Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người để điều trị vết thương bỏng nhiệt thực nghiệm

1
ĐẶT VẤN ĐỀ

Da là cơ quan lớn nhất của cơ thể có chức năng bảo vệ. Mặc dù chỉ
gồm 2 lớp mô chuyên biệt với hai loại tế bào chủ yếu là nguyên bào sợi và
tế bào sừng nhƣng việc tái tạo khi da bị tổn thƣơng vẫn còn là một thách
thức. Các tấm tế bào da nuôi cấy hoặc vật liệu tƣơng đƣơng da chế tạo từ
tế bào da nuôi cấy đã đƣợc ứng dụng trong điều trị bỏng, vết thƣơng mạn
tính …. Việc khắc phục các hạn chế đang đƣợc kỳ vọng vào vai trò tác
dụng của các tế bào gốc bởi chúng là những tế bào chƣa có chức năng
chuyên biệt, chúng có tiềm năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác
nhau và có khả năng tự thay mới.
Tế bào gốc trung mô tồn tại trong tủy xƣơng, máu cuống rốn, dây rốn,
mô liên kết của cơ thể và ở các khoảng kẽ của nhiều cơ quan. Các tế bào
này có thể đƣợc nuôi cấy và nhân lên in vitro và dƣới các điều kiện thích
hợp chúng có thể cảm ứng biệt hóa thành các tế bào xƣơng, sụn, cơ và mỡ.
Hiện nay, tế bào gốc trung mô đƣợc coi là dạng tế bào quan trọng cho
công nghệ mô.
Trong liền vết thƣơng, tế bào gốc trung mô đƣợc xác định là chúng
biệt hóa thành các dạng tế bào da khác nhau. Tủy xƣơng là nguồn chính
của tế bào gốc trung mô nhƣng vấn đề thu tủy xƣơng gặp khó khăn và số
lƣợng ngƣới cho tủy xƣơng cũng hạn chế. Những vấn đề cần cân nhắc này
đã hạn chế các ứng dụng lâm sàng của tế bào gốc trung mô tủy xƣong.
Việc tìm kiếm các tế bào gốc trung mô từ nguồn mô khác đã đƣợc
quan tâm nghiên cứu trong những năm gần đây. Dây rốn là mô mềm có
chiều dài lớn và là cầu nối giữa thai và bánh nhau để trao đổi oxy, dinh
dƣỡng…cho thai. Các nghiên cứu phôi thai học và kháng nguyên bạch cầu
ngƣời (Human Leukocyte Antigen – HLA) của các tế bào từ dây rốn cho
thấy chúng có nguồn gốc từ thai nhi chứ không phải từ ngƣời mẹ.
Mô dây rốn là sản phẩm thải sau khi sinh và là một nguồn tƣơng đối

dƣ thừa. Sự thu hồi mô cũng dễ dàng và không bị ảnh hƣởng cúa các vấn

2
đề về đạo đức và luật pháp. Năm 2004, tế bào gốc trung mô phân lập đƣợc
từ màng dây rốn. Các tế bào này sau khi phân lập và nuôi cấy duy trì, cấy
chuyền 3 đến 5 lần trong môi trƣờng nuôi cấy đặc trƣng chƣa hề bị biệt
hoá, vẫn giữ đƣợc đầy đủ đặc tính của TBG ban đầu mới phân lập.
Từ những cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên, đề tài “Nghiên cứu biệt hóa
tế bào gốc trung mô màng dây rốn người để điều trị vết thương bỏng
nhiệt thực nghiệm” đƣợc tiến hành nhằm mục tiêu:
1. Đánh giá một số đặc điểm phân lập nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc
trung mô màng dây rốn.
2. Đánh giá hiệu quả ghép tế bào gốc trung mô màng dây rốn trong
điều trị vết thƣơng bỏng nhiệt thực nghiệm
Những đóng góp mới của luận án:
- Luận án có đóng góp mới cho nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu thực
nghiệm, đã phân lập đƣợc tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn ngƣời, các
đặc tính tế bào gốc trung mô và ảnh hƣởng của chúng trên vết thƣơng bỏng
dị loại là thỏ thực nghiệm.
- Mở ra hƣớng nghiên cứu mới trong lĩnh vực nuôi cấy tế bào để điều trị
vết thƣơng bỏng, vết thƣơng mạn tính.
- Một số điểm mới thu đƣợc trong kết quả nghiên cứu của luận án là tế bào
gốc trung mô phân lập từ màng dây rốn ngƣời mọc đơn lớp trong điều kiện
nuôi cấy in vitro và có khả năng tạo cụm, cụm của tế bào gốc trung mô ở
dạng CFU-F (Collony Forming Unit – Fibroblast).
- Tế bào gốc trung mô màng dây rốn ngƣời có đặc tính sinh miễn dịch thấp.
Các tế bào có bộc lộ các phân tử HLA-G và HLA-E nhƣng bộc lộ HLA-
DR, với mức độ thấp. Kháng thể đặc hiệu kháng tế bào gốc trung mô trên
thỏ xuất hiện với hiệu giá thấp.
- Tế bào gốc trung mô màng dây rốn có thể cảm ứng để biệt hóa thành

nguyên bào sợi trong môi trƣờng định hƣớng in vitro.
Bố cục luận án:
Luận án gồm 119 trang với 29 hình ảnh, 9 biểu đồ và 22 bảng, trong

3
đó: đặt vấn đề (2 trang); Tổng quan tài liệu (30 trang); Đối tƣợng và
phƣơng pháp nghiên cứu (23 trang); Kết quả nghiên cứu (36); Bàn luận (25
trang); Kết luận (2 trang); Kiến nghị (1 trang). Tài liệu tham khảo: 145 tài
liệu (tiếng Việt 29, tiếng Anh 116).

