nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase của vi khuẩn phân lập từ đất thuộc tỉnh khánh hoà

i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CHẾ BIẾN
o0o


NGUYỄN THU NHƯỜNG


NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME CHITINASE
CỦA VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ ĐẤT THUỘC
TỈNH KHÁNH HOÀ


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM



GVHD: Trần Thị Luyến
MSSV: 46134262




ii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN iv
MỞ ĐẦU 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ CHITIN VÀ SẢN PHẨM TỪ CHITIN 3
1.2. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME 8
1.3. ENZYME CHITINASE: PHÂN LOẠI VÀ CƠ CHẾ TÁC ĐỘNG 14
1.3.1. Phân loại hệ thống enzyme thủy phân Chitin: 14
1.3.2. Cơ chế tác động của enzyme thủy phân Chitin: 17
1.4. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHITINASE 18
1.4.1. Các công trình nghiên cứu ngoài nước. 18
1.4.2. Các công trình nghiên cứu trong nước. 18
1.5. PHÂN LOẠI VI KHUẨN THEO PHƯƠNG PHÁP CỔ ĐIỂN 20
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG-VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU21
2.1. ĐỐI T ƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 21
2.1.1. Đối tượng 21
2.1.2. Vật liệu 21
2) Môi trường: 21
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.2.1 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn 24
2.2.2. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 25
2.2.3. Phương pháp xác định số lượng tế bào 26
2.2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 27
2.2.5. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố bên ngoài
đến hoạt tính enzyme 28
2.2.6. Phương pháp xác định hoạt độ của enzyme chitinase theo phương
pháp NELSON 29

2.2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme kỹ thuật
chitinase 29
1.Nuôi chủng vi khuẩn sinh enzyme chitinase 30
2.Tiến hành ly tâm 30
3.Kết tủa enzyme 30
2.2.8. Phương pháp phân loại chủng vi sinh vật 32
2.2.9. Phương pháp xử lý số liệu 34
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35
3.1. KẾT QUẢ CỦA QUÁ TRÌNH PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN 35
3.2. ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN SINH TỔNG
HỢP ENZYME CHITINASE CỦA CHỦNG VI KHUẨN LỰA CHỌN 36
3.2.1. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp: 36
3.2.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu 38


iii


3.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ 39
3.2.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy: 40
3.3. KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME TRONG LÊN MEN
XỐP 42
3.4. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ BÊN NGOÀI ĐẾN HOẠT
TÍNH ENZYME CHITINASE 43
3.4.1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính chitinase 43
3.4.2. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến hoạt tính chitinase 44
3.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính chitinase 45
3.5. THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME KỸ THUẬT CHITINASE 46
3.6. PHÂN LOẠI CHỦNG VI KHUẨN THEO PHƯƠNG PHÁP CỔ ĐIỂN.
49

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 50
KẾT LUẬN 50
ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO 51
PHỤ LỤC 54
MỘT SỐ HÌNH ẢNH LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH LÀM THÍ NGHIỆM
60















iv


LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này
Trước hết em xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc nhất đến cô giáo hướng dẫn: GS.TS.
Trần Thị Luyến đã tận tình hướng dẫn và động viên em trong quá trình thực hiện đề tài.

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô đã truyền đạt cho em những kiến
thức quý báu trong suốt thời gian học tập trong trường.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô trong khoa Chế biến, đặc biệt
em xin chân thành cảm ơn các thầy cô thuộc Viện công nghệ sinh học và môi
trường, ĐH Nha Trang đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em trong quá trình
thực hiện đề tài.
Em cũng xin được ghi nhớ nhiều tình cảm, sự giúp đỡ của các bạn cùng lớp
và gia đình đã luôn luôn chia sẻ cùng em trong suốt thời gian vừa qua.

Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, tháng 11 năm 2008
Sinh viên
Nguyễn Thu Nhường







1

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, ngành công nghệ sinh học đang có bước phát
triển rất mạnh mẽ. Phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học là một xu thế tất yếu
trong điều kiện các ngành sản xuất truyền thống đang gây ô nhiễm môi trường
nghiêm trọng. Các chế phẩm sản xuất bằng con đường sinh học không chỉ thân
thiện với môi trường sống, mang lại giá trị kinh tế cao mà còn ứng dụng rất hiệu

quả trong nhiều lĩnh vực đời sống. Và enzyme là một phần không thể thiếu được
của ngành công nghệ sinh học. Hiện nay, có rất nhiều loại enzyme được nghiên
cứu và ứng dụng của chúng ngày càng được mở rộng. Một trong số đó có enzyme
chitinase với dẫn xuất quan trọng là chitosan đang được ứng dụng vào vô số các
lĩnh vực khác nhau.
Việt Nam có nguồn lợi thủy sản rất dồi dào, ngành công nghệ nuôi trồng và
chế biến ngày càng phát triển mạnh. Nuôi tôm là một trong những nghề đã đem lại
hiệu quả kinh tế cao vì tôm là mặt hàng hải sản có giá trị không những cho nguồn
đạm động vật cao, mà còn là loại thực phẩm được nhiều người ưa thích và ngày
càng có giá trị trên thị trường thế giới. Tuy nhiên, dịch bệnh là nỗi ám ảnh và gây
thiệt hại lớn về kinh tế cho nghề nuôi tôm nói riêng và ngành thuỷ sản nói chung.
Nguyên nhân gây bệnh chủ yếu là do lượng thức ăn hữu cơ dư thừa trong nước sẽ
làm ô nhiễm, gây độc cho tôm, đồng thời vỏ tôm sau khi lột xác bị lắng đọng
xuống đáy ao tạo điều kiện phát triển cho các sinh vật có hại cho sự phát triển của
tôm. Trên thì trường đã xuất hiện nhiều chế phẩm vi sinh được nhập về nhưng quá
đắt cho người nông dân sử dụng và không kiểm soát được các vi sinh vật có trong
chế phẩm có ảnh hưởng gì đến sức khoẻ con người và môi trường không. Trong
khi đó, việc sử dụng các chế phẩm sinh học có nguồn gốc tự nhiên lại cho hiệu quả
hơn trong việc phòng và trị bệnh nhờ quá trình cạnh tranh sinh học. Khi ta thêm
các vi sinh vật có lợi như các vi sinh vật có hoạt tính sinh học cao vào môi trường,
chúng sẽ phân giải nhanh các chất hữu cơ, lấn át và ức chế mầm bệnh phát triển, vì
thế sẽ ngăn ngừa được các mầm bệnh xảy ra.
Mặt khác một trong những dạng phế liệu chiếm phần lớn từ ngành thuỷ sản
là nguồn chitin từ vỏ loài giáp xác như tôm, cua. Tận dụng nguồn phế liệu này
không những giải quyết triệt để vấn đề ô nhiễm môi trường mà còn tạo ra các chế
phẩm mới có giá trị, làm tăng giá trị kinh tế cho ngành thủy sản. Để tạo ra các chế
phẩm có khả năng hòa tan trong nước từ chitin, chitosan có thể dùng phương pháp
hóa học, dùng các tia mang năng lượng cao và một số phương pháp khác để cắt
đứt mạch polymer của chúng. Các phương pháp trên thu được sản phẩm với hiệu

