Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng phân huỷ rơm rạ thành phân hữu cơ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN




LÊ THỊ THÙY DUNG






PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ
CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG
PHÂN HỦY RƠM RẠ THÀNH
PHÂN HỮU CƠ


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật học


Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

1. TS. PHƢƠNG PHÚ CÔNG
2. PGS. TS ĐINH THỊ KIM NHUNG




HÀ NỘI - 2014







LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài này, em nhận được sự giúp đỡ tận tình
của thầy cô giáo, gia đình và bạn bè. Khi hoàn thành khóa luận em xin gửi lời
cảm ơn sâu sắc đến TS. Phương Phú Công và PGS. TS Đinh Thị Kim Nhung
người đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Em
xin chân thành cảm ơn tất cả các thầy cô giáo và cán bộ trong tổ Thực vật - Vi
sinh, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình
giúp đỡ em trong thời gian làm khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn
trong nhóm vi sinh đã giúp đỡ tôi trong thời gian qua.
X


Sinh viên

Lê Thị Thùy Dung















LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài “
thành là do tôi thực hiện, không
sao chép lại của ai. Tất cả các số liệu đều thu thập từ thực nghiệm, qua xử lí
thống kê, không có số liệu sao chép không trùng với kết quả của tác giả nào
đã công bố. Trong đề tài tôi có sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả
khác, tôi xin phép tác giả được trích dẫn để bổ sung cho khóa luận tốt nghiệp
của mình.
Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.


  2014

Sinh viên


Lê Thị Thùy Dung















DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CFU : Colony forming unit
CMC : Cacboxyl methyl cellulose
d : Đường kính lỗ thạch
D : Đường kính vòng phân giải
ĐC : Đối chứng
G : Gram
HCVS : Hữu cơ vi sinh
M : Nấm mốc mẫu làm giàu
MPA : Meat peptone agar

MT : Môi trường
NM : Nấm mốc
PTN : Phòng thí nghiệm
RBBR : Remazol Brilliant Blue R
STT : Số thứ tự
TN : Thí nghiệm
U : Ủ
UBND : Ủy ban nhân dân
U
n
: Nấm mốc mẫu ủ
U
v
: Vi khuẩn mẫu ủ
U
x
: Xạ khuẩn mẫu ủ
V : Vi khuẩn mẫu làm giàu
VK : Vi khuẩn
VQG : Vườn quốc gia
VSV : Vi sinh vật
X : Xạ khuẩn mẫu làm giàu
XK : Xạ khuẩn





MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1

1. Lý do chọn đề tài 1
2. Mục tiêu của đề tài 2
3. Nội dung nghiên cứu 2
3.1. Phân lập VSV có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ 2
3.2. Tuyển chọn tổ hợp VSV có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ 2
3.3. Thử nghiệm ủ rơm rạ quy mô PTN với các chủng VSV tuyển chọn 2
4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài 2
4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài 2
4.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2
5. Điểm mới của đề tài 2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Hệ vi sinh vật đất 3
1.1.1. Sự phân bố của vi sinh vật trong đất 3
1.1.2. Vi sinh vật có khả năng phân hủy lignocellulose 4
1.2. Thực trạng sử dụng rơm rạ tại Việt Nam 7
1.2.1. Sử dụng rơm để trồng nấm rơm 8
1.2.2. Sử dụng rơm rạ để sản xuất phân hữu cơ vi sinh 9
1.2.3. Một số ứng dụng khác trong sử dụng rơm rạ ở nước ta 9
1.3. Sự phân bố và cấu trúc của cellulose trong tự nhiên 9
1.3.1. Sự phân bố của cellulose trong tự nhiên 9
1.3.2. Cellulose 10
1.3.3. Hemicellulose 11
1.3.4. Lignin 12
1.3.5. Cơ chế chuyển hóa lignocellulose 13
1.4. Các bước của quy trình chế tạo chế phẩm vi sinh phân hủy rác thải hữu cơ 16
1.5. Lịch sử phát triển phân bón vi sinh 17
1.5.1. Trên thế giới 17
1.5.2. Ở Việt Nam 17
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.1. Đối tượng nghiên cứu 19

2.2. Hóa chất, thiết bị 19
2.2.1. Hóa chất 19
2.2.2. Thiết bị 19





2.3. Các loại môi trường nuôi cấy 19
2.3.1. Môi trường phân lập và giữ giống vi khuẩn MPA 19
2.3.2. Môi trường phân lập và giữ giống xạ khuẩn Gauze I 20
2.3.4. Môi trường phân lập và giữ giống nấm mốc Crapeckdox 20
2.3.5. Môi trường phân lập và giữ giống nấm men Hansen 20
2.3.6. Môi trường thử hoạt tính sinh tổng hợp enzyme của các chủng VSV 20
2.4. Phương pháp nghiên cứu 21
2.4.1. Phương pháp vi sinh học 21
2.4.2. Phương pháp toán học trong thống kê và xử lý số liệu. 24
2.6. Địa điểm thực hiện đề tài 25
2.7. Thời gian thực hiện đề tài 25
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26
3.1. Phân lập VSV có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ 26
3.1.1. Kết quả lấy mẫu 26
3.1.2. Thí nghiệm với khối ủ mẫu lớn 29
3.1.3. Kết quả phân lập 31
3.2. Tuyển chọn tổ hợp vi sinh vật có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ 33
3.3. Thử nghiệm ủ rơm rạ quy mô PTN với các chủng VSV tuyển chọn 41
3.3.1. Kết quả kiểm tra tính đối kháng của các chủng VSV tuyển chọn 41
3.3.2. Kết quả xác định hàm lượng giống ban đầu bổ sung vào khối ủ 43
3.3.3. Thử nghiệm ủ rơm rạ quy mô phòng thí nghiệm 44
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

