Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn sinh polyhydroxyalkanoate (PHA) phân lập từ rơm rạ mục

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN





NGUYỄN THỊ NGỌC


















NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN
SINH POLYHYDROXYALKANOATE (PHA) PHÂN LẬP TỪ RƠM
RẠ MỤC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật học






HÀ NỘI, 2014




TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN




NGUYỄN THỊ NGỌC

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN
SINH POLYHYDROXYALKANOATE (PHA) PHÂN LẬP TỪ RƠM
RẠ MỤC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật học



Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
TS. ĐOÀN VĂN THƢỢC




`HÀ NỘI, 2014



LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành gửi lời cảm
ơn đến thầy giáo TS. Đoàn Văn Thƣợc - giảng viên Bộ môn Công nghệ
Sinh học - Vi sinh, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội - ngƣời
đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình nghiên cứu và
hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin gửi tới cô giáo PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung lời cảm ơn chân

thành và sâu sắc! Cảm ơn cô đã truyền niềm đam mê và tạo cho tôi cơ hội đến
với chuyên ngành này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị và các bạn
trong bộ môn Công nghệ Sinh học - Vi sinh, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học
Sƣ phạm Hà Nội, đặc biệt là thầy giáo Ths. Trần Hữu Phong, bạn Mùi, bạn
Phƣơng đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và
hoàn thành khóa luận.
Con cảm ơn bố mẹ, anh trai vì đã luôn yêu thƣơng con và cho con cơ
hội để học bao điều hay trong cuộc sống…
Cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời
gian qua.
Tôi xin trân trọng cảm ơn !


Sinh viên

Nguyễn Thị Ngọc










LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết

quả nghiên cứu, số liệu đƣợc trình bày trong khóa luận là trung thực và không
trùng với tác giả khác.

Sinh viên


Nguyễn Thị Ngọc





DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Công thức tổng quát của polyhydroxyalkanoate (PHA) với
R là hydro hoặc nhóm ankyl (C
1
- C
13
), x = 1 - 4 và n = 100 -
30.000 9
Hình 1.2. Sơ đồ tổng quát quá trình sinh tổng hợp PHA ở vi khuẩn 10
Hình 1.3. Ba bƣớc của con đƣờng sinh tổng hợp PHB. Một promoter
nằm trƣớc gen phbC đóng vai trò khởi động quá trình sinh
tổng hợp 12
Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc hạt PHA 12
Hình 3.1. Khả năng sinh sinh khối và tích lũy PHBV trong các chủng
vi khuẩn 28
Hình 3.2. Khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn tuyển chọn trên môi
trƣờng MT2 đặc 29

Hình 3.3. Ảnh chụp qua kính hiển quang học cho thấy hình thái tế
bào và hạt PHA tích lũy trong tế bào vi khuẩn 30
Hình 3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đế sự sinh trƣởng của chủng V
63
31
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đế sự sinh trƣởng của chủng V
182
31
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của pH đến sự sinh trƣởng của chủng V
63
32
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của pH đến sự sinh trƣởng của chủng V
182
33
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của các nguồn cacbon đến sự sinh trƣởng và
tích lũy hạt PHA của chủng vi khuẩn V
63
34
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của các nguồn cacbon đến sự sinh trƣởng và
tích lũy hạt PHA của chủng vi khuẩn V
182
34
Hình 3.10. Động thái sinh trƣởng và khả năng tích lũy PHA của
chủng vi khuẩn V
63
36
Hình 3.11. Động thái sinh trƣởng và khả năng tích lũy PHA của
chủng vi khuẩn V
182
36

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Khu vực phân bố và nguồn rơm rạ ở Việt Nam 4
Bảng 1.2. Thành phần hóa học của rơm rạ 5
Bảng 1.3. Hàm lƣợng một số chất có trong rơm rạ 5
Bảng 1.4. Ứng dụng rơm rạ trong nông nghiệp 6
Bảng 1.5. Ứng dụng rơm rạ trong lĩnh vực hóa chất 7
Bảng 1.6. Tên gọi của một số PHA tƣơng ứng với nhóm R và x 9
Bảng 1.7. Bốn nhóm enzyme PHA synthase 11
Bảng 1.8. So sánh tính chất vật lý của một số dạng PHA với
polypropylene 14
Bảng 1.9. Các công ty thƣơng mại tham gia nghiên cứu, sản xuất và
ứng dụng PHA 16
Bảng 2.1. Công thức của các loại môi trƣờng sử dụng trong nghiên cứu 19
Bảng 3.1. Các chủng vi khuẩn thu đƣợc qua 5 lần phân lập 26
Bảng 3.2. Các chủng vi khuẩn tuyển chọn bằng sử dụng thuốc nhuộm
Nile blue A và quan sát dƣới kính hiển vi quang học 27

CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN

CDW (cell dry weight)
: Khối lƣợng tế bào khô
Cs
: Cộng sự
HA
: Hydroxyalkanoate -Đơn phân cấu tạo nên PHA
mcl (medium-chain-length)
: Mạch trung bình
OD (Optical Density)
: Mật độ quang
PHA
: Polyhydroxyalkanoate
PhaC
: PHA synthase
PhaP
: Phasin protein
PhaR
: Protein điều hòa quá trình sinh tổng hợp PHA
PhaZ
: PHA depolymerase
PHB (hay P(3HB))
: Poly(3-hydroxybutyrate)
phbA
: Gen quy định enzyme β-ketoacyl-CoA thiolase
phbB
: Gen quy định enzyme acetoacetyl-CoA
reductase
phbC

