Phân lập và xác định tính chất các chủng vi khuẩn Bacillus từ ruột gà để sản xuất Probiotic tăng trọng cho gà siêu thịt

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC


NGUYỄN VĂN ĐỨC


PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT CÁC CHỦNG
VI KHUẨN Bacillus TỪ RUỘT GÀ ĐỂ SẢN XUẤT
PROBIOTIC TĂNG TRỌNG CHO GÀ SIÊU THỊT




LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC









HÀ NỘI- 2014



ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC

NGUYỄN VĂN ĐỨC

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT CÁC CHỦNG VI
KHUẨN Bacillus TỪ RUỘT GÀ ĐỂ SẢN XUẤT PROBIOTIC
TĂNG TRỌNG CHO GÀ SIÊU THỊT



LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số:
60420107

Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Thị Vân Anh
TS. Nguyễn Thị Hồng Loan







Hà Nội – 2014
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới PGS.TS. Nguyễn
ThịVân Anh và TS. Nguyễn Thị Hồng Loan đã giúp đỡ và hướng dẫn tôi hoàn
thành luận văn tốt nghiệp. Từ tận đáy lòng, tôi bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến

PGS.TS. Nguyễn Thị Vân Anh, người đã luôn động viên, hướng dẫn và tạo điều
kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc đến GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa, người đã chỉ dạy
tôi những kiến thức khoa học cũng như cách làm việc một cách khoa học đồng thời
đã tạo điều kiện để tôi tiếp tục được nghiên cứu khoa học. Tôi cũng chân thành
cảm ơn các thầy, cô giáo, cán bộ, và các bạn bè trong phòng Sinh học Nano và
Ứng dụng cũng như phòng Protein tái tổ hợp thuộc Phòng Thí nghiệm trọng điểm
Công nghệ Enzyme và Protein, Đại học Khoa học Tự Nhiên đã giúp đỡ, hỗ trợ
nhiệt tình trong quá trình làm luận văn cao học.
Trong quá trình học tập và nghiên cứu, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và tạo
điều kiện của Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Phòng công tác chính trị học
sinh và sinh viên, Phòng sau đại học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên. Tôi xin
cảm ơn sự giúp đỡ này!
Tôi cũng gửi lời cảm ơn tới công ty ANABIO R&D đã giúp đỡ tôi trong quá
trình sản xuất bào tử của một số chủng Bacillus phân lập trong khóa luận, cảm ơn
KS. Nguyễn Thị Loan, Trung tâm chẩn đoán Thú y – Tập đoàn DABACO đã giúp
đỡ tôi trong việc thử nghiệm các chế phẩm probiotic trên gà siêu thịt.
Cho phép tôi giửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, đồng nghiệp ở bộ môn Tự
nhiên, trường THPT Vân Nội, Đông Anh, Hà Nội đã tạo điều kiện về mặt thời gian
và chuyên môn cũng như động viên để tôi yên tâm đi học cao học.
Hà Nội, tháng 12 năm 2014
Học viên
Nguyễn Văn Đức
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Từ/cụm từ viết đầy đủ
Bp Base pair (cặp nuclêôtit)
CFU Colony forming unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc)
DNA Deoxyribonucleic Acid
DSM Difco Sporulation Medium

EtBr Ethidium bromide
FAO/WHO Food and Agriculture Orgaization of the United
Nations/ World Health Organization
FCR Feed conversion ratio (hệ số chuyển đổi thức ăn)
G+C Guanine+Cytosine
LB Luria Bertani
NA Nutrient Agar
PCR Polymerase chain reaction
rDNA Rebosomal Deoxyribonucleic Acid
RFLP Restriction fragment length polymorphism
RO Reverse osmosis
S Svedberg ( đơn vị lắng)
TLR Toll-like receptors
TSA Tryptone Soya Broth Agar
TSB Tryptone Soya Broth
VP Voges-Proskauer

DANH MỤC BẢNG BIỂU



Trang
Bảng 1.

pH và thời gian tồn tại của thức ăn ở các phần khác nhau
trong ống tiêu hóa của gà
4
Bảng 2.

Các chi của vi khuẩn đã phát hiện trong hồi tràng và

manh tràng bằng kỹ thuật giải trình tự 16S rDNA
6
Bảng 3.

Một số mô tả và khái niệm về probiotic được chính dẫn
nhiều trong các năm qua
11
Bảng 4.

Bảng 4. Các tiêu chí lựa chọn probiotic ứng dụng trong
thương mại
13
Bảng 5.

Một số vi sinh vật được dùng làm probiotic 20
Bảng 6.

Một số sản phẩm probiotic dùng cho gia cầm có mặt trên
thị trường
22
Bảng 7.

Một số sản phẩm thương mại chứu bào tử Bacillus 27
Bảng 8.

Tính chất sinh lí hóa sinh của một số chủng Bacillus
phân lập từ ruột gà
45
Bảng 9.

Kết quả định danh đến mức độ loài bằng kỹ thuật sinh
học phân tử
49
Bảng 10.

Các phân đoạn thu được khi cắt gen 16S ribosome của
các chủng vi khuẩn bằng bộ enzyme Alf II và Alw 26I
theo lý thuyết
52
Bảng 11.

Kết qủa thử hoạt tính kháng kháng sinh của một số chủng
vi khuẩn
55
Bảng 12

Thử nghiệm trên diện rộng thức ăn bổ sung bào tử B.
subtilis CH16 trên gà siêu thịt
63
DANH MỤC HÌNH


Trang
Hình 1.

Cấu tạo hệ tiêu hóa ở gà 3
Hình 2.

Thành phần của hệ vi khuẩn trong hồi tràng và manh tràng của gà
giò được xác định bằng giải trình tự 1230 dòng từ cộng đồng 16S

rDNA trong thư viện DNA
7
Hình 3.

Chu trình hình thành, nảy mầm của nội bào tử thuộc chi Bacillus
và cấu trúc của nội bào tử
9
Hình 4.