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. QUÁ TRÌNH LIỀN VẾT THƢƠNG
1.1.1. Diễn biến lâm sàng vết thƣơng, vết bỏng sâu
Thông thƣờng, các vết thƣơng liền trong vòng 4 – 6 tuần. Các vết
thƣơng khuyết da hoặc bỏng sâu toàn bộ lớp da thì quá trình liền vết
thƣơng đều phải trải qua quá trình hình thành mô hạt. Tùy thuộc vào diện
tích, độ sâu của vết bỏng, sức đề kháng của cơ thể, vết bỏng cơ bản tiến
triển theo ba giai đoạn đan xen và kế tiếp nhau là: Giai đoạn cấp tính, giai
đoạn tái tạo và giai đoạn hình thành sẹo.
1.1.2. Các tế bào chủ yếu tham gia liền vết thƣơng
Quá trình liền vết thƣơng có nhiều cơ chế phức tạp nhƣng kết quả
cuối cùng là tái lập lại các mô tế bào đã bị tổn thƣơng. Do đó quan niệm
mới trong điều trị các tổn thƣơng ở bất cứ cơ quan nào trong cơ thể là các
tế bào tổn thƣơng phải đƣợc thay thế bằng các tế bào khoẻ mạnh. Để duy
trì chức năng bảo vệ cơ thể, con ngƣời cần có da. Thành phần tế bào da
ngƣời chủ yếu gồm 2 loại là nguyên bào sợi và tế bào sừng.
1.1.2.1. Nguyên bào sợi
1.1.2.2. Tế bào sừng
1.2. GHÉP TẾ BÀO ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG

Do có vai trò quan trọng quyết định trực tiếp tới quá trinh liền vết
thƣơng nên nguyên bào sợi và tế bào sừng cũng là những tế bào đƣợc nuôi
cấy để ghép trong điều trị vết thƣơng.
1.2.1. Vật liệu tƣơng đƣơng trung bì có tế bào
Vật liệu thay thế trung bì có tế bào là vật liệu dùng nguyên bào sợi để
tạo một cấu trúc tái sinh trên giá đỡ làm từ một số nguyên liệu khác nhau.

4
Cấu trúc này đƣợc cấy nguyên bào sợi để tổng hợp các protein và các thành
phần khác của đệm gian bào mà có tác dụng kích thích những tế bào tại vết
thƣơng của ngƣời bệnh tăng cƣờng hoạt động để làm nhanh liền vết thƣơng.
* TransCyte.
* Dermagraft.
1.2.2. Vật liệu tƣơng đƣơng biểu bì có tế bào
* Epicel.
* Laserskin.
1.2.3. Vật liệu tƣơng đƣơng da hai lớp có tế bào
Vật liệu tƣơng đƣơng da hai lớp gồm biểu bì và trung bì là sản phẩm
mới và phức tạp nhất hiện nay về cấu trúc. Vật liệu đƣợc tạo ra bởi nuôi
cấy nguyên bào sợi và tế bào sừng trên nền là giá thể collagen và cơ chất
lycosaminoglycan…
Vật liệu tƣơng đƣơng da đồng loại là sản phẩm mới nhất và tiến bộ
nhất gần đây, chúng đang đƣợc lƣu hành trên thị trƣờng. Hai sản phẩm
nguyên mẫu của dạng này là Apligraf và Orcel.
1.3. TẾ BÀO GỐC, TIỀM NĂNG VÀ ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC
1.3.1. Tế bào gốc, đặc tính và phân loại tế bào gốc
Tế bào gốc là những tế bào chƣa có chức năng chuyên biệt, chúng có
tiềm năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau và có khả năng tự
thay mới.
Dựa theo nguồn gốc hoặc thời điểm phân lập, có thể phân loại các tế

bào gốc thành các nhóm sau:
- Tế bào gốc phôi
- Tế bào gốc thai
- Tế bào gốc nhũ nhi
- Tế bào gốc trƣởng thành
- Tế bào vạn tiềm năng do cảm ứng
1.3.2. Ứng dụng tế bào gốc trong điều trị bệnh
1.3.3. Các tiềm năng ứng dụng tế bào gốc

5
1.3.4. Biệt hóa tế bào gốc thành các tế bào da dùng trong điều trị vết thƣơng
1.3.4.1. Biệt hóa tế bào gốc trung mô thành nguyên bào sợi
1.3.4.2. Biệt hóa tế bào gốc thành tế bào sừng
1.4. DÂY RỐN VÀ TẾ BÀO GỐC PHÂN LẬP TỪ MÀNG DÂY RỐN
Năm 2004, nhóm nghiên cứu tại Đại học Quốc gia Singapore đã
thành công trong việc xác định và phân lập đƣợc các TBG biểu mô và TBG
trung mô từ màng dây rốn. Cả hai loại tế bào gốc biểu mô và trung mô
màng dây rốn đều có 2 loại marker là: Oct 4 (Octamer 4) và Nanog
(Pluripotency Sustaining ES Cell Factor). Điều này gợi ý cho thấy tính gốc
của cả hai loại tế bào này cao hơn so với tính gốc của tế bào tuỷ xƣơng,
máu cuống rốn hay các tế bào gốc trƣởng thành khác.

CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Thỏ thí nghiệm bao gồm 02 lô:
Lô 1, gồm 15 thỏ dùng để đánh giá tính sinh miễn dịch của tế bào
gốc trung mô màng dây rốn ngƣời khi ghép dị loại.
Lô 2, gồm 30 thỏ dùng để đánh giá hiệu quả ghép tấm tế bào gốc
trung mô điều trị vết bỏng nhiệt thực nghiệm.

Thỏ thí nghiệm đều đã trƣởng thành từ 10-12 tháng tuổi, do Ban chăn
nuôi động vật thí nghiệm, Học viện Quân y, Bộ Quốc Phòng cung cấp.
Nuôi đảm bảo tiêu chuẩn thực nghiệm.
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
2.2.1. Mẫu mô dây rốn
Mô dây rốn thu từ sản phụ ngay sau khi sinh với các tiêu chuẩn
nguồn mô nhƣ sau:
- Tiêu chuẩn y đức về nguồn cung cấp mô:
- Tiêu chuẩn sàng lọc
- Ngƣời hiến dây rốn thử máu âm tính với các bệnh truyền nhiễm

6
- Tính pháp lý của nguồn mô nghiên cứu
2.2.2. Hóa chất chủ yếu dùng trong nghiên cứu
Các hoá chất và vật tƣ nuôi cấy do hãng Invitrogen và PAAcung
cấp, đều đạt tiêu chuẩn quốc tế an toàn về độc tính, vi khuẩn,
mycoplasma và vi rút.
Môi trƣờng nuôi cấy tế bào trung mô do Ngân hàng tế bào gốc
Mekostem (Việt Nam) cung cấp theo bản quyền chuyển nhƣợng của công
ty CRC (Singapore).
2.2.3. Các vật tƣ tiêu hao chủ yếu
Màng Tegaderm,
Các vật tƣ tiêu hao do hãng Corning, 3M, Baxter cung cấp đạt tiêu
chuẩn quốc tế về vô trùng và phục vụ mục đích nuôi cấy tế bào.
2.2.4. Các thiết bị và dụng cụ chủ yếu
- Phòng sạch nuôi cấy tế bào
- Kính hiển vi đảo ngƣợc
- Máy ly tâm lạnh
- Tủ hood lọc không khí vô trùng
- Tủ ấm (incubator)

- Pipet Aid
- Tủ lạnh gia dụng
- Tủ lạnh âm 86
0
C và âm 152
0
C
- Tank Nitơ lỏng
- Thiết bị hạ nhiệt độ theo chƣơng trình hoặc hộp hạ nhiệt độ với cồn PIA.
- Nỉa, kéo
2.2.5 Các giá đỡ để tạo tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì.
Màng Tegaderm chất liệu polyurethane do hãng 3M Health Care,
USA cung cấp đƣợc dùng để làm giá đỡ tế bào.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Các phƣơng pháp nghiên cứu trong phân lập, nuôi cấy và biệt
hóa tế bào

7
2.3.1.1. Phân lập tế bào gốc trung mô
2.3.1.2. Cấy chuyển nhân rộng số lƣợng tế bào gốc trung mô dây rốn
2.3.1.3. Đánh giá khả năng tạo colony của tế bào
2.3.1.4. Xác định số lƣợng tế bào trong nuôi cấy
Số lƣợng TB đƣợc tính theo công thức: C = n/v (n: số lƣợng TB đã
đếm đƣợc trong buồng đếm, v: thể tích đếm (ml), C: mật độ TB (TB/ml).
Trong buồng đếm Neubaeur có thể tích 0,1mm
3
= 1.10
-4
ml do đó công
thức tính là:

C = n x 10
4
/ml
2.3.1.5. Đánh giá hình thái tế bào
- Đánh giá hình thái tế bào bằng phƣơng pháp nhuộm giemsa
- Đánh giá hình thái mô bằng phƣơng pháp nhuộm HE
- Đánh giá hình thái siêu cấu trúc
2.3.1.6 Phƣơng pháp khảo sát biểu hiện của các kháng nguyên HLA của
tế bào gốc trung mô
- Phân tích biểu hiện của HLA-G và HLA-E bằng kỹ thuật western blot
- Phân tích HLA-DR bằng kỹ thuật flowcytometry
2.3.1.7 Xác định tính sinh miễn dịch của tế bào gốc
Nguyên liệu và chuẩn bị
- Tế bào gốc: là dòng tế bào cùng nguồn gốc và thế hệ tế bào đã sử
dụng ghép cho thỏ trong quá trình nghiên cứu thực nghiệm.
- Huyết thanh thỏ: các mẫu máu thỏ đƣợc lấy ở 4 thời điểm: Bắt đầu
nghiên cứu ghép tế bào gốc - D0 và các thời điểm sau đó là D15, D30, D60.
Phương pháp phân tích miễn dịch ELISA
2.3.1.8. Biệt hóa tế bào gốc mô thành tế bào dạng nguyên bào sợi
- Môi trƣờng cảm ứng biệt hóa
- Các bƣớc biệt hóa
- Xác định khả năng tạo tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì của tế bào
2.3.1.9. Xét nghiệm ELISA collagen typ I trong dịch nổi tế bào biệt hóa

8
2.3.2. Các phƣơng pháp đánh giá hiệu quả ghép tế bào điều trị vết
thƣơng thực nghiệm
2.3.2.1. Quy trình nghiên cứu thực nghiệm

