Thiết kế vector biểu hiện mang gene sinh tổng hợp carotenoid trong e coli

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM




HÀ THỊ HỒNG


Tên đề tài:

THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN MANG GENE
SINH TỔNG HỢP CAROTENOID TRONG E.coli



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC





Hệ đào tạo : Chính quy
Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Khoa : CNSH-CNTP
Khóa học : 2012- 2014

Thái Nguyên, 2014

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM




HÀ THỊ HỒNG


Tên đề tài:

THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN MANG GENE
SINH TỔNG HỢP CAROTENOID TRONG E.coli



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC




Hệ đào tạo : Chính quy
Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Khoa : Công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm
Lớp : LTK8 - CNSH

Khóa học : 2012- 2014
Giáo viên hướng dẫn: TS. Dương Văn Cường – Khoa công nghệ sinh học
và công nghệ thực phẩm – Đại học Nông Lâm Thái Nguyên






Thái Nguyên, 2014
LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này đầu tiên cho tôi gửi lời cảm ơn chân thành và sâu
sắc tới TS. Dương Văn Cường - Phòng sinh học phân tử và công nghệ gen – Viện
Khoa Học Sự Sống- Đại Học Thái Nguyên, người đã tạo mọi điều kiện thuận lợi,
tận tình giúp đỡ và định hướng tôi trong suốt quá trình thực tập tại Viện.
Tôi xin cảm ơn KS. Ma Thị Trang, Phòng sinh học phân tử và công nghệ gen
– Viện Khoa học Sự Sống đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi trong quá trình
thực tập và hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tập thể cán bộ giáo viên Khoa Công
nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên đã
truyền đạt những kiến thức cho tôi trong quá trình học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, ban bè, đặc biệt là Bố Mẹ tôi đã
luôn bên tôi, ủng hộ và kích lệ tôi học tập, nghiên cứu để hoàn thiện khóa luận tốt
nghiệp này.


Thái Nguyên, 03/06/2014
Sinh viên

Hà Thị Hồng







MỤC LỤC
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2
1.3 Yêu cầu của đề tài 2
1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2
1.4.1 Ý nghĩa khoa học 2
1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 2
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Cơ sở khoa học
3
2.1.1. Nhóm sắc tố Carotenoid 3
2.1.1.1. Cấu trúc phân tử các carotenoid 4
2.1.1.2 .Tính chất vật lý và tính chất hóa học của carotenoid 4
2.1.2 Phương pháp tổng hợp carotenoid 4
2.1.2.1 Con đường sinh tổng hợp tự nhiên 4
2.1.2.2. Sản xuất từ thực vật 6
2.1.2.2 Phương pháp tổng hợp bằng hóa học 7
2.1.2.3 Sản xuất phương pháp bằng phương pháp điều hướng trao đổi chất
(Metabolic engineering) 9
2.1.3 Vai trò carotenoid với sức khỏe con người 10

2.2 Tình hình nghiên cứu carotenoid trong và ngoài nước
16
2.2.1 Tình hình nghiên cứu thế giới 16
2.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 17
PHẦN 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
3.1. Vật liệu nghiên cứu
19
3.2 Hóa chất
19
3.2.1. Hóa chất cho quá trình biến nạp 19
3 2.2 Hóa chất dung cho gắn nối gene vào vector 19
3.2 .3 Hóa chất dùng cho thí nghiệm biến nạp và nuôi khuẩn 21
3.2.4. Hóa chất dung cho phản ứng cắt enzyme giới hạn 21
3.2.5 Hóa chất dùng cho tách chiết DNA plasmid 21
3.3 Thiết bị
22
3.4. Địa điểm và thời gian thực tập
22
3.5. Nội dung nghiên cứu
23
3.6 Phương pháp nghiên cứu
24
3.6.1 Quy trình gắn nối cụm gen iEIB vào vector pET 28 24
3.6.2. Phản ứng cắt enzyme giới hạn để thôi gel 26
3.6.3 .Phương pháp điện di 26
3.6.4 Thôi gel , thu nhận DNA 26
3.6.5. Phản ứng nối cụm gen iEIB vào vector pET28 27
3.6.6 Biến nạp 28
3.6.7. Phương pháp tách chiết Plasmid 29
3.6.7.1. Tách plasmid bằng phương pháp ankaline lysis 29

3.6.7.2. Tách plasmid bằng Kit “Gene JET plasmid Miniprep “ 29
3.6.8. Thành phần phản ứng cắt kiểm tra chiều gắn nối bằng enzyme giới hạn 30
3.6.9 Kiểm tra gen gắn nối bằng phương pháp PCR 30
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32
4.1 Kết quả sàng lọc dòng tái tổ hợp 32
4.2. Kết quả biểu hiện pET28-iEIB trong E.coli BL21 (DE3)
37
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO 40










DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT


IPP : isopentenyl diphosphat
DMPP : Dimethyllalyl diphosphate
GPP : Geranyl diphosphate
GGPP : Geranylgeranyl diphosphate
FPP : Farnesyl diphosphate
MVA : mevalone
MEP : C-methyl-D-erthritol-4- phosphate
DXP : 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphat

HPLC : Hight Performance Liquid Chromatography- sắc kí lỏng hiệu
suất cao
TAE : Tris-acetate-EDTA
LB : Lauria Broth
IPTG : Isopropyl Thiogalactoside
Bp : Base pair- cặp bazo nito
PCR : Polymerase Chain Reaction- phản ứng trùng hợp
RE : Reaction enzyme
v/p : vòng / phút





DANH MỤC HÌNHẢNH

Hình 2.1: Tính chất vật lý và hóa học của carotenoid 4
Hình 2.2.Hai con đường sinh tổng hợp isoprenoids (IPP và DMAPP) và sự hình
thành các carotenoid từ các đơn vị isoprenoids (building block) (Lee and Schmidt-
Dannert 2002) 5
Hình 2.3 Sơ đồ tổng hợp công nghiệp hợp chất Lycopene (Ernst 2002) 8
Hình 2.4 Sơ đồ tổng hợp Xanthophyll (Ernst 2002) 9
Hình 2.5 : Vai trò carotenoid với sức khỏe con người(Debjani Dutta 2005) 11
Hình 2.6 Các gen sinh tổng hợp carotenoid trong vi khuẩn Pantoea ananatis 16
Hình 2.7: Con đường tổng hợp carotenoid trong vi khuẩn Pantoea ananatis 11
Hình 3.1: Cấu trúc vector biểu hiện pET28 20
Hình 3.2. Sơ đồ thiết kế vector pET28-iEIB 23
Hình 3.3 Quy trình gắn nối gen 25
Hình 3.4. Sơ đồ biến nạp plasmid pET28-iEIB vào E.coli DH5α 28
Hình 4.1: Kết quả điện di kiểm tra các dòng plasmid 33

Hình 4.2 : Kết quả điện di sản phẩm cắt Hình 4.3.Sơ đồ vector biểu hiện 34
plasmid các dòng bằng XbaI và EcoRI 34
Hình 4.4 Minh họa 2 khả năng gắn nối của cụm gen iEIB trong pET28 35
Hình 4.5 Kết quả cắt pET-iEIB với XhoI 36
Hình 4.6 Kết quả sản phẩm chạy điện di PCR 37
Hình 4.7 Biểu hiện sản xuất carotenoid trên dòng tế bào E.coli BL21 38




DANH MỤC BẢNG



Bảng 2.1 : Hàm lượng carotenoid có trong thực vật 7
Bảng 2.2 : Lợi ích về sức khỏe của một số carotenoid 14
Bảng 2.3. Một số carotenoid được sử dụng làm phụ gia trong thực phẩm và thức ăn
chăn nuôi 15
Bảng 3.1 thành phần cấu trúc vector pET28 20
Bảng 3.2 : Các thiết bị sử dụng trong đề tài 22
Bảng 3.3: Thành phần phản ứngcắt 26
Bảng 3.4 Thành phần phản ứng nối 27
Bảng 3.5. Thành phần phản ứng cắt XhoI 30
Bảng 3.6 Thành phần phản ứng PCR 31

1
PHẦN 1
MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Carotenoid là nhóm sắc tố phân bố rộng rãi và đa dạng trong tự nhiên. Nhóm
sắc tố này được tổng hợp trong một số sinh vật quang hợp bao gồm thực vật, vi
khuẩn lam và sinh vật không quang hợp bao gồm một số loài nấm và vi khuẩn.
Trong thực vật, carotenoid giữ vai trò quan trọng như tham gia vào quá trình quang
hợp, hình thành màu sắc và tạo thành các hormone thực vật. Cơ thể người và động
vật không tự tổng hợp được carotenoid [1]
Carotenoid không chỉ quan trọng với sinh vật tổng hợp ra nó mà nó còn quan
trọng với người và động vật: Carotenoid có tác dụng loại bỏ gốc oxy tự do để bảo
vệ cơ thể, ngăn ngừa quá trình ung thư và các bệnh tim mạch [2], tăng cường đáp
ứng miễn dịch [3]. Qua nghiên cứu người ta tìm thấy có hơn 20 loại có ý nghĩa quan
trọng trong tế bào động vật, là sắc tố không thể thiếu trong cơ thể động vật như: α-
carotene, β- carotene, lycopene, lutein, crytoxanthin … [4].
Trong công nghiệp, carotenoid đã được sử dụng làm chất màu thực phẩm,
chất bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, và gần đây hơn là sử dụng trong ngành công
nghiệp sản xuất mỹ phẩm và dược phẩm [5]. Với những lợi ích và tiềm năng ứng
dụng to lớn của chúng, người ta đã tìm ra các nguồn và phương pháp nhằm sản xuất
thương mại các carotenoid. Trong suốt quá trình đó, khi mà các phương pháp tách
chiết carotenoid từ thực vật hay tổng hợp hóa học đều có những nhược điểm nhất
định thì sử dụng vi sinh vật để tổng hợp carotenoid là một giải pháp tốt, với những
ưu điểm vượt trội như thân thiện với môi trường, giúp hạ giá thành sản phẩm và cho