1. Kết luận 47
2. Kiến nghị 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO 48













DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Cấu trúc của phân tử cellulose 11
Hình 3.1. Thí nghiệm ủ mẫu khối lớn 30
Hình 3.2. Biểu đồ biểu diễn sự biến thiên nhiệt độ của U1 và U2 30
Hình 3.3. VSV phân lập trên môi trường thạch đĩa 32
Hình 3.4. Hoạt tính một số VSV tuyển chọn trên MT cơ chất bột giấy 38
Hình 3.5. Hoạt tính một số chủng VSV tuyển chọn trên MT cơ chất CMC 39
Hình 3.6. Hoạt tính một số chủng VSV tuyển chọn trên MT cơ chất xylan, RBBR 39
Hình 3.7. Khuẩn lạc các chủng VSV tuyển chọn trên môi trường thạch đĩa 40
Hình 3.8. Kết quả kiểm tra tính đối kháng của 10 chủng VSV tuyển chọn 42
Hình 3.9. Biểu đồ biểu diễn sự biến thiên nhiệt độ của các đống ủ 44
Hình 3.10. Biểu đồ biểu diễn độ giảm khối lượng của các đống ủ 46

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Môi trường thử hoạt tính 20
Bảng 3.1. Kết quả lấy mẫu 26
Bảng 3.2. Hàm lượng nitơ bổ sung 27
Bảng 3.3. Độ giảm trọng lượng cơ chất, m(g), sau 4 tuần ủ làm giàu ở nhiệt độ phòng 28
Bảng 3.4. Tỉ lệ phối trộn tiến hành thí nghiệm ủ mẫu 29
Bảng 3.5. Kết quả phân lập 32
Bảng 3.6. Theo dõi hoạt tính của các chủng có hoạt tính lignocelluase 34
Bảng 3.7. Hoạt tính enzyme ngoại bào của 10 chủng VSV tuyển chọn 37
Bảng 3.8. Hàm lượng vi khuẩn bổ sung 43
Bảng 3.9. Hàm lượng xạ khuẩn, nấm mốc bổ sung 43
Bảng 3.10. Tỉ lệ phối trộn các thành phần ủ rơm rạ 44




1
MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Hàng năm, tại vùng nông thôn miền Bắc sau thu hoạch lúa sinh ra một
lượng rơm rạ khổng lồ. Với phế phẩm giàu cellulose này, một lượng rất ít

được sử dụng để trồng nấm hay làm thức ăn gia súc, phần lớn được xử lý theo
phương pháp truyền thống là đốt trực tiếp trên đồng ruộng, điều này gây ra
nhiều hậu quả như góp phần làm ô nhiễm không khí, phá hủy hệ sinh thái đất
và đất ngày càng bạc màu. Người dân đốt rơm tại ruộng và ngay cả trên
đường, không những gây lãng phí mà còn gây khói bụi, gây ô nhiễm môi
trường do khói đốt rơm rạ có tỉ lệ tro bụi cao, các khí CO, CO
2
, NO
2
, SO
2
…
gây ảnh hưởng tới sức khỏe của người dân xung quanh. Việc đốt rơm rạ trong
những ngày nắng nóng còn gây nguy cơ cháy nổ cao và gây nguy cơ tai nạn
giao thông khi khói bụi trở nên mù mịt. Trong khi đó lượng rơm rạ thải ra sau
mỗi vụ thu hoạch rất lớn. Trước thực trạng đó, một giải pháp hữu hiệu để xử
lý các phụ phẩm nông nghiệp nhằm tận thu nguồn nguyên liệu này là sử dụng
những phế phẩm bỏ đi trong nông nghiệp như rơm rạ để ủ phân hữu cơ. Việc
này giúp cho bà con nông dân không những tiết kiệm chi phí mua phân hóa
học mà còn giúp cải tạo đất, đảm bảo sức khỏe cho người sử dụng và hạn chế
tác động xấu đến môi trường. Phân hữu cơ có thể đem bón cho đất trước khi
gieo trồng làm tăng lượng dinh dưỡng hữu cơ bổ sung cho đất, nâng cao độ
phì nhiêu của đất, làm cho đất tơi, xốp, tăng lượng oxy hòa tan trong đất.
Ngoài ra, phân hữu cơ sau khi ủ có thể tiêu diệt được các nguồn bệnh tàn dư
trong nguyên liệu ủ nên không mang tác nhân gây bệnh cho cây trồng.
Từ những yêu cầu thực tiễn của ngành nông nghiệp, tôi tiến hành đề tài:



2
2. Mục tiêu của đề tài
Phân lập, tuyển chọn được tổ hợp vi sinh vật có khả năng phân hủy rơm
rạ thành phân hữu cơ.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Phân lập VSV có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ
3.2. Tuyển chọn tổ hợp VSV có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân
hữu cơ
3.3. Thử nghiệm ủ rơm rạ quy mô PTN với các chủng VSV tuyển chọn
4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài
4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
Đề tài nhằm phân lập tuyển chọn được các chủng vi sinh vật có khả
năng sinh enzyme phân giải lignocellulose. Góp một phần nhỏ bổ sung cho
các nghiên cứu về chế phẩm vi sinh vật sử dụng trong sản xuất phân bón nói
riêng và ứng dụng trong đời sống nói chung phù hợp với điều kiện kinh tế
Việt Nam.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Tận dụng nguồn nguyên liệu rơm rạ sau mỗi vụ thu hoạch, tuyển chọn
được tổ hợp vi sinh vật hữu hiệu để ủ phân hữu cơ góp phần làm giảm lượng
rác thải nông nghiệp tránh ô nhiễm môi trường, nâng cao hiệu quả canh tác
nông nghiệp.
5. Điểm mới của đề tài
Đây là những kết quả nghiên cứu đầu tiên khảo sát sự có mặt của một
số chủng VSV có khả năng sinh enzyme lignocellulase trong đất tại 3 địa
điểm: Khu vực đất nông nghiệp huyện Mê Linh (Hà Nội), VQG Ba Vì (Hà
Nội), VQG Tam Đảo (Vĩnh Phúc).