: Gen quy định enzyme PHB polymerase
P(3HB-co-3HV)
(hay PHBHV)
: Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)
PHV (hay P(3HV))
: Poly(3-hydroxyvalerate)
PLA
: Polylactic acid
scl (short-chain-length)
: Mạch ngắn
UV (Untraviolet)
: Tia tử ngoại
wt% (weight percent)
: Phần trăm khối lƣợng
%, w/v
: Phần trăm khối lƣợng trên thể tích





MỤC LỤC

MỞ ĐẦU …………………………………………………………………….1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Giới thiệu về rơm rạ và hệ vi sinh vật trong rơm rạ 4
1.1.1. Nguồn rơm rạ ở Việt Nam 4
1.1.2. Thành phần chính của rơm rạ 5
1.1.3. Ứng dụng của rơm rạ ở thế giới và ở Việt Nam 6
1.1.4. Hệ vi sinh vật trong rơm rạ 7

1.2. Polymer sinh học 7
1.2.1. Các dạng polymer sinh học chủ yếu 7
1.2.2. Polyhydroxyalkanoate (PHA) 8
1.2.2.1. Sinh tổng hợp PHA trong tế bào vi khuẩn 9
1.2.2.2. Phân loại và tính chất của PHA 13
1.2.3. Tình hình nghiên cứu, ứng dụng polymer sinh học trên thế giới
và ở Việt Nam 15
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 19
2.2. Vật liệu nghiên cứu 19
2.2.1. Hóa chất 19
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị 20
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 20
2.3.1. Phƣơng pháp thu mẫu 20
2.3.2. Phƣơng pháp phân lập 20
2.3.3. Phƣơng pháp giữ giống vi khuẩn 21
2.3.3.1. Phƣơng pháp cấy truyền định kỳ 21
2.3.3.2. Phƣơng pháp lạnh đông bằng 15% glycerol 21

2.3.3.3. Phƣơng pháp đông khô 21
2.3.4. Phƣơng pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn có tích lũy PHA
bằng thuốc nhuộm Nile blue A và quan sát dƣới kính hiển vi
điện tử để phát hiện các hạt dự trữ 21
2.3.5. Phƣơng pháp lên men thu sinh khối của tế bào khô 22
2.3.6. Phƣơng pháp sắc kí khí, phân tích hàm lƣợng PHA tích lũy trong
tế bào vi khuẩn 22
2.3.7. Phƣơng pháp mô tả hình thái khuẩn lạc, tế bào vi khuẩn 24
2.3.8. Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng của các yếu tố dinh dƣỡng
và điều kiện môi trƣờng đến khả năng sinh trƣởng, phát triển
của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 24

2.3.8.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự sinh trƣởng, phát triển của các
chủng vi khuẩn tuyển chọn 24
2.3.8.2. Hoạt hóa chủng nghiên cứu 24
2.3.8.3. Ảnh hƣởng của pH đến sự sinh trƣởng, phát triển của các
chủng vi khuẩn tuyển chọn. 24
2.3.8.4. Ảnh hƣởng nguồn cacbon đến sự sinh trƣởng, phát triển và
tích lũy PHA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 25
2.3.8.5. Động thái sinh trƣởng và hàm lƣợng PHA tích lũy trong tế bào
các chủng vi khuẩn tuyển chọn ở các thời điểm khác nhau 25
2.3.9. Phƣơng pháp thống kê toán học trong xử lý số liệu 25
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26
3.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sinh PHA từ rơm rạ mục 26
3.2. Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn
tuyển chọn 29
3.2.1. Hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn tuyển chọn….………….29
3.2.2. Hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn tuyển chọn… …… ………29

3.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trƣởng, phát triển của
các chủng vi khuẩn tuyển chọn 30
3.4. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng sinh trƣởng, phát triển của các
chủng vi khuẩn tuyển chọn 32
3.5. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trƣởng, phát
triển và tích lũy PHA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 33
3.6. Động thái sinh trƣởng, phát triển và tích lũy PHA của các chủng
vi khuẩn tuyển chọn 35
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO 39
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Ngọc 1 K36B - Sinh