phép đáp ứng được nhu cầu ngày càng tăng về carotenoid.
Gần đây, các nhà khoa học đã thành công trong việc sản xuất các carotenoid
trong các vi sinh vật dị carotenoid bằng kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Các nghiên cứu
của họ đã tiến hành biểu hiện các gen cần thiết để tổng hợp các đồng phân khác
nhau của carotenoid trong một số loài vi khuẩn như Zymomonas mobilis,
Agrobacterium tumefaciens [6]; trong nấm men [7] và trong Escherichia coli [8]

2
Việc thiết kế các gen sinh tổng hợp carotenoid trên các vector khác nhau nhằm
mang lại vật liệu phong phú trong quá trình chọn lọc chủng E.coli phù hợp trong
nghiên cứu, có khả năng tổng hợp carotenoid cao. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn tôi
thực hiện đề tài : “Thiết kế vector biểu hiện mang gene sinh tổng hợp carotenoid
trong E.coli”. Nhằm tạo ra nguồn vector mang gene tổng hợp carotenoid phong phú
có năng suất tổng hợp cao và là nguyên liệu cho quá trình tổng hợp β-carotene,
lycopene sau này
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Thiết kế vector biểu hiện tái tổ hợp trên nền tảng pET28a(+) mang các gen mã
hóa các enzyme xúc tác quá trình tổng hợp carotenoid.
1.3. Yêu cầu của đề tài
Thiết kế được vector biểu hiện tái tổ hợp trên nền tảng pET28a(+) mang các
gen mã hóa các enzyme xúc tác quá trình tổng hợp carotenoid.
1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả của đề tài là tiền đề cho các nghiên cứu về các hợp chất khác của
carotenoid sau này
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Sản phẩm của nghiên cứu góp phần tạo ra một phương pháp mới để sản xuất
carotenoid.

3

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Cơ sở khoa học
2.1.1. Nhóm sắc tố Carotenoid
Carotenoid là là nhóm sắc tố tự nhiên thuộc nhóm các hợp chất thứ cấp, được
tổng hợp trong nhiều loài thực vật, nấm, tảo và vi khuẩn [9]. Carotenoid là nhóm
sắc tố phổ biến và phân bố rộng rãi trong tự nhiên, đặc trưng cho màu sắc của nhiều
loài sinh vật như: màu tím của vi khuẩn tím, sắc tố nâu của tảo nâu, màu vàng ố của
con trai, màu đen của mai tôm càng, màu hồng của thịt cá hồi, cho đến một loạt màu
sắc của lông chim và da bò sát đều được hình thành bởi các sắc tố carotenoid [10],
màu đỏ, da cam đến vàng, màu xanh đậm của trái cây và rau quả hình thành cũng
do carotenoid [11]. Ngoài ra, carotenoid còn là sắc tố phụ cho quang hợp giúp tăng
quang phổ hoạt động và hiệu suất của quá trình quang hợp, giúp che chắn ánh sáng
bảo vệ diệp lục và tế bào và đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành các
hocmone [10]
Các hợp chất này rất cần thiết và giữ những vai trò quan trọng trong cơ thể
động vật và con người, tuy nhiên động vật và con người lại không thể tự tổng hợp
được carotenoid mà phải hấp thụ qua thức ăn. Hiện nay đã có hơn 600 hợp chất
carotenoid được tìm thấy trong tự nhiên, trong đó có hơn 40 hợp chất phổ biến được
tìm thấy trong khẩu phần ăn của con người, nhất là trong các loại rau và hoa quả có
màu và trong 40 hợp chất đó chỉ có 14 chất và một vài dạng chuyển hóa của chúng
được xác định có mặt trong huyết thanh và mô động vật [12]
Số lượng các hợp chất thuộc nhóm carotenoid là rất lớn, tuy nhiên các
carotenoid được chia thành hai nhóm lớn: nhóm thứ nhất là các hợp chất hydrocacbon
có mạch thẳng hoặc bị vòng hóa ở một hoặc cả hai đầu của phân tử - hay là nhóm các
carotene (lycopene, α-carotene, β-carotene…) và nhóm thứ hai là nhóm các dẫn xuất

oxy hóa hóa của các carotene - hay là các xanthophylls (lutein, α-cryptoxanthin, β-
cryptoxanthin, zeaxanthin, canthaxanthin, astaxanthin…) [9]

