Nghiên cứu thu nhận enzyme gelatinase từ vi khuẩn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG




TRẦN QUỐC ĐẢM





NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME GELATINASE
TỪ VI KHUẨN







LUẬN VĂN THẠC SĨ

Nha Trang - 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG



TRẦN QUỐC ĐẢM




NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME GELATINASE
TỪ VI KHUẨN


Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch
Mã số: 60 54 10


LUẬN VĂN THẠC SĨ



NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. NGUYỄN MINH TRÍ
TS. NGUYỄN ANH TUẤN

Nha Trang – 2013
- i -

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và
kết quả nêu trong luận văn là trung thực, chưa được ai công bố trong bất kỳ công
trình nào.

Tác giả luận văn



Trần Quốc Đảm

- ii -

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành Luận văn, trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám Hiệu, Ban Chủ
nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm cùng toàn thể Thầy Cô Trường Đại học Nha
Trang sự kính trọng, lòng biết ơn và niềm tự hào được học tập và nghiên cứu tại
trường trong những năm qua.
Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được dành cho thầy: Nguyễn Minh Trí, thầy
Nguyễn Anh Tuấn, cô Nguyễn Thị Thanh Hải - Trường Đại học Nha Trang đã tận
tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện Luận văn.
Xin chân thành cảm ơn Trung tâm Thí nghiệm Thực hành, toàn thể Thầy Cô,
anh chị quản lý phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện nghiên
cứu tại đây. Đặc biệt tôi xin gửi lời cảm ơn đến Thầy Vũ Phương, Thầy Nguyễn Đình

Khương, cô Đỗ Thị Ánh Hòa, chị Nguyễn Minh Nhật, chị Nguyễn thị Đoan Trang và
anh Đỗ Xuân Lộc đã giúp đở tôi trong suốt quá trình làm Luận văn.
Xin cảm ơn cha mẹ và các anh chị của tôi đã luôn ủng hộ tôi học tập và
nghiên cứu nhiều năm qua. Cảm ơn toàn thể bạn bè đã luôn ở bên cạnh giúp đỡ tôi
trong quá trình làm Luận văn.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!
Tác giả luận văn



Trần Quốc Đảm

- iii -

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu viết tắt Diễn giải
B Bacillus
sp species
F Flavobacterium
P Pseudomonas
BA Blood agar
BSA Bovine Serum Albumin
TSA Tryptone Soya Agar
C Chủng
E Enzyme
S Cơ chất
P Sản phẩm thủy phân
CPE Chế phẩm enzyme
MC Mẫu đối chứng

MT Môi trường
DX8 Phần mềm Design-Expert 8
V Vận tốc phản ứng
t
o

Nhiệt độ
h Giờ
ADN

Acid Deoxyribo Nucleic
ARN Axít ribonucleic
mARN Messenger ARN
rRNA

Riboxom ARN
GRAS Generally recognized as safe
TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam
- iv -

MỤC LỤC


LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii
MỤC LỤC iv
DANH MỤC BẢNG viii
MỞ ĐẦU 1
Chương 1: TỔNG QUAN 4

1.1. Gelatin 4
1.1.1. Khái quát về gelatin 4
1.1.2. Tính chất công nghệ của gelatin 7
1.2. Gelatin thủy phân 7
1.2.1. Khái quát về gelatin thủy phân 7
1.2.2. Ứng dụng của gelatin thủy phân 9
1.2.3. Một số nghiên cứu về gelatin thủy phân 11
1.2. Tổng quan về enzyme và tổng hợp enzyme từ vi sinh vật 12
1.2.1. Tổng quan về enzyme 12
1.2.2. Tổng hợp enzyme từ vi sinh vật 19
1.3. Enzyme protease và enzyme gelatinase 21
1.3.1. Enzyme protease 21
1.3.2. Enzyme gelatinase 23
1.4. Tổng quan về sự phân bố của vi sinh vật và các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh
trưởng của vi sinh vật 28
1.4.1. Sự phân bố vi sinh vật trong tự nhiên 28
1.4.2. Dinh dưỡng của vi sinh vật 29
1.4.3. Ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh đến sự sinh trường và phát triển của
vi sinh vật 30
1.5. Vi khuẩn Bacillus subtilis 31
1.6. Quy trình thu nhận chế phẩm enzyme từ vi sinh vật 32
- v -

1.6.1. Tuyển chọn chủng vi sinh vật trong môi trường tự nhiên 33
1.6.2. Bảo quản giống 33
1.6.3. Nuôi cấy vi sinh vật để sinh enzyme 34
1.6.4. Thu hồi chế phẩm enzyme 36
Chương 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38
2.1. Nguyên vật liệu 38
2.1.1. Mẫu phân lập vi khuẩn 38