Hướng dẫn cho đánh giá Probiotic sử dụng cho thực phẩm 15
Hình 5.

Sự ức chế của các vi khuẩn thối giữa và tăng cường chức năng của
rào chắn và mô hình đáp ứng miễm dịch niêm mạc của vi khuẩn
probiotic
19
Hình 6.

Một số chủng không sắc tố đã phân lập 43
Hình 7.

Một số tính chất sinh lí hóa sinh của các chủng CH phân lập từ
ruột gà
46
Hình 8.

Kết quả điện di genome và điện di sản phẩm nhân bản gen mã hóa
16S rRNA bằng kĩ thuật PCR
48
Hình 9.

Cây phân loại các chủng Bacillus 50
Hình 10

Sơ đồ các phân đoạn thu được sau khi xử lí bởi bộ enzyme giới hạn
Alw26I và AflII của gen mã hóa 16S ribosome của các chủng vi
khuẩn
51
Hình 11.

Phân biệt các chủng vi sinh vật bằng kỹ thuật PCR-RFLP 53
Hình 12.

Hiệu suất tạo bảo tử của các chủng vi khuẩn 56
Hình 13.

Độ bền của bào tử của chủng CH16 và CH22 từ pH từ 2 đến 10 58
Hình 14.

Độ bền của bào tử ở các nồng độ muối khác nhau 59
Hình 15.

Biofilm tạo thành trên đĩa thạch CMK của các chủng HU58 và
CH16, và khuẩn lạc tạo thành trên đĩa thạch của các chủng PY79
và CH22 ở điều kiện
60
Hình 16

Ảnh chụp chế phẩm chứa bào tử dạng bột (A), ảnh bào tử dưới kính
hiển vi điện tử (B) và ảnh khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch (C) của 2

chủng CH16 và CH22
61
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
1.1. Hệ tiêu hóa của gà 2
1.1.1. Cấu tạo hệ tiêu hóa và sinh lí tiêu hóa ở gà 2
1.1.2. Hệ vi khuẩn đường ruột của gà 4
1.1.3. Các vi khuẩn Bacillus phân lập từ ruột gà 7
1.2. Probiotic 9
1.2.1. Khái niệm chung về probiotic 9
1.2.2. Probiotic sử dụng cho gia cầm 21
1.2.3. Các chủng vi khuẩn Bacillus sử dụng làm probiotic cho gia cầm 27
2.1. Nguyên liệu và hóa chất 29
2.1.1. Mẫu ruột gà 29
2.1.2. Các chủng vi khuẩn tham chiếu 29
2.1.3. Môi trường nuôi cấy 29
2.1.4. Hóa chất sinh học phân tử 32
2.1.5. Các hóa chất khác 33
2.1.6. Dụng cụ và thiết bị 33
2.2. Phương pháp nghiêu cứu 33
2.2.1. Phân lập các chủng vi khuẩn từ ruột gà 33
2.2.2. Các kỹ thuật vi sinh và hóa sinh cơ bản 34
2.2.3. Phân tích trình tự 16S rRNA 38
2.2.4. Kỹ thuật PCR-RFLP 39
2.2.5. Điều kiện sinh trưởng tối ưu 40
2.2.6. Sản xuất bào tử trong nồi lên men 40
2.2.7. Thử nghiệm chế phẩm probiotic trên gà siêu thịt ở diện rộng 41
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 43
3.1. Các chủng vi khuẩn Bacillus không sắc tố được phân lập từ ruột gà 43
3.2. Tính chất sinh lý, sinh hóa của một số chủng Bacillus có hoạt tính ưu việt

44
3.3. Định danh loài bằng phân tích 16S rRNA 47
3.4. Phân biệt các chủng đã phân lập bằng kỹ thuật PCR-RFLP 50
3.5. Một số tính chất probiotic của các chủng Bacillus được tuyển chọn 53
3.5.1. Tính kháng kháng sinh 53
3.5.2. Hiệu suất tạo bào tử 55
3.5.3. Độ bền của bào tử trong các môi trường pH khác nhau 56
3.5.4. Độ bền của bào tử trong dung dịch muối 57
3.5.5. Khả năng tạo biofilm 58
3.6. Điều kiện sinh trưởng tối ưu và thu chế phẩm probiotic dạng bào tử sau
lên men 59
3.7. Tăng trọng trên gà siêu thịt và giảm chỉ số tiêu thụ thức ăn 60
KẾT LUẬN 63
HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO 65




1

MỞ ĐẦU

Theo định nghĩa của WHO/FAO, Probiotic hay còn gọi là lợi khuẩn là những
vi sinh vật sống, khi được sử dụng với lượng thích hợp sẽ mang lại các tác dụng có
lợi cho vật chủ. Probiotic dạng bào tử của một số vi khuẩn thuộc chi Bacillusnhư B.
subtilis và B. licheniformis được sử dụng ngày càng rộng rãi trong chăn nuôi và
thủy sản vì bào tử có tính chất bền nhiệt giúp sản phẩm ổn định chất lượng trong
quá trình chế biến với thức ăn và bảo quản. Với gia cầm, đặc biệt là đối vớigà siêu
thịt, đã có nhiều sản phẩm probiotic nổi tiếng được sản xuất cả ở Châu Âu và ở Mỹ.