4
2.1.1.1. Cấu trúc phân tử các carotenoid
Các carotenoid được tạo thành từ nhiều phân tử isoprenoid (isopentenyl hay
terpenoid), do đó chúng cũng được gọi là polyprenoid, bằng cách kết hợp hai phân
tử geranylgeranyl diphosphate (có 20 cacbon) tạo ra một khung cacbon gồm 40
phân tử cacbon, khung cacbon này được biến đổi tạo ra nhiều carotenoid khác nhau
bằng cách: vòng hóa (tạo vòng) ở một hoặc cả hai đầu của phân tử tạo ra các nhóm
kết thúc ở hai đầu phân tử khác nhau; Thay đổi các mức hydro hóa; Thêm các nhóm
chứa oxy vào phân tử. Trong cấu trúc của các phân tử carotenoid chứa các liên kết
đơn đôi xem kẽ (polyene), tính chất này quy định hình dạng phân tử, khả năng phản
ứng hóa học, tính chất hấp thụ ánh sáng và tạo màu của các carotenoid. Mỗi liên kết
đôi trong chuỗi polyene của carotenoid có thể tồn tai ở hai dạng đồng phân trans
hoặc cis nhưng trong tự nhiên, hầu hết các carotenoid tồn tại ở dạng đồng phân
trans [13]
2.1.1.2 .Tính chất vật lý và tính chất hóa học của carotenoid

Hình 2.1: Tính chất vật lý và hóa học của carotenoid
2.1.2. Phương pháp tổng hợp carotenoid
2.1.2.1. Con đường sinh tổng hợp tự nhiên
Các carotenoid đều được tạo thành từ các tiền chất gọi là isoprenoid
(isopentenyl hay terpenoid). Có hai con đường tạo sinh tổng hợp các tiền chất này là
con đường mevalonate ( MVA) và con đường C-methyl-D-erythritol- 4 phosphat
Carotenoid

Lo
ạ
i b

ỏ

oxy
đơn

H
ấ
p th
ụ

ánh
sáng

D
ễ

dàng đ
ồ
ng phân hóa
và oxy hóa
Bám vào các b
ề

mặt kỵ nước

Tan trong Lipid,
không tan trong nước
Ph
ả
n

ứ
ng v
ớ
i các
gốc tự do


5
(MEP). Hai con đường này đều tạo ra cac tiền chất isopentenyl diphosphate ( IPP)
và các đồng phân của nó là dimethylallyl diphosphate (DMAPP)

Hình 2.2. Hai con đường sinh tổng hợp isoprenoids (IPP và
DMAPP) và sự hình thành các carotenoid từ các đơn vị isoprenoids
(building block) [14]
Sinh vật nhân chuẩn thường sử dụng con đường MVA để chuyển hóa acetyl-
CoA thành IPP, tiếp theo là đồng phân hóa IPP thành DMAPP. Sinh vật nhân sơ trừ
một số trường hợp ngoại lệ, thường sử dụng con đường MEP để sản xuất IPP và
DMAPP qua phản ứng ngưng tụ đầu tiên giữa pyruvateandglyceraldehyde-3-
phosphate. Thực vật và Streptomycetes thì sử dụng cả hai con đường [15]

6
Theo con đường MEP, phản ứng đầu tiên trong con đường tổng hợp IPP có
sản phẩm là 1-deoxy-D-xylulose-5- phosphate (DXP), phản ứng này được enzyme
DXP synthase xúc tác, enzyme này do gene dxs mã hóa. Sau đó DXP được chuyển
hóa thành 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate (MEP) bởi enzyme DXP
reductoisomerasedo gene ispC (dxr) mã hóa. Một chuỗi các enzyme trong con đường
MEP do các gene ispD (ygbP), ispE (ychB), ispF (ygbB), ispG (gcpE) và ispH (lytB)
mã hóa được sử dụng cho các phản ứng tiếp theo, giúp chuyển hóa MEP thành các
tiến chất trung tâm IPP và DMAPP [14]
Theo con đường MVA, quá trình tổng hợp IPP và đồng phân của nó bắt đầu

bằng phản ứng chuyển hóa ba phân tử acetyl-CoA thành MVA thông qua
acetoacetyl-CoA và β-hydroxy-β-methylglutarylcoenzyme A (HMG-CoA), cuối
cùng tạo thành IPP và đồng phân DMAPP. Sau khi IPP và DMAPP được tổng hợp
theo một trong hai con đường MVA hoặc MEP thì tiếp theo sẽ xảy ra sự kéo dài
mạch cac bon từ các tiền chất này. Quá trình kéo dài mạch cacbon bắt đầu bằng
phản ứng ngưng tụ liên tiếp từ đầu đến cuối của các tiền chất IPP và DMAPP làm
cho chuỗi polyprenyl diphosphate dài ra nhờ vào sự xúc tác của các enzyme.
Geranyldiphosphate (GPP, gồm 10 cacbon) và farnesyldiphosphate (FPP,gồm 15
cacbon) được tổng hợp nhờ enzyme FPP synthase do gene ispA mã hóa (trong
E. coli), sau đó FPP sẽ kết hợp với 1 phân tử IPP tạo thành
geranylgeranyldiphosphate (GGPP, gồm 20 cacbon) phản ứng này được xúc tác bởi
enzyme GGPP synthetase do gene CrtE mã hóa. FPP và GPPP là những hợp chất
trung gian quan trọng, đóng vai trò là tiền chất trực tiếp của các 30C và 40C
carotenoid, sự kết hợp của 2 phân tử FPP (15C) hoặc GGPP (20C) sẽ tạo thành bộ
khung cacbon, sau đó qua các phản ứng đồng phân hóa, vòng hóa, hydro hóa, oxy
hóa sẽ tạo thành các 30C và 40C carotenoid khác nhau
2.1.2.2. Sản xuất từ thực vật
Nguồn cung cấp chủ yếu carotenoid cho con người là từ rau xanh, trái cây và
các sản phẩm của rau quả. Theo nghiên cứu của Hà Thị Bích Ngọc và các cộng sự
tại Khoa Sinh học-Trường Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội
đã tiến hành phân tích và khảo sát hàm lượng carotenoid trong các bộ phận lá, hoa,

7
củ đối với 30 loài thực vật ở Việt Nam bằng phương pháp HPLC. Kết quả cho thấy,
trong các mẫu khảo sát hàm lượng β- caroten có nhiều nhất ở lá đu đủ (57,059%);
hàm lượng lutein có nhiều nhất ở lá đinh lăng (50,762%), hàm lượng lycopen có
nhiều nhất ở quả cà chua (22,483%) [16]
Bảng 2.1: Hàm lượng carotenoid có trong thực vật [16]

Carotenoid từ thực vật có thể sử dụng trực tiếp từ thực vật làm thức ăn cho
người và động vật hoặc tách chiết từ thực vật tạo dạng chế phẩm thương mại. Tuy
nhiên, phương pháp tách chiết từ thực vật còn mang nhiều hạn chế như: phụ thuộc
vào thời vụ, quy trình tách chiết phức tạp, thời gian dài và hiệu suất không cao [17]
2.1.2.2. Phương pháp tổng hợp bằng hóa học
Hơn 600 loại caroteneoid thì có ít nhất 8 loại được tổng hợp hóa học trên quy
mô công nghiệp bao gồm: lycopene, lutein, zeaxanthin, canthanxanthin, α-carotene,
β- carotene, β- crytoxanthin. Trong đó β- carotene sử dụng làm màu thực phẩm,
lycopene, zeaxanthin, được sử dụng làm chất bổ sung dinh dưỡng trong chăn nuôi
gia cầm va nuôi trồng thủy sản
Phương pháp sản xuất chủ yêu bằng cách tổng hợp các cấu trúc đối xứng ( có
thể biến đổi đồng nhất các nhóm cuối). Phương pháp hiệu quả để tạo ra cấu trúc đối

8
xứng là phản ứng ngưng tụ Wittig kép giữa một dialdehyde C10 đối xứng đóng vai
trò như là một đơn vị cấu thành cơ bản của muối phosphonium C15 thích hợp.
+ Phản ứng tổng hợp lycopene :

Hình 2.3 Sơ đồ tổng hợp công nghiệp hợp chất Lycopene [18]
Vật liệu khởi đầu sử dụng trong tổng hợp Lycopene là pseudoionone có chứa

13 nguyên tử cacbon và chưng cất tạo pseudoionone-E nguyên chất. Quá trình kéo
dài thêm hai nguyên tử cacbon để tạo ra đơn vị cấu thành cơ bản C15 (E)-vinyl
pseudoinone được thực hiện qua chuỗi phản ứng gồm hai bước: ethynyl hóa và
hydro hóa phần tiếp theo. Bước tiếp theo trong quá trình tổng hợp lycopene là việc
sắp xếp lai các (E)-vynyl pseudoionone để tạo thành muối photphoium lycopene,
đây là bước rất qua trọng. Tiếp theo các lập thể (Z) hình thành tại ba nhóm thế các
liên kết đôi ở vị trí (5/6) và (5’/6’) trong chuỗi polyene, bước này cần phải giảm tới
mức tối thiểu. Và được xử lý với hỗn hợp triphenylphosphate và acid acetic để tạo
ra C15 phosphonium. Việc tăng hàm lượng của đồng phân E bằng phương pháp trao
đổi ion giữa acetat và chlorid đã thu được của đồng phân E/Z là 3,7:1. Trong
phương pháp này hàm lượng các đồng phân Z giảm do sự tinh thế hóa.

9

+ Phản ứng tổng hợp Xanthopyll

Hình 2.4 Sơ đồ tổng hợp Xanthophyll [18]

Bên cạnh những ưu điểm của phương pháp tổng hợp hóa học là tạo ra được
sản phẩm tinh khiết và bền vững thì phương pháp này vẫn tồn tại có một số hạn chế
như: sự tổng hợp phức tạp, mỗi quy trình sản xuất một carotenoid mới thì yêu cầu
nghiên cứu ra một con đường hóa học mới, tương đối phức tạp, tồn tại một số chất
gây dị ứng. Ngoài ra, một số đồng phân tạo ra bằng phương pháp hóa học có thể
không hoạt động như đồng phân carotenoid tự nhiên, có tác dụng phụ và tạo chất
thải ô nhiễm môi trường. Do vậy, cần tìm phương pháp mới hiệu quả hơn, đồng thời
khắc phục nhược điểm của phương pháp hóa học
2.1.2.3. Sản xuất bằng phương pháp điều hướng trao đổi chất (Metabolic
engineering)
Kỹ thuật điều hướng trao đổi chất là phương pháp sử dụng công nghệ DNA
tái tổ hợp nhằm biến đổi mạng lưới trao đổi chất trong tế bào sống để sản xuất ra

các hợp chất mong muốn với hiệu suất cao. Phương pháp này có thể giúp sản xuất
các hợp chất hiệu quả hơn các phương pháp khác không thể thực hiện được.
Các gen mã hóa cho các enzyme trong con đường tổng hợp carotenoid của vi
khuẩn P. ananatis được sử dụng nhiều trong nghiên cứu sinh tổng hợp các
carotenoid trong các vật chủ mà bản thân không có chứa gen này. Một số carotenoid

10
đã được sản xuất thành công trong các vi sinh vật dị carotenoid như: Escherichia
coli, Saccharomyces ceverisiae, Candida untilis và Zymomonas mobilis, bằng cách
biến nạp các gene tham gia sinh tổng hợp các carotenoid từ các sinh vật khác
Điều hướng trao đổi chất đã được nghiên cứu áp dụng tăng cường sự biểu
hiện bằng cách đưa các gen crt của P. ananatis vào vi khuẩn E.coli
2.1.2.4 Vai trò của các gen trong tổng hợp carotenoid
Năm 1990 Misawa và cộng sự đã tách dòng và xác định trình tự các gene Crt
tham gia con đường sinh tổng hợp các carotenoid đồng thời làm sáng tỏ con đường
sinh tổng hợp các carotenoid trong vi khuẩn Pantoea ananatis bằng cách biến nạp
các gene Crt của vi khuẩn này vào E. coli và phân tích chức năng của các sản phẩm
do các gene đó mã hóa từ đó làm sáng tỏ thứ tự và vai trò của các gene trong con
đường sinh tổng hợp carotenoids trong vi khuẩn Pantoea ananatis [8]

11
Hình 2.7. Con đường tổng hợp carotenoid trong vi khuẩn Pantoea
ananatis
[8]


Nghiên cứu này cũng đã chỉ ra vai trò của từng gene trong sinh tổng hợp các
carotenoids trong Pantoea ananatis. Trong đó gen CrtB mã hóa cho enzyme
phytoen synthase xúc tác cho phản ứng chuyển hóa tiền chất geranylgernyl
PPi thành prephytoen. Gen CrtE mã hóa cho enzyme GGPP synthase xúc tác
cho phản ứng chuyển hóa tiền phytoene (prephytoene PP
i
) thành phytoene
cung cấp tiền chất cho phản ứng tạo thành lycopene do gen CrtI đảm nhiệm
mã hóa enzyme phytoen desatinase.
[8]

2.1.3. Vai trò carotenoid với sức khỏe con người
* Vai trò carotenoid với sức khỏe con người

Hình 2.5 : Vai trò carotenoid với sức khỏe con người[19]
Tiền chất vitamin A

Tiền chất
vitamin A
Carotenoid
Phòng ngừa bệnh

tim mạch
Ngăn ngừa thoái hóa
điểm vàng
Giảm nguy cơ đục
thủy tinh thể
ức chế tế bào ung thư
Tăng cường miễn
dịch

12
Chức năng quan trọng nhất của carotenoid với con người là khả năng chuyển
đổi thành pro-vitamin A. Vitamin A là nguyên tố quan trọng đối với sức khỏe con
người, nếu thiếu vitamin A con người dễ mắc phải một số bệnh như: rối loạn thị
lực, giảm hoạt động của phổi, khí quản gây các bệnh về khoang miệng. Ngoài ra,
vitamin A còn ảnh hưởng đến quá trình biệt hóa tế bào, quá trình tổng hợp
glycoprotein, quá trình tổng hợp dịch nhầy ở biểu mô, và quá trình hình thành, phát
triển của xương [19]
Trong cơ thể người và động vật không có khả năng tổng hợp carotenoid,
chúng ta phải cung cấp từ nguồn thức ăn từ thực vật và vi tảo. Theo nhiều nghiên
cứu đã chỉ ra lượng carotenoid hấp thu hàng ngày thích hợp cho một người là 6 mg,
giá trị này đã được tính toán dựa trên tỷ lệ của các hợp chất tiền vitamin A dạng hoạt
động (retinol), đặc biệt là β-carotene là hợp chất tiền vitamin A hoạt động có thể
chuyển hóa 100 % [20]
Ức chế tế bào ung thư
Carotenoid có tác động mạnh mẽ vào tế bào ung thư do chúng điều khiển tăng
trưởng của tế bào, điều hòa biểu hiện gene và tác động lên các tế bào miễn dịch. Tác
động này, carotenoid có thể hạn chế các sai khác bất thường dẫn tới sự phát triển
không ngừng của tế bào ung thư
Caroteinoid tác động vào quá trình ưng thư theo 2 hướng : một là chúng tác
động vào quá trình oxy hóa tế bào do tính chất oxy mạnh, hai là chúng tham gia vào
quá trình biệt hóa và phân chia của tế bào [21]
Lutein và zeaxanthin đã được chứng minh là có khả năng chống đột biến và
ung thư. Mỗi carotenoid có hoạt động khác nhau ở một giai đoạn phát triển khac nhau
của bệnh ung thư. β- carotene hoạt động ở giai đoạn đầu phát triển của khối u, trong
khi lutein hoạt động ở giai đoạn sau của bệnh [6]
Phòng ngừa bệnh tim mạch
Nguyên nhân chủ yếu gây bệnh tim mạch chủ yếu là do tích lũy quá nhiều
sản phẩm oxy hóa và viêm [22]. Đăc biệt là sự oxy hóa lipoprotein tỷ trọng thấp do
ROS (các phân tử dạng hoạt động có chứa oxy-hay các gốc tự do, ví dụ như oxy

nguyên tử hay các peroxit) gây ra và là nguyên nhân gây nên xơ vữa động mạch.

13
Carotenoid có tác dụng tới các bệnh tim mạch là chống lại quá trình oxy hóa
lipoprotein và sơ vữa động mạch. Ngoài ra caroteinoid đã được sử dụng để ức chế
con đường peroxy hóa lipid trong cơ thể, vì carotenoid có mặt trong màng tế bào
đóng vai trò quan trọng trong đảm bảo ổn định cấu trúc màng tế bào. Một số
carotenoid tham gia vào quá trình peroxy hóa cholesterol như: astaxanthin,
cantaxanthin, lutein và β- carotene [23]
Tăng cường miễn dịch
Carotenoid bảo vệ thực bào khỏi sự tự oxy hóa, thúc đẩy tế bào lympho B tăng
trưởng và kích thích khả năng đáp ứng miễn dịch, làm tăng cường đại thực bào và tế
bào độc tiêu diệt các tế bào khối u[24]. Ngoài ra, carotenoid còn có khả năng điều
tiết miễn dịch tiết ra interleukin-2 và interlukin -4, nâng cao khả năng miễn dịch của
cơ thể.
Ngăn thoái hóa điểm vàng
Lutein và zeaxanthin được biết đến là hai carotenoid duy nhất tồn tại trong mắt
người và tập trung nhiều nhất trong võng mạc mắt, thủy tinh thể. Tại điểm vàng,
lutein và zeaxanthin có chức năng chuyên biết hấp thu ánh sáng xanh- ánh sáng có
năng lượng cao nhất có khả năng gây tổn thương cho võng mạc, đồng thời chúng có
tác dụng giống như chất chống oxy hóa ngăn chặn tác động xấu của gốc tự do gây
tổn thương điểm vàng.

14

Bảng 2.2: Lợi ích về sức khỏe của một số carotenoid [25]
Carotenois Lợi ích với sức khỏe con người
Lycopene - Ngăn ngừa ung thư tuyến tiền liệt
- Phòng chống bệnh xơ vữa động mạch và hội chứng động mạch
vành cấp và mãn tính.

- Tăng cường khả năng miễn dịch
- Chống lão hóa
- Ngăn ngừa bệnh tim mạch
β-carotene - Tiền tố vitamin A dạng hoạt động quan trọng nhất
- Phòng chống ung thư trực tràng
- Bảo vệ da chống tia UV

Astaxanthin

- Ngăn chặn sự tiến triển của bệnh phì đại tuyến tiền liệt
- Ngăn chặn ung thư tuyến tiền liệt và ung thư gan
- Chống viêm
Zeaxanthin

- Duy trì chức năng bình thường của thị giác
- Phòng chống bệnh đục thủy tinh thể
- Ngăn ngừa bệnh thoái hóa điển vàng
Lutein - Ngăn ngừa hội chứng động mạch vành cấp và mãn tính và bệnh
đột quỵ
- Duy trì chức năng bình thường của thị giác
- Phòng chống đục thủy tinh thể và thoái hóa điểm vàng
- Phòng chống bện viêm võng mạc
- Hạn chế nhiễm trùng dạ dày

• Ý nghĩa trong công nghiệp và đời sống
Trong công nghiệp, carotenoid đã được sử dụng làm chất màu thực phẩm, chất
bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, và gần đây hơn là sử dụng trong ngành công nghiệp
sản xuất mỹ phẩm và dược phẩm [5]

15

Bảng 2.3. Một số carotenoid được sử dụng làm phụ gia trong thực phẩm và thức
ăn chăn nuôi [26]

Carotenoids
Nguồn thu nhận
Vai trò
Nguồn không phải
vi sinh vật
Vi sinh vật
β-carotene Cà rốt Blakeslea trispora
Dunaliella salina
Tạo màu thực
phẩm
Lycopene Cà chua
Blakeslea trispora; Streptomyces
chrestomyceticus
subsp. rubescens

Tạo màu thực
phẩm
Lutein Ngô, Cỏ ba lá, Ng
ũ
cốc, hoa Cúc Vạ
n
thọ
Spongiococcum excentricum
Chlorella pyrenoidosa
Thức ăn cho
gia cầm

Zeaxanthin (Giống nguồ
n thu
nhận Lutein)
Flavobacterium sp. Thức ăn cho
gia cầm và cá

Canthaxanthin -
Các loài Giáp xác
(ví dụ: Artemia)
-
Lông các loài chim,
gia cầm
- Tổng hợp nhân tạo
Cantharellus cinnabarinus
Brevibacterium KY-4313
Rhodococcus maris
( Mycobacterium brevicale)
Corynebacterium michiganense

Thức ăn cho
gia cầm và cá

Astaxanthin - Vỏ tôm thải
- Hoa của loài
Adonis
annua
- Tổng hợp nhân tạo
Mycobacterium lacticola
Brevibacterium 103
Phafja rhodozyma

Peniophora sp.

Thức ăn cho
cá
Rhodoxanthin - Cá Tilapia
- Lá cây mùa thu
Protomonas exrorquens Thức ăn cho
cá


16

2.2. Tình hình nghiên cứu carotenoid trong và ngoài nước
2.2.1. Tình hình nghiên cứu thế giới
Các sắc tố carotenoid nhận được sự quan tâm và bắt đầu được nghiên cứu từ
rất sớm, tuy nhiên các nghiên cứu từ trước thể kỷ XX chủ yếu là các nghiên cứu về
bản chất hóa học, các tính chất của carotenoid và phân lập tách chiết carotenoid từ
các nguồn trong tự nhiên.
Năm 1990 Misawa và cộng sự đã tách dòng và xác định trình tự các gene Crt
tham gia con đường sinh tổng hợp các carotenoid đồng thời làm sáng tỏ con đường
sinh tổng hợp các carotenoid trong vi khuẩn Pantoea ananatis bằng cách biến nạp
các gene Crt của vi khuẩn này vào E. coli và phân tích chức năng của các sản phẩm
do các gene đó mã hóa từ đó làm sáng tỏ thứ tự và vai trò của các gene trong con
đường sinh tổng hợp carotenoids trong vi khuẩn Pantoea ananatis

Hình 2.6. Các gen sinh tổng hợp carotenoid trong vi khuẩn Pantoea
ananatis

17

2.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam các nghiên cứu về carotenoid cũng đã được tiến hành. Hà Thị
Bích Ngọc và các cộng sự tại Khoa Sinh học-Trường Đại học Khoa học Tự nhiên-
Đại học Quốc gia Hà Nội đã tiến hành phân tích và khảo sát hàm lượng carotenoid
trong các bộ phận lá, hoa, củ đối với 30 loài thực vật ở Việt Nam bằng phương pháp
HPLC. Kết quả cho thấy, trong các mẫu khảo sát hàm lượng β- caroten có nhiều
nhất ở lá đu đủ (57,059%); hàm lượng lutein có nhiều nhất ở lá đinh lăng
(50,762%), hàm lượng lycopen có nhiều nhất ở quả cà chua (22,483%) [16]
Trong một nghiên cứu khác, khi phân tích các carotenoid ở thịt quả và màng
hạt trong trái Gấc Việt Nam cũng bằng phương pháp HPLC, các tác giả đã chỉ ra
trong trái Gấc chứa một lượng carotenoid khá lớn, nhất là ở màng hạt Gấc. Trong
một gam thịt quả gấc (phần có màu vàng) chứa 7-37 µg β-carotene, 0,2-1,6 µg
lycopene, còn trong một gam màng hạt gấc chứa 310-460 µg lycopene, 60-140 µg
β-carotene. Các tác giả cũng cho rằng nồng độ lycopene trong màng hạt gấc gấp từ
4-10 lần so với lượng lycopene trong một số rau quả được cho là giàu lycopene[27]
Tại Hội nghị Khoa học và Công nghệ lần thứ 9, hai tác giả Nguyễn Thị Lý
và Trần Thị Hồng Vân đã trình bày báo cáo phương pháp và kết quả nghiên cứu
tách chiết tinh dầu và carotenoid từ lá Trầu Không (Piper betle L.). Kết quả nghiên
cứu của họ cho thấy, tỷ lệ tinh dầu tách chiết được từ lá Trầu Không là 0,9-1% và
hàm lượng carotenoid đạt 0,19%. Sản phẩm này khá tinh khiết, quang phổ IR không
phức tạp, đồng dạng