2.1.2. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn 38
2.1.3. Hóa chất 39
2.2. Phương pháp nghiên cứu 39
2.3. Bố trí thí nghiệm 40
2.3.1. Bố trí thí nghiệm phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng
sinh gelatinase cao 41
2.3.2. Bố trí thí nghiệm xác định một số tính chất của enzyme gelatinase từ
chủng tuyển chọn 43
2.3.3. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi sinh enzyme
đến khả năng sinh gelatinase của chủng tuyển chọn 47
2.3.4. Bố trí thí nghiệm khảo sát mức độ, chiều hướng ảnh hưởng và sự tương
tác của các yếu tố nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp gelatinase của chủng
tuyển chọn 54
2.3.5. Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện nuôi sinh gelatinase từ chủng
tuyển chọn 54
2.3.6. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện kết tủa thích hợp để thu nhận chế
phẩm gelatinase từ chủng tuyển chọn 55
2.3.7. Bố trí thì nghiệm áp dụng thủy phân gelatin bằng chế phẩm gelatinase từ
chủng tuyển chọn 57
2.4. Phương pháp phân tích 59
2.4.1. Xác định hoạt độ gelatinase 59
2.4.2. Định lượng nitơ amin, nitơ amoniac và nitơ tổng số 59
2.5. Phương pháp xử lý số liêu 60
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ 61
- vi -

3.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh gelatinase cao .61
3.1.1. Kết quả phân lập chủng vi khuẩn có khả năng sinh gelatinase 61
3.1.2. Kết quả kiểm khả năng sinh gelatinase của các chủng vi khuẩn phân lập
được 62

3.1.3. Kết quả tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh gelatinase cao nhất
từ các chủng phân lập và tuyển chọn được 62
3.1.4. Kết quả định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn 63
3.2. Kết quả xác định một số tính chất của enzyme gelatinase từ chủng Bacillus sp… 66
3.2.1. Kết quả xác định cơ chất đặc hiệu của chế phẩm gelatinase từ chủng
Bacillus sp. C7 66
3.2.2. Kết quả xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ gelatinase từ chủng
Bacillus sp. C7 67
3.2.3. Kết quả xác định ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của gelatinase từ
chủng Bacillus sp. C7 68
3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme
gelatinase từ chủng Bacillus sp. C7 69
3.3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi sinh enzyme đến khả
năng sinh gelatinase của chủng Bacillus sp. C7 69
3.3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi sinh enzyme đến khả
năng sinh gelatinase của chủng Bacillus sp. C7 70
3.3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng gelatin trong môi
trường nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase của chủng Bacillus sp 72
3.3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nuôi sinh
enzyme đến khả năng sinh gelatinase của chủng Bacillus sp. C7 73
3.3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi sinh enzyme đến khả năng
sinh gelatinase của chủng Bacillus sp. C7 74
3.4. Kết quả khảo sát mức độ và chiều hướng ảnh hưởng của các yếu tố đến khả
năng sinh tổng hợp gelatinase của chủng Bacillus sp. C7 75
3.5. Kết quả tối ưu hóa điều kiên nuôi sinh gelatinase từ chủng Bacillus sp. C7 77
3.6. Kết quả xác định ảnh hưởng của điều kiện kết tủa đến hoạt tính của chế phẩm
gelatinae từ chủng Bacillus sp. C7 84
- vii -

3.6.1. Kết quả xác định ảnh hưởng của tác nhân và nồng độ kết tủa đến hoạt

tính của chế phẩm gelatinae từ chủng Bacillus sp. C7 84
3.6.2. Kết quả xác định ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hoạt tính của chế
phẩm gelatinae từ chủng Bacillus sp. C7 85
3.7. Kết quả áp dụng thủy phân gelatin 1% bằng chế phẩm gelatinase từ chủng
Bacillus sp. C7 86
3.7.1. Kết quả xác định ảnh hưởng của tỷ lệ giữa chế phẩm gelatinase với cơ
chất gelatin 1% (E/S) đến tốc độ phản ứng 86
3.7.2. Kết quả xác định thời gian và mức độ thủy phân gelatin 1% của
gelatinase từ chủng Bacillus sp. C7 87
3.8. Đề xuất quy trình thu nhận chế phẩm gelatinase kỹ thuật từ chủng Bacillus sp.
C7 tuyển chọn phân lập được 88
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 90
TÀI LIỆU THAM KHẢO 91


- viii -

DANH MỤC BẢNG


Bảng 1.1. Thành phần hóa học của gelatin 5
Bảng 1.2. Thành phần acid amin của gelatin và collagen trên 1000g nguyên liệu 5
Bảng 1.3. Thành phần acid amin của gelatin trên 1000g nguyên liệu 6
Bảng 1.4. Một số tính chất của gelatin 7
Bảng 1.5. Ứng dụng chủ yếu của gelatin thủy phân 10
Bảng 1.6. Khả năng sinh gelatinase của một số chủng vi khuẩn Bacillus sp. C7 24
Bảng 1.7. Ảnh hưởng của muối canxi và magie đến số lượng vi sinh vật, pH và khả
năng sinh gelatinase từ Proteus trong môi trường lactate 27
Bảng 1.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sự phát triển và sự thủy phân
gelatin của các chủng vi khuẩn của các loài F. meningosepticum, P.

aeruginosa, P. diminuta, P. fluorescens trong môi trường gelatin-agar 28
Bảng 1.9. Nhu cầu khoáng đối với một số vi sinh vật 36
Bảng 3.1. Số chủng vi khuẩn phân lập từ các mẫu 61
Bảng 3.2. Mô tả hình thái khuẩn lạc các chủng phân lập được 61
Bảng 3.3. Kết quả đo đường kính vòng phân giải và đường kính khuẩn lạc của các
chủng vi khuẩn trên thạch gelatin-agar sau 72 giờ nuôi cấy 95
Bảng 3.4. Bảng phân tích BLAST đoạn gen giải trình tự của chủng C7 65
Bảng 3.5. Kết quả thí nghiệm xác định cơ chất đặc trưng của CPE gelatinase từ
chủng Bacillus sp. C7 96
Bảng 3.6. Kết quả thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ
gelatinase của chủng Bacillus sp. C7 96
Bảng 3.7. Kết quả thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của
gelatinase của chủng Bacillus sp. C7 96
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi sinh enzyme đến khả
năng sinh gelatinase của chủng Bacillus sp. C7 98
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi sinh enzyme đến khả năng
sinh gelatinase của chủng Bacillus sp. C7 97
- ix -