Đặc điểm chung của các sản phẩm này là các chủng vi khuẩn được nghiên cứu sâu
về tính chất và độ an toàn, cũng như các hoạt tính có lợi cho sức khỏe của vật chủ.
Tuy nhiên, các chủng vi khuẩn thường không có nguồn gốc từ hệ tiêu hóa mà
thường được phân lập từ đất, duy nhất chỉ có 01 sản phẩm Clostat của hãng Kemin,
Mỹ, gồm chủng B. subtilis PB6 là có nguồn gốc từ hệ tiêu hóa. Ngoài ra, một số chế
phẩmcũng chưa được sản xuất ở dạng bào tử hoàn toàn mà còn lẫn một tỷ lệ tế bào
sinh dưỡng nên bị giảm sút độ sống khi xử lý nhiệt trong quá trình chế biến thức ăn
cho gia cầm.
Ở Việt Nam, nhu cầu sử dụng probiotic trong nuôi gà siêu thịtngày càng tăng
với mục đích chủ yếu kích thích tăng trọng và tăng cường sức khỏe, phòng bệnh
cho gà. Các chủng vi khuẩn sử dụng làm probiotic cho gà cũng đã được nhiều tác
giả tại các trường đại học và viện nghiên cứu trong nước phân lập, xác định tính
chất và thử nghiệm tác dụng trên gà. Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào đề cập tới
việc phân lập các chủng Bacillus từ chính ruột gà để tạo chế phẩm probiotic sử
dụng cho gà. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “ Phân lập và xác định tính chất
các chủng vi khuẩn Bacillus từ ruột gà để sản xuất probiotic tăng trọng cho gà
siêu thịt” nhằm sàng lọc các chủng vi khuẩnBacillus có hoạt tính probiotic ưu việt
và thân thiện với hệ tiêu hóa của gà, nhờ đó phát huy hiệu quả tác dụng tăng trọng
cho gà siêu thịt.


2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Hệ tiêu hóa của gà
1.1.1. Cấu tạo hệ tiêu hóa và sinh lí tiêu hóa ở gà
Hệ tiêu hóa ở gà có cấu tạo khá đặc biệt để thích nghi với thức ăn là thực vật
và khoang miệng hẹp, không có răng. Thức ăn được đưa vào diều, diều là một cái
túi phình to của thực quản, là nơi chứa thức ăn và nhào trộn với dịch tiết để làm cho

thức ăn mềm ra. Một trong cấu tạo đặc biệt khác trong hệ tiêu hóa ở gà đó là dạ dày
cơ, dạ dày cơ có thành cơ chắc khỏe, là nơi nghiền nát thức ăn trước khi được đưa
tới tá tràng. Một dặc điểm khác biệt so với dạ dày của động vật nói chung đó là dạ
dày cơ không có khả năng tiết bất cứ loại enzyme nào, một số enzyme đươc dạ dày
tuyến tiết ra để hòa trộn vào trong thức ăn giúp tăng hiệu quả tiêu hóa ở dạ dày cơ.
Đặc biệt, để tăng hiệu quả tiêu hóa cơ học, gà còn ăn thêm những hạt sỏi nhỏ, đó là
cách tăng ma sát cơ học giúp thức ăn thực vật bị nghiền nhỏ thành những mảnh vụn
li ti để quá trình tiêu hóa ở ruột diễn ra hiệu quả.
So với tất cả các động vật ăn thực vật, gà là nhóm động vật có cách tiêu hóa
khá đặc biệt, thời gian tồn tại của thức ăn tại diều và dạ dày của gà là khá lâu so với
các phần còn lại trong ống tiêu hóa [67], điều này được thể hiện rất rõ qua Bảng 1.
Lối tiêu hóa diễn ra từ từ ở phần đầu của ống tiêu hóa với pH thấp đã ức chế sự phát
triển của nhiều loài vi sinh vật. Đó cũng là một vấn đề khó khăn khi đưa các loại
probiotic là các tế bào sinh dưỡng vào trong ống tiêu hóa của gà vì có thể số tế bào
probiotic vượt qua được dạ dày với nồng độ không đủ lớn để phát huy tác dụng.
Quan sátHình 1 cho thấy, lượng axít hữu cơ tiết ra trong ống tiêu hóa với nồng độ
cao làm cho pH ở các phần đầu ống tiêu hóa thấp, điều này khẳng định rằng các axít
hữu cơ có vai trò trực tiếp quyết định đến hệ vi khuẩn đường ruột, làm giảm các vi
nhuẩn gây bệnh và kiểm soát các quần thể chủ yếu cạnh tranh chất dinh dưỡng đối
với gà [28]. Đây cũng chính là cơ sơ để các nhà nghiên cứu đánh giá về tác động

của các axít hữu cơ c
ũng nh
bệnh ở gà [28,65].
Ở
tá tràng là nơi tiêu h
chủ yếu của hệ
tiêu hóa khi có nhi
trong tuyến tụy cũng nh
ư các mu

niêm mạc ruột lượ
n sóng và có nhi
thụ lên rất nhiều lần. C
ũng gi
gà dài và có đôi mang tràng l
và hồi tràng là khá lớ
n, v
(Bảng 1 và Hình 1
), đây có th
cũng như các vi sinh vậ
t có l
nơi khu trú của nhiề
u loài vi sinh v
quan trọng giố
ng như manh
chúng. Chức năng củ
a manh tràng đư
khó tiêu hóa, hấp thu nư
ớ
thông với hậ
u môn, nơi có pH 8 và c
khuẩn diễn ra khá mạ
nh m
Hình 1. C

3
ũng nh
ư các vi khuẩn sinh axít đối với việc kiể
m soát các m
tá tràng là nơi tiêu h

óa hóa học thức ăn cũng như hấp thụ
ch
tiêu hóa khi có nhi
ều enzyme được tiết ra từ
thành ru
ư các mu
ối mật được tiết ra từ gan. Cấu tạ
o c
n sóng và có nhi
ều nhung mao đã làm tăng diệ
n tích b
ũng gi
ống như đa số các động vật ăn thực vậ
t khác, ru
gà dài và có đôi mang tràng l
ớn. Thời gian tồn tại của hỗn dị
ch tiêu hóa
n, v
ới thành phần chất dinh dưỡng đa dạ
ng, pH trung tính
), đây có th
ể sẽ là điều kiện thuận lợi để
cho vi sinh v
t có l
ợi phát triển. Với đôi manh tràng lớ
n, có l
u loài vi sinh v
ật, tuy nhiên, đây không phả
i là cơ qua
ng như manh

tràng ở thỏ, nơi đây-manh tràng là dạ
dày th
a manh tràng đư
ợc cho là có liên quan đến sự
tiêu hóa các ch
ớ
c, glucose và và các axít béo. Trự
c tràng là m
u môn, nơi có pH 8 và c
ũng là nơi mà quá tr
ình lên men c
nh m
ẽ.
Hình 1. C
ấu tạo hệ tiêu hóa ở gà [28]
m soát các m
ầm
ch
ất dinh dưỡng
thành ru
ột, các enzyme
o c
ủa ruột non với
n tích b
ề mặt hấp
t khác, ru
ột của
ch tiêu hóa
ở hỗn tràng
ng, pH trung tính

cho vi sinh v
ật gây bệnh
n, có l
ẽ đây cũng là
i là cơ qua
n tiêu hóa
dày th
ứ hai của
tiêu hóa các ch
ất
c tràng là m
ột đoạn ngắn
ình lên men c
ủa các vi


4

Bảng 1. pH và thời gian tồn tại của thức ăn ở các phần khác nhau trong
ống tiêu hóa của gà [67]
Các cơ quan trong ống tiêu hóa Thời gian tồn tại của
thức ăn (phút)
pH
Diều
50 5,5
Dạ dày tuyến và dạ dày cơ
90 2,5-3,5
Tá tràng
5-8 5-6
Hỗn tràng

20-30 6,5-7
Hồi tràng
50-70 7-7,5
Trực tràng
25 8

1.1.2. Hệ vi khuẩn đường ruột của gà
Vi khuẩn đường ruột đóng một vai trò quan trọng đối với sức khỏe thông qua
các tác động của nó tới hình thái ruột, dinh dưỡng, sinh bệnh học của các bệnh
đường ruột và các đáp ứng miễn dịch [34]. Hệ vi khuẩn đường ruột cũng được cho
là có khả năng chống xâm lấn của các mầm bệnh trong đường ruột và kích hoạt các
đáp ứng miễn dịch [45].
Các nghiên cứu về hệ vi khuẩn trong đường tiêu hóa của gà ngày càng được
chú ý. Các vi khuẩn dễ nuôi cấy chiếm ưu thế trong manh tràng, đa số là các vi
khuẩn kỵ khí bắt bắt buộc, với mật độ 10
11
/g trọng lượng [10]. Ít nhất có 38 loại vi
khuẩn kỵ khí khác nhau đã được phân lập từ manh tràng của gà và chúng bao gồm
nhiều chủng khác nhau [9]. Mead (1989) đã tìm thấy các cầu khuẩn gram dương
như Peptostreptococcus chiếm 28% tổng số vi khuẩn có thể nuôi cấy, các nhóm
khác bao gồm Bacteroidaceae (20%), Eubacterium spp. (16%), Bifidobacterium
spp. (9%), cầu khuẩn nảy mầm (6%), Gemmiger formicilis (5%), và Clostridium
spp. (5%). Tuy nhiên, các nghiên cứu về mặt vi sinh học thông qua nuôi cấy đã cho
ra những kết quả không đồng nhất [9,44]. Việc áp dụng các kỹ thuật sinh học phân
tử trong điều tra sinh thái học vi khuẩn trong hệ tiêu hóa của gà đã được tiến hành


5

trong những năm gần đây [34]. Netherwood và cộng sự (1999) đã dùng phản ứng lai

để theo dõi đáp ứng của hệ vi khuẩn với sự bổ sung probiotic. Apajalahti và cộng sự
(2001) đã phân tích sự khác biệt về hệ vi khuẩn ruột- manh tràng do chế độ ăn bằng
cách sử dụng nhận dạng % G+C trong các trình tự của 16S rDNA. Họ đã chỉ ra rằng
phần lớn các gen phát hiện không phải là từ các vi khuẩn đã biết rõ. Các kết quả
nghiên cứu này đã được xác nhận bởi Gong và cộng sự (2002) và Zhu và cộng sự
(2002), những người đã ghi nhận rằng một số trình tự trong 16S rDNA khôi phục lại
từ thư viện manh tràng biểu hiện trình tự tương đồng thấp với các gen của các chi vi
khuẩn đã biết.
Trong nghiên cứu của mình,Jiangrang và cộng sự (2003) đã dùng phương
pháp phân tích trình tự của 16S rDNA của cộng đồng vi khuẩn phân lập trong ống
tiêu hóa của gà. Kết quả cho thấy cộng đồng vi khuẩn trong ruột gà được chia thành
4 nhóm: Nhómvi khuẩn gram dương có G+C thấp, nhóm vi khuẩn gram dương có
G+C cao, nhóm vi khuẩn cổ và nhóm Cytophaga/Flexibacter/Bacteroides. Nhóm vi
khuẩn gram dương có G+C thấp bao gồm Lactobacillus, clostridia, Bacillus và
streptococci. Bacillus và streptococci là nhóm phổ biến nhất trong hồi tràng và
manh tràng. Mười ba chi đã được tìm thấy trong cả hồi tràng lẫn manh tràng nhưng
sự phong phú ở các cơ quan này là khác nhau. Trong hồi tràng, Lactobacillus chiếm
67% nhưng Clostridiaceae lại phong phú hơn ở trong manh tràng (68%). Sự khác
biệt về thành phần loài trong cộng đồng vi khuẩn ở hồi tràng và manh tràng được
thể hiện chi tiết qua Bảng 2 và Hình 2 dưới đây.


6

Bảng 2. Các chi của vi khuẩn đã phát hiện trong hồi tràng và manh tràng
bằng ngân hàng 16S rDNA [34]
Nhóm (% tổng số) Chi % của chi trong
a
Hồi tràng

Manh tràng

Nhóm G+C thấp, gram dương
(hồi tràng, 94,18%;
manh tràng 76,9%)
Lactobacillus 67,59 7,75
Weisella 1,05 0,48
Clostridium 9,69 39,26
Ruminococcus 0,44 16,48
Eubacterium 0,73 9,85
Bacillus 0,67 1,45
Staphylococcus 0,95 0
Streptococcus 6,63 0,65
Enterococcus 6,43 0,97
Nhóm G+C cao, gram dương
(hồi tràng, 0,92; mang tràng 13,89)
Fusobacterium 0,73 13,89
Bifidobacterium 0,19 0
Vi khuẩn cổ (gram âm)
(hồi tràng, 0,6; manh tràng 2,75)
Ochrobacterium

0,18 0,81
Alcaligenes 0,88 0,65
Escherichia 0,35 1,19
Campylobacter 0,88 0
Cytophaga/Flexibacter/Bacteroides
( hồi tràng, 0,6; manh tràng 5,19)
Flavobacterium 0 0,16
Bacteroides 0,60 5,01

a
tổng số của 614 và 616 trình tự được phân tích từ hồi tràng và manh tràng

Hình 2. Thành phần c
ủ
được xác định bằng giả
i trình t
DNA [34]
. (A) Thành ph
trong manh tràng.
Hệ vi khẩn đườ
ng ru
triển của vật chủ
. Các vi sinh v
hàng rào bảo vệ và chố
ng l
sinh đấu tranh với các
m
cáo bởi nhiều tác giả c
ũng nh
[36]. Thành phần hệ
vi sinh v
vật làm cho FCR thấ
p bao g
vi sinh vật đường ruột c
ũng đóng góp quan trong trong vi
gây bệnh đường ruột, đ
ặ
kháng vi khuẩn, hạn chế

1.1.3. Các vi khu
ẩn Bacillus phân lập từ ruột g
Bacillus có thể
tìm th
người. Một số loài gặ
p ph
megaterium,
B.licheniformis
cereus, B. flexus, B. firmus, B. indicus, Bacillus ssp.
khuẩn Bacillus trong ruộ
t gà là không ph

7
ủ
a hệ vi khuẩn trong hồ
i tràng và manh tràng c
i trình t
ự 1230 dòng từ trình tự
16S rDNA trong thư vi
. (A) Thành ph
ần vi khuẩn trong hồ
i tràng. (B) Thành ph
ng ru
ột có vai trò cực kì quan trọng đối sứ
c kh
. Các vi sinh v
ật đường ruột bám dọc theo đườ
ng tiêu hóa t
ng l
ại các vi khuẩn gây bệnh [58]. Việc nhữ

ng vi khu
m
ầm bệnh theo nguyên tắc loại trừ cạ
nh tranh đ
ũng nh
ư ở các đối tượng vật chủ
khác nhau, k
vi sinh v
ật cũng ảnh hưởng đến FCR [6, 16]
, các nhóm vi sinh
p bao g
ồm Lachnospiraceae, Lactobacillus
và Clostridiales. H
ũng đóng góp quan trong trong vi
ệc chố
ng l
ặ
c biệt là một số vi khuẩn hội sinh có khả
năng ti

sự phát triển của các mầm bệnh [6].
ẩn Bacillus phân lập từ ruột g
à
tìm th
ấy trong đất, rễ cây, trong ố
ng tiêu hóa c
p ph
ổ biến trong chi Bacillus bao gồm
Bacillus subtilis
B.licheniformis

, B. clausii,
B. amyloliquefaciens, B. pumilus, B.
cereus, B. flexus, B. firmus, B. indicus, Bacillus ssp.

[4, 5, 7, 20, 32, 68]
t gà là không ph
ổ biến và thành phần loài c
ũng khác nhau

i tràng và manh tràng c
ủa gà giò
16S rDNA trong thư vi
ện
i tràng. (B) Thành ph
ần vi khuẩn
c kh
ỏe và sự phát
ng tiêu hóa t
ạo thành
ng vi khu
ẩn hội
nh tranh đ
ã được báo
khác nhau, k
ể cả ở người
, các nhóm vi sinh
và Clostridiales. H
ệ
ng l
ại các tác nhân

năng ti
ết ra chất
ng tiêu hóa c
ủa động vật và
Bacillus subtilis
, B.
B. amyloliquefaciens, B. pumilus, B.
[4, 5, 7, 20, 32, 68]
. Tỉ lệ vi
ũng khác nhau
ở


8

các cơ quan khác nhau [34]. Trong nghiên cứu của Jiangrang và cộng sự, đã chỉ ra
trong hồi tràng của gà chỉ có 0,67% và ở manh tràng là 1,45% (chi tiết thể hiện rõ ở
Bảng 2 và Hình 2). Các loài Bacillus phân lập được trong ống tiêu hóa của gà bao
gồm Bacillus subtilis, B. megaterium, B.licheniformis, B. clausii, B. pumilus, B.
cereus, B. firmus, Bacillus ssp. [4, 20].
Mặc dù với số lượng loài không phải là đa dạng nhưng các loài Bacillus có
vai trò rất quan trọng đối với đời sống cũng như sức khỏe của động vật nói chung
cũng như gia cầm nói riêng. Bacillus có khả năng hình thành nội bào tử có khả năng
kháng nhiệt, chị được muối mật, sản xuất các chất kháng khuẩn, kích thích sự đáp
ứng của hệ thống miễn dịch của vật chủ, tốc độ hình thành bào tử cũng như tốc độ
nảy mầm cao, tăng cường khả năng sinh trưởng của vật chủ [5, 20, 32, 63]. Với
những tính năng ưu việt như vậy, các loài Bacillus cần được phân lập, sàng lọc đánh
giá một cách chi tiết để chế tạo probiotic chất lượng cao cung cấp cho chính vật chủ
là gà để đem lại năng suất, chất lượng cũng như hiệu quả cho người chăn nuôi, đồng
thời có thể kiểm soát được bệnh dịch ở gia cầm. Chu trình nảy mầm, tạo bào tử

cũng như cấu trúc của nội bào tử được mô phỏng chi tiết thông qua Hình 3 dưới
đây.



9



A




B

Hình 3: Chu trình hình thành, nảy mầm của nội bào tử thuộc chi Bacillus và cấu
trúc của nội bào tử [16]. A: VC (tế bào sinh dưỡng) khi thiếu dinh dưỡng bắt đầu
hình thành F (tiền bào tử) nằm trong MC (tế bào mẹ) và tách ra sau khoảng 8
giờ, trở thành bào tử dạng tự do S . B: vị trí hình thành bào tử (A), lát cắt ngang
cấu trúc bào tử (B), bào tử khi nảy mầm (C).
1.2. Probiotic
1.2.1. Khái niệm chung về probiotic
Những vi khuẩn có lợi đã được con người biết đến từ rất lâu. Năm 1899,
Tissier đã xác định các tính chất của trực khuẩn và đề xuất được sử dụng nó để điều
trị bệnh tiêu chảy ở trẻ sơ sinh [61], ông cũng đặt tên cho loài vi khuẩn có lợi mà
mình phân lập được là Bacillus bifidus communis [69]. Tuy nhiên, khởi nguồn của
những quan sát về các vi sinh vật có lợi phải kể đến công trình của Elie Metchnikoff
vào những năm 1907 [8, 22, 69].Metchnikoff thấy một số loài vi khuẩn lactic làm
tăng tuổi thọ cho người nông dân Bulgari. Ông cũng cho rằng sự phụ thuộc của các

vi khuẩn đường ruột vào thức ăn làm cho chúng có khả năng biến đổi hệ vi khuẩn
đường ruột và thay thế các vi khuẩn có hại bằng các vi khuẩn có lợi [22]. Do vậy,


10

ông đã phát triển một chế độ ăn với sữa được lên men bằng vi khuẩn mà ông đặt tên
cho nó là “Bulgarian bacillus”. Vào những năm 1930 thì Minoru Shirota đã phân
lập được vi khuẩn Lactobacillus casei Shirota và sau đó đã phát triển thành nước
giải khát để tăng cường sức khỏe cho người dân Nhật Bản [61].
Những công trình của Metchnikoff và Tissier lần đầu tiên đã tạo nên những
gợi ý khoa học về việc sử dụng vi khuẩn probiotic. Các quan sát của họ rất hấp dẫn
về mặt thương mại nhưng thật không may rằng, không phải quan sát nào cũng có
kết quả dương tính và hầu hết các quan sát đó chỉ mang tính chủ quan. Đó cũng là lí
do tại sao khái niệm probiotic đã không nhận được nhiều sự quan tâm trong nhiều
thập kỉ với chỉ một số ít các nghiên cứu liên quan đến động vật nuôi để tìm ra cách
cải thiện sức khỏe và tăng khả năng sinh trưởng cho vật nuôi. Thuật ngữ “probiotic”
không được chú ý nhiều cho tới những năm 1960, khi nghiên cứu của Lilly và
Stillwell được tiến hành. Để làm rõ bản chất của vi khuẩn probiotic, Fuller (1989)
đã định nghĩa lại thuật ngữ probiotic là vi khuẩn sống được bổ sung vào thức ăn để
đem lại những tác động có ích đối với vật chủ bằng cách cải thiện cân bằng trong
ruột của chúng. Một định nghĩa cũng khá tương đồng với định nghĩa của Fuller,
được đề xuất bởi Havenaar và Huis in't Veld (1992), probiotic được hiểu là một
nuôi cấy đơn hoặc hỗn hợp của vi khuẩn sống , khi bổ sung vào động vật hoặc
người, đem lại lợi ích đối với vật chủ bằng cách cải thiện những đặc tính của hệ vi
sinh vật bản địa. Một trong những định nghĩa về probiotic gây được nhiều chú ý đã
được đưa ra bởi các tác giả Guarner và Schaafsma (1998), các tác giả đã định nghĩa
probiotic là các vi sinh vật sống, khi được bổ sung với lượng vừa đủ, nó sẽ đem lại
lợi ích về mặt sức khỏe cho vật chủ. Như vậy định nghĩa chỉ ra rằng có hạn chế sự
sự dụng thuật ngữ probiotic đối với những sản phẩm chứa các vi sinh vật sống đồng

thời, nó cũng yêu cầu rằng để đạt được tác dụng tối ưu đối với vật chủ thì cần phải
đưa vào liều lượng probiotic thích hợp.
Việc nghiên cứu và ứng dụng probiotic trong thực tiễn tăng nhanh kể từ 30
năm trở lại đây, điều này kéo theo nhiều quan điểm khác nhau về việc định nghĩa


11

probiotic. Thuật ngữ probiotic đôi khi còn được sử dụng nhầm và đánh đồng với tác
động có lợi do các vi sinh vật hội sinh đem lại, sự lạm dụng này đã gây ra hiểu
nhầm rằng các yếu tố dinh dưỡng hoặc các yếu tố môi trường có thể kích hoạt các
probiotic bẩm sinh trong cơ thể. Các vi khuẩn hội sinh trong cơ thể thường là nguồn
quan trọng để phân lập và tuyển chọn ra các probiotic. Tuy nhiên, ngay cả khi các
chủng ưu việt đó được xác định đầy đủ các tính chất như khối lượng, độ ổn định và
các tác động về mặt sức khỏe thì chúng chưa hẳn đã là các probiotic. Cơ quan Quản
lí Thuốc và Thực phẩm Hoa Kì (FDA) lại áp dụng các định nghĩa về probiotic khác
nhau trong các lĩnh vực khác nhau. Vi khuẩn sống được sử dụng trong thức ăn dành
cho động vật thì gọi là các vi khuẩn làm thức ăn trực tiếp, còn nếu được sử dụng
như là thuốc dành cho người thì chúng thuộc nhóm các liệu pháp sinh học sống. Khi
không có một thuật ngữ chính thống nào mang tính pháp lí thì việc tiếp thị các sản
phẩm được dán nhãn là “probiotics” sẽ khó có thể đáp ứng được các tiêu chí cơ bản
được quy định trong các định nghĩa khoa học [60]. Đứng trước nhu cầu thực tiễn,
FAO/WHO (2002) đã ra hướng dẫn về đánh giá probiotic trong thực phẩm, trong
hướng dẫn đó đã thống nhất áp dụng định nghĩa về probiotic là “Các vi sinh vật
sống khi bổ sung một lượng vừa đủ sẽ đem lại lợi ích về sức khỏe cho cơ thể vật
chủ”. Bảng 3 dưới đây mô tả lại các khái niệm về probiotic qua các năm cho tới khi
có được một định nghĩa chính thức về probiotic.
Bảng 3.Một số mô tả và khái niệm về probiotic được trích dẫn nhiều
trong các năm qua [8]
Mô tả Nguồn

Probiotics có phổ biến trong thực phẩm rau quả như các
vitamin, các hợp chất thơm, các emzyme, và các chất có ích
khác để kết nối các quá trình sống
Kollath (1953)
Probiotic đối lập với các chất kháng sinh Vergin (1954)


12

Các ảnh hưởng có hại của các chất kháng sinh có thể được
ngăn chặn bằng liệu pháp brobiotic
Kolb (1955)
Một hợp chất được tiết ta bởi một vi sinh vật, nó kích thích
sinh trưởng của các vi sinh vật khác
Lilly và Stillwell
(1965)
Các chất chiết của mô, nó kích thích sự sinh trưởng của vi
sinh vật
Sperti (1971)
Các hợp chất mà dựng lên hàng rào ngăn chặn sự nhiễm
trùng trong cơ thể vật chủ nhưng nó lại không ức chế sự sinh
trưởng in vitro của các vi sinh vật
Fujii và Cook
(1973)
Các sinh vật và các hợp chất mà nó góp phần vào duy trì cân
bằng hệ vi sinh vật ruột
Parker (1974)
Bổ sung vào thức ăn các vi sinh vật sống mà nó đem lại các
tác động có lợi đối với vật chủ là động vật bằng cách cải
thiện cân bằng vi sinh vật

Fuller (1989)
Nuôi cấy đơn hoặc nuôi cấy hỗn hợp của các vi sinh vật, nó
được bổ sung vào động vật hoặc con người, có lợi ích đối
với vật chủ bằng cách cải thiện các tính chất của hệ vi khuẩn
bản địa
Havenaar và
Huisint’Veld
(1992)
Dịch nuôi chứa vi khuẩn sống hoặc sản phẩm được nuôi cấy
tại trại sản xuất bơ sữa, nó đem lại các tác dụng có lợi về mặt
sức khỏe và dinh dưỡng đối với vật chủ
Salminen và cộng
sự (1996)
Các vi khuẩn sống, khi uống với một số lượng nhất định nó
sẽ phát huy các lợi ích về sức khỏe chứ không phải là do chế
độ dinh dưỡng vốn có
Schaafsma
(1996)


13

Các chế phẩm tế bào vi sinh vật hoặc các hợp chất của các tế
bào vi sinh vật có tác động có lợi về sức khỏe và thể chất của
vật chủ
Salminen và cộng
sự (1999)
Một chế phẩm hoặc một sảm phẩm chứa vi khuẩn sống, khi
đưa vào với lượng cần thiết, nó thay đổi hệ vi sinh vật (bằng
cách gắn chặt hoặc khuẩn lạc hóa) trong một bộ phận của vật

chủ, qua đó nó thúc đẩy lợi ích về mặt sức khỏe trong cơ thể
vật chủ
Schrezenmeir và
Vrese (2001)
Các vi sinh vật sống khi nó được đưa vào một lượng vừa đủ
thì đem lại lợi ích về mặt sức khỏe đối với vật chủ
FAO/WHO
(2002)
Probiotic thực sự là một lĩnh vực hấp dẫn đối với các nhà khoa học cũng như
đối với các nhà sản xuất thương mại trong vài thập kỉ gần đây. Tuy nhiên, việc tạo
ra một sảm phẩm chất lượng cao và an toàn thì cần phải có các tiêu chuẩn chặt chẽ
quy định cho các sản phẩm được gắn nhãn là probiotic. Các đặc tính và các tác động
có lợi của một probiotic lí tưởng được thể hiện rõ qua Bảng 4 và Hình 4.
Bảng 4. Các tiêu chí lựa chọn probiotic ứng dụng trong thương mại [8, 54]

Các tiêu chí Đặc tính
Tiêu chí an toàn Có nguồn gốc phân lập từ vật chủ
Không gây độc và gây nhiễm trùng
Có khả năng hoạt hóa trao đổi chất và các đặc tính vốn
có như khả năng kháng lại một số chất kháng sinh
Tiêu chí công nghệ Ổn định khi sản xuất và khi bảo quản
Có tính nhạy cảm cao khi ở giai đoạn nghỉ


14

Có thể sản xuất ở quy mô lớn
Tiêu chí chức năng Chịu đựng được dịch và axít dạ day
Chịu đựng được muối mật
Có khả năng bám dính tốt vào bề mặt niêm mạc

Thay đổi hệ vi sinh vật đường ruột
Ngăn chặn sự xâm lấn của các mầm bệnh
Giảm các ô nhiễm trong cơ thể động vật
Nâng cao năng suất vật nuôi
Có hoạt tính đối kháng với các mầm bệnh trong dạ dày
như Helicobacter pylori , Candida albicans
Tiêu chí sinh lí học Tăng cường khả năng miễn dịch
Có khả năng trao đổi cholesterol, lactose
Giảm các phản ứng viêm
Giảm bài tiết amoniac và urê
Các đặc tính về ngăn chặn đột biến gen, ngăn chặn sản
xuất các chất gây ung thư


Hình 4. Hướng dẫ
n cho đánh giá Probiotic s


15
n cho đánh giá Probiotic s
ử dụng cho thực phẩ
m (FAO/WHO, 2002)

m (FAO/WHO, 2002)



16

Probiotic khi được bổ sung vào cơ thể động vật thông qua đường uống và

đem lại những lợi ích về mặt sức khỏe cho vật chủ. Một vấn đề đặt ra là, cơ chế hoạt
hóa của nó trong ống tiêu hóa của vật chủ diễn ra như thế nào? Ống tiêu hóa của
động vật là một môi trường cho các vi khuẩn hoạt động, chúng ảnh hưởng lên cơ
thể vật chủ theo những cách khác nhau. Sự xâm nhập của các vi khuẩn diễn ra ngay
khi động vật sinh ra sau đó hình thành nên một hệ vi khuẩn đường ruột. Chính sự
tương tác giữa các vi khuẩn với nhau cũng như sự tương tác giữa các vi khuẩn với
vật chủ tạo nên một sự cân bằng động [64]. Có một số cơ chế hoạt động của các
prbiotic trong cơ thể vật chủ như: 1) Duy trì hệ vi sinh vật đường ruột bằng cách
loại trừ vi sinh vật cạnh tranh và các vi sinh vật đối kháng [3, 33, 36, 47, 54]; 2)
Thúc đẩy trao đổi chất bằng cách tăng hoạt tính của các enzyme tiêu hóa và giảm
hoạt tính enzyme của các vi khuẩn cũng như giảm sản xuất amoniac, tổng hợp các
chất kháng vi sinh vật [33, 36, 57]; 3) Cải thiện lượng thức ăn và khả năng tiêu hóa
[36, 57]; 4) Kích thích thệ thống miễn [3, 8, 33, 36, 47, 64].
Cơ chế cạnh tranh theo kiểu loại trừ đã được sử dụng như một phương pháp
để kiểm soát loài đặc hữu cũng như các tác nhân gây bệnh ở gia cầm. Rantala và
Nurmi (1973) là những người đầu tiên áp dụng phương này để kiểm soát sự bùng
phát nghiêm trọng của Salmonella infantis trong các đàn gà ở Phần Lan. Trong các
nghiên cứu của họ đã chỉ ra rằng chỉ cần một liều lượng yêu cầu rất thấp của
Salmonella (1-10 tế bào trong dạ dày tuyến) đã đủ khởi động cho bệnh nhiễm
Salmonella. Các tác giả cũng nhận thấy rằng, gà con ở tuần thứ thất sau khi nở thì
dễ bị nhiễm trùng Salmonella nhất. Khi sử dụng một chủng Lactobacillus đã không
gây ra phản ứng miễn dịch trong cơ thể vật chủ. Từ đó, họ ước lượng được kích
thước quần thểvi khuẩn tương đối ổn định trong đường ruột của gà trưởng thành
kháng lại Salmonella infantis. Việc bổ sung bằng đường uống một nuôi cấy hỗn
hợp của Lactobacillus và Salmonella cho gà con đã tạo ra khả năng kháng lại
Salmonella một cách hiệu quảở dạng gà trưởng thành. Cách làm này sau này trở
thành phương pháp Nurmi hay khái niệm cạnh tranhtheo kiểu loại trừ.


17

Cạnh tranh theo kiểu loại trừ được cho là có nhiều cơ chế khác nhau như
cạnh tranh về các vị trí của thụ thể trên niêm mạc ruột, tiết ra các chất kháng lại vi
sinh vật, sản xuất các sản phẩm lên men phụ như axít béo bay hơi, cạnh tranh về các
chất dinh dưỡng thiết yếu và kích thích chức năng miễn dịch của vật chủ [3, 22].
Tuy nhiên, cơ chế tăng cường khả năng miễn dịch của vậ chủ mới được các
nhà nghiên chú ý hơn cả [65]. Nhiều tác động của probiotic là sự điều hòa miễn
dịch thông qua các yếu tố trung gian, đặc biệt là thông qua điều khiển cân bằng của
tiềm viêm và chống viêm các cytokine [25, 35]. Các probiotic cũng được chứng
minh rằng nó kích thích các tiểu phần của các tế bào trong hệ thống miễm dịch để
sản xuất các cytokine [13, 42]. Tuy nhiên, một số chủng probiotic đặc hiệu có thể
kích thích miễn dịch bẩm sinh [12, 52] cũng như để tăng miễn dịch qua trung gian
[21, 27, 46]. Gill và cộng sự (2001) đã chỉ ra rằng, probiotic có thể làm tăng hoạt
tính ở của tế bào giết tự nhiên ở người già thậm chí là có thể kích hoạt các cơ chế
bảo vệ không đặc hiệu của vật chủ [19]. Kabir và cộng sự (2004) đã đánh giá các
động lực của probiotic trong việc đáp ứng miễn dịch của gà thịt và họ đã báo cáo
rằng sự sản xuất kháng thể ở nhóm thí nghiệm cao hơn so với nhóm đối chứng. Một
khả năng khác của probiotic là tương tác với các vi khuẩn hội sinh thông qua các
phân tử nhận dạng hay thụ thể TLR như TLR-2 và TLR-4 có ở trên biểu mô. Tương
tác như vậy gây ra tăng cường tiết cytokine để bảo vệ biểu mô và ức chế quá trình
tự chết của các tế bào [55].Lactobicullus casei có khả năng ngăn chặn dextran
sodium sufate (DSS)- tác nhân gây cảm ứng đại tràng trong chuột độtbiến TLR-4
bằng cách ức chế hoạt tính của myeloperoxidase và tăng hoạt tính của TGF-beta và
IL-10 mRNA. Các tác động này được gọi là cơ chế hoạt động của L.casei phần lớn
phụ thuộc vào tình trạng của TLR-4 [14]. Các vi khuẩn kích hoạt đáp ứng tiền viêm
trong các tế bào biểu mô ruột bằng cách hoạt hóa yếu tố phiên mã
NF-
κ
B.
Ngược lại,

các loài không gây bệnh có khả năng làm giảm các đáp ứng tiền viêm bằng cách
ngăn chặn sự suy giảm của yếu tố điều hòa- ngược IκB. Phương pháp ngăn chặn
phản ứng tiền viên có ở vi khuẩn không gây bệnh đã được chứng minh, ví dụ như
Salmonella pullorum có khả năng làm giảm tiết IL-8 của vi khuẩn gây bệnh