Sơ đồ 2.1. Thiết kế nghiên cứu vết thƣơng bỏng thực nghiệm

Thỏ nghiên cứu
(n = 30)
Gây bỏng thực nghiệm
2 bên lƣng thỏ
Cắt lọc hoại tử
ở vết thƣơng bỏng
Vùng B (n = 30)
Đắp tấm vật liệu
Tegaderm không

có tế bào
Vùng A (n = 30)
Đắp tấm vật liệu
tƣơng đƣơng trung bì
Theo dõi diễn biến vết
thƣơng bỏng vào các
thời điểm D0, D5, D10
Theo dõi diễn biến vết
thƣơng bỏng vào các
thời điểm D0, D5, D10

Kết luận

9
2.3.2.2. Gây bỏng thực nghiệm
- Phương pháp gây bỏng: Theo phƣơng pháp của Halovec và
Pocicado 1961 (có cải tiến).
2.3.2.3.Thay băng chăm sóc vết thƣơng
2.3.2.4. Ghép tấm tế bào lên vết thƣơng
Vùng A – vùng nghiên cứu ghép tấm tế bào (quy định vết thƣơng bên
phải lƣng thỏ), vùng B – vùng đối chứng (chỉ ghép màng Tegaderm đơn thuần).
2.3.2.5. Xét nghiệm hình thái cấu trúc mô vết thƣơng
2.3.2.6. Xét nghiệm vi khuẩn vết bỏng
- Xác định số lƣợng vi khuẩn có trong 1 cm
2
vết bỏng theo công thức:
SLVK/ cm
2
=
(5 N

1
x 10
3
) + (5 N
2
x 10
2
)
2
N
1
: Số lƣợng khuẩn lạc ở đĩa thạch cấy lúp 0,001.
N
2
: Số lƣợng khuẩn lạc ở đĩa thạch cấy lúp 0,01.
5: 5 ml nƣớc muối 0,9%.
2.3.2.7. Các chỉ tiêu theo dõi toàn thân
* Toàn thân
* Cân nặng thỏ
2.3.2.8. Các chỉ tiêu theo dõi tại chỗ vết thƣơng
- Theo dõi hàng ngày diễn biến
- Tính diện tích vết thƣơng
2.3.2.9. Các xét nghiệm huyết học và sinh hoá máu
- Xét nghiệm huyết học
- Xét nghiệm sinh hoá
2.3.2.10. Xác định hoạt độ enzym GOT trong huyết thanh


10
2.3.2.11. Xác định hoạt độ enzym GPT trong huyết thanh

2.4. XỬ LÝ SỐ LIỆU
Các số liệu đựơc tính theo trị giá trung bình (X  SD ) hoặc tỷ lệ % .
Xử lý số liệu trên phần mềm SPSS 16.0 sự khác biệt có ý nghĩa thống kê
khi P<0,05.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. ĐẶC ĐIỂM PHÂN LẬP, NUÔI CẤY BIỆT HÓA TẾ BÀO GỐC
TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN
3.1.1. Đặc điểm phân lập tế bào gốc trung mô dây rốn
3.1.1.1. Kết quả phân lập và hình thái tế bào gốc trung mô dây rốn
Bảng 3.2. Thời gian tế bào tách ra khỏi mẫu mô và đạt 50% che phủ (n=17)
Chỉ tiêu
Trong 7
ngày
Trong 14
ngày
Trong 21
ngày
Trong 28
ngày
Số
mẫu
%
Số
mẫu
%
Số
mẫu
%
Số

mẫu
%
Mọc tế
bào
02
11,7
10
58,8
15
88,2
17
100,0
Tế bào
đạt 50%
00
00
05
29,4
14
82,3
16
94,1

Sau 4 tuần tất cả các mẫu mô đều mọc tế bào.
Theo dõi tế bào mọc ra khỏi mẫu mô nuôi cấy, thu tế bào bằng quy
trình tripsin và cấy chuyển đến P3-P4.

11
3.1.1.2. Khả năng tạo colony của tế bào gốc trung mô dây rốn
Bảng 3.3. Khả năng tạo colony của tế bào gốc trung mô ở P2

Nguồn tế bào
Thời gian (ngày)
Tỷ lệ % số
colony/tế bào
thí nghiệm
Bắt đầu quan sát
thấy colony
Thấy rõ đa số
colony
Mẫu mô 01
04
7
73
Mẫu mô 02
05
8
72
Mẫu mô 03
05
10
77
Mẫu mô 04
04
9
66
Mẫu mô 05
05
7
71

3.1.2. Biểu hiện kháng nguyên hòa hợp tổ chức và tính sinh miễn dịch
của tế bào gốc trung mô dây rốn
3.1.2.1. Đặc điểm biểu hiện HLA-G, HLA-E và HLA-DR của tế bào

Ảnh 3.6. Kháng nguyên HLA-G và HLA-E có trong dịch nghiền tế bào
gốc trung mô màng dây rốn được phát hiện bằng kỹ thuật western blot.
Mức độ biểu hiện HLA-DR trên bề mặt TBGTM màng dây rốn đƣợc
phân tích qua flowcytometry.

12


Biểu đồ 3.2. Kết quả phân tích bằng flowcytometry mức độ biểu hiện HLA-DR
của tế bào gốc trung mô màng dây rốn.
3.1.2.2. Tính sinh miễn dịch của tế bào gốc trung mô dây rốn

Biểu đồ 3.3. Phát hiện kháng thể thỏ kháng tế bào gốc với kháng
nguyên siêu nghiền bằng xét nghiệm ELISA


13

Biểu đồ 3.4. Phát hiện kháng thể thỏ kháng tế bào gốc với kháng
nguyên là tế bào nguyên vẹn
3.1.3. Khả năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô thành nguyên bào sợi
3.1.3.1. Thay đổi về hình thái và dấu ấn tế bào trong quá trình biệt hóa
Bảng 3.4. Tỷ lệ % hình dạng tế bào biệt hóa qua các thế hệ tế bào
Thế hệ tế bào
Hình sao
Hình thoi

Hình sợi
Hình dạng
khác
P5
69,0
19,9
5,9
5,2
P10
35,8
47,8
9,8
0,6
P15
23,4
61,5
15,1
00

Tỷ lệ các tế bào hình thoi và sợi tăng dần theo các thế hệ tế bào khi
nghiên cứu nuôi cấy trong môi trƣờng định hƣớng biệt hóa.


14

Bảng 3.6. Tỷ lệ % hình dạng nhân tế bào biệt hóa
Thế hệ tế bào
Nhân tế bào biệt hóa
Hình tròn
Hình trứng

Đang phân
chia
Nhân quái
P5
70,7
26,2
3,1
00
P10
38,8
58,0
3,4
00
P15
17,4
80,9
1,7
00


3.1.3.2. Khả năng chế tiết collagen và tạo tấm vật liệu tƣơng đƣơng
trung bì của tế bào gốc trung mô
Bảng 3.7. Hàm lượng collagen hòa tan (µg/ml)
Mẫu xét nghiệm
Nhóm tế bào
Nhóm chứng
(TBGTM)
Nhóm nghiên cứu
(NBS biệt hóa)
P

Môi trƣờng nuôi cấy
(n=5)
0,045 ± 0,002
0,046 ± 0,001
>0,05
Dịch nổi nuôi cấy
(n=5)
0,069 ± 0,003
0,297 ± 0,011
<0,01
P
>0,05
<0,001


3.2. HIỆU QUẢ GHÉP TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN
TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG BỎNG NHIỆT THỰC NGHIỆM
3.2.1. Thay đổi một số chỉ số toàn thân và xét nghiệm của thỏ trong
ghép tế bào gốc trung mô




15
Bảng 3.8. Thay đổi các chỉ số huyết học thỏ nghiên cứu
Chỉ số
Thời điểm
D0
D5
D10

Số lƣợng hồng cầu
(x10
12
/L)
5,56  1,67
5,67  1,69
5,84  0,12
Huyết tắc số
(g/L)
120,13  1,44
125,58  2,92
131,1  2,81
Hematocrit (%)
34,41  1,81
37,25  1,56
38,10  2,10
Số lƣợng bạch cầu
(x10
9
/L)
5,26  0,36
8,27  0,72
6,26  0,56
Bạch cầu N (%)
23,05  2,41
19,90  1,67
20,69  2,42
Bạch cầu L (%)
58,24  4,30
62,20  2,26

61,58  2,19

Bảng 3.9. Thay đổi các chỉ số sinh hoá máu liên quan chức năng thận
Chỉ số
Thời điểm
D0
D5
D10
Glucose (mmol/L)
4,79  0,31
4,96  0,35
5,27  0,33
Ure (mmol/L)
5,34  0,47
5,2  0,41
5,10  0,27
Creatinin (mol/L)
93,8  4,86
94,6  5,48
96,04  5,63

3.2.2. Ảnh hƣởng của ghép tế bào gốc trung mô tới liền vết thƣơng
3.2.2.1. Ảnh hƣởng của ghép tế bào gốc trung mô tới diễn biến lâm
sàng tại chỗ vết thƣơng
Bảng 3.12. Thay đổi diện tích vết thương bỏng
Thời điểm
Tỷ lệ % diện tích vết thƣơng đã liền
P
Vùng A (n = 30)
Vùng B (n = 30)

D5
26,53 ± 12,04
25,84 ± 11,40
0,601
D10
77,44 ± 12,24
68,76 ± 11,14
< 0,01
D15
93,23 ± 3,74
87,36 ± 4,78
< 0,001
Ngày thứ 10 và 15, diện tích vết bỏng của vùng A liền nhanh vùng B
rệt hơn (p<0,001).

16
Bảng 3.13. Tốc độ liền vết thương
Thời điểm
Diện tích vết thƣơng thu hẹp
(cm
2
/ngày)
P
Vùng A (n = 30)
Vùng B (n = 30)
Ngày thứ 1 - 5
0,93 ± 0,32
0,90 ± 0,29
0,488
Ngày thứ 5 – 10

1,77 ± 0,74
1,25 ± 0,28
<0,01
Ngày thứ 1 – 10
1,41 ± 0,33
1,28 ± 0,19
<0,01
Ngày thứ 1 - 15
1,12 ± 0,16
1,04 ± 0,13
< 0,01
Tốc độ thu hẹp vết thƣơng giữa vùng A và vùng B trong khoảng thời
gian từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 10 thì sự khác nhau có ý nghĩa thống với
p<0,01.
3.2.2.2. Ảnh hƣởng của ghép tế bào gốc trung mô đến thay đổi hình
thái cấu trúc mô vết thƣơng
Bảng 3.17. Thay đổi số lượng tế bào viêm tại mô vết thương
Thời điểm
Số lƣợng tế bào viêm/ĐVDT
Vùng A (n=30)
Vùng B (n=30)
P
D0
30,16  7,41
31,46  5,98
0,375
D5
18,86  4,46
18,01  5,08
0,475

D10
08,96  1,80
12,50  3,01
0,001

Số lƣợng tế bào viêm cả 2 vùng đều giảm theo tiến trình nghiên cứu.
Tại thời điểm 10 ngày nghiên cứu (15 ngày sau gây bỏng), vùng A có số
lƣợng tế bào viêm thấp hơn so với vùng B và sự khác biệt có ý nghĩa thống
kê (P<0,001).

17
Bảng 3.18. Thay đổi số lượng nguyên bào sợi tại mô vết thương

Thời điểm
Số lƣợng nguyên bào sợi/ĐVDT
Vùng A (n=30)
Vùng B (n=30)
P
D0
13,86  5,40
13,53  03,13
0,714
D5
37,20  8,26
36,56  9,35
0,76
D10
67,10  9,09
52,73  10,38
<0,001

Ngày thứ 10 thấy số lƣợng nguyên bào sợi vùng A tăng hơn vùng B
với p< 0,001.

Bảng 3.19. Thay đổi số lượng tân mạch tại mô vết thương

Thời điểm
Số lƣợng tân mạch/ĐVDT
Vùng A (n=30)
Vùng B (n=30)
P
D5
3,50  1,04
3,67  1,02
0,484
D10
7,23  1,13
4,90  0,95
0,001

Số lƣợng tân mạch ở vùng A tại thời điểm ngày nghiên cứu thứ 10
(ngày thứ 15 sau khi gây bỏng) cao hơn có ý nghĩa thống kê so với vùng B
với p <0,001.
Bảng 3.20. Thay đổi chỉ số phân bào lớp mầm tại mô vết thương
Thời điểm
Chỉ số phân bào (có hiệu chỉnh MI x 100)
Vùng A (n=30)
Vùng B (n=30)
P
D5

1,53  0,50
1,47  0,51
0,189
D10
2,47  0,56
1,86  0,51
0,010

Tại thời điểm ngày nghiên cứu thứ 10, chỉ số phân bào tăng hơn so
với ngày thứ 5, đặc biệt vùng A tăng cao hơn so với vùng B có ý nghĩa
thông kê (p<0,01).

18
3.2.3. Vi khuẩn học vết thƣơng bỏng thực nghiệm
Bảng 3.22. Thay đổi mật độ Số lượng vi khuẩn vết thương
Thời điểm
Số lƣợng vi khuẩn (510
3
/cm
2
)
Vùng A (n = 30)
Vùng B (n = 30)
P
D0
05,67 ± 31,07
9,02 ± 28,40
0,575
D5
16,06 ± 37,15

22,87 ± 42,98
0,108
D10
10,57 ± 27,96
7,22 ± 22,21
0,343
Xét tại vùng A và vùng B thì số lƣợng vi khuẩn tăng cao ở lần 2 (thời
điểm 5 ngày sau khi bắt đầu ghép tế bào) nhƣng sau đó giảm ở lần 3 (ngày
thứ 10 sau khi ghép tế bào).

CHƢƠNG 4
BÀN LUẬN
4.1. ĐẶC ĐIỂM PHÂN LẬP NUÔI CẤY, BIỆT HÓA TẾ BÀO GỐC
TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN
4.1.1. Phân lập tế bào gốc trung mô màng dây rốn
Tế bào gốc trung mô dây rốn có thể dễ dàng thu đƣợc. Do việc sử
dụng chúng không bị các vƣớng mắc về vấn đề đạo đức, dây rốn là sự lựa
chọn tối ƣu cho việc phân lập tế bào gốc trung mô. Hochedlinger và cộng sự
đã xác định OCT-4 cũng có biểu hiện ở các tế bào gốc trung mô dây rốn.
OCT-4 là một gene đặc biệt của tế bào gốc phôi, có vai trò quan trọng trong
việc duy trì tình trạng không biệt hóa của tế bào gốc.
Kết quả của chúng tôi có 15/17 mẫu mô nghiên cứu mọc tế bào ra
khỏi mẩu mô trong 3 tuần sau nuôi cấy mô, đạt tỷ lệ 88,2% và cũng chỉ
cần nuôi cấy trong hai tuần là đã có thể thu hoạch tế bào. Kết quả nghiên

19
cứu các dấu ấn bề mặt tế bào cho thấy tế bào gốc trung mô có biểu hiện
mạnh các dấu ấn CD44, CD29, CD105, và HLA-ABC, nhƣng không có
CD34, HLA-DR, CD31 hoặc CD45
4.1.2. Một số đặc tính của tế bào gốc trung mô dây rốn

4.1.2.1. Khả năng tạo colony của tế bào gốc trung mô dây rốn
Tỷ lệ colony trong tập hợp số tế bào tách ra khỏi mẫu mô đạt cao,
thấp nhất là 66% và cao nhất là 77%. Các mẫu nghiên cứu cho thấy, tế bào
gốc trung mô phát triển tốt và tạo ra số lƣợng lớn các colony (gần 30
colonies) và đƣờng kính của colony cũng đạt hơn 2mm.Nghiên cứu này
chỉ ra rằng tế bào gốc trung mô phân lập đƣợc duy trì khả năng di truyền.
Kích thƣớc colony lớn cũng gợi ý rằng chúng có khả năng tăng sinh và cả
khả năng di cƣ.
4.1.2.2. Tế bào gốc trung mô dây rốn có tính sinh miễn dịch thấp
Đặc điểm kháng nguyên HLA ở tế bào gốc trung mô dây rốn
Kết quả ở biểu đồ 3.2 cho thấy, trên 98% số tế bào thuộc quần thể
TBGTM màng dây rốn thể dƣơng tính với CD90 là một dấu ấn đặc trƣng
của TBGTM. Kết quả phân tích 15 mẫu TBGTM màng dây rốn cho mức
độ biểu hiện của HLA-DR chỉ ở mức 1,95 ± 1,53%.
TBGTM màng dây rốn trẻ sơ sinh bộc lộ các phân tử HLA-G và
HLA-E nhƣng không bộ lộ HLA-DR. Đặc điểm biểu hiện này về HLA có
thể là một phần nguyên nhân tạo nên tính sinh miễn dịch thấp của loại tế
bào gốc này.
Trong nghiên cứu này, tất cả các mẫu huyết thanh thỏ ở các thời điểm
đƣợc khảo sát là D15, D30 và D60 đều có hoạt tính kháng thể kháng
TBGTMMDRN đƣợc cấy ghép, chứng tỏ các tế bào này có tính sinh miễn dịch.

20
4.1.3. Biệt hóa tế bào gốc trung mô dây rốn thành dạng nguyên bào sợi

Trong nghiên cứu này, chúng tôi thu dây rốn trong điều kiện vô trùng
sau đó phân lập tế bào gốc theo phƣơng pháp nuôi cấy bám dính của mô.
Phƣơng pháp này đã đƣợc nhiều tác giả sử dụng để phân lập tế bào gốc
trung mô dây rốn và xác định đặc tính của chúng. Kết quả nghiên cứu
của chúng tôi tập trung vào quan sát các biến đổi hình thái của tế bào

biệt hóa so với tế bào gốc trung mô cả trên kính hiển vi đảo ngƣợc và
cả nhuộm tế bào.
4.2. HIỆU QUẢ GHÉP TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ ĐIỀU TRỊ VẾT
BỎNG THỰC NGHIỆM
4.2.1. Mô hình nghiên cứu ghép tế bào gốc trung mô dây rốn
Trị liệu tế bào đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các bệnh về máu và vết
thƣơng. Kết quả ứng dụng lâm sàng trong nhiều thập kỷ đã khuyến khích
các nhà khoa học tìm hiểu các trị liệu tế bào khác để thay thế các mô tế
bào của hầu hết các cơ quan trong cơ thể. Trong mô hình nghiên cứu thực
nghiệm của chúng tôi là ghép tấm tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn
của ngƣời trên vết thƣơng của động vật là một dạng ghép dị loại.
4.2.2. Tác động của ghép tế bào gốc trung mô trên quá trình liền vết
thƣơng thực nghiệm
Nghiên cứu của chúng tôi sử dụng tế bào có tính gốc tách từ màng
dây rốn có một số đặc tính của tế bào gốc trung mô để ghép trên những vết
thƣơng thực nghiệm sau cắt hoại tử thấy diễn biến quá trình liền vết
thƣơng có những dấu hiệu thuận lợi hơn.
Ở vùng đƣợc ghép tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì thì tốc độ thu hẹp
vết thƣơng diễn ra nhanh hơn trong 10 ngày đầu tiên sau ghép tế bào (bảng
3.9, bảng 3.10).

21
4.2.2.1. Ảnh hƣởng trên quá trình hình thành mô hạt
Ở vùng đƣợc ghép tế bào gốc trung mô, mô hạt cũng hình thành sớm
nhƣng mỏng, vấn đề này thể hiện ở xét nghiệm mô học thấy nguyên bào
sơi và tân mạch tăng dần ở các thời điểm nghiên cứu ngày thứ 5 ghép tế
bào tuy nhiên chỉ tăng nhẹ so với vùng chứng mà không có ý nghĩa thống
kê. Tuy nhiên vào ngày nghiên cứu thứ 10 (D10) thì số lƣợng NBS và tân
mạch vùng nghiên cứu tăng cao hơn so với vùng đối chứng và có ý nghĩa
thống kê với p<0,05 (bảng 3.15, bảng 3.16).

4.2.2.2. Ảnh hƣởng đến quá trình viêm
Kết quả ở nhóm nghiên cứu cho thấy khi ghép tế bào thì phản ứng
viêm ở vết thƣơng đều giảm dần và giảm nhiều hơn so với vùng đối
chứng: ở ngày thứ 5 vết thƣơng tiết dịch ít và quanh vết thƣơng không
viêm nề trong khi đó vùng chứng còn tiết dịch nhiều và bề mặt vết thƣơng
vẫn có giả mạc (bảng 3.8).
4.2.2.3. Ảnh hƣởng đến quá trình biểu mô hoá vết thƣơng
Nghiên cứu này chỉ ra rằng vết thƣơng ghép tấm vật liệu tƣơng
đƣơng trung bỉ làm tăng chỉ số phân bào so với vùng chứng (bảng 3.17).
Kết quả cả sự tăng phân bào tế bào lớp mầm là trên thực tế vết thƣơng
quan sát thấy với vùng ghép tế bào thì vết thƣơng thu hẹp và đƣợc đóng kín
chủ yếu do biểu mô hoá. Kích thƣớc của quầng biểu mô đƣợc tính từ bờ mép
vết thƣơng ban đầu đến sát mép vết thƣơng ở thời điểm 10 ngày đều lớn hơn
so với vết thƣơng vùng chứng.
4.2.2.4. Ảnh hƣởng đến quá trình co rút vết thƣơng
Kết quả nghiên cứu ghép tế bào gốc trung mô màng dây rốn của
chúng tôi cho thấy tế bào gốc trung mô làm tăng nhanh quá trình biểu mô
hoá mà cụ thể là kích thƣớc mép biểu mô lớn hơn và chỉ số phân bào cao

22
hơn so với vùng chứng (bảng 3.17) trong khi đó ở vùng chứng không ghép
tế bào thì hiện tƣợng co rút vết thƣơng diễn ra sớm và mạnh hơn vùng
nghiên cứu.
Tóm lại: Qua phân tích các số liệu nghiên cứu và bàn luận trên đây
có thể đƣa ra nhận định những tác động chính làm liền vết thƣơng ở từng
loại vết thƣơng theo thứ tự sắp xếp nhƣ sau:
Vết thƣơng vùng đối chứng
1. Co kéo mạnh làm hẹp vết thƣơng.
2. Tổ chức hạt bình thƣờng
3. Biểu mô hoá bình thƣờng.

Vết thƣơng ghép tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì
1. Biểu mô hoá tăng nhanh
2. Tổ chức hạt bình thƣờng
3. Co rút vết thƣơng nhẹ
4.2.3. Những ảnh hƣởng bất lợi của ghép tấm vật liệu tƣơng đƣơng
trung bì đến tình trạng toàn thân và nhiễm khuẩn vết thƣơng
4.2.3.1. Ảnh hƣởng trạng thái toàn thân của thỏ nghiên cứu
Kết quả nghiên cứu ghép tấm tế bào gốc trung mô màng dây rốn trên
vết thƣơng bỏng nhiệt thực nghiệm cho thấy diễn tiến của thỏ nghiên cứu
ngày càng tốt lên qua các giai đoạn nghiên cứu. Chỉ riêng các xét nghiệm
bạch cầu cho thấy có sự tăng tƣơng đối trong công thức bạch cầu ở ngày
nghiên cứu thứ 5 và thứ 10 (bảng 3.6). Điều đó cho thấy có thế cơ thể đang
bắt đầu phản ứng miễn dịch trƣớc kháng nguyên là các tế bào và các sản
phẩm do tế bào đƣợc ghép giải phóng ra.
Các tế bào gốc trung mô màng dây rốn khi đƣợc ghép dị loài vào
vết bỏng có kích thích thỏ sinh kháng thể kháng tế bào gốc trung mô
màng dây rốn. Hoạt tính kháng thể không mạnh và giảm nhanh sau khi

23
ngừng cấy ghép tế bào.
4.2.3.2. Ảnh hƣởng đến nhiễm khuẩn vết thƣơng
Nghiên cứu cho thấy: hầu hết các mẫu cấy khuẩn dƣơng tính đều ở
mật độ thấp dƣới 10
5
/cm
2
(bảng 3.19) nên theo chúng tôi việc ghép tế bào
không làm tăng tình trạng nhiễm trùng vết thƣơng và tình trạng ô nhiễm
vết thƣơng vùng cấy ghép tế bào cũng không gây bất lợi cho thỏ nghiên
cứu đặc biệt là bất lợi cho diễn biến của quá trình liền vết thƣơng. Do đó

theo chúng tôi, các kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của ghép tấm tế bào tới
quá trình liền vết thƣơng chỉ do chính các tế bào đƣợc ghép lên vết thƣơng
quyết định.

KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn để điều
trị vết thƣơng bỏng thực nghiệm chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
1. Một số đặc điểm phân lập nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc trung mô
màng dây rốn.
- Tế bào phân lập từ màng dây rốn mọc đơn lớp trong điều kiện nuôi
cấy in vitro và có khả năng tạo cụm. Cụm của tế bào gốc trung mô ở dạng
CFU-F (Collony Forming Unit – Fibroblast).
- Tế bào gốc trung mô dây rốn có đặc tính sinh miễn dịch thấp. Các
tế bào có bộc lộ các phân tử HLA-G và HLA-E nhƣng không bộ lộ rõ
HLA-DR.
- Kháng thể đặc hiệu kháng tế bào gốc trung mô màng dây rốn ở thỏ
đƣợc ghép thấp và giảm dần từ ngày thứ 30 sau ghép.
- Tế bào gốc trung mô dây rốn có thể cảm ứng để biệt hóa thành
nguyên bào sợi trong môi trƣờng định hƣớng in vitro

24
2. Ghép tế bào gốc trung mô màng dây rốn trên mô hình vết thƣơng
bỏng là an toàn và có tác dụng tích cực trong điều trị vết thƣơng
- Quá trình biểu mô hóa tại vết thƣơng ghép tấm tế bào gốc trung mô
màng dây rốn có tác dụng thúc đẩy nhanh quá trình liền vết thƣơng.
- Mật độ nguyên bào sơn, tân mạch và chỉ số phân bào vùng nghiên
cứu tăng cao hơn so với vùng đối chứng.
- Tình trạng viêm ở vết thƣơng giảm nhẹ dần từ ngày nghiên cứu thứ
5 đến ngày nghiên cứu thứ 10.
- Ghép tấm tế bào gốc trung mô màng dây rốn vật liệu tƣơng

đƣơng trung bì không làm tăng tình trạng nhiễm khuẫn vết thƣơng tại
các thời điểm nghiên cứu.

KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu với vùng đối chứng đƣợc điều trị bằng phác đồ
sinh học khác nhƣ: ghép da, ghép tế bào sừng, nguyên bào sợi để so sánh
với hiệu quả ghép tế bào gốc trung mô màng dây rốn.
Tiếp tục nghiên cứu hóa mô miễn dịch để làm rõ hơn cơ chế thúc
đẩy quá trình liền vết thƣơng tại vùng nghiên cứu và vùng đối chứng.