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Sự phát triển của nhân loại đang phụ thuộc khá lớn vào các nguồn
nguyên liệu hóa thạch. Tuy nhiên các nguồn nguyên liệu hóa thạch chỉ phân
bố ở một số vùng trên thế giới và đang ngày càng cạn kiệt. Để đảm bảo cho
sự phát triền bền vững của nhân loại trong tƣơng lai chúng ta phải tìm kiếm
các nguồn nguyên liệu mới thay thế nguồn nguyên liệu hóa thạch. Bên cạnh
đó một lý do khác thúc đẩy các nhà khoa học tìm kiếm nguồn nguyên liệu
mới đó là sự ô nhiễm môi trƣờng do sử dụng các nguồn nguyên liệu hóa
thạch. Một ví dụ điển hình là việc sử dụng các loại plastic không phân hủy
sinh học. Lƣợng plastic tiêu thụ trên toàn thế giới hiện nay là khoảng hơn 250
triệu tấn, lƣợng tiêu thụ này tăng lên khoảng 5% một năm, các plastic sử dụng
hiện nay có nguồn gốc chủ yếu từ dầu mỏ [31]. Các loại plastic hay polymer
có nguồn gốc từ dầu mỏ ví dụ nhƣ polyethylene, polypropylene, và
polyvinylchloride đang đƣợc sử dụng rất rộng rãi vì có giá thành thấp. Tuy
nhiên những vật liệu này không có khả năng phân hủy sinh học, chính bởi vậy
nó là nguyên nhân gây hiện tƣợng ô nhiễm môi trƣờng. Ngƣời ta thống kê
đƣợc rằng có khoảng 40% lƣợng plastic tiêu thụ sẽ tích lũy trong đất sau khi
sử dụng và có hàng trăm nghìn tấn đƣợc vứt bỏ vào môi trƣờng biển, tích lũy
trong các đại dƣơng [21].
Theo thống kê sơ bộ của Bộ Tài nguyên và Môi trƣờng, trung bình
một ngày, một ngƣời tiêu dùng phải sử dụng ít nhất một chiếc túi nylon. Vậy
với dân số hơn 80 triệu ngƣời, mỗi ngày nƣớc ta phải tiêu thụ hơn 80 triệu túi
nylon và con số này ngày càng tăng theo đà tăng dân số. Song song với điều
đó, số lƣợng rác thải cũng tăng lên không ngừng. Đây là một thách thức lớn
cho môi trƣờng bởi vì phải mất một khoảng thời gian rất dài những túi nylon
này mới có thể phân hủy đƣợc, có thể là 500 năm hoặc lâu hơn.
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Ngọc 2 K36B - Sinh

Nghiên cứu để tìm ra một loại vật liệu mới, có khả năng phân hủy mà
không gây hậu quả cho môi trƣờng và giá thành chấp nhận đƣợc là nhiệm vụ
hàng đầu của các nhà khoa học. Polyme có khả năng phân hủy sinh học là
một trong nhiều loại vật liệu lý tƣởng có thể thay thế các polyme truyền thống
nhƣng vẫn đảm bảo các tính năng cơ lý của polyme truyền thống. Một số
polymer sinh học có những tính chất vật lý, hóa học gần giống các polymer có
nguồn gốc từ dầu mỏ đang sử dụng hiện nay, nhƣng nổi bật hơn ở khả năng
phân hủy sinh học (biodegradable). Chính nhờ khả năng này mà các sản phẩm
đƣợc chế tạo từ polymer sinh học sau khi qua sử dụng có thể phân hủy hoàn
toàn thành CO
2
và CH
4
, hoặc CO
2
và H
2
O… trong thời gian ngắn. Các dạng
chính của polymer sinh học bao gồm: polylactic acid (PLA),
polyhydroxyalkanoate (PHA), dẫn xuất cellulose, những plastic có nguồn gốc
từ tinh bột [31]. Trong đó PLA và PHA là 2 dạng polymer có khả năng tự
phân hủy triệt để, đang đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều.
PHA là polymer phân hủy sinh học đƣợc sinh tổng hợp một cách tự
nhiên bởi quá trình lên men đƣờng và các hợp chất cacbon-hydrate nhờ các vi
sinh vật. PHA rất đa dạng về mặt cấu tạo, có hơn 100 loại monomer khác
nhau tham gia cấu tạo PHA, vì vậy chúng có những đặc tính lý hóa đa dạng
tƣơng tự nhƣ polymer đƣợc tổng hợp từ dầu mỏ [19]. Điểm khác biệt là
chúng có khả năng phân hủy sinh học. Chính vì vậy PHA đƣợc coi là loại vật
liệu lý tƣởng nhằm thay thế các polymer hóa dầu hiện nay [17, 21].
Ở Việt Nam, polymer sinh học vẫn còn là lĩnh vực khá mới mẻ, nên

mới chỉ đƣợc nghiên cứu trong khoảng 10 năm trở lại đây. Hƣớng nghiên cứu
chủ yếu hiện nay là phối trộn tinh bột với một số hợp chất khác để tạo ra các
polymer sinh học.
Việt Nam - một nƣớc xuất khẩu gạo lớn thứ 2 thế giới, nên rơm rạ -
sản phẩm phụ của nông nghiệp có số lƣợng rất lớn. Rơm rạ hoại mục có chứa
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Ngọc 3 K36B - Sinh
lƣợng cacbon dồi dào là điều kiện tƣơng đối thuận lợi cho vi sinh vật tích lũy
PHA phát triển. Tuy nhiên chƣa có một nghiên cứu nào về vi sinh vật sản xuất
PHA phân lập từ rơm rạ ở Việt Nam. Xuất phát từ lí do trên chúng tôi thực
hiện đề tài “Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn sinh
polyhydroxyalkanoate (PHA) phân lập từ rơm rạ mục”.
2. Mục đích nghiên cứu
Phân lập đƣợc chủng vi khuẩn sinh PHA từ rơm rạ, nghiên cứu một số
đặc tính sinh học và khả năng tích lũy PHA của chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Nghiên cứu này là tiền đề để định hƣớng ứng dụng chuyển hóa rơm rạ thành
nhựa sinh học.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh PHA từ rơm rạ mục.
3.2. Nghiên cứu đặc điểm khuẩn lạc và hình thái của chủng vi khuẩn
tuyển chọn.
3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trƣởng, phát
triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của độ pH đến khả năng sinh trƣởng, phát
triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
3.5. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh
trƣởng, phát triển và tích lũy PHA của các chủng tuyển chọn.
3.6. Động thái sinh trƣởng, phát triển và tích lũy PHA của chủng tuyển
chọn.