2

suất cao nhưng có nhược điểm lớn là hoạt tính các chế phẩm thấp, nhiều tạp chất
và gây độc cho người trực tiếp sản xuất. Sử dụng các enzyme chitinase,
chitosanase thủy phân chitin, chitosan tạo ra các chế phẩm có hoạt tính sinh học
cao không gây ô nhiễm môi trường và ít ảnh hưởng đến sức khỏe người lao động
là hướng đi có lợi.
Như chúng ta đã biết, trong số các vi sinh vật có khả năng sinh enzyme
chitinase thì vi khuẩn đóng vai trò quan trọng. Nhiều nghiên cứu tiến hành ở
trường Đại học Quốc Gia, Đại học Sư phạm Hà Nội và Viện Công nghệ Sinh học
cho thấy tỉ lệ vi khuẩn sinh enzyme chitinase ở Việt Nam là khá cao (50-60%).
Việt Nam là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm rất thuận lợi cho sự phát triển của
vi sinh vật và đây được coi là một kho tàng vô giá về nguồn gen trong tự nhiên.
Xuất phát từ những hiểu biết thực tiễn trên cùng với xu hướng nghiên cứu
trên thế giới hiện nay, cũng như để góp phần khai thác nguồn vi sinh vật vô cùng
phong phú của nước ta và Khánh Hoà nói riêng, tôi đã thực hiện đề tài: Nghiên
cứu thu nhận enzyme chitinase của vi khuẩn phân lập từ đất thuộc tỉnh
Khánh Hoà.
Mục đích của luận văn:
Nghiên cứu chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme chitinase ngoại bào
mạnh trong đất có khả năng ứng dụng thực tiễn cao.
Nội dung nghiên cứu của luận văn:
- Phân lập và xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh tổng hợp
enzyme chitinase.
- Nghiên cứu ảnh hưởng cuả một số yếu tố bên ngoài đến hoạt tính enzyme
chitinase
- Bước đầu nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme kỹ thuật chitinase

3

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ CHITIN VÀ SẢN PHẨM TỪ CHITIN
Năm 1811, giáo sư Henri Braconnott là người đầu tiên nghiên cứu về
Chitin, ông là người đã khám phá ra sự có mặt của chất này trong thành tế bào của
một số loài nấm. Vào những năm 30 của thế kỷ 19, chất này đã được tách riêng
biệt từ một loài côn trùng và được đặt tên là Chitin. Chitosan – một dẫn xuất của
Chitin đã được sản xuất vào năm 1859. Sau đó có rất nhiều công trình nghiên cứu
về đặc điểm và tính chất của Chitin và Chitosan nhằm áp dụng và phát triển chúng
theo hướng thương mại.
Chitin có ở nhiều nơi, trong thành tế bào của hầu hết các loại nấm (nấm sợi,
nấm men, …), biểu bì các loài thuộc lớp nhện, côn trùng, trong mai của lớp giáp
xác, các loài tảo cát, động vật nguyên sinh và giun tròn. Sự xuất hiện của Chitin ở
các đối tượng khác nhau được trình bày ở bảng 1 [20].
Bảng 01. Hàm lượng Chitin ở các sinh vật
Sinh vật
Hàm lượng
Chitin (%)

Sinh vật
Hàm lượng
Chitin (%)
Giáp xác Côn trùng
Cancer 72,1 Periplaneta 2,0
Carcinus 64,2 Blatella 18,4
Paralithodes 36,0 Coleoptera 27-35
Callinectes 14,0 Diptera 54,8
Crangon 69,1 Pieris 64,0
Alaskan 28,0 Bombyx 44,2
Nephrobs 69,8 Calleria 33,7
Homarus 60-75 Nấm
Lepas 58,3 Aspergillus niger 42,0
Động vật thân mềm Penicillum notatum 18,5
Clamshell 6,1 Penicillum hrysogenum 20,1
Oyster shell 3,6 Saccharomycescerevisiae

2,9
Squid skeletal
pen
41,0 Mucor rouxii 44,5
Lactarius vellereus 19,0


4

Chitin có màu trắng, cứng, là polysaccarit cấu trúc thẳng, gồm các chuỗi N-
acetyl glucosamin gắn với nhau nhờ liên kết glycozit. Công thức hóa học
chung của Chitin là (C
6

H
9
O
4
-NHCOCH
3
)
n
với tỉ lệ nitơ là 6,9%. Với sự tương
đồng trong cấu trúc phân tử mà đôi lúc Chitin được xem như sản phẩm phụ của
xenlulose. Chúng chỉ khác nhau ở vị trí cacbon C số 2 của đường glucose. Trong
xenlulose vị trí này liên kết với một nhóm (-OH), còn trong phân tử Chitin nhóm
(-OH) được thay thế bởi một nhóm phức acetylamin (-NH(CO)CH
3
).
Với rất nhiều cầu nối hydro giữa các nhóm N-acetyl của các chuỗi đã làm
cho Chitin rất dai và cực bền.
Chitin không hòa tan trong nước, trong dung môi hữu cơ, dung dịch kiềm
hay acid vô cơ loãng, nhưng Chitin hòa tan trong dung dịch kiềm đặc nóng.
Trong tự nhiên Chitin được phân giải bởi một hệ thống enzyme thủy phân
của cơ thể sinh vật.
Công thức cấu tạo chitin:

Hình 1: Cấu trúc hóa học của Chitin

Hình 2: Cấu trúc hóa học của xenlulose



5

Có 3 dạng cấu trúc dị hình của Chitin đó là Chitin, Chitin,
Chitin trong đó dạng phổ biến nhất được biết đến là Chitin (hình 3),
Chitin tìm thấy trong khoang của thủy tức, sinh vật phù du…. Và có trong
biểu bì của động vật chân đốt, Chitin – một dạng kém bền vững và dễ thoái
hóa của Chitin được tìm thấy ở mai mực, tảo cát, bộ xương ngoài côn trùng, kén
và là thành phần chính trong thành tế bào của nấm (hình 4). Dạng thứ ba là
Chitin, tìm thấy trong dạ dày của loài mực ống loligo, cấu trúc cụ thể của nó
đến nay vẫn còn là một vấn đề gây tranh cãi.
Trong hầu hết các cơ thể sinh vật, Chitin thường tồn tại ở dạng liên kết với
các polyme khác như: glucan, protein …. Vì nó có khả năng phản ứng được với
các hợp chất khác ở C thứ 2 của acid amin tự do. Điều này sẽ làm xuất hiện thêm
số lượng lớn các đại phân tử có cấu trúc và tính chất lý hóa mới. Ví dụ, với lớp vỏ
ngoài của côn trùng, khi Chitin liên kết với protein, cấu trúc của nó bị kéo căng ra
làm tăng khả năng đàn hồi cho quá trình vận động [20].

Hình 3. Cấu trúc phân tử của Chitin

Hình 4. Cấu trúc phân tử của Chitin




6

Sau khi phát hiện ra Chitin, vào những năm 40 của thế kỷ 20, có tới gần 50
sáng chế về các sản phẩm có liên quan đến Chitin. Chitin có mặt ở khắp nơi, với
sự đa dạng và phong phú lớn, nó tham gia vào nhiều quá trình sinh học quan trọng
trong tự nhiên.
Đối với các sinh vật lột xác, hàng năm vỏ Chitin do chúng thải ra là rất lớn,

vì vậy ngoài ý nghĩa của quá trình sinh trưởng, phát triển, thích nghi với môi
trường sống của cơ thể sinh vật, vỏ Chitin tham gia vào quá trình tạo phản ứng
miễn dịch chống lại các loài gây bệnh (nấm men, nấm mốc …).
Chitin đã được ứng dụng rất nhiều ở các lĩnh vực khác nhau.
Về lĩnh vực y học, từ rất sớm, người ta đã nhận ra chúng có khả năng chữa
lành các vết thương. Vào giữa những năm 50 của thế kỷ 20, các đường khâu vết
thương có phủ Chitin đã được sử dụng và đã làm tăng khả năng chữa trị vết
thương lên tới 35-50%. Năm 1970, trường đại học Delaware đã nghiên cứu về
phương pháp để tách các sợi Chitin tinh khiết. Các công ty của Nhật Bản đã mua
lại bằng sáng chế này, những sợi dùng khâu vết thương bằng Chitin tinh khiết vẫn
đang được sử dụng. Hơn nữa nguyên liệu này còn được sử dụng để bó các vết
bỏng, bề mặt vết thương, trên vết cắt da của người cho da. Phương pháp này làm
vết thương chóng bình phục hơn, giảm đau hơn so với các phương pháp điều trị
thông thường. Ngoài ra, Chitin còn được dùng để sản xuất gạc chống khuẩn, y
phục bệnh viện, túi đựng máu nhân tạo, thấu kính bằng chất dẻo, ức chế khối u,
ngăn ngừa mảng bám răng, điều chỉnh lượng cholesterol trong máu. Các sản phẩm
sử dụng trong gia đình có thể kể đến như: băng gạc, giấy vệ sinh, giấy ăn ….
Trong lĩnh vực sản xuất mỹ phẩm có hàng loạt các sản phẩm có chứa Chitin
như: phấn trang điểm, thuốc dưỡng móng tay, kem giữ ẩm da mặt, da tay, kem
dưỡng thể, kem đánh răng ….
Chitin được thêm vào hỗn hợp chứa nước sữa – một sản phẩm của ngành
công nghiệp sản xuất pho mát. Nhiều động vật sẽ thấy khó tiêu hóa do hàm lượng
lactoza trong nước sữa quá cao nhưng khi có mặt của Chitin, nó sẽ thúc đẩy sự
hoạt động của các vi sinh vật có lợi trong bộ máy tiêu hóa sinh enzyme, kết quả là
làm cho quá trình tiêu hóa tốt hơn rất nhiều.
Các sản phẩm chuyển đổi từ Chitin có ý nghĩa thương mại rất cao nhất là
trong sản xuất Chitooligosaccarit (COS). Dẫn xuất quan trọng nhất của Chitin phải
kể đến là Chitosan.

7







Hình 5: Công thức hóa học của Chitosan
Thực tế, thuật ngữ Chitosan là tên gọi dùng để đại diện cho cả họ Chitin đã
bị đề acetyl. Chitosan là polysaccarit thẳng, gồm liên kết (1-4) 2-amino – 2 deoxy
- D- glucopyranoza. Với tính chất của một polyamin, nó có thể tan trong acid
và rất dễ bị biến đổi về tính chất hóa học. Chitosan cũng được tìm thấy trong tự
nhiên nhưng trong phạm vi nhỏ hơn so với Chitin. Chitosan là thành phần chính ở
thành tế bào nấm. Mặc dù cả Chitin và Chitosan đều có công thức tương tự nhau
nhưng Chitosan có thể hòa tan trong môi trường acid dưới dạng nhầy. Về mặt hóa
học, Chitosan có tính chất tương tự như sợi xenlulose. Do không có giá trị về calo,
Chitosan không tiêu hóa được. Điều này đã được áp dụng trong các sản phẩm làm
giảm cân. Đặc biệt, có thể phản ứng rất linh hoạt do có sự hoạt động của 3 nhóm
acid amin tự do [20]. Chính vì vậy ngày nay, ở rất nhiều quốc gia, Chitosan đang
được ứng dụng vào vô số các lĩnh vực khác nhau.
* Trong nông nghiệp:
- Sử dụng như các tác nhân miễn dịch, tạo hàng rào miễn dịch cho cây
trồng thay thế một phần thuốc trừ sâu hóa học góp phần vào bảo vệ môi trường.
- Làm phân bón, thuốc diệt nấm, thuốc diệt côn trùng.
- Chất bảo quản sau thu hoạch: tạo lớp vỏ cho hạt nấm.
* Xử lý nước thải:

- Loại ion kim loại.
- Làm đông hay ngưng tụ: protein, thuốc nhuộm,acid amin.
* Công nghệ thực phẩm:
- Loại bỏ thuốc nhuộm, các chất huyền phù.
- Chất bảo quản.
- Bền màu.
- Chất bổ sung thức ăn gia súc.
* Y tế:
- Băng y tế.
- Chất điều chỉnh cholesterol đường máu.
- Thuốc giảm béo.


8

- Kiểm soát sự thải loại của thuốc.
- Chữa bỏng.
- Kính áp tròng…
* Mỹ phẩm:
- Kem giữ ẩm da.
- Kem dưỡng thể, kem bôi mặt, tay.
- Sữa tắm…
* Bột giấy và giấy:
- Xử lý bề mặt.
- Giấy ảnh.
* Màng mỏng:
- Màng kiểm tra khả năng thấm.
- Màng thấm thấu ngược.
* Công nghệ sinh học:
- Cố định enzyme.

- Phân tách protein.
- Khôi phục tế bào.
- Cố định tế bào.
- Sắc kí.
1.2. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME
Enzyme là những chất hữu cơ có phân tử lượng lớn (đa số các enzyme có
phân tử lượng từ 6.000 đến 1.000.000 dalton). Qua quá trình nghiên cứu cấu trúc,
tính chất đã khẳng định bản chất của enzyme là protein. Các kết quả nghiên cứu
cho thấy enzyme được cấu tạo từ các L-α-acid amin kết hợp với nhau bằng liên kết
peptit [4].
Người ta đã phát hiện ra rằng, các enzyme đã xúc tác cho hầu hết các phản
ứng hóa học xảy ra bên trong cơ thể sống, đảm bảo cho các quá trình chuyển hóa
các chất trong cơ thể sống được thực hiện một cách nhịp nhàng, cân đối và theo
những chiều hướng xác định. Chúng không chỉ có khả năng xúc tác cho các phản
ứng xảy ra trong tế bào sống mà sau khi được tách ra khỏi tế bào sống chúng vẫn
có khả năng xúc tác cho các phản ứng xảy ra.
Sự khác biệt giữa xúc tác bằng enzyme so với các chất xúc tác vô cơ, hữu
cơ là ở chỗ xúc tác bằng enzyme có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn. Nó có thể gấp
hàng trăm, hàng ngàn, hàng triệu lần so với xúc tác bằng các chất vô hoặc hữu cơ.


9

Ví dụ: trong phản ứng thủy phân sacaroza, nếu dùng chất xúc tác là
sacaraza thì tốc độ của phản ứng tăng nhanh gấp 2.10
2
lần so với dùng acid làm
chất xúc tác [4].
Đặc điểm ưu việt của enzyme so với các chất xúc tác khác là khi sử dụng
enzyme làm chất xúc tác có thể thực hiện hoạt động xúc tác trong điều kiện nhẹ

nhàng như ở áp suất và nhiệt độ bình thường của cơ thể hay ở môi trường bên
ngoài, pH thích hợp của enzyme gần pH sinh lý. Ngoài ra enzyme còn có khả năng
lựa chọn cao đối với kiểu phản ứng mà nó xúc tác cũng như đối với chất mà nó tác
dụng. Đó là tính đặc hiệu của enzyme [4].
Ví dụ: Chất xúc tác là acid không có tính đặc hiệu. Nó có thể xúc tác thủy
phân cắt đứt liên kết peptid của protein, liên kết glucosid của tinh bột, của agar,
carrageennan, chitin vv… trong khi đó enzyme protease chỉ xúc tác thủy phân cắt
đứt các liên kết peptid mà không xúc tác để cắt được liên kết glucosid.
Do là chất xúc tác đặc biệt, có nhiều ưu việt hơn so với các chất xúc tác
khác nên enzyme đang được nghiên cứu và ứng dụng rất mạnh mẽ trong đời sống
con người.
Enzyme bao gồm hai loại là enzyme một thành phần và enzyme hai thành
phần. Enzyme một thành phần (apoenzyme) là enzyme khi bị thủy phân thì sản
phẩm của quá trình thủy phân chỉ bao gồm các acid amin. Enzyme hai thành phần,
phân tử enzyme gồm phần protein (apoenzyme) kết hợp với nhóm khác không
phải protein gọi là nhóm ngoại hay coenzyme. Apoenzyme quyết định tính đặc
hiệu cao của enzyme và làm tăng hoạt tính xúc tác của coenzyme. Coenzyme
quyết định kiểu phản ứng mà enzyme xác tác, trực tiếp tham gia phản ứng và làm
tăng độ bền của apoenzyme đối với các yếu tố gây biến tính [4].
Tính chất của enzyme: Bản chất của enzyme là protein nên enzyme không
bền với nhiệt. Dưới tác dụng của nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính mất khả năng
xúc tác. Môi trường acid, kiềm mạnh hay muối kim loại nặng cũng làm mất hoạt
tính của enzyme.
Enzyme có hai dạng biến tính là biến tính thuận nghịch và không thuận
nghịch. Nếu bị biến tính thuận nghịch, enzyme có khả năng phục hồi lại khả năng
xúc tác khi loại bỏ các tác nhân gây biến tính. Khi bị biến tính không thuận
nghịch, enzyme không thể phục hồi lại khả năng xúc tác khi loại bỏ các tác nhân
gây biến tính.
Do có kích thước lớn nên enzyme không đi qua màng bán thấm. Đây cũng
là một tính chất mà người ta sử dụng để tinh sạch enzyme.

10


Enzyme có tính chất lưỡng tính. Trong môi trường điện ly có thể tồn tại ở
dạng anion, cation hay dạng trung hòa về điện. Người ta lợi dụng tính chất trên để
phân tách cũng như tinh sạch enzyme (phương pháp điện di).
Cũng giống như protein, các enzyme đều có thể hòa tan trong nước, trong
dung dịch muối loãng nhưng không hòa tan trong dung môi không phân cực
(aceton, ete vv…). Dung dịch chứa enzyme có tính chất của dung dịch keo ưa
nước. Khi hòa tan enzyme vào trong nước, do phân tử nước có tính chất lưỡng cực
sẽ kết hợp với các ion, các nhóm ion hoặc các nhóm phân cực trong phân tử
enzyme tạo thành lớp vỏ hydrat và có vai trò quan trọng làm môi trường cho các
phản ứng sinh hóa.
Trước đây mỗi loại enzyme đều được đặt tên tùy theo tác giả vì vậy không
có sự thống nhất. Từ năm 1960 Hội hóa sinh quốc tế (IUB) đã thống nhất phân
loại enzyme thành 6 lớp dựa trên tính đặc hiệu phản ứng của enzyme:
1. Oxydoreductaza : các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử.
2. Transferaza: các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị.
3. Hydrolaza: các enzyme xúc tác phản ứng thủy phân.
4. Liaza: các enzyme xúc tác phản ứng phân cắt không cần nước, loại nước
tạo thành liên kết đôi hoặc kết hợp phân tử nước vào liên kết đôi.
5. Izomeraza: các enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa.
6. Ligaza: các enzyme xúc tác cho phản ứng tổng hợp có sử dụng liên kết
giàu năng lượng của ATP…
Cơ chế tác dụng của enzyme: Trong quá trình xúc tác, chỉ một phần nhỏ
của phân tử enzyme tham gia kết hợp đặc biệt với cơ chất và phần này gọi là trung
tâm hoạt động của enzyme.
Đối với enzyme một thành phần thì trung tâm hoạt động được hình thành là

do sự phối hợp giữa các nhóm chức tự do của acid amin. Ví dụ: nhóm SH
(sunfidryl) của cystein, nhóm NH
2
(amin) của lysin, nhóm OH (hydroxyl) của
serin, treonin, tyrosin, nhóm COOH (cacboxyl) của aspactic, glutamic, vòng
imidazol của histidin, indol của triptophan, guanilic của arginin.
Enzyme hai thành phần, trung tâm hoạt động của enzyme được hình thành
ngoài các nhóm chức của các acid amin còn có sự tham gia của coenzyme. Ví dụ:
vitamin, ion kim loại vv…
Yêu cầu của phản ứng hóa học xảy ra là các chất tham gia phản ứng phải va
chạm với nhau tại vị trí xảy ra phản ứng và các chất trên phải ở trạng thái hoạt
động tức là đã được hoạt hóa. Để hoạt hóa các phân tử thì cần cung cấp năng
lượng cho chúng, năng lượng này gọi là năng lượng hoạt hóa.


11


Các chất xúc tác nói chung đều có khả năng làm giảm năng lượng hoạt hóa
mà phản ứng đòi hỏi bằng cách tiến hành qua các phản ứng tạo phức trung gian.
Qua đó tổng số năng lượng hoạt hóa của chúng sẽ nhỏ hơn so với trường hợp
không có chất xúc tác. Năng lượng hoạt hóa thường nhỏ đối với xúc tác bằng
enzyme và nhỏ hơn cả trường hợp có các chất xúc tác thông thường.
Ví dụ: Trong phản ứng thủy phân H
2
O
2
tạo thành H
2
O và O

2
nếu không có
xúc tác thì năng lượng hoạt hóa là 18 Kcal/mol, xúc tác là keo platin thì năng
lượng hoạt hóa là 11.7 Kcal/mol trong khi đó sử dụng enzyme catalase thì năng
lượng hoạt hóa chỉ là 5.5 Kcal/mol.
Phương trình phản ứng được biểu diễn như sau:
E + S ES P + E
E : enzyme.
S : cơ chất.
ES : phức hợp enzyme – cơ chất.
P : sản phẩm.
Quá trình xúc tác bằng enzyme trải qua 3 giai đoạn:
Giai đoạn 1: enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức
enzyme-cơ chất (ES) không bền. Phản ứng này xảy ra nhanh và đòi hỏi năng
lượng hoạt hóa thấp.
Giai đoạn 2 : xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn đến sự kéo căng và phá vỡ các
liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng làm cho cơ chất được hoạt hóa, dễ dàng
tham gia phản ứng hơn.
Giai đoạn 3: sản phẩm được tạo ra và enzyme được giải phóng ở dạng tự
do.
Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động xúc tác của enzyme. Dưới đây
là một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng xúc tác của chúng:
Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ
phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme. Khi tăng nồng độ của
enzyme, tốc độ phản ứng sẽ tăng nhưng mức độ tăng nồng độ enzyme cũng có giới
hạn vì khi tăng nồng độ enzyme quá lớn vận tốc phản ứng tăng chậm sẽ không có
hiệu quả trong thực tế sản xuất.
Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: Như chúng ta đã thấy, trong các phản
ứng có xúc tác là enzyme, có sự hình thành phức chất trung gian giữa enzyme và
cơ chất (ES), tiếp đó mới có sự chuyển hóa trong phức chất để tạo ra sản phẩm và

giải phóng enzyme ở dạng tự do. Tốc độ phản ứng thủy phân tỷ lệ với nồng độ của
phức chất trung gian vì vậy nồng độ cơ chất có ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ của


12


phản ứng có enzyme xúc tác. Theo phương trình Michaelis-Menten, khi nồng độ
cơ chất rất thấp vận tốc phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ cơ chất. Khi nồng độ cơ
chất đã đủ lớn, nếu tăng lượng cơ chất vận tốc phản ứng sẽ không tăng.
Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa: Các chất hoạt hóa có thể làm tăng hoạt
độ của enzyme có thể theo các cách khác nhau. Chúng có thể loại trừ các chất kìm
hãm ra khỏi phản ứng hoặc tác dụng trực tiếp vào trung tâm hoạt động của enzyme
hoặc làm biến đổi cấu hình không gian của enzyme tạo thuận lợi cho quá trình xúc
tác.
Ảnh hưởng của các chất kìm hãm: Vì enzyme có bản chất là protein nên
tất cả các yếu tố làm biến tính protein đều là các yếu tố kìm hãm hoạt động của
enzyme. Ngoài ra còn các yếu tố kìm hãm khác tuy không trực tiếp làm biến tính
protein nhưng có thể thế chỗ cơ chất, kết hợp vào ngay trung tâm hoạt động của
enzyme tạo thành phức chất trung gian (chất kìm hãm cạnh tranh) hoặc kết hợp
vào một vị trí nào đó của enzyme, làm thay đổi cấu trúc không gian của enzyme
theo chiều hướng không có lợi cho hoạt động xúc tác (chất kìm hãm không cạnh
tranh). Có những trường hợp sản phẩm phản ứng hay dư thừa cơ chất cũng làm
kìm hãm phản ứng.
Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ là yếu tố quan trọng, ảnh hưởng trực
tiếp tới vận tốc phản ứng của enzyme. Nhiệt độ càng tăng thì vận tốc của phản ứng
có xúc tác enzyme càng tăng. Nhưng vì enzyme có bản chất protein nên nhiệt độ
chỉ tăng đến một mức độ giới hạn. Nếu vượt quá giới hạn này thì phản ứng sẽ
giảm hoặc dừng lại do bản thân enzyme bị biến tính. Nhiệt độ mà ở đó tốc độ phản
ứng đạt cực đại gọi là nhiệt độ tối thích.

Nhiệt độ tới hạn là nhiệt độ làm mất hoàn toàn hoạt tính xúc tác của
enzyme. Nhiệt độ tối thích của các enzyme không giống nhau, phụ thuộc vào
nguồn gốc của enzyme từ thực vật, động vật hay vi sinh vật. Nhiệt độ tối thích của
enzyme không phải là hằng số mà nó còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như:cơ
chất, pH môi trường, nồng độ enzyme, nguồn enzyme. Khi thời gian tác dụng của
enzyme càng dài thì nhiệt độ tối thích càng giảm.
Ảnh hưởng của pH: Mỗi loại enzyme sẽ có hoạt tính cao nhất ở một pH
xác định gọi là pH tối thích của enzyme. pH ảnh hưởng tới hoạt tính xác tác của
enzyme có thể do nó làm thay đổi trạng thái ion hóa các nhóm định chức trong
trung tâm hoạt động của enzyme, có thể làm thay đổi cấu trúc trung tâm hoạt động
của enzyme. Nó cũng có thể làm thay đổi trạng thái ion hóa của cơ chất làm ảnh
hưởng tới khả năng hình thành hợp chất trung gian. Đa số enzyme có pH tối thích
ở vùng acid yếu, kiềm yếu hay trung tính.


13


Ảnh hưởng của lượng nước: Nước là chất trực tiếp tham gia vào phản ứng
thủy phân. Nước cũng là môi trường tạo điều kiện thuận lợi cho tiếp xúc của
enzyme và cơ chất nên cũng ảnh hưởng nhiều đến tốc độ thủy phân.
Ảnh hưởng của thời gian thủy phân: Để phản ứng thủy phân được thực
hiện cần có yếu tố thời gian. Thời gian dài hay ngắn tùy thuộc vào các yếu tố
enzyme, cơ chất, nhiệt độ, pH, các yếu tố hoạt hóa cũng như kìm hãm…
Nguồn thu nhận enzyme: Enzyme có trong tất các các cơ thể động vật,
thực vật và vi sinh vật. Tùy theo loại và lượng enzyme tồn tại trong các nguồn trên
mà ta chọn đối tượng thích hợp để thu enzyme, ứng dụng chúng trong sản xuất và
một số lĩnh vực của đời sống.
Các phương pháp tinh sạch enzyme: Có nhiều loại enzyme với các tính
chất khác nhau. Vì vậy, hiện nay chưa có phương pháp chung nào có thể tách và

làm sạch cho mọi enzyme. Khi nghiên cứu một loại enzyme cụ thể cần phải có
thực nghiệm để xác định phương pháp tách chiết và tinh sạch phù hợp nhất. Việc
phân tách và làm sạch enzyme rất phức tạp do lượng enzyme chiếm một tỉ lệ rất
nhỏ, luôn tồn tại đồng thời với các loại protein khác có tính chất hóa lý tương tự
như enzyme. Ngoài ra enzyme bản chất là protein nên cũng rất dễ biến tính, mất
khả năng xúc tác khi bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài.
Trong các nguồn thu nhận enzyme, để thu enzyme từ thực vật người ta
thường chọn dung môi thích hợp để chiết rút enzyme ra khỏi nguyên liệu. Enzyme
từ vi sinh vật tồn tại ở hai dạng: enzyme ngoại bào là enzyme được tiết ra môi
trường bên ngoài và enzyme nội bào tồn tại bên trong tế bào. Enzyme ngoại bào
có thể dùng dung môi chiết ngay ra được. Đối với dạng enzyme nội bào, để tách
chiết dạng enzyme này trước hết phải phá vỡ cấu trúc tế bào bằng các biện pháp cơ
học như xay, nghiền. Tiếp đó enzyme được chiết ra bằng các dung môi thích hợp
như nước cất, các dung dịch đệm, dung dịch muối sinh lý vv…
Dịch chiết chứa không chỉ có enzyme mà còn có các protein tạp và các tạp
chất khác. Để tách các tạp chất làm tăng độ sạch, tinh khiết của enzyme phải sử
dụng kết hợp nhiều phương pháp khác nhau. Đối với muối, các tạp chất có phân tử
lượng thấp thường dùng biện pháp thẩm tích hoặc lọc qua cột gel sephadex. Để
loại các protein tạp và các tạp chất có phân tử lượng cao thường dùng kết hợp
nhiều biện pháp khác nhau : Phương pháp biến tính chọn lọc dưới tác dụng của
nhiệt độ hay pH môi trường: phương pháp này thích hợp đối với loại enzyme có
tính bền nhiệt hoặc bền acid. Giữ dịch chứa enzyme ở nhiệt độ cao 50 – 70
0
C hoặc
pH = 5 trong thời gian xác định các protein tạp bị biến tính và được loại bỏ bằng
lọc hay ly tâm.


14

Kết tủa phân đoạn enzyme bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ
thích hợp đối với các loại enzyme ít bị biến tính bởi các dung môi, muối trung
tính. Khi đó các protein tạp sẽ bị biến tính và được tách ra khỏi dịch chứa enzyme.
Ngoài ra còn có các phương pháp khác như: Phương pháp sắc ký, điện di hay lọc
gel.vv…
Một số yếu tố gây biến tính enzyme như nhiệt độ cao, acid hay kiềm đặc,
muối kim loại nặng thường làm mất hoạt tính xúc tác của enzyme, do đó người ta
thường dùng các yếu tố này để ức chế hoạt độ của enzyme khi cần thiết [3], [4].
Ứng dụng của enzyme: Enzyme được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh
vực của cuộc sống. Có thể chia ứng dụng của enzyme thành hai hướng chính.
Hướng thứ nhất: điều hòa định hướng tác dụng của enzyme ngay trong bản thân
nguyên liệu có chứa nó. Hướng sử dụng này không phổ biến vì chỉ sử dụng được
khi bản thân nguyên liệu có tồn tại enzyme. Hướng thứ hai là: tách chiết enzyme
ra khỏi nguyên liệu ở dạng chế phẩm và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh
vực sản xuất. Hướng này có ưu điểm là chủ động được nguồn enzyme, có thể dễ
dàng điều khiển được hoạt động của nó theo các mục đích khác nhau của quá trình
sản xuất [4].
1.3. ENZYME CHITINASE: PHÂN LOẠI VÀ CƠ CHẾ TÁC ĐỘNG
1.3.1. Phân loại hệ thống enzyme thủy phân Chitin:
Enzyme thủy phân Chitinase là enzyme thuộc hệ thống enzyme thủy phân
(glycosyhydrolasa). Đến năm 2004, số lượng họ enzyme glycosyhydrolasa đã tìm
được là 97 họ. Chitinase thuộc về họ 18 và 19 của glycosyhydrolasa. [25].
Có một vài hệ thống dùng trong phân loại glycosyhydrolasa (GHs). Sự
phân loại chủ yếu dựa vào cơ chất tham gia; sản phẩm tạo thành hoặc theo cơ chế
phản ứng. Hệ thống phân loại đơn giản là dựa theo cơ chất đã sử dụng và sản
phẩm được tạo thành sau phản ứng. Tuy nhiên, cách phân loại này không thể đưa
lại kết quả một cách rõ ràng về cấu trúc không gian ba chiều của một enzyme. Vì
vậy, ngày nay, để phân loại enzyme vào các họ enzyme, người ta thường dựa vào
trình tự các aminoacid của chúng. Theo phương pháp phân loại dựa vào trình tự

aminoacid thì những acid amin có phần xúc tác mang trình tự acid amin tương tự
nhau sẽ được xếp vào cùng một họ. Nguyên lý cơ sở của sự phân loại này đó là
trình tự và cấu trúc của enzyme luôn có liên quan với nhau, trình tự aminoacid
chứa đựng những thông tin về cấu trúc và cơ chế phản ứng. Ngoài ra, trong hệ
thống enzyme glycosyhydrolase cũng xuất hiện một số enzyme có trình tự amino
acid tương tự nhau mà có khả năng phân giải những cơ chất khác nhau. Những họ
này chiếm 1/3 số lượng họ enzyme trong hệ thống enzyme glycosyhydrolasa.


15


Hệ thống enzyme thủy phân được tìm thấy ở vi sinh vật, thực vật và động
vật. Hệ thống này hoạt động đòi hỏi sự tham gia của một chuỗi enzyme và các
protein liên kết phân giải Chitin. Ví dụ như ở chủng Serratia marcescens trong đất
sinh tổng hợp 5 protein có liên quan đến sự phân giải Chitin. [26]
Những enzyme họ 18 có ở phần lớn các loài sinh vật từ nhân sơ đến nhân
chuẩn (vi khuẩn, nấm, và động vật). Trong khi đó những enzyme họ 19 chỉ có ở
thực vật bậc cao là vi khuẩn Gram dương, Streptomyces.
Hai họ enzyme này đều gồm:
- EndoChitinase: enzyme phân cắt một cách ngẫu nhiên chuỗi Chitin.
- ExoChitinase: phân cắt Chitobiase [(NAG)
2
)] bởi enzyme Chitobiosidase;
hoặc phân cắt Chitotriose [(NAG)
3
)] bởi enzyme Chitotriodase, từ các đầu tận
cùng của chuỗi Chitin [23].
- Ngoài endoChitinase và exoChitinase, sinh vật phân giải còn có
Chitobiase, enzyme thủy phân Chitin hạng 3 nhằm biến đổi dimer NAG thành các

monome.
Họ enzyme Chitinase 18 xuất hiện ở vi khuẩn, nấm và ở động vật,
Chitinase thuộc họ này được phân loại thành lớp III và lớp V. Hoạt động thủy
phân liên kết glycosid đồng thời với việc duy trì cấu trúc anomer tại vị trí nguyên
tử C số 1. Vùng xúc tác của những enzyme này có một nếp gấp của rãnh xúc tác
()
8
với cấu trúc 3D của Hevamine [23] Chúng xúc tác thủy phân liên kết giữa
(NAG-NAG) và (NAG-NG). Hoạt tính thủy phân bị ức chế bởi allosamin – một
isome của N-acetylglucosamine.
Họ enzyme 19 xuất hiện ở thực vật và Streptomyces grises [24]. Các
enzyme này chia thành ba lớp: lớp I, lớp II, và IV. Hoạt động thủy phân liên kết
glycosid với sự nghịch chuyển cấu trúc anomer tại vị trí nguyên tử C số 1. Vùng
xúc tác của chúng là nếp gấp chứa -helic cao và có cấu trúc giống nhau bao gồm
sự duy trì trung tâm của enzyme . Họ này chỉ thủy phân liên kết giữa (NAG-
NAG). Hoạt tính enzyme họ 19 không mẫn cảm với allosamidin, Cơ chế xúc tác
của chúng giống nhau về cơ chế acid-bazo.
* Vi khuẩn sinh enzyme Chitinase:
Chitinase do vi khuẩn sinh ra có mặt trong các môi trường khác nhau như:
nước, đất, phân trộn … Vi khuẩn sinh chitinase được sử dụng cho mục đích dinh
dưỡng và mục đích kí sinh [5]. Trong đó Bacillus và Streptomyces được nghiên
cứu một cách sâu sắc về khả năng sản xuất mạnh Chitinase.
Một số vi khuẩn Gr
–
có hoạt tính thủy phân Chitin bao gồm: Aeromonas,
Enterobacter, Pseudomonas, Serratia, Ewinggella, Vibrio và vi khuẩn Cytophaga,


16

Lasobacter. Vi khuẩn Gr
–
sản xuất Chitinase một cách phổ biến. Chitinase của
Serratia marcescens gồm có 3 loại: ChiA, ChiB, ChiC đều chứa một vùng xúc tác
đặc trưng cho họ enzyme 18. Thêm vào đó mỗi enzyme chứa các vùng liên kết với
cơ chất. Chuỗi thẳng hàng của các vùng xúc tác được đặc trưng bởi xảy ra một số
lượng tương đối lớn quá trình gắn và tách chậm. Một số đặc điểm này liên quan
đến sự biến đổi trong cấu trúc và vị trí của vùng ngoài.
Enzyme thứ tư liên quan đến phân giải Chitin và Chitobiase khối lượng
phân tử là 95 kD, thuộc họ 20 của glycosyl hydrolase. Chitobiase chứa bốn vùng
xúc tác, một vài trong số đó chưa biết rõ chức năng. Vùng xúc tác giống toàn bộ
nếp gấp như Chitinase họ 18. Nhưng cấu trúc vị trí hoạt động là khác nhau. Dựa
trên sự cảm ứng với Chitin. S.marcescens sản xuất protein liên kết Chitin nhưng
không phải enzyme hoạt động. Các chủng S.marcescens thủy phân Chitin kháng
lại với nấm gây bệnh như: Botrytis spp, B.cinerea, Rhizostonia solani, Fusarium
oxysporum, Sclerotinia minor.
Gen mã hóa ChiA, ChiB từ S.marcescens được chuyển vào các chủng vi
khuẩn khác như Pseudomonas flurescens và E.coli nhằm tận dụng khả năng hạn
chế nấm gây bệnh thực vật, hoặc để tạo ra chất điều chỉnh sinh học mới. Hơn nữa
ChiA đã cho thấy khả năng giảm bệnh gây ra bởi Sclerotium rolfsii ở cây đậu và
Rhizotonia solani ở cây bông.
Vi khuẩn trong môi trường nước biển Aeromonas hydrophila sản xuất
ChiA. Vi khuẩn trong đất theo họ Bacillus sản xuất Chitinase trọng lượng phân tử
25-29 kDa. Ba đồng dạng của Chitinase (L, M, S) được tinh chế từ vi khuẩn ưa
nhiệt Bacillus sp. Thu được exochitinase chịu nhiệt từ B.steraothermopholus phân
lập từ phân compost chứa phế thải tôm của trong nông nghiệp. Phân lập bốn dạng
Chitinase chịu nhiệt từ B.licheniformis -70. B.circulant từ đất cũng sinh Chitinase.
Flavobacterium sp. sản xuất Chitinase 30 kDa. Alteromonas sinh Chitinase 87
kDa. Chitinase phổ rộng trọng lượng 25 kDa được tinh sạch từ B.subtilis DC121,

một chủng điều khiển sinh học. Protein này cho thấy sự kháng lại Fusarium
moniliforme, F.oxysporum, Alternaria alternate, Pornoa sorghina, Pyricularia
oryzae và Rhizoctonia solani. Ngoài ra B.cereus sinh Chitinase cũng được coi là
một tác nhân điều khiển sinh học trong chống nấm.
Trong nông nghiệp kiểm soát bệnh ở thực vật bởi vi khuẩn phân giải Chitin
đã được báo cáo từ rất lâu. Việc bổ sung Chitin vào đất hoặc lên tán lá làm tăng số
lượng vi khuẩn phân giải Chitin đã tạo điều kiện hạn chế mầm bệnh. Thêm vào đó
gen mã hóa Chitinase ở vi khuẩn khi được đưa vào các chủng, các loài khác đã tạo
ra khả năng chống bệnh cao. Tuy nhiên các nghiên cứu trên vi khuẩn cung cấp dấu


17


hiệu trực tiếp, qua phân tích đột biến khuyết gen mã hóa Chitinase hay qua đánh
giá dịch chiết Chitinase cho thấy việc hạn chế sự nảy mầm của bào tử đính của
Bioplaris sorokinaza trên lá cỏ đã giúp chống bệnh đốm lá, góp phần rất lớn trong
sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, …. Qua đó vi khuẩn sinh Chitinase được đánh giá
như một tác nhân điều chỉnh sinh học.
Với đặc điểm thời gian sinh trưởng ngắn, điều kiện phát triển dễ dàng, các
chủng vi khuẩn sinh chitinase được sử dụng trong các ngành công nghiệp như:
công nghiệp sản xuất gốm nhằm tạo ra các sản phẩm có độ xốp cao… Được ứng
dụng vào xử lý rác thải từ ngành chế biến thủy hải sản góp phần bảo vệ môi trường
vào sản xuất ra các sản phẩm có tính ứng dụng và giá trị rất cao trên thị trường.
Nhờ những ứng dụng rộng rãi đem lại giá trị cao của Chitin và các sản
phẩm dẫn xuất của nó, cộng với các đặc tính hấp dẫn về mặt thương mại của
Chitinase vi khuẩn, cho nên việc sử dụng vi sinh vật phân giải Chitin sẽ mở ra
những triển vọng rất lớn trong việc nghiên cứu và sản xuất.
1.3.2. Cơ chế tác động của enzyme thủy phân Chitin:

Hình 6: Cơ chế tác động của enzyme thủy phân Chitin
IM: Màng trong (Inner membrain)
OM: Màng ngoài (Outer membrain)
Nói chung, sự phân giải Chitin của các vi sinh vật đều bắt nguồn từ sự tiết
enzyme depolymease {EC 3.2.1.14; poly[1,4-(N-acetyl-D-glucosaminide)]}
glycanohydrolaza để phân giải chitin thành các chất GlcNAc, chitobiose và
chitooligosaccharit (hình 6). Sau đó, những chất này sẽ đi vào vùng chu chất – nơi
mà chitodextrinaza (EC 3.2.1.14) và N-acetylglucosamindaza (EC 3.2.1.52;
acetyl-D-hexosaminide N-acetylhexosaminohydroase) hoạt động để tạo


18


thành các chất GlcNAc và chitobioza. Khi vào tới tế bào chất, GlcNAc và
chitobioza sẽ tham gia vào quá trình trao đổi chất hoặc bị biến đổi. Dựa vào đặc
điểm hoạt động của mỗi loại enzyme mà có thể khai thác chúng để sản xuất những
hợp chất có nguồn gốc từ Chitin nhằm thu lại lợi ích thực tiễn.
1.4. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHITINASE
1.4.1. Các công trình nghiên cứu ngoài nước.
Theo nghiên cứu của Masaru Mitsutomi (1997) đã nghiên cứu chitinase 19
(chitinase C-1) được chiết rút từ vi khuẩn streptomyces griseus HUT 6037.
Enzyme chitinase C-1 là enzyme loại endo có thể cắt đứt được liên kết beta- 1,4-
N-acetylglucosaminidic và liên kết beta-1,4-glucosaminidic trong khi chitinase
chiết rút từ các loại vi sinh vật khác chỉ có thể cắt đứt được liên kết beta- 1,4- N-
acetylglucosaminidic của chitin. Chitinase thu được từ dịch chiết được tinh sạch
bằng sắc ký cho 2 enzyme chitinase C-1 và C-2 có khối lượng phân tử đều bằng 27
kDa, có điểm đẳng điện lần lượt 7.7 và 7.3. Chitinase C-1, C-2 có khoảng pH thích
hợp 4.5 đến 6 và bền trong khoảng pH rất rộng từ 6.5 đến 10. chitinase thu được
có khả năng thủy phân chitin, colloidal chitin, glycol chitin, cacboxymethyl chitin,