3
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Hệ vi sinh vật đất
1.1.1. Sự phân bố của vi sinh vật trong đất
Vi sinh vật phân bố ở khắp mọi nơi trên trái đất, nhưng phân bố nhiều
nhất là ở trong môi trường đất. Sự phân bố của vi sinh vật trong đất còn gọi là
hệ sinh vật đất. Bởi vì trong môi trường đất nói chung và trong đất trồng nói
riêng cung cấp một nguồn thức ăn phong phú cho vi sinh vật. Các chất vô cơ
có trong đất là nguồn thức ăn cho nhóm vi sinh vật tự dưỡng, chúng chuyển
hóa các hợp chất này, ví dụ chuyển hóa các hợp chất của S, P, Fe… Các chất
hữu cơ là nguồn thức ăn cho vi sinh vật tự dưỡng, ví dụ vi sinh vật phân giải
cellulose, vi sinh vật phân giải protein…
Các chất dinh dưỡng phân bố không đồng đều trong đất, cho nên ở các
tầng đất khác nhau, sự phân bố của vi sinh vật cũng khác nhau vì nó phụ
thuộc vào hàm lượng chất dinh dưỡng. Mức độ thoáng khí của đất cũng là
một điều kiện ảnh hưởng đến sự phân bố của vi sinh vật. Các nhóm hiếu khí
phát triển nhiều ở những nơi có nồng độ oxi cao, hàm lượng oxi thấp hơn
thường phân bố nhiều loại vi sinh vật kị khí. Độ ẩm và nhiệt độ trong đất
cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật đất. Đại đa số các loài vi
khuẩn có ích đều phát triển mạnh mẽ ở độ ẩm từ 60% ÷ 80%. Độ ẩm quá thấp
hoặc quá cao đều ức chế vi sinh vật. Chỉ có nấm mốc và xạ khuẩn là phát
triển được ở những điều kiện khô. Nếu độ ẩm thấp dưới 20% vi khuẩn phát
triển kém nhưng xạ khuẩn lại phát triển mạnh. Đất vùng nhiệt đới có độ ẩm
70% ÷ 80% và nhiệt độ 20 ÷ 30
0
C, đó là điều kiện thích hợp với đa số vi sinh
vật. Bởi vậy trong mỗi gram đất trồng thường có hàng triệu đến hàng tỉ tế bào

4
vi sinh vật bao gồm nhiều nhóm khác nhau về vị trí phân loại cũng như hoạt
tính sinh lý, sinh hóa.
Các nhóm vi sinh vật chính trong đất là: Vi khuẩn, vi nấm, vi tảo, động
vật nguyên sinh trong đó vi khuẩn là nhóm chiếm nhiều nhất về số lượng.
Trung bình trong đất vi khuẩn chiếm khoảng 90% tổng số, xạ khuẩn 8%, vi
nấm 1% còn lại 1% là tảo và động vật nguyên sinh. Tỉ lệ này thay đổi tùy theo
loại đất khác nhau cũng như khu vực địa lý khác nhau, tầng đất, thời vụ, chế
độ canh tác… Ở những nơi có đầy đủ chất dinh dưỡng, độ thoáng khí tốt,
nhiệt độ, độ ẩm và pH thích hợp thì vi sinh vật phát triển nhiều về số lượng
và thành phần sự phát triển của vi sinh vật lại chính là nhân tố làm cho đất
thêm phì nhiêu [3].
1.1.2. Vi sinh vật có khả năng phân hủy lignocellulose
1.1.2.1. Vi sinh vt phân hy cellulose
Trong tự nhiên, khu hệ vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose vô
cùng phong phú bao gồm vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn.
a) Nấm sợi
Trong rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulase thì nấm
sợi thuộc nhóm có khả năng tổng hợp cellulase mạnh nhất. Chúng là những vi
sinh vật thuộc nhóm hạ đẳng, không có diệp lục, chúng chủ yếu sống hoại
sinh ở trong đất và tiết ra môi trường một lượng lớn enzyme chuyển hoá các
tàn dư của thực vật thành những chất dinh dưỡng cung cấp cho cây và làm
cho đất trở nên màu mỡ hơn [9].
Trong thực tế không có một loại nấm hay vi sinh vật nào có khả năng
sinh tổng hợp đầy đủ cả một phức hệ enzyme cần cho quá trình chuyển hoá
cellulose đến sản phẩm cuối cùng mà mỗi loài chỉ có thể sinh tổng hợp một
vài loại enzyme. Các loại nấm đáng chú ý nhất là: Alternaria tenuis,