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
4.1. 
Nghiên cứu đi sâu vào tìm hiểu các chủng vi khuẩn có khả năng sinh
PHA và đặc tính sinh học của chúng.
4.2. 
Đƣa ra ứng dụng chuyển hóa rơm rạ thành nhựa sinh học.
5. Điểm mới của đề tài
Tìm ra đƣợc chủng vi khuẩn sinh polyhydroxyalkanoate từ rơm rạ mục
tối ƣu nhất.
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Ngọc 4 K36B - Sinh
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về rơm rạ và hệ vi sinh vật trong rơm rạ
1.1.1. Nguồn rơm rạ ở Việt Nam
Cây lúa luôn giữ vị trí trung tâm trong nông nghiệp và kinh tế Việt
Nam. Đặc biệt hai vựa thóc lớn là Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) và
Đồng bằng sông Hồng (ĐBSH). Khoảng 80% trong tổng số 11 triệu hộ nông
dân tham gia sản xuất lúa gạo. Việc sản xuất lúa gạo đã tạo ra một lƣợng lớn
phụ phẩm từ cây lúa - rơm rạ.
Bảng 1.1. Khu vực phân bố và nguồn rơm rạ ở Việt Nam [12]

Khu vực
Tổng
diện tích
(10
3
ha)

Khu vực
trồng
lúa
( 10
3
ha)
Sản
lƣợng
lúa gạo
(10
3
tấn)
Sản lƣợng
rơm rạ
(khô 10
3

tấn/năm)
Đồng bằng sông Hồng
2106.3
1155.4
6796.3
8665.3
Trung du và miền núi
phía Bắc
9533.7
669.9
3047.1
3885.1
Ven biển Bắc Trung Bộ và

miền Trung
9588.6
1221.6
6252.0
7971.3
Tây Nguyên
5464.1
213.6
994.3
1267.7
Phía Đông Nam
2360.5
306.7
1322.4
1686.1
Đồng bằng sông Cửu Long
4051.9
3872.9
20483.4
26116.3
Cả nƣớc
33105.1
7440.1
38895.5
49591.8

Thu hoạch 1kg hạt lúa thì sẽ thu đƣợc tƣơng ứng 1 - 1,5 kg rơm. Ƣớc
tính khoảng 5 triệu tấn rơm rạ đƣợc sản xuất mỗi năm ở nƣớc ta. Với sự gia
tăng sản lƣợng lúa gạo và đẩy mạnh trồng trọt, việc quản lý các sản phẩm phụ
của cây lúa đang trở thành một vấn đề nhƣng cũng có thể mở ra một cơ hội.

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Ngọc 5 K36B - Sinh
Trong các hệ thống trồng lúa truyền thống, rơm rạ thƣờng đƣợc chuyển dời ra
khỏi các cánh đồng khi thu hoạch lúa và ngƣời dân thƣờng đem về nhà đánh
đống để đun nấu hoặc làm thức ăn cho gia súc. Tuy nhiên trong thời gian gần
đây do lƣợng rơm rạ quá lớn đồng thời do nhu cầu sử dụng làm thức ăn cho
gia súc hay đun nấu giảm nên ngƣời dân thƣờng đốt ngay ngoài đồng ruộng
gây lãng phí và ô nhiễm môi trƣờng [30].
1.1.2. Thành phần chính của rơm rạ
Tại thời điểm thu hoạch, hàm lƣợng ẩm của rơm rạ thƣờng cao tới
60%, tuy nhiên trong điều kiện thời tiết khô hanh rơm rạ có thể trở nên khô
nhanh đạt đến trạng thái độ ẩm cân bằng vào khoảng 10 - 12%. Rơm rạ, có
hàm lƣợng tro cao và lƣợng protein thấp [30]. Trong rơm rạ chứa một lƣợng
lớn các chất hóa học và cacbon-hydrate thể hiện trong bảng 1.2. và bảng 1.3.
[22].
Bảng 1.2. Thành phần hóa học của rơm rạ
Các chất hóa học
Rơm rạ (%)
Cellulose
32 - 47
Hemicelluose
19 - 27
Ligin
5 - 24
Protein
-
Tro
12.4

Bảng 1.3. Hàm lƣợng một số chất có trong rơm rạ
Cacbon-hydrate
Rơm rạ (%)
Glucose
41 – 43.4
Xylose
14.8 – 20.2
Mannose
1.8
Galactose
0.4
Arabinose
2.7 – 4.5
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Ngọc 6 K36B - Sinh
1.1.3. Ứng dụng của rơm rạ ở thế giới và ở Việt Nam
Theo các dữ liệu thu thập đƣợc, cách sử dụng sản phẩm phụ rơm rạ
theo truyền thống chủ yếu bao gồm sử dụng để làm củi đốt, làm vật liệu xây
dựng, nuôi gia súc và trồng nấm.
Ngoài ra, rơm rạ còn có thể tận dụng trong nhiều lĩnh vực ứng dụng
khác nhau, ví dụ nhƣ trong ngành hóa chất rơm rạ đƣợc sử dụng làm nguyên
liệu thô để sản xuất các sản phẩm hóa chất. Trong lĩnh vực công nghiệp và
xây dựng, rơm rạ có thể tận dụng cho một loạt các ứng dụng nhƣ làm các vật
liệu xây dựng nhƣ tấm lớp nhà, cách nhiệt, panen tƣờng hay làm giấy… (bảng
1.4. và bảng 1.5.). Đặc biệt phải kể đến nhũng ứng dụng quan trọng nhƣ: sản
xuất năng lƣợng, khí hóa để sản xuất năng lƣợng, chuyển hóa thành đƣờng để
dùng trong công nghệ lên men [30].
Bảng 1.4. Ứng dụng rơm rạ trong nông nghiệp
Phủ đất

Phủ một lớp vật liệu chết (không hoạt động) lên bề
mặt đất.
Phân ủ
Quá trình phân giải để khôi phục một phần các chất
dinh dƣỡng và thành phần hữu cơ.
Lót ổ cho gia súc
Phổ biến trong chăn nuôi gia súc.
Chất nền trong
trồng trọt
Các khối kiến rơm rạ có thể sử dụng trong sản xuất
nhiều loại cây trồng, dƣa chuột, cà chua,….
Chống sƣơng giá
Thƣờng đƣợc ứng dụng kết hợp với phƣơng pháp phủ
đất và phân ủ trong khí hậu giá rét.
Nuôi giun
Sử dụng làm phƣơng tiện nuôi giun.
Gieo hạt trong
nƣớc
Rơm rạ nghiềm sợi đƣợc sử dụng trong gieo hạt nƣớc
- một quy trình gieo trồng dọc theo các bờ dốc đứng
nhằm chống sói mòn.
Trồng cây cảnh
Rơm thô hoặc nghiền đều có thể sử dụng trong nghề
trồng cây cảnh.
Làm ổ gia cầm
Ổ gia cầm bằng rơm có thể sử dụng trong hệ thống ổ
ráp nối.
Trộn bùn thải
Làm vật mang trong ủ và phân hủy bùn cống.
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Ngọc 7 K36B - Sinh
Bảng 1.5. Ứng dụng rơm rạ trong lĩnh vực hóa chất
Quy trình xử lý
Sản phẩm
Thủy phân
Pentose, glucose và lignin, các thành
phần tan trong nƣớc
Các quá trình nhiệt phân
Khí tổng hợp
Xử lý kết hợp
Tấm xơ ép và alcohol
Hòa tan xenluloza nhớt
Sợi nhân tạo tổng hợp
Linhin bột
Chất keo dán
Thủy phân axit - lên men
Glucose, cellobiose hay xylose
Lên men vi sinh
Protein đơn bào
Quá trình Gulf đƣờng hóa song song
và lên men (SSF)
Sản xuất ethanol

1.1.4. Hệ vi sinh vật trong rơm rạ
Hệ vi sinh vật trong rơm rạ rất phong phú và đa dạng, trong đó có rất
nhiều vi sinh vật có lợi. Những năm gần đây các nhà khoa học phân lập và lƣu
giữ đƣợc nhiều loài rất có ý nghĩa, ví dụ nhƣ Cytophaga, Cellulomonas, chi
Bacillus, chi Clostridium, Aspergillus và Penicillium… có khả năng sinh các
enzyme ngoại bào có hoạt tính cao nhƣ cellulase, xylanase… [9]. Đặc biệt,

với nguồn cacbon dồi dào là điều kiện rất tốt cho vi khuẩn sinh PHA sinh
trƣởng phát triển - tiềm năng tìm ra vi khuẩn sinh PHA từ rơm rạ hoại mục là
rất lớn.
1.2. Polymer sinh học
1.2.1. Các dạng polymer sinh học chủ yếu
Polymer sinh học là loại polymer có nguồn gốc từ các sinh vật (chủ yếu
là từ vi khuẩn, vi sinh vật cổ và thực vật), có khả năng phân hủy bởi nhiều
sinh vật trong tự nhiên. Nhờ khả năng này mà các sản phẩm đƣợc chế tạo từ
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Ngọc 8 K36B - Sinh
polymer sinh học sau khi qua sử dụng có thể phân hủy hoàn toàn thành CO
2
,
CH
4
, H
2
O… trong thời gian ngắn, do đó hầu nhƣ không gây ô nhiễm môi
trƣờng. Sự khác biệt trong cấu trúc giữa polymer có nguồn gốc từ dầu mỏ với
polymer sinh học nằm ở các nguyên tố tham gia cấu tạo. Polymer sinh học có
chứa các nhóm chức dễ dàng tham gia vào các phản ứng oxi hóa khử trong
điều kiện môi trƣờng tự nhiên để rồi với sự tác động của các nhóm vi khuẩn,
chúng tan rã theo thời gian. Trong khi đó, đa số các polymer có nguồn gốc từ
dầu mỏ chỉ có nhóm CH, ít có oxi (các loại nhựa truyền thống nhƣ PE, PP,
PVC hoàn toàn không có oxi) nên khó tham gia vào các phản ứng oxi hóa
khử. Một số polymer có chứa nguyên tố oxi nhƣ polystyrol (PS) thì lại có cấu
trúc có vòng benzene nên các vi sinh vật cũng rất khó phân hủy chúng. Do
thời gian phân hủy rất dài (khoảng 450 năm) nên sau khi sử dụng nếu không
đƣợc tái chế các polymer hóa dầu sẽ tích tụ trong đất, nƣớc gây ô nhiễm môi

trƣờng. Bởi vậy một trong những giải pháp cho vấn đề này là phát triển và sử
dụng các polymer sinh học.
Các dạng chính của polymer sinh học bao gồm: polylactic acid (PLA),
polyhydroxyalkanoate (PHA), dẫn xuất cellulose và những plastic có nguồn
gốc từ tinh bột [31]. Trong đó PLA và PHA là 2 dạng polymer có khả năng tự
phân hủy triệt để, đang đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều.
1.2.2. Polyhydroxyalkanoate (PHA)
PHA là polyester của các hydroxyalkanoate (HA) (hình 1.1), chúng
đƣợc tích lũy trong tế bào nhƣ là nguồn dự trữ cacbon và năng lƣợng bởi rất
nhiều vi sinh vật, thƣờng là trong điều kiện thiếu một vài chất dinh dƣỡng
thiết yếu nhƣ oxy, nito, photphat, lƣu huỳnh, mangan và dƣ thừa cacbon [27].
PHA là polymer của khoảng 10
3
đến 10
4
monomer, chúng tồn tại dƣới dạng
các hạt riêng biệt trong tế bào. Có khoảng 5 - 13 hạt PHA trong một tế bào,
kích thƣớc hạt từ 0.2 đến 0.5 µm [27]. Sau khi tách chiết ra khỏi tế bào, các
PHA thể hiện các tính chất đặc trƣng nhƣ không độc hại, không tan trong
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Ngọc 9 K36B - Sinh
Hình 1.1. Công thức tổng quát của polyhydroxyalkanoate (PHA) với R
là hydro hoặc nhóm ankyl (C
1
- C
13
), x = 1 - 4 và n = 100 - 30.000
nƣớc, tƣơng thích sinh học cao, có khả năng tự phân hủy, là những nhựa ƣa
nhiệt có thể tái sử dụng.

Bảng 1.6. Tên gọi của một số PHA tƣơng ứng với nhóm R và x
Nhóm R
X
Tên đầy đủ của PHA
Tên viết tắt
H
CH
3
CH
2
CH
3
CH
2
CH
2
CH
3
H
CH
3
1
1

1
1
2
2
Poly(3-hydroxypropionate)
Poly(3-hydroxybutyrate)
Poly(3-hydroxyvalerate)
Poly(3-hydroxyhecxanoate)
Poly(4-hydroxybutyrate)
Poly(4-hydroxyvalerate)
P(3HP)
P(3HB)
P(3HV)
P(3HHx)
P(4HB)
P(4HV)

Từ khi poly ( 3-hydroxybutyrate) (PHB, P (3HV)) đƣợc tìm ra vào năm
1926, cho đến nay đã có hơn 150 loại PHA (Bảng 1.6) đƣợc phân lập từ hơn
300 vi khuẩn [27].

Tích lũy PHA là cách thức tự nhiên mà vi khuẩn sử dụng để dự trữ
cacbon và năng lƣợng khi hàm lƣợng các nguyên tố dinh dƣỡng trong môi
trƣờng sống mất cân bằng. Việc polymer hóa các phân tử chất tan thành các hạt
PHA (không hòa tan) không làm thay đổi áp suất thẩm thấu của tế bào, ngƣợc
lại, điều này giúp ngăn cản sự thất thoát của các hợp chất có giá trị, chúng sẽ
đƣợc dự trữ để duy trì sự ổn định của tế bào [18]. Con đƣờng sinh tổng hợp
PHA từ các nguồn cacbon khác nhau có thể đƣợc tóm tắt trong hình 1.2. [27].
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Ngọc 10 K36B - Sinh
Màng tế bào









Hình 1.2. Sơ đồ tổng quát quá trình sinh tổng hợp
PHA ở vi khuẩn
Đầu tiên nguồn cacbon đƣợc đƣa vào tế bào chất bằng cách khuếch tán
hoặc qua những kênh vận chuyển chủ động. Nguồn cacbon sau đó đƣợc biến
đổi thành một dạng (R)-hydroxyacylcoA thioester (cơ chất cho quá trình tổng
hợp PHA) nhờ các phản ứng đồng hóa hoặc dị hóa hoặc cả hai. Cuối cùng,
PHA synthase - enzyme chìa khóa của quá trình tổng hợp PHA sẽ sử dụng các
phân tử (R)-hydroxyacylcoA thioester làm cơ chất để tổng hợp PHA, kèm
theo đó là sự giải phóng các phân tử coemzyme A [27].
Căn cứ vào cấu tạo enzyme và nguồn cơ chất đặc trƣng mà enzyme này
tác động, PHA synthase đƣợc chia thành 4 nhóm (bảng 1.7). PHA synthase
nhóm I và nhóm II chỉ đƣợc cấu tạo từ 1 tiểu phần protein (PhaC). Các PHA
synthase nhóm I sử dụng CoA thioester của các phân tử 3-HA, 4-HA và 5-HA
có từ 3-5 nguyên tử cacbon làm nguồn cơ chất để tổng hợp nên phân tử PHA
mạch ngắn (scl-PHA). Trong khi đó, các PHA synthase nhóm II sử dụng CoA
thioester của các phân tử 3-HA có từ 6-14 nguyên tử cacbon để tổng hợp nên
phân tử PHA mạch trung bình (mcl-PHA). PHA synthase nhóm III đƣợc cấu
tạo từ hai tiểu phẩn protein (PhaC và PhaE), sử dụng nguồn cơ chất gần giống
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Ngọc 11 K36B - Sinh
PHA synthase nhóm I, ngoài ra chúng còn có thể polymer hóa các phân tử 3-
HA có từ 6 - 8 nguyên tử cacbon. PHA synthase nhóm IV cũng đƣợc cấu tạo
từ hai tiểu phần protein (PhaC và PhaR), chúng sử dụng các phân tử 3-HA có
từ 3-5 nguyên tử cacbon làm nguồn cơ chất cho quá trình sinh tổng hợp [27].
Bảng 1.7. Bốn nhóm enzyme PHA synthase
Loại PHA đầu tiên đƣợc các nhà khoa học phát hiện và cũng là loại PHA
đƣợc nghiên cứu chi tiết nhất cho đến thời điểm hiện tại chính là poly(3-
hydroxybutyrate) (PHB) [28]. Những nghiên cứu trên loài Cupriavidus necator
cho thấy quá trình sinh tổng hợp PHB chịu sự chi phối của 3 gen, đƣợc điều hòa
hoạt động bởi cùng một operon có tên là operon phbCAB. 3 gen này mã hóa cho
3 enzyme thực hiện 3 phản ứng tổng hợp kế tiếp nhau (hình 1.3). Phản ứng đầu
tiên là biến đổi hai phân tử acetyl coenzyme A (Acetyl-CoA) thành phân tử
acetoacetyl-CoA nhờ xúc tác của β-ketoacyl-CoA thiolase (mã hóa bởi gen
phbA). Phản ứng thứ hai có sự tham gia của NAD(P)H kết hợp với acetoacetyl-
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Ngọc 12 K36B - Sinh
Hình 1.3. Ba bước của con đường sinh tổng hợp PHB. Một promoter
nằm trước gen phbC đóng vai trò khởi động quá trình sinh tổng hợp
[27]
CoA reductase (mã hóa bởi gen phbB) biến đổi acetoacetyl-CoA thành (R)-3-
hydroxybutyryl-CoA. Cuối cùng, các phân tử (R)-3-hydroxybutyryl-CoA đƣợc
polymer hóa thành poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) nhờ sự xúc tác của PHB
polymerase (mã hóa bởi gen phbC) [27]. Trong quá trình sinh trƣởng của vi
khuẩn, enzyme β-ketothiolase bị ức chế bởi hàm lƣợng Coenzyme A tự do giải
phóng từ chu trình Krebs, nhƣng khi sự tiếp nhận acetyl-CoA vào chu trình
Krebs bị giới hạn (xảy ra khi môi trƣờng sống bị hạn chế một vài nguyên tố dinh
dƣỡng thiết yếu, nguồn cacbon vẫn dồi dào) thì lƣợng acetyl-CoA dƣ thừa đó sẽ

đƣợc chuyển vào con đƣờng sinh tổng hợp PHB [28].






Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc hạt PHA
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Ngọc 13 K36B - Sinh
Trong tế bào, PHA tích lũy dƣới dạng các thể ẩn nhập (hạt dự trữ) hình
cầu, không tan trong nƣớc, chứa các chuỗi polyester, thƣờng đƣợc gọi là hạt
PHA. Hạt PHA đƣợc bao ngoài bởi một lớp màng có bản chất là màng
phospholipid và đƣợc “khảm” bởi các protein bám màng và protein xuyên
màng trong đó bao gồm enzyme PHA synthase (PhaC), protein phasin (PhaP),
enzyme PHA depolymerase (PhaZ), protein điều hòa (PhaR) và một số loại
protein khác chƣa rõ chức năng [27] (hình 1.4). Kích thƣớc của hạt PHA tăng
lên khi enzyme PHA synthase không ngừng xúc tác để liên kết các monomer
có trong tế bào chất, làm mạch polyester dài ra. Khi sự tích lũy PHA đạt đến
cực đại, các hạt PHA sẽ choán hết thể tích bên trong tế bào [27].

Các PHA đƣợc cấu tạo từ một loại monomer duy nhất đƣợc gọi là đồng
polymer (homopolymer). Các PHA đƣợc cấu tạo từ hai hay nhiều monomer
khác nhau đƣợc gọi là dị polymer (heteropolymer) hay polymer đồng trùng hợp
(copolymer). Căn cứ vào số nguyên tử cacbon có trong monomer cấu tạo nên
PHA, ngƣời ta chia PHA thành hai nhóm: Nhóm PHA mạch ngắn (scl-PHA)
đƣợc tổng hợp từ các hydroxyacid có 3 - 5 nguyên tử cacbon trong phân tử
(C
3

-C
5
) và nhóm PHA mạch trung bình (mcl-PHA) đƣợc tổng hợp từ các
hydroxyacid có 6-16 nguyên tử cacbon trong phân tử (C
6
-C
16
). PHA mạch
ngắn có tính cứng, giòn gần giống với các loại polymer thông thƣờng trong
khi PHA mạch trung bình là loại nhựa mềm dẻo, hàm lƣợng tinh thể thấp, có
khả năng đàn hồi [19]. Một vài chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp phân tử
PHA chứa cả scl- và mcl-monomer [19].
Sau khi đƣợc tách chiết và tinh sạch, các PHA thể hiện một số tính chất
đặc trƣng nhƣ: bền nhiệt, không dẫn điện, cứng hoặc mềm dẻo (tùy loại
PHA), không thấm nƣớc, không cho không khí đi qua… [10]. Khối lƣợng
phân tử trung bình của các PHA thƣờng gặp dao động từ 2 x 10
5
đến 3 x 10
6

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Ngọc 14 K36B - Sinh
Dalton. Các polymer sinh học này có tính chất cơ bản giống với polymer
thông thƣờng nhƣ polyethylene (PE) hay polypropylene (PP) (bảng 1.8) [27].
Bảng 1.8. So sánh tính chất vật lý của một số dạng PHA với
polypropylene
Polymer
Nhiệt độ nóng
chảy (ºC)

(1)
Tinh thể
hóa (%)
(2)
Độ đàn hồi
(MPa)
(3)

P(3HB)
P(4HB)
P(3HB-co-3 mol% 3HV)
P(3HB-co-14 mol% 3HV)
P(3HB-co-20 mol% 3HV)
P(3HB-co-25 mol% 3HV)
P(3HB-co-64 mol% 4HB)
P(3HB-co-6 mol% 3HA)
P(3HB-co-10 mol% 3HHx)
P(3HO-co-11 mol% 3HHx)
Polypropylene (PP)
175-179
53
169 - 170
150
145
137
50
133
127
61
176

60-80
34
69
56
50
40
15
45
34
30
50-70
40
104
38
35
32
30
17
17
21
10
34.5 - 38

Ghi chú:
(1)
T
m
(melting temperature): Nhiệt độ mà ở đó polymer chuyển từ
trạng thái rắn sang trạng thái lỏng.
(2)

Crystallinity: là tỉ lệ tinh thể có trong
toàn bộ mẫu polymer (polymer = tinh thể + chất vô định hình).
(3)
Tensile
strength: Là lực căng lớn nhất mà polymer chịu đƣợc (không bị rách, đứt
gãy), tính bằng megapascal (1Pa = 1N/m
2
; 1MPa = 10
6
Pa).
Bên cạnh các tính chất nêu trên, một tính chất đặc trƣng khác của PHA
là khả năng phân hủy sinh học (biodegradable). Các vi sinh vật trong tự nhiên
có thể phân hủy PHA bằng cách sử dụng các enzyme PHA hydrolase và PHA
depolymerase. Hoạt động của các enzyme này có thể rất khác nhau, phụ thuộc
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Ngọc 15 K36B - Sinh
vào thành phần cấu tạo của polymer và điều kiện môi trƣờng. Một mẫu PHB
có thể phân hủy hoàn toàn sau vài tháng trong điều kiện yếm khí của bể chứa
nƣớc thải hoặc sau vài năm trong môi trƣờng nƣớc biển. Tác động của tia UV
trong ánh sáng mặt trời cũng có tác dụng đẩy nhanh quá trình phân hủy. Một
điều đặc biệt nữa là PHA có tính tƣơng thích sinh học, nghĩa là chúng không
gây tác động xấu nào khi đƣợc đƣa vào các cơ thể sống. Trong mô của động
vật có vú, PHA phân hủy rất chậm, sau 6 tháng cấy ghép vào cơ thể chuột thí
nghiệm, lƣợng PHA hao mòn do phân hủy là rất nhỏ (nhỏ hơn 1.6% khối
lƣợng) [28].
1.2.3. Tình hình nghiên cứu, ứng dụng polymer sinh học trên thế giới và ở
Việt Nam
Polymer sinh học đƣợc các nhà khoa học trên thế giới bắt đầu nghiên
cứu vào những năm 1970 của thế kỷ 20 và có thể đƣợc chia thành nhiều giai

đoạn. Giai đoạn 1970 - 1990 đƣợc xem là giai đoạn khởi thủy của các nghiên
cứu về 35 vật liệu polymer sinh học với số lƣợng sáng chế đăng ký rất khiêm
tốn (năm có số lƣợng sáng chế nhiều nhất là 1989 với 52 sáng chế, năm có số
lƣợng sáng chế ít nhất là 1979, 1983 với 1 sáng chế). Giai đoạn 1991 - 2000
đƣợc xem là giai đoạn cao trào của các nghiên cứu về polymer sinh học với số
lƣợng sáng chế tăng lên liên tục (năm 1991 - 1992 tăng từ 140 lên 233 sáng
chế, 1994 - 1995 tăng từ 270 lên 373 sáng chế). Giai đoạn 2001 - 2010 là giai
đoạn có số lƣợng sáng chế tăng vọt lên đến đỉnh điểm (năm 2003 có số lƣợng
sáng chế nhiều nhất là 645 sáng chế). Từ năm 2006 trở về sau, số lƣợng sáng
chế giảm dần, năm 2010 chỉ còn 154 sáng chế đƣợc đăng ký [4].
Ngày nay, trƣớc yêu cầu cấp thiết của việc giải quyết bài toán ô nhiễm
môi trƣờng do nhựa không tự phân hủy gây ra, các hƣớng nghiên cứu và ứng
dụng polymer sinh học ngày càng đƣợc đề cao. Tuy nhiên do giá thành sản
xuất cao (gấp khoảng 2 đến 4 lần so với polymer hông tự phân hủy) nên việc