Bảng 3.10. Kết quả hảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng gelatin trong môi
trường nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase của chủng Bacillus
sp. C7 97
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nuôi sinh
enzyme đến khả năng sinh gelatinase của chủng Bacillus sp. C7 97
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi sinh enzyme đến khả năng
sinh gelatinase của chủng Bacillus sp. C7 98
Bảng 3.13. Miền nghiên cứu thí nghiệm khảo mức độ và chiều hướng ảnh hưởng
của các yếu tố 75
Bảng 3.14. Kết quả thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng
sinh gelatinase từ chủng Bacillus sp. C7 98

Bảng 3.15. Mức độ và chiều hướng ảnh hưởng của các yếu tố trong quá trình nuôi
sinh gelatinase từ chủng Bacillus sp. C7 76
Bảng 3.16. Miền nghiên cứu tối ưu hóa các yếu tố nuôi sinh gelatinase 77
Bảng 3.17. Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng
sinh gelatinase từ chủng Bacillus sp. C7 99
Bảng 3.18. Phân tích chọn mô hình tối ưu hóa 77
Bảng 3.19. Bảng phân tích tính phù hợp của mô hình tối ưu đã chọn 78
Bảng 3.20. Kết quả phân tích các chỉ số thống kê tương ứng với mô hình tối ưu 79
Bảng 3.21. Kiểm định sự chính xác của phương trình hồi quy 80
Bảng 3.22. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các tác nhân kết tủa và nồng độ của các
tác nhân kết tủa đến hoạt độ của CPE gelatinase từ chủng Bacillus sp. C7
101
Bảng 3.23. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hoạt độ CPE
gelatinase Bacillus sp. C7 101
Bảng 3.24. Sự thay đổi hàm lượng đạm acid amin khi thủy phân gelatin 1% bằng
chế phẩm gelatinase ở các nồng độ khác nhau 102
Bảng 3.25. Sự thay đổi hàm lượng đạm acid amin theo thời gian và hiệu quả thủy
phân gelatin 1% bằng chế phẩm gelatinase 102

- x -

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc phân tử gelatin 4
Hình 1.2. Bột gelatin thủy phân 8
Hình 1.3. Sự phân bố khối lượng gelatin thủy phân so với gelatin trước thủy phân 8
Hình 1.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới tốc độ phản ứng enzyme 14
Hình 1.5. Ảnh hưởng của pH tới tốc độ phản ứng
15
Hình 1.6. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới tốc độ phản ứng

15
Hình 1.7. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất tới tốc độ phản ứng
16
Hình 1.8. Đồ thị biểu diễn phương trình
Linewear và Burk
17
Hình 1.9. Cấu trúc không gian phân tử gelatinase 24
Hình 1.10. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh gelatinase của Proteus 26
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát nghiên cứu thu nhận gelatinase từ vi
khuẩn tự nhiên 40
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập chủng vi khuẩn có khả năng sinh gelatinase
41
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập chủng có khả năng sinh gelatinase 42
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh gelatinase cao
nhất từ các chủng vi khuẩn phân lập 43
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát nghiên cứu một số tính chất của enzyme
gelatinase từ chủng tuyển chọn 44
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định cơ chất đặc hiệu của enzyme gelatinase
từ chủng tuyển chọn 44
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ
enzyme gelatinase từ chủng tuyển chọn 45
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH đến hoạt độ gelatinase
từ chủng tuyển chọn 46
Hình 2.9. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi sinh
enzyme đển khả năng sinh gelatinase từ chủng tuyển chọn 47
Hình 2.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi sinh
enzyme đến khả năng sinh gelatinase của chủng tuyển chọn 49
- xi -

Hình 2.11. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi sinh

enzyme đến khả năng sinh gelatinase từ chủng tuyển chọn 50
Hình 2.12. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng trong
môi trường nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase từ chủng vi khuẩn
tuyển chọn 51
Hình 2.13. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường
nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase từ chủng vi khuẩn tuyển
chọn 52
Hình 2.14. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi sinh
enzyme đến khả năng sinh gelatinase từ chủng vi khuẩn tuyển chọn 53
Hình 2.15. Sơ đồ thí nghiệm xác định ảnh hưởng của các tác nhân và nồng độ kết
tủa đến hoạt độ của chế phẩm gelatinase từ chủng tuyển chọn 55
Hình 2.16. Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hoạt độ của chế
phẩm gelatinase từ chủng tuyển chọn 57
Hình 2.17. Sơ đồ thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ giữa chế phẩm gelatinase
với cơ chất gelatin 1% (E/S) đến tốc độ phản ứng 58
Hình 2.18. Sơ đồ xác định thời gian và mức độ thủy phân gelatin 1% của chế phẩm
gelatinase từ chủng tuyển chọn 59
Hình 3.1. Vòng phân giải gelatin của các chủng vi khuẩn phân lập trên môi trường
thạch gelatin-agar sau 48 giờ nuôi cấy 62
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn khả năng sinh gelatinase của các chủng vi khuẩn phân
lập 63
Hình 3.3. Vòng phân giải của nhóm chủng vi khuẩn sinh gelatinase cao trên môi
trường thạch gelatin-agar sau 72 giờ nuôi cấy 63
Hình 3.4. Khuẩn lạc của chủng vi khuẩn tuyển chọn trên môi trường TSA và BA 64
Hình 3.5. Hình thái nhuộm Gram tế bào chủng vi khuẩn tuyển chọn 64
Hình 3.6. Trình tự gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn tuyển chọn 65
Hình 3.7. Độ thị biểu diễn ảnh hưởng của cơ chất khác nhau đến hoạt độ của
gelatinase từ chủng Bacillus sp. C7 66
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính của gelatinase từ chủng
Bacillus sp. C7 67

- xii -

Hình 3.9. Ảnh hưởng của pH phản ứng đến hoạt tính gelatinase từ chủng Bacillus
sp. C7 Error! Bookmark not defined.
Hình 3.10. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của môi trường nuôi sinh gelatinase đến khả
năng sinh gelatinase của chủng Bacillus sp. C7 70
Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh
gelatinase của chủng Bacillus sp. C7 71
Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn đường công sinh trường của chủng Bacillus sp. C7 nuôi
cấy trong môi trường MT3 71
Hình 3.13. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ gelatin trong môi trường nuôi
cấy đến khả năng sinh gelatinase của chủng Bacillus sp. C7 72
Hình 3.14. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH ban đầu trong môi trường nuôi cấy
đến khả năng sinh gelatinase của chủng Bacillus sp. C7 73
Hình 3.15. Đồ thì biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh
gelatinase của chủng Bacillus sp. C7 74
Hình 3.16. Ảnh hưởng và tương tác của các yếu tố nghiên cứu đến khả năng sinh
gelatinase của chủng Bacillus sp. C7 76
Hình 3.17. Biểu đồ mô tả tương tác của nhiệt độ và thời gian 81
Hình 3.18. Biểu đồ mô tả tương tác của pH và thời gian 82
Hình 3.19. Biểu đồ mô tả tương tác của nhiệt độ và pH 83
Hình 3.20. Ảnh hưởng của các tác nhân kết tủa và nồng độ của các tác nhân kết tủa
đến hoạt độ của CPE gelatinase thu được 84
Hình 3.21. Ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hoạt độ gelatinase trong quá trình
kết tủa gelatinase 86
Hình 3.22. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến khả năng thủy phân gelatin 1% 86
Hình 3.23. Sự thay đổi hàm lượng đạm acid amin theo thời gian thủy phân gelatin
1% bằng chế phẩm gelatinase 87

- 1 -

MỞ ĐẦU
- Tính cấp thiết
Gelatin là một polymer sinh học có nguồn gốc từ collagen, là thành phần chủ
yếu của da, xương và mô liên kết động vật. Gelatin được sản xuất bởi sự thủy phân
một phần phân tử collagen [25].
Các báo cáo gần đây cho thấy sản lượng gelatin trên thế giới hàng năm
khoảng 326 000 tấn, với gelatin có nguồn gốc từ da lợn chiếm 46% cao nhất, tiếp
theo là da trâu, bò 29,4%, xương 23,1%, và các nguồn khác 1,5% [25]. Gelatin được
cung cấp từ một số công ty hàng đầu trên thế giới như Công ty Nitta Gelatin Inc
Nhật Bản với hệ thống phân phối toàn cầu, Kyunggi Gelatin Ltd công ty hàng đầu
Hàn Quốc, Xinwulong Gelatin Trung Quốc … Ở Việt Nam hiện gelatin được sản
xuất tại Công ty CP Nam Việt từ da cá tra với công suất hơn 10 000 tấn/năm. Ngoài
ra, còn có dự án xây dựng nhà máy sản xuất collagen từ da cá tra của Công ty cổ
phần Vĩnh Hoàn với công suất dự kiến 1 000 tấn thành phẩm/năm và dự kiến đi vào
hoạt động năm 2013 (Vasep, 09/8/2012). Đây là nguồn gelatin dồi dào đáp ứng nhu
cầu sử dụng trong nước cũng như xuất khẩu của Việt Nam trong thời gian tới.
Một sản phẩm đặc biệt của gelatin là gelatin thủy phân đã được nghiên cứu
sản xuất và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Khả năng hòa tan, khả năng tạo nhủ, tạo
bọt hay hoạt tính chống oxy hóa … là những tính chất quan trọng của dịch thủy
phân gelatin được ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm [29, 32].
Dịch thủy phân gelatin có chứa một lượng lớn các acid amin như glycine, proline,
hydroxyproline, lysine, hydroxylysine … và chúng dễ dàng được hấp thụ vào cơ
thể. Đây là các thành phần chức năng quan trọng, nó được ứng dụng trong công
nghiệp mỹ phẩm và dược phẩm để sản xuất các sản phẩm hỗ trợ cấu trúc collagen
trong da và sụn [29].
Ngoài ra, gelatin thủy phân cũng có thể ứng dụng trong nông nghiệp mà chủ
yếu là trong trồng trọt. Gelatin thủy phân chứa nhiều acid amin cần thiết cho thực
vật. Theo nhiều nghiên cứu thì các acid amin có vai trò quan trọng trong điều hoà
quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật [12]. Ví dụ như glycine, proline là

hai acid amin giữ vai trò quan trọng làm tăng khả năng chống chịu của cây trồng
với môi trường bất lợi [17]. Thực vật có thể hấp thụ trực tiếp các đoạn peptide ngắn
và các acid amin qua lá với hiệu suất cao [12].
- 2 -

Quá trình thủy phân gelatin có thể được thực hiện bằng phương pháp hóa học
hoặc bằng phương enzyme. Chúng ta đã biết, enzyme có cường lực xúc tác mạnh
hơn rất nhiều so với các chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác, đồng thời nó có thể thực
hiện hoạt động xúc tác ở điều kiện áp suất và nhiệt độ thường [1, 10]. Từ những đặc
điểm trên cho thấy phương pháp enzyme góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm
và giảm thiểu tác động gây ô nhiễm môi trường từ quá trình sản xuất so với phương
pháp hóa học. Việc nghiên cứu và ứng dụng enzyme có nghĩa to lớn về mặt lý
thuyết cũng như về thực tế áp dụng [1].
Gelatinase là một proteolytic enzyme, có thể thủy phân gelatin thành các
peptide và các acid amin. Chúng ta có thể thu nhận gelatinase từ nhiều nguồn khác
nhau, trong đó thu nhận gelatinase từ vi sinh vật thì được chú ý hơn. Trong tự nhiên
có nhiều vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp gelatin [2, 22, 28]. Việc tuyển chọn
chủng an toàn (GRAS) thường được quan tâm trong ứng dụng các chủng vi sinh vật
vào sản xuất ngành công nghệ thực phẩm [25, 31].
Như vậy, đề tài “Nghiên cứu thu nhận enzyme gelatinase từ vi khuẩn” là
cần thiết, bước đầu có thể ứng dụng enzyme này để thủy phân gelatin ứng dụng
trong đời sống sản xuất.
- Mục tiêu nghiên cứu:
+ Phân lập và tuyển chọn được chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp
gelatinase cao từ tự nhiên.
+ Xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm enzyme gelatinase từ vi khuẩn tuyển
chọn phân lập được.
- Nội dung nghiên cứu:
+ Phân lập và tuyển chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp gelatinase cao tử vi
khuẩn trong tự nhiên.

+ Nghiên cứu một số đặc tính của enzyme gelatinase từ vi khuẩn tuyển chọn
phân lập được.
+ Nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi sinh gelatinase từ vi khuẩn tuyển chọn phân
lập được.
+ Nghiên cứu thu nhận chế phẩm gelatinase kỹ thuật từ vi khuẩn tuyển chọn
phân lập được.
- 3 -

- Ý nghĩa khoa học:
+ Sự thành công của đề tài sẽ cung cấp thêm nguồn tài liệu khoa học về lĩnh
vực nghiên cứu thu nhận enzyme từ vi khuẩn nói chung và enzyme gelatinase từ vi
khuẩn nói riêng, phục vụ trong giảng dạy và nghiên cứu.
+ Làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về tinh chế enzyme gelatinase và
các nghiên cứu ứng dụng enzyme này vào đời sống sản xuất.
- Ý nghĩa thực tiễn:
+ Sự thành công của đề tài sẽ cung cấp chế phẩm enzyme gelatinase ứng dụng
thủy phân gelatin và các quá trình khác trong đời sống sản xuất.
+ Mở rộng đầu ra cho ngành công nghiệp gelatin ở Việt Nam.
- 4 -

Chương 1: TỔNG QUAN
1.1. Gelatin
1.1.1. Khái quát về gelatin
Gelatin là một polymer sinh học có nguồn gốc từ collagen, là thành phần chủ
yếu của da, xương và mô liên kết động vật. Gelatin được sản xuất bởi sự thủy phân
một phần phân tử collagen [25].
Nguồn gelatin được sản xuất phổ biến trước đây là từ heo, bò, trâu, gia xúc
và cá. Gelatin được sử dụng ngày càng phổ biến và nguồn gốc gelatin sử dụng là
một vấn đề tồn động trong người tiêu dùng. Đặc biệt là các gelatin có nguồn gốc từ
động vật có vú ảnh hưởng đến phong tục, tín ngưỡng và khả năng lây truyền bệnh.

Do đó, gelatin cá được xem là một thay thế tốt cho các gelatin động vật có vú [25].
Giống như cấu trúc của colagen, gelatin có cấu trúc dạng chuỗi. Chuỗi
gelatin gồm những phân tử có kích thước nhỏ liên kết lại với nhau bằng liên kết
hydro tạo thành mạng lưới gelatin [20, 33].
Công thức tiêu biểu của gelatin là: Alanin-Glycin-Prolin–Arginin-Glycin–
Glutamic-4Hydroxyproline-Glycin-Prolin [18].
Cấu trúc phân tử gelatin được thể hiện qua Hình 1.1.









Hình 1.1. Cấu trúc phân tử gelatin

- Thành phần hóa học của gelatin gồm protein, khoáng và nước được trình
bày trong Bảng 1.1.
Gelatin có trọng lượng phân tử khoảng 100000 g/mol. Thành phần acid amin
của gelatin rất giống với collagen tạo ra nó, có chứa tất cả 20 loại acid amin và được

- 5 -

đặc trưng bởi một chuỗi lặp đi lặp lại của 3 acid amin là glycine-X-Y, trong đó X
chủ yếu là proline và Y chủ yếu là hydroxyproline [23]. Glycine chiếm khoảng 33%
thành phần acid amin, proline và hydroxyproline chiếm khoảng 22%.
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của gelatin [32]
STT Thành phần Tỉ lệ (%)

1 Protein 84-90
2 Khoáng 1-2
3 Nước 8-15

Bảng 1.2. Thành phần acid amin của gelatin và collagen trên 1000g nguyên liệu [32]
Amino acid Gelatin A

Gelatin B

Colagen (Gia súc)

Alanine
Arginine
Asparagine
Aspartic acid
Cysteine
Glutamic acid
Glutamine
Glycine
Histidine
Hydroxyproline

Hydroxylysine
Isoleucine
Leucine
Lysine
Methionine
Phenylalanine
Proline
Serine

Threonine
Tryptophan
Tyrosine
Valine
112
49
16
29
–
48
25
330
4
91
6.4
10
24
27
3.6
14
132
35
18
–
2,6
26
117
48
0
46

–
72
0
335
4.2
93
4.3
11
24.3
28
3.9
14
124
33
18
–
1,2
22
114
51
16
29
–
48
25
332
4.4
104
5.4
11

24
28
5.7
13
115
35
17
–
4,4
22

- 6 -

Nguồn gốc collagen và phương pháp sản xuất gelatin khác nhau dẫn đến hàm
lượng acid amin trong sản phẩm gelatin thủy phân thu được là khác nhau. Điều này
được trình bày trong Bảng 1.2 và 1.3 thành phần acid amin của gelatin gia súc dưới
đây [32].

Bảng 1.3. Thành phần acid amin của gelatin trên 1000g nguyên liệu [14]

Acid amin Mực ống

(Squid)
Cá ngừ

(Tuna)

Cá chim
(Halibut)

Hydroxyproline

Asparagine
Threonine
Serine
Glutamine
Proline
Glycine
Alanine
Cysteine
Valine
Methionine
Isoleucine
Leucine
Tyrosine
Phenylalanine
Histidine
Lysine
Arginine
Hyldroxylicine
Imino acid
74
61
26
43
83
89
332
82
10

37
9
11
26
8
10
7
12
61
17
163
78
44
21
48
71
107
336
119
–
28
16
7
21
3
13
7
25
52
6

184
67
49
22
65
71
94
365
108
–
15
12
8
22
3
13
5
25
50
6
160

Trong sản xuất gelatin, nguyên liệu được xử lý với acid hoặc kiềm loãng và sự
phân cắt một phần các liên kết chéo và liên kết peptide đến mức collagen hòa tan
trong nước ấm thì ta được gelatin. Quá trình xử lý hóa học tạo ra hai loại gelatin A
và B tương ứng với xử lý acid và xử lý kiềm.
- 7 -

1.1.2. Tính chất công nghệ của gelatin [32]
- Đặc tính lý hóa của gelatin thì được quyết định chủ yếu bởi các chuỗi acid

amin trong phân tử của nó, do cấu trúc không gian, sự phân bố khối lượng phân tử,
cũng như điều kiện môi trường như pH, độ ion và phản ứng với các thành phần
khác. Một số tính chất của gelatin được trình bày trong Bảng 1.4.
Bảng 1.4. Một số tính chất của gelatin [32]

Các tính chất tạo gel

Các tính chất bề mặt
Hình thành gel
Kết cấu
Tạo độ đặc
Giữ nước
Tạo nhũ tương và ổn định nhũ tương

Chức năng bảo vệ keo
Tạo bọt và ổn định bọt
Độ bám dính

- Các tính chất chức năng của gelatin có thể được chia thành hai nhóm. Nhóm
thứ nhất là các tính chất tạo với gel, ví dụ như: sức bền gel, thời gian tạo gel, nhiệt
độ nóng chảy và độ nhớt. Nhóm thứ hai liên quan đến các tính chất bề mặt của
gelatin như sự hình thành và ổn định của xà phòng và nhũ tương, tính kết dính và sự
phân ly của nó.
- Gelatin không tan trong nước dưới 20
o
C mà chỉ hút nước và trương nở. Khi
nhiệt độ tăng lên, nó tan ra và tạo thành dung dịch thể keo. Dung dịch này đem làm
lạnh, dù nồng độ rất thấp (0,25%) cũng có thể đông đặc.
- Ngược lại khi gelatin bị thủy phân thành các phân tử nhỏ hòa tan được
trong nước lạnh và dung dịch của nó không tạo gel với bất cứ nồng độ nào.

1.2. Gelatin thủy phân [14, 32]
1.2.1. Khái quát về gelatin thủy phân
Gelatin thủy phân là một dạng đặc biệt của gelatin (Hình 1.2), trong đó có
nhiều loại có thể hòa tan được trong nước lạnh. Gelatin thủy phân mất đi khả năng
tạo gel và được gọi là Zero-Bloom, hoặc về mặt quy định thực phẩm Châu Âu gọi là
gelatin thực phẩm không tạo gel (Non-gelling edible gelatin). Tuy nhiên, chúng vẫn
có tính chất hoạt động bề mặt rất tốt.
Khối lượng trung bình của các phân tử gelatin thủy phân là từ 500÷25000
g/mol (Hình 1.3) với phân tử khác nhau từ các acid amin tự do đến peptide và
- 8 -

gelatin. Bằng cách kiểm soát sự thủy phân của enzyme thì có thể thu được sản phẩm
có trọng lượng phân tử trong một phạm vi nào đó.
Thông thường, gelatin được thủy phân bởi sự kết hợp của các enzyme thủy
phân và chất hóa học hay tác nhân vật lý. Đầu tiên thủy phân bằng hóa học hay vật
lý để sản xuất gelatin từ collagen. Sau đó thủy phân gelatin bằng enzyme cho đến
khi đạt được trọng lượng phân tử mong muốn.








Hình 1.2. Bột gelatin thủy phân

Gelatin có thể được thủy phân với nhiều enzyme khác nhau như pepsin,
neutrase, alkalase, bromelain, hoặc papain [14, 25, 34, 27]. Việc lựa chọn các
enzyme và điều kiện thủy phân cơ bản xác định các tính chất của sản phẩm.

Hình 1.3. Sự phân bố khối lượng gelatin thủy phân so với gelatin trước thủy phân

Gelatin thủy phân có một số tính chất công nghệ đặc biệt trái ngược với gelatin
thông thường. Ví dụ, chúng có thể hoà tan trong nước lạnh và không tạo gel ngay cả
trong dung dịch có nồng độ cao ở nhiệt độ thường được sử dụng trong chế biến.
- 9 -

Các tính chất công nghệ chủ yếu của gelatin thủy phân là do cấu trúc phân tử của
nó. Điều này góp phần làm đa dạng các ứng dụng của gelatin thủy phân. Các phân tử
thủy phân phụ thuộc vào nguyên liệu và đặc biệt là quá trình sản xuất ứng dụng.
Tất cả các loại bột gelatin thủy phân có thể được lưu trữ rất lâu với điều kiện
môi trường khô ráo. Độ khô là đặc biệt quan trọng vì hàm lượng nước của bột
gelatin thủy phân thấp 5÷8% nên có xu hướng hấp thụ nước từ không khí nhanh
hơn so với gelatin thông thường, trong đó có một lượng nước trong 10÷12%.
1.2.2. Ứng dụng của gelatin thủy phân [32]
Sản phẩm gelatin thủy phân ngày càng trở nên được sử dụng phổ biến trong
công nghiệp thực phẩm. Sản phẩm này được sử dụng với mục đích công nghệ hơn
là mục đích dinh dưỡng của nó. Khả năng hòa tan tốt, khả năng tạo nhũ, tạo bọt …
là những tính chất quan trọng của gelatin thủy phân được sử dụng để phát triển sản
phẩm trong ngành công nghiệp thực phẩm được trình bày trong Bảng 1.5.

Khả năng hòa tan tốt của gelatin thủy phân có thể ứng dụng như một chất hoạt
động bề mặt. Nó giảm sức căng bề mặt, cho phép bọt được hình thành. Đồng thời
nó còn giúp ổn định bọt bởi ngăn cản các bong bóng khí nhỏ kết hợp lại với nhau
thành những cái lớn hơn và phá vỡ hệ bọt. Nồng độ gelatin thủy phân hòa tan trong
nước có thể lên đến 60%. Trong một số ứng dụng, bột gelatin thủy phân có thể được
cho khuấy trực tiếp vào sản phẩm.
Gelatin thủy phân thường tương thích với đường, các chất thay thế đường,
hydrocolloids và protein. Nó có thể sử dụng ở nồng độ cao trong các sản phẩm phức
hợp như là thực phẩm giảm béo và giảm calo. Trong thực tế, gelatin thủy phân thậm
chí còn tăng cường cảm giác ngon miệng khi dùng sản phẩm.
Một tính chất công nghệ của gelatin thủy phân được sử dụng phổ biến là khả
năng tạo nhũ tương của nó. Khả năng này thì phụ thuộc vào trọng lượng phân tử của
gelatin thủy phân, lượng dầu có thể được nhũ tương hóa với protein ở các điều kiện
tiêu chuẩn. Nồng độ gelatin thủy phân cần thiết cho ứng dụng này là 3÷5%. Chúng
cũng có khả năng bảo vệ các hệ keo, ngăn ngừa các hạt liên kết với nhau làm phá
hủy các nhũ tương. Tính chất đặc trưng này thì được các nhà sản xuất sử dụng để
sản xuất các nước uống hòa tan vitamin E, A và các chất màu như các carotenoid.
Trong ứng dụng này, gelatin thủy phân được sử dụng như một chất nhũ hóa và ổn
định cho các vitamin trong dầu. Ngoài ra, khả năng liên kết nước của dung dịch
cũng được cải thiện khi có mặt gelatin thủy phân.
- 10 -

Bảng 1.5. Ứng dụng chủ yếu của gelatin thủy phân [32]

Chức năng Ứng dụng
- Tăng độ hòa tan và phân
tán.
- Nhũ tương hóa và ổn định.

- Cải thiện kết cấu.

- Liên kết với nước.
- Sự gắn kết và bám dính.
- Như một chất mang.
- Làm trong.
- Thành phần chức năng.
- Trà hòa tan, đồ uống …

- Sandwich ít béo, gắn kết vitamin, ổn định pho mát ít
béo …
- Pho mai, đồ uống, kẹo …
- Thực phẩm ăn liền, thịt tươi …
- Ngũ cốc đóng bánh, protein đóng bánh
- Trà hòa tan, các chất có hoạt tính dược, gia vị …
- Làm trong đồ uống như bia, rượu và nước trái cây.
- Tăng cường protein, phòng ngừa viêm xương khớp,
thay thế các carbohydrate và chất béo, thực phẩm ít
muối, dinh dưỡng thể thao, sản phẩm làm đẹp.

Gelatin thủy phân cũng có tính kết dính tốt nên nó được sử dụng để sản xuất
các loại thực phẩm dạng đóng bánh. Nó được dùng ở nồng độ khoảng 7% là tác
nhân giúp liên kết các thành phần chất khô lại với nhau. Trong khi đó, việc sử dụng
đường cho mục đích này thì đòi hỏi nồng độ rất cao. Do đó, gelatin thủy phân có thể
sử dụng để sản xuất các sản phẩm đường thấp và ít năng lượng.
Các sản phẩm chứa gelatin thủy phân cũng có thể được phát triển với vị cay,
mặn, hay hương vị thảo dược. Tính chất này của gelatin thủy phân được ứng dụng
trong sản xuất thực phẩm gia vị. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc giảm
các nồng độ muối, gia vị, và các phụ gia khác trong chế biến thịt, thực phẩm ăn liền,
và đặc biệt là các thực phẩm ăn kiêng. Nghiên cứu gần đây cũng cho thấy gelatin
thủy phân trong các loại nước ép hoa quả làm tăng vị ngọt và mùi của chúng.
Gelatin thủy phân được sử dụng trong sản xuất đồ uống thực phẩm. Nó có tác

dụng làm tăng độ trong cho các sản phẩm như bia, rượu, và nước trái cây vào phản
ứng giữa các phân tử gelatin thủy phân với các pectin mang điện tích âm.
Một ứng dụng khác của gelatin thủy phân là bổ sung vào các sản phẩm kem
như là một chất phụ gia để hạn chế sự lớn lên của các tinh thể đá trong quá trình
làm đông sản phẩm, nâng cao chất lượng kem [34].
- 11 -

Trong công nghiệp mỹ phẩm và dược phẩm, gelatin thủy phân là những thành
phần chức năng quan trong hỗ trợ cấu trúc collagen trong da cũng như trong sụn. Tính
dễ hấp thụ của các sản phẩm gelatin thủy phân được ứng dụng để sản xuất các sản
phẩm mỹ phẩm bảo vệ da và làm đẹp da. Trong dược phẩm, ứng dụng dựa vào thành
phần acid amin của gelatin thủy phân. Nó có chứa một lượng lớn hai acid amin glycine
và proline có vai trò quan trọng trong cấu trúc collagen trong sụn [32].
Gelatin thủy phân còn có chứa các peptide có hoạt tính sinh học với đặc tính
chống oxy hóa cũng được nghiên cứu ứng dụng trong các lĩnh vực như dược phẩm,
y học và thực phẩm [14, 24, 27].
1.2.3. Một số nghiên cứu về gelatin thủy phân
- Nghiên cứu của Alemán và cộng sự (2011) về thủy phân gelatin từ mực để
sản xuất các chất có hoạt tính sinh học. Tác giả đã tiến hành thủy phân gelatin da
mực với bảy enzyme protease thương mại (protamex, trypsin, neutrase, savinase,
NS37005, esperase và alcalase). Trong các enzyme thủy phân sử dụng thì alcalase
và esperase thủy phân mạnh nhất và tạo ra hầu hết các peptidevới trọng lượng phân
tử từ 500÷1400 Da [15].
- Nghiên cứu của Alemán và cộng sự (2011) về thủy phân gelatin từ cá ngừ, cá
bơn và mực để sản xuất chất chóng oxy hóa. Tiến hành hòa tan gelatin 2,5% trong
dung dịch đệm photphate (0,01M; pH 8). Sau đó bổ sung alcalase vào với tỷ lệ E/S :
1/20 và thủy phân ở 50
o
C trong 3 giờ. Gelatin mực và cá ngừ cũng được thủy phân
bằng enzyme trypsin và pepsin. Điều kiện thủy phân của các enzyme này như sau:

trypsin (37
o
C; pH 7,5) và pepsin (37
o
C; pH 4). pH môi trường được điều chỉnh bằng
dung dịch NaOH 1N hoặc HCl 1N tương ứng với pH kiềm hoặc acid. Sau khi thủy
phân các enzyme bị bất hoạt bằng cách gia nhiệt ở 90
o
C trong 10 phút [14].
- Nghiên cứu của Zhao và cộng sự (2007) về thủy phân gelatin của sâm biển
với hai enzyme là bromelin và alcalase. Tác giả đã tiến hành thủy phân ở ba phân
đoạn để tạo ra ba loại sản phẩm khác nhau. Dựa vào trọng lượng phân tử sản phẩm
thủy phân thu được ba loại sản phẩm gồm: GH-I <10 kDa; GH-II <5 kDa; GH-III
<1 kDa [35].
- Nghiên cứu của Wang và cộng sự (2009) về thủy phân gelatin bò bằng
papain ứng dụng sản xuất kem thực phẩm. Điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân