng C-18 hoặc những gốc tương đồng. Vật liệu pha đảo mắc hơn nhiều so với pha
tĩnh chuẩn và đó là lý do chính khiến pha tĩnh chuẩn được sử dụng chủ yếu trong sắc ký nhanh.
9.3. Khảo sát hệ thống sắc ký trước bằng sắc ký lớp mỏng:
Như đã đề cập, đa phần sắc ký cột nhanh sử dụng pha tĩnh là silica
gel bình thường hoặc phân cực cao do đó việc tiến hành khảo sát
trước bằng TLC là hợp lý với một sự đầu tư nhỏ nhất về thời gian và
vật liệu, hứa hẹn tìm ra điều kiện sắc ký có khả năng áp dụng cho cột
sắc ký nhanh.
Xác định pha tĩnh
Tìm pha động với sự chọn lọc nhất
Xác định độ mạnh dung môi
Một cách lý tưởng, chất hấp phụ trên 2 loại sắc ký nên giống nhau để
khả năng áp dụng từ TLC cho FC là cao nhất.
Khảo sát pha tĩnh
Thực nghiệm với TLC có thể giúp đưa ra chọn lựa đúng đắn. Nếu

TLC với silica gel thường được sử dụng cho kết quả tốt thì cũng có
thể sử dụng cho FC. Nếu kết quả không đạt, khi đó mới nghĩ đến khả
năng sử dụng pha đảo.
Khảo sát dung môi
Một khi đã chọn được pha tĩnh với những đặc tính thích hợp, dung môi hoặc hỗn hợp dung môi
phân lập các chất thành phần sẽ được khảo sát.
Một cách tổng quát, mỗi dung môi đều có những đặc tính riêng, một số có xu hướng giống nhau
trong khi một số thì khác nhau rất nhiều. L.R.Snyder và J.J.Kirkland đã nghiên cứu và so sánh
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
Trang 22
các kết quả đặc tính của nhiều loại dung môi và các nhóm dung môi có chung tác dụng thành
các nhóm chọn lọc.
Nhóm chọn lọc cho
phép công việc tìm
kiếm được tập trung,
sẽ có ít điểm so sánh
khi mà dung môi
chung nhóm. Công
việc sẽ được tiến hành
theo hướng so sánh
giữa các nhóm đặc
tính.
Những dung môi quan
trọng cho sắc ký được
trình bày theo bảng
sau chỉ bao gồm các
dung môi có thể dùng
trong phân lập sử dụng bộ phận phát hiện UV (không gây tín hiệu)
Dựa trên độ phân cực của các thành phần cần được phân lập, trong trường hợp độ dung môi có
độ mạnh quá lớn khiến không thể phân tách được, độ mạnh của dung môi có thể được giảm

xuống bằng cách hòa tan thêm hexane (độ mạnh 0.1), ngay lập tức có thể phân lập tốt.
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
Trang 23
Giảm độ mạnh của dung môi (trái: dichloromethane, phải: Hexane:dichloromethane 3:1)
Việc thêm hexane giúp giảm độ mạnh của dung môi nhưng không tác động lên tính chọn lọc
(khả năng phân giải)
Tùy theo thành phần được lựa chọn để chọn dung môi có sự chọn lọc thích hợp. Bản VI có sự
phân tách tốt nhưng nếu chỉ quan tâm tới việc phân lập thành phần đầu tiên, dung môi chạy ở
bản V sẽ được chọn.
Lý tưởng = các thành phần khác càng tách xa chất cần tách càng tốt.
9.4. Từ TLC đến FC
Do hiệu năng tách của TLC cao hơn so với FC nên cần phải có sự điều chỉnh khi áp dụng từ
TLC đến FC
Thể tích cột CV = 1/R
f
R
f
nằm trong khoảng từ 0.15 – 0.4 sẽ tương ứng với thể tích cột 2.5 -6.6
9.5. Nạp mẫu lên cột
Việc nạp mẫu đối với sắc ký cột bình thường là một công việc đơn giản trong phân tích sắc ký,
tuy nhiên trong sắc ký điều chế, cột thường được triển khai quá tải và việc nạp mẫu là rất quan
trọng.
Lúc trước, quy định chung cho sắc ký chế hóa là cột có thể nập mẫu ở nồng độ gần 1% tùy theo
loại silica gel, ngày nay với việc sử dụng FC và tối ưu hóa pha động (R
f
0.04 – 0.4, CV > 1),
nồng độ mẫu nạp có thể tăng đến 10% và sự phân lập nhanh và hiệu quả hơn rất nhiều. Khi đó
thể tích mẫu sẽ nhỏ và được nạp thành băng có độ hẹp tối thiểu, hiệu năng tách sẽ cao.
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
Trang 24

9.6. Rửa giải theo gradient
Khảo sát pha động và ghi nhận sự phân tách các pic theo mỗi pha.

Chia phân đoạn để
thay đổi
dung môi
nhằm tách
tốt hơn.
Ví dụ các kết quả:
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
Trang 25