5
Aspergillus wentii, Aspergillus fumigatus, Trichoderma reesei, Fusarium
solani, Penicillium pinophinum,, Aspergillus niger [8].
Các nấm ưa nhiệt cũng được chú ý vì chúng có thể tổng hợp các
enzyme bền nhiệt hơn, chúng sinh trưởng và phân giải nhanh cellulose nhưng
hoạt tính cellulase của dịch lọc lại thấp. Nấm có khả năng sinh trưởng và sản
xuất cellulase cực đại ở phạm vi pH bằng 3,5 - 6,6 [9].
b) Vi khuẩn
Từ thế kỷ XIX, các nhà khoa học đã nghiên cứu và nhận thấy một số vi
sinh vật kị khí có khả năng phân giải cellulose. Những năm đầu thế kỷ XX
(1903) G.Van Iterson phân lập được các vi khuẩn hiếu khí cũng có khả năng
này. Trong các vi khuẩn hiếu khí phân giải cellulose, niêm vi khuẩn chiếm
một vị trí quan trọng, chúng thường có hình que nhỏ bé hơi uốn cong, có
thành tế bào mỏng, bắt màu thuốc nhuộm kém, chủ yếu ở các giống
Cytophaga, Sporocytophaga và Sorangium. Niêm vi khuẩn nhận năng lượng
khi oxy hoá các sản phẩm của sự phân giải cellulose thành CO
2
và H
2
O [9].
Ngoài ra còn thấy các loài thuộc giống Cellvibrio cũng có khả năng
phân huỷ cellulose. Trong điều kiện kị khí, các loài ưa ấm hoặc ưa nhiệt thuộc
giống Clostridium và Bacillus tiến hành phân giải cellulose. Chúng phát triển
yếu trên môi trường chứa đường đơn. Khi phân giải cellulose thành glucose
và xenlobiose, chúng sử dụng các đường này như nguồn năng lượng và nguồn
cacbon cũng thường kèm theo việc tạo thành các axit hữu cơ CO
2
và H
2
O.

Trong dạ cỏ của các động vật ăn cỏ có một hệ vi sinh vật đặc biệt.
Chúng có khả năng phân giải cellulose thành các sản phẩm. Các vi sinh vật đó
thường là: Ruminococcus albus, Ruminococcus flavofaciens, Butyrivibrio
fibrisolvens, Cillobacterium cellulosolvens, Bacteroides amylophillus,
Bacteroides ruminicola, Clostridium perfringens, Clostridium butycium [9].



6
c) Xạ khuẩn
Xạ khuẩn là một nhóm vi khuẩn đặc biệt, tế bào đặc trưng bởi sự phân
nhánh, đa số sống trong đất gram dương và hiếu khí. Dựa vào đặc điểm về
nhiệt độ sinh trưởng, người ta chia xạ khuẩn thành hai dạng:
Xạ khuẩn ưa ấm : phát triển tốt ở nhiệt độ 25 – 30
0
C
Xạ khuẩn ưa nhiệt : phát triển tốt ở nhiệt độ 50 – 70
0
C
Xạ khuẩn có mặt ở khắp mọi nơi đặc biệt trong đất. Cellulase của xạ
khuẩn là enzyme ngoại bào [7].
Hungater phân lập được loài Micromonospora có khả năng thuỷ phân
cellulose. Các xạ khuẩn khác nhau có nhu cầu khác nhau về dinh dưỡng.
Nhiều nhóm đòi hỏi nguồn dinh dưỡng cao. Các môi trường có dịch chiết
nấm men, pepton, dịch thuỷ phân cazêin thường thuận lợi cho sinh trưởng. Xạ
khuẩn thường sinh sản bằng cách đứt đoạn hay phân chia tế bào bình thường.
Bào tử của xạ khuẩn thường có hình cầu hay hình bầu dục chứa
axitdipicolinic, canxi và một số ít magiê là chất quyết định tính kháng nhiệt
của chúng. Các xạ khuẩn khác nhau có nhu cầu khác nhau về dinh dưỡng.
Việc hình thành cuống bào tử diễn ra mạnh hơn khi thêm các nguyên tố vi

lượng [9].
Veigia và cộng sự đã phân lập được 36 chủng xạ khuẩn từ bùn ở vịnh
Lacoruva (Tây Ban Nha), trong đó có 19 chủng có khả năng tổng hợp
cellulose và sinh trưởng tốt trong môi trường chứa 3,5% NaCl. Mandels và
cộng tác viên nghiên cứu khả năng tổng hợp enzyme cellulase của hai chủng
Streptomyces antibioticus và Streptomyces sp. với cơ chất là CMC, nhiệt độ
tối thích là 37
0
C và pH tối thích là 5,9 [9].
1.1.2.2. Vi sinh vt phân hy hemicellulose
Hemicellulase là enzyme ít người nghiên cứu ngoại trừ xylanase vì
xylan là một loại hemicellulose phổ biến trong tự nhiên. Các tác giả cho rằng


7
nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp cả cellulase đồng thời tổng hợp cả
hemicellulase. Khả năng này thường thấy ở vi khuẩn dạ cỏ như Bacillus,
Bacteriodes, Butyvibrio và các loại thuộc chi Clostridium.
Ngoài vi khuẩn thì nhiều loại nấm sợi cũng có khả năng tổng hợp
xylanase. Các loại nấm này bao gồm: Mycothecium verrucaria, Aspergillus
oryzae, A.niger, A.wentti, Aspergillus terreus, T.reesei, Chaetomium
trilaterates, Penicilium [11].
1.1.2.3. Vi sinh vt phân hy lignin
Đối với lignin, là loại có chất khó chuyển hoá nhất thời gian phân huỷ
rất chậm kéo dài hàng tháng đến hàng năm. Các vi sinh vật phân giải lignin
thường là các loại nấm mục xốp như: Paocylimyces, Allescheria, Pseussis,
Chaetomium, Stachybotrys, Lemzites… Ngoài ra còn có các loại nấm trắng
như: Corrolus versicolor, Polyrus anceps, Phanerochaeter chrysosporium,
Sporotrichum pulverulentum, Aspergillus fumigatus [12].
1.2. Thực trạng sử dụng rơm rạ tại Việt Nam

Ở nước ta sản xuất lúa hàng năm đã tạo ra hàng chục triệu tấn rơm rạ.
Riêng tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long mỗi năm cũng có tới 15 triệu
tấn rơm. Tuy nhiên, loại phế thải nông nghiệp này thường được nông dân đốt
gây lãng phí và làm ô nhiễm môi trường. Hiện nay, cùng với việc ứng dụng
các tiến bộ khoa học vào sản xuất, nhiều loại máy móc được đưa vào gặt và
tuốt lúa. Sau khi gặt xong nông dân đã tuốt lúa ngay tại đồng ruộng nên giảm
được nhiều công sức trong việc vận chuyển lúa chưa tuốt về nhà tuốt. Vì thế,
rơm rạ phần lớn để lại ngoài đồng ruộng chỉ một phần nhỏ được nông dân đưa
về nhà để làm thức ăn cho gia súc về mùa đông. Phần rơm rạ ngoài đồng lại
được người dân đốt thành tro. Đây là một việc làm gây hại cho môi trường và
ảnh hưởng trực tiếp tới sức khoẻ của người dân. Theo các chuyên gia y tế, mù
bụi ro đốt rơm rạ (đã từng xảy ra vào tháng 6/2009 tại Hà Nội) gây ô nhiễm


8
không khí rất có hại đối với sức khỏe con người, nhất là đối với trẻ em, người
già và người mắc bệnh đường hô hấp.
Việc đốt rơm rạ là điều nên tránh và đã có khuyến nghị bà con sử dụng
rơm rạ cho việc trồng nấm rơm, dự trữ làm thức ăn gia súc, ủ gốc trồng
màu… Trong trường hợp khó vận chuyển và cất giữ có thể vận động tập thể
mua máy đóng bánh rơm của một số xí nghiệp đã khuyến cáo rất có hiệu quả
trong việc ép rơm rạ thành bánh giúp cho việc vận chuyển và bảo quản rơm rạ
được dễ dàng. Từ đó có thể sử dụng rơm rạ cho nhiều mục đích khác. Máy ép
rơm đã được sản xuất và đưa vào sử dụng ở các tỉnh An Giang, Đồng Tháp,
Thành phố Hồ Chí Minh Việc dùng rơm rạ cho mục đích làm giấy, sản xuất
ethanol được áp dụng rất ít ở nước ta.
1.2.1. Sử dụng rơm để trồng nấm rơm
Nấm rơm là thực phẩm rất được người dân các nước châu Á ưa chuộng
và được trồng phổ biến ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam,
nấm rơm được trồng trên nhiều loại nguyên liệu khác nhau như lục bình, bã

mía, rơm rạ,… Nhưng nguyên liệu phổ biến nhất hiện nay mà người trồng
nấm sử dụng vẫn là rơm rạ. Các địa phương phía Nam phát triển nấm rơm
nhiều nhất là Phú Yên, ở đây đã trồng nấm rơm theo quy trình mới, hiệu quả
kinh tế cao của Trung tâm Công nghệ sinh học Việt Nam lần đầu tiên được
triển khai đại trà tại huyện Sơn Hòa bước đầu đã được nông dân đón nhận.
Tại miền Bắc, nhiều địa phương cũng thành công với việc trồng nấm
rơm như: xã Nghĩa Thái, huyện Nghĩa Hưng (Nam Ðịnh), xã Khánh Trung,
huyện Yên Khánh (Ninh Bình), với sự hỗ trợ của Trung tâm Công nghệ Sinh
học thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam. UBND tỉnh Ninh Bình
đã có quyết định số 1297, phê duyệt dự án "Xây dựng trung tâm sản xuất
giống và chế biến nấm xuất khẩu Hương Nam…”.


9
1.2.2. Sử dụng rơm rạ để sản xuất phân hữu cơ vi sinh
Hiện nay tại nhiều tỉnh thành trong cả nước đã ứng dụng công nghệ vi
sinh phân hủy rơm rạ để làm phân bón. Chẳng hạn, tại tỉnh Quảng Nam,
người dân đã ứng dụng công nghệ vi sinh phân hủy rơm rạ để làm phân bón ở
Hội An. Kết quả sử dụng phân hữu cơ vi sinh từ phế phẩm nông nghiệp đã
cho thấy cây phát triển tốt hơn so với mẫu đối chứng về mật độ gieo trồng, bộ
lá xanh, mượt, cây cao, chắc khoẻ và đặc biệt là đã hạn chế được nấm bệnh
cho cây trồng.
Hàng năm, nông dân đổ xuống đồng ruộng lượng lớn phân hoá học,
thuốc bảo vệ thực vật làm cho cấu trúc đất bị thay đổi. Nếu cứ tiếp tục như
vậy, đồng ruộng sẽ mất dần độ phì nhiêu, môi trường ô nhiễm, sức khoẻ con
người bị ảnh hưởng. Do vậy, việc sử dụng rơm, rạ làm phân bón hữu cơ có ý
nghĩa rất lớn về mặt kinh tế, xã hội.
1.2.3. Một số ứng dụng khác trong sử dụng rơm rạ ở nước ta
Ngoài dùng rơm rạ trồng nấm rơm, sản xuất phân bón hữu cơ, rơm rạ
cũng có thể được sử dụng để làm vật liệu xây dựng, đệm lót, tránh va đập cho

các sản phẩm nông nghiệp và gốm sứ… trong quá trình vận chuyển. Tại xã
Mỹ Yên, Long Hiệp (huyện Bến Lức, Long An), rơm đang được các chủ vựa
thu mua từ những cánh đồng lúa mùa ở các xã Long Khê, Long Định, Phước
Lý, Phước Toàn, Phước Vân… (thuộc các huyện Bến Lức, Cần Đước, Cần
Giuộc) để cung cấp cho các vựa dưa, trái cây, xí nghiệp thuỷ tinh, các trang
trại nuôi bò, xuất khẩu…
1.3. Sự phân bố và cấu trúc của cellulose trong tự nhiên
1.3.1. Sự phân bố của cellulose trong tự nhiên
Sinh khối thực vật của trái đất ước tính khoảng 1,8.10
12
tấn. Trong đó
cellulose chiếm khoảng 4.10
10
tấn. Sản lượng cellulose được tổng hợp hàng
năm trong tự nhiên lớn hơn bất kỳ chất hữu cơ nào khác.


10
Dưới dạng phế thải, cellulose có trong các phế liệu nông nghiệp chăn
nuôi, công nghiệp, đồ hộp, công nghiệp chế biến gỗ, trong chất thải sinh hoạt
từ nhà bếp, đường phố Sự phân bố đa dạng với khối lượng lớn ở khắp nơi
của cellulose có trong rác thải là một khó khăn và trở ngại cho việc bảo vệ
môi trường, do đó để thu gom và xử lý triệt để lượng chất thải hữu cơ này đòi
hỏi phải có những biện pháp và công nghệ phù hợp với từng khu vực, từng
vùng [6], [7], [9], [11].
1.3.2. Cellulose
Cellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật. Thông thường,
cellulose của tế bào thực vật chiếm 50% tổng số hydratcacbon có trên trái đất
của chúng ta. Người ta nhận thấy rằng trong thiên nhiên hầu như không gặp
cellulose ở dạng tinh khiết mà nó thường tồn tại ở dạng kết hợp với những

chất khác như hemicellulose, lignin, pectin các chất này liên kết với nhau
tạo nên màng tế bào thực vật và có tên gọi chung là lignocellulose. Trong đó,
cellulose và hemicellulose chiếm tỉ lệ cao nhất. Hai chất này được bao bọc
bởi một lượng lignin. Các thành phần này thường có tỉ lệ khác nhau trong các
loại cây khác nhau tạo ra các đặc tính hoá lý riêng cho từng loại thực vật.
Về mặt cấu tạo hoá học, cellulose là một polime mạch thẳng, có thành
phần cấu trúc cơ bản là các D-glucopiranose. Các gốc này nối với nhau nhờ
liên kết β-1,4-glucozit. Mức độ polime hoá của phân tử cellulose thay đổi
nhiều (từ vài trăm đến 15000) trung bình là 3000.
Các đơn phân glucoza trong cellulose thì có cấu trúc dạng ghế bành
(hình 1.1). Trong công thức phối cảnh, biểu diễn glucoza số chẵn, quay góc
180
o
so với glucose số lẻ và các nhóm hydroxyl đều nằm trên mặt phẳng nằm
ngang [9], [11].


11


Hình 1.1. Cấu trúc của phân tử cellulose

Dùng phương pháp phân tích của Rơngen, người ta đã chứng minh
được rằng phân tử cellulose có dạng sợi. Các sợi này của cellulose lại gắn với
nhau nhờ liên kết hydro tạo thành từng bó nhỏ gọi là các microfibrin.
Microfibrin có cấu trúc không đồng nhất và thường có hai vùng β. Vùng kết
tinh có cấu trúc trật tự rất cao vì thế nó rất bền vững với tác động bên ngoài.
Vùng vô định hình có cấu trúc trật tự không chặt do đó kém bền vững hơn.
Do có cấu trúc như thế, vùng vô định hình của cellulose có thể hấp thụ
nước và trương lên. Trong khi đó vùng kết tinh, mạng lưới liên kết hydrogen

ngăn cản sự trương này. Ở vùng kết tinh, enzyme chỉ tác dụng lên bề mặt các
sợi [7].
Cellulose là một hợp chất cao phân tử có cấu trúc rất bền vững. Nó
không tan trong nước, không được tiêu hoá trong đường tiêu hoá của người và
động vật có dạ dày một túi. Tuy nhiên, trong dạ dày của động vật nhai lại và
trong đất có tồn tại rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh cellulase, là
enzyme thuỷ phân cellulose [9].
1.3.3. Hemicellulose
Trong tế bào thực vật, hemicellulose đứng thứ hai về khối lượng.
Hemicellulose là nhóm polisacarit có phân tử lượng nhỏ hơn rất nhiều so với
H
O
O
H
HO
O
CH
2
OH
H
OH
O
H
H
CH
2
OH
H
OH
H

HO
H
H
H


12
cellulose. Thông thường chúng chỉ có 150 gốc đường. Các gốc đường được
nối với nhau bằng liên kết β-1.4, β-1.5, β-1.6 glucozit. Chúng tạo thành mạch
ngắn và phân nhánh.
Do đó, so với cellulose thì hemicellulose có cấu trúc không chặt chẽ
bằng, chúng dễ dàng bị phân giải khi bị axit loãng tác dụng. Đôi khi
hemicellulose còn bị phân giải trong nước nóng và chúng dễ dàng bị phân giải
bởi enzyme hemicellulase.
Hemicellulose tồn tại chủ yếu ở các phần như hạt, bẹ ngô, cám, rơm, rạ,
trấu. Trong các loại hemicellulose thì xylan là loại có nhiều trong tự nhiên.
Trong đó nhiều nhất là ở rơm rạ (chiếm hơn 30%), kế đến là cây lá rộng
(20 - 30%). ở cây lá kim, xylan ít hơn nhiều (7 - 17%) [7], [8], [11].
1.3.4. Lignin
Lignin là hợp chất cao phân tử ngưng tụ từ ba loại rượu chủ yếu: rượu
trans-P-cumarylic, trans-conyferylic và trans-cynapylic. Tuy nhiên, tỉ lệ ba
loại rượu nói trên trong lignin của các loại thực vật khác nhau không giống
nhau. Trong lignin các đơn phân này thường liên kết với nhau bằng liên kết
C-O và C-C. Trong đó kiểu liên kết aryl-glyxecol, aryl-aryl hoặc diaryl ete là
phổ biến [7].
Lignin của cây gỗ gồm 8% conyferylic, 14% cumarylic và 6%
cynapylic. Trong thực vật, lignin tập trung ở các mô hoá gỗ và vai trò như
chất liên kết tế bào, do đó mà làm tăng độ bền cơ học, tăng khả năng chống
thấm, ngăn chặn các chất độc gây bệnh và các vi sinh vật gây bệnh cũng như
các tác dụng khác từ bên ngoài. Lignin không hoà tan trong nước, trong các

dung môi hữu cơ đậm đặc kể cả axit. Chỉ có tác dụng với kiềm bisunfit natri
và axit sunfurơ, lignin mới mới lại bị phân giải từng phần. Lignin rất bền đối
với tác dụng của các enzyme. Do đó trong cây lignin chỉ được tạo ra mà
không tham gia vào sự trao đổi chất.


13
Ba cấu tử cellulose, hemicellulose, lignin tạo nên lignocellulose. Thành
phần lignin, cellulose, hemicellulose trong các loại thực vật có sự khác biệt
lớn. Điều này quyết định sự khác nhau giữa các loại thực vật về tính chất vật
lý và thành phần hoá học. Chính vì thế đòi hỏi phải có biện pháp, tác nhân xử
lý khác nhau đối với các loại thực vật khác nhau [7], [11].
1.3.5. Cơ chế chuyển hóa lignocellulose
Lignocellulose là một tập hợp thành phần phức tạp, có mức độ polime
cao, khó tan trong nước, do đó rất khó bị thuỷ phân bởi enzyme. Các cấu phần
hợp thành nên lignocellulose được liên kết chặt chẽ với nhau và liên kết với
các thành phần khác tạo ra một cấu trúc hết sức chặt chẽ.
Do thành phần cấu tạo của lignocellulose rất đa dạng và phức tạp nên
để có thể thuỷ phân được chúng một cách triệt để cần phải có một phức hệ
enzyme tương ứng. Một loại vi sinh vật riêng rẽ không đủ khả năng để có thể
sinh tổng hợp một phức hệ enzyme phong phú và đa dạng như vậy. Muốn
chuyển hoá được lignocellulose cần phải có sự phối hợp của các loại vi sinh
vật khác nhau.
1.3.5.1. Enzyme và  thy phân lignocellulose
a) Enzyme thuỷ phân cellulose: Cellulase
Cellulase ở vi sinh vật và cơ chế tác dụng của chúng gần đây đã được
một số tác giả tổng kết khá chi tiết. Đây là phức hệ enzyme thuỷ phân
cellulose tạo ra các đường đủ nhỏ để đi qua vách tế bào thực vât. Nhiều tác
giả cho rằng phức hệ enzyme cellulase bao gồm ba enzyme chủ yếu sau:
Exo-(1,4)-glucanase hay xenlobiohydrolase: Enzyme này phân cắt

chuỗi cellulose từ đầu không khử và giải phóng ra xenlobioza. Enzyme này
không thuỷ phân cellulose kết tinh cũng như cellulose hoà tan (caboxymetyl
cellulose) nhưng có thể thuỷ phân được cellulose đã bị cắt ngắn mạch. Có lẽ


14
vai trò chính của enzyme này là giúp cho enzyme endocellulase tác động lên
được cellulose kết tinh.
Endoglucanase hay Endocellulase (1,4 -D-glucano-hydrolaza):
Enzyme này có nhiệm vụ cắt đứt các liên kết ò 1,4-glucozit trong phân tử
cellulose một cách ngẫu nhiên để giải phóng ra xenlodextrin, xenlobiose và
glucose. Enzyme này phân giải mạnh mẽ các cellulose vô định hình nhưng lại
tác dụng yếu trên cellulose kết tinh và không phân giải được xenlobiose.
Chính nhờ sự phân cắt trước của endocellulase, đã tạo ra các đầu không khử
làm dễ dàng enzyme xenlobio-hydrolase, do đó mà thuỷ phân được cellulose
kết tinh.
Enzyme -1,4-glucozidase hay xenlobiase: Đây là những enzyme rất
đặc hiệu. β-glucozidase làm thuỷ phân xenlobiose và các xenlooligo-sacarit
mạch ngắn thành glucose. Vận tốc chung của phản ứng thuỷ phân cellulose
phụ thuộc chặt chẽ vào quá trình hoạt động của xenlobiase. Tuy nhiên theo
một số tác giả cơ chế thuỷ phân cellulose bởi phức hệ enzyme trên diễn ra
theo một trật tự khác nhau.
b) Cơ chế thuỷ phân cellulose
Theo Reese và các đồng sự thì C1 là enzyme “tiền tố thuỷ phân” hay là
không đặc hiệu. Các enzyme này chỉ có tác dụng làm trương cellulose tự
nhiên. Các cellulose tự nhiên sẽ được chuyển thành các cellulose hoạt động
trương nở có mạch ngắn hơn. Các chuỗi này sẽ được enzyme Cx tiếp tục phân
cắt tạo thành đường tan (xenlobiose) và sau cùng thành glucose [9].
Tuy nhiên Erikson và các đồng sự lại cho rằng: Đầu tiên enzyme
endoglucanase tác động vào vùng vô định hình trên bề mặt cellulose, cắt các

liên kết β-1,4 glucozit và tạo ra các đầu mạch tự do. Sau đó exoglucanose sẽ
cắt ra tạo thành những đoạn xenlobiose. Kết quả tạo thành xenlo-oligosacarit


15
mạch ngắn, xelobiose, glucose. Cuối cùng enzyme xenlobiase thuỷ phân tiếp
theo tạo thành glucose.
Dựa trên kết quả trên mà Reese đã hiệu chỉnh quan niệm của mình về
enzyme C1 và Cx. Theo ông thì C1 có tác dụng làm trương nở cellulose kết
tinh, phá vỡ liên kết đồng hoá trị tạo ra cellulose biến tính. Sau đó enzyme
endoglucanase tác động lên chuỗi và tạo ra xenlobiose. Ông cho rằng sự thuỷ
phân cellulose là kết quả của sự tác động cùng một lúc của cả endoglucanase,
enxoglucanase và xenlobiase.
Mặc dù có rất nhiều kết quả nghiên cứu về quá trình thuỷ phân
cellulose nhưng cho đến này thì cơ chế thuỷ phân cellulose vẫn chưa hoàn
toàn thống nhất.
1.3.5.2. Enzyme  thy phân hemicellulose
Khi nghiên cứu hemicellulose, người ta nhận thấy có nhiều điểm giống
nhau giữa hai thành phần này. Chính vì vậy mà nhiều tác giả cho rằng enzyme
hemicellulase cũng có nhiều điểm tương đồng với cellulase ví dụ như cơ chế
tác động Tuy nhiên, giữa hemicellulase và cellulase vẫn còn nhiều điểm
khác biệt:
Hemicellulose có phân tử nhỏ hơn, cấu trúc phân tử đơn giản và kém
bền hơn so với cellulose. Hemicellulose là cơ chất dễ đồng hoá hơn cellulose
do đó hemicellulase thường được tạo thành sớm hơn trong quá trình nuôi cấy
vi sinh vật.
Mặc dù vậy thì quá trình phân giải hemicellulose thường diễn ra song
song với quá trình phân giải cellulose [7].
1.3.5.3. Enzyme và  thy phân lignin
Có nhiều quan điểm trái ngược nhau về cơ chế phân giải lignin. Một số

tác giả cho rằng, lignin có tác dụng như một nguồn cảm ứng để tổng hợp ra
ligninase. Nhưng một số tác giả khác lại cho rằng quá trình phân giải lignin là


16
một quá trình trao đổi chất thứ cấp. Chúng chỉ xảy ra khi môi trường thiếu các
nguồn dinh dưỡng cacbon dễ đồng hoá hoặc thiếu nguồn nitơ. Nếu thêm nitơ
vào sẽ làm giảm nhanh quá trình phân giải lignin.
Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy có khoảng 15 loại enzyme tham
gia vào quá trình thuỷ phân lignin. Ligninase không thuỷ phân lignin thành
các tiểu phần hoà tan như phân giải cellulose và hầu hết các polime khác, vì
lignin chứa một số lượng các liên kết có thể bị phân huỷ nhỏ. Mặt khác
ligninase lại rất khó hoà tan, chúng sẽ liên kết theo một kiểu nào đó cho phép
tiếp xúc với lignin. Quá trình thuỷ phân có thể diễn ra theo điều kiện phản
ứng hoá học sau:
- Cắt oxy hoá mạch bên của đơn vị phenylpropan
- Hình thành nhóm carboxyl thơm
- Tách nhóm methoxyl
- Hydroxyl hoá vòng thơm.
1.4. Các bƣớc của quy trình chế tạo chế phẩm vi sinh phân hủy rác thải
hữu cơ
Bước 1: Phân lập vi sinh vật phân hủy rác thải hữu cơ
Bước 2: Chọn chủng, nâng cao hoạt tính các chủng. Chọn các chủng theo tiêu
chuẩn sau:
+ Hoạt tính enzyme cao
+ Có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào lớn.
+ Có khả năng sinh trưởng, phát triển và sinh sản trên môi trường rác
thải hữu cơ tự nhiên.
+ Có khả năng sống và giữ gìn hoạt tính trong chất mang dùng để
chế tạo chế phẩm.

Bước 3: Thử nghiệm khả năng kết hợp giữa các chủng VSV.
Bước 4: Chế tạo chế phẩm VSV phân hủy rác thải hữu cơ.
Bước 5: Thử nghiệm sử dụng chế phẩm [4].


17
1.5. Lịch sử phát triển phân bón vi sinh
1.5.1. Trên thế giới
Phân bón vi sinh vật (tên thường gọi: phân hữu cơ vi sinh) là sản phẩm
được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu hữu cơ khác nhau, nhằm cung cấp chất
dinh dưỡng cho cây trồng, cải tạo đất, chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật
sống được tuyển chọ với mật độ đạt tiêu chuẩn quy định, góp phần nâng cao
năng xuất, chất lượng nông sản. Phân hữu cơ vi sinh vật không gây ảnh hưởng
xấu đến con người, động vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản.
Phân bón vi sinh do Noble Hiltner sản xuất đầu tiên tại Đức năm 1896 và
được đặt tên là Nitragin. Sau đó phát triển sản xuất tại một số nước khác như ở
Mỹ ( 1896), Canada (1905), Nga (1907), Anh (1910) và Thụy Điển (1914).
Nitragin là một loại phân được chế tạo bởi vi khuẩn Rhizibium do
Beijerink phân lập năm 1888 và được Ferd đặt tên vào năm 1889 dùng để bón
cho các loại cây thích hợp họ Đậu. Từ đó cho đến nay đã có rất nhiều công
trình nghiên cứu nhằm ứng dụng và mở rộng việc sản xuất các loại phân bón
vi sinh cố đinh nitơ mà thành phần còn được phối hợp thêm một số vi sinh vật
có ích khác như một số xạ khuẩn cố đinh nitơ sống tự do Frankia spp. ,
Azotobacter spp. , các vi khuẩn cố định nitơ sống tự do Clostridium,
Pasterium, Beijerinkia indica, các xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose,
hoặc một số chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hóa các nguồn dự trữ
photpho, kali ở dạng khó hòa tan với một số lượng lớn có trong đất mùn, than
bùn, trong các quặng apatit, photpho,… chuyển chúng thành dạng dễ hòa tan,
cây trồng có thể hấp thụ được.
1.5.2. Ở Việt Nam

Phân vi sinh vật cố đinh đạm cây họ đậu và phân vi sinh vật phân giải
lân đã được nghiên cứu từ năm 1960. Đến năm 1987, phân Nitragin nền chất
mang than bùn mới được hoàn thiện. Năm 1991 đã có hơn 10 đơn vị trong cả