53% deacetylated chitosan và oligomers của N-acetylglucosamine nhưng enzyme
này không thủy phân được 96% deacetylated chitosan [28].
Katsuichiro Okazaki, Hiromasa Maki, Tomomi Imachi và Shigeru Hayakawa
(1997) nghiên cứu hai loại chitinase thu được từ Streptomyces sp. J-13-3 là
chitinase A và B với khối lượng phân tử lần lượt 31 và 32 kDa, có điểm đẳng điện
lần lượt 3.9 và 3.5. Khoảng pH thích ổn định từ 4 đến 6 đối với chitinase A và
chitinase B là 3 đến 7. nhiệt độ thích hợp đối với cả hai enzyme là 45
0
C. Hoạt độ
của hai enzyme bị ức chế bởi N-bromo và N- cholorosuccunimide (1mM) [29].
1.4.2. Các công trình nghiên cứu trong nước.
Hiện nay trong nước, các công trình nghiên cứu đang tập trung vào chitin,
chitosan và các chế phẩm từ chúng. Tập trung nghiên cứu về chitin chitosan nhằm
nâng cao giá trị của thủy sản và tìm hiểu nhiều đặc tính quý của các chế phẩm
cũng như mở rộng ứng dụng của chitin, chitosan trong đời sống.
PGS.TS. Phạm Văn Ty (2006), Đại học Quốc gia Hà Nội đã làm đề tài về tìm
kiếm các chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh học cao nhằm tạo ra chế phẩm làm
sạch nước nuôi tôm, với mục đích tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng


19


phân giải nhanh vỏ tôm ở đáy ao, xác định môi trường, điều kiện nuôi cấy thích
hợp đồng thời nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại các chủng vi khuẩn
đã lựa chọn nhằm ứng dụng trong việc sản xuất chế phẩm làm sạch ao nuôi tôm.
Trần Thị Luyến (2005), Đại học Thủy sản đã đưa ra quy trình sản xuất olygo-
chitin, olygo-chitosan, glucosamin, N-acetyl-β-D-glucosamin. Chitin, chitosan
được thủy phân bằng acid HCl đậm đặc. Hiệu suất thu sản phẩm đạt 90%, sản
phẩm có tính kháng khuẩn, chống oxy hóa nhưng có nhược điểm hoạt tính sinh

học thấp, nhiều tạp chất.
Trần Thị Luyến, Lê Thị Tưởng, Đặng Trung Thành, Nguyễn Ngọc Anh
(2007), bước đầu nghiên cứu sản xuất COS (chitoolygosaccharide) từ chitin,
chitosan bằng enzyme Hemicellulase thương mại, enzyme chitinase từ lá khoai
lang, enzyme papain từ đu đủ, enzyme cellulase từ xạ khuẩn.
Trang Sĩ Trung (2005), nghiên cứu ứng dụng chitosan làm chậm quá trình
phân rã của thức ăn tôm trong môi trường ao nuôi.
Một số nghiên cứu đã được triển khai như:Nghiên cứu thử nghiệm thu nhận
chế phẩm enzyme chitinase kỹ thuật từ Streptomyces griceus. Nghiên cứu enzyme
chitinase từ nấm mốc Trichoderma harzianum và ứng dụng chúng trong một số
lĩnh vực đời sống.
Năm 1999, Đinh Duy Kháng, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Chikafusa
Fukazawa đã nghiên cứu tinh chế và xác định tính chất của chitinase từ đậu tương
(Báo cáo Khoa học Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội). Cũng trong
năm 1999, Nguyễn Thị Thu Trang, Nguyễn Lân Dũng đã nghiên cứu khả năng
sinh tổng hợp chitinase của chủng vi khuẩn Bacillus Q3 có hoạt tính kháng nấm
cao. Trong nghiên cứu đã phân lập được 22 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải
chitin từ mẫu đất nông nghiệp lấy ở Hà Nội và tỉnh Thái Bình, Hoà Bình. Trong số
22 chủng này, có chủng Bacillus Q3 có hoạt tính chitinase và có khả năng sử dụng
chitinase để ức chế mạnh mẽ nhiều chủng nấm gây bệnh thực vật (Aspergillus
VN04-460; Trichoderma VN04-412; Eurotium amstelodami; Eurotium chevalieri;
Fusarium oxysporum).
Năm 2001, Đinh Minh Hiệp, Đại học Khoa học Tự nhiên đã nghiên cứu thu
nhận chitinase từ nấm mật Coprinus Fimentarius và các đặc tính của nó.



20

1.5. PHÂN LOẠI VI KHUẨN THEO PHƯƠNG PHÁP CỔ ĐIỂN
Phương pháp phân loại cổ điển là phương pháp phân loại dựa vào các đặc
điểm về hình thái, sinh lý, sinh hoá như:
+ Hình dạng khuẩn lạc
+ Hình dạng tế bào
+ Kết quả nhuộm Gram
+ Khả năng hình thành bào tử
+ Khả năng chịu muối
+ Khả năng di động
+ Khả năng đồng hoá cacbon, nitơ
+ Khả năng đồng hoá nitrat thành nitrit
+ Khả năng sinh khí CO
2

+ Khả năng sinh catalaza
+ Khả năng hoá lỏng gelatin.
Dựa vào những đặc điểm sinh lý, sinh hoá trên, theo quan điểm hiện đại (NCBI-
National Center for Biotechnology Information, 2005) thì vi khuẩn bao gồm các
ngành sau đây: [27]
+ Thermotogae + Proteobacteria
+ Thermodesufobacteria + Firmicutes
+ Deinococcus- Thermus + Actinobacteria
+ Chrysiogenetes + Planctomycetes
+ Aquificae + Chlamydiae
+ Chloroflexi + Spirobacteres
+ Nitrospiae + Fibrobacteres
+ Defferribacteres + Bacteroidetes
+ Cyanobacteria + Fusobacteria
+ Dictyoglomi

21


Chương 2. ĐỐI TƯỢNG-VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI T ƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng
Chủng vi khuẩn dùng trong nghiên cứu được tuyển chọn từ nhiều chủng vi
sinh vật phân lập từ các mẫu đất trong đảo, vùng ven bờ biển thuộc Khánh Hoà:
Hồ cá Trí Nguyên, hòn Một, suối nước nóng Ninh Hoà, Trường Xuân - Ninh Hoà,
hòn Chồng, bãi Dương, trại nuôi trồng thuỷ sản - Cam Ranh.
2.1.2. Vật liệu
1) Hoá chất
 Các hóa chất thông thường: pepton, Chitin, cao men, thạch (agar), thuốc
thử lugol và hoá chất khác.
 Dụng cụ chủ yếu:
- Máy lắc thường và máy lắc ổn nhiệt (Nhật)
- Tủ ấm (CHLB Đức)
- Tủ sấy (CHLB Đức)
- Nồi hấp thanh trùng (Trung Quốc)
- Tủ cấy vô trùng (Việt Nam)
- Tủ lạnh DaeWoo ( Hàn Quốc)

- Máy đo pH Mettler Toledo (Thuỵ Sĩ)
- Máy li tâm (Eppendoft, Đức).
- Máy ổn nhiệt (Nhật)
- Cân phân tích độ chính xác 10
-4
(g)
- Kính hiển vi quang học 3 mắt (Nhật Bản)
- Máy đo mật độ quang OD
Các dụng cụ phòng thí nghiệm: bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri ,
pipet, đầu côn các loại, đèn cồn, que cấy, que gạt
2) Môi trường:
 Môi trường thạch thường: g/l
Pepton 10,0
Thạch 15,0
Nước mắm 20 ml
Nước cất 1000 ml
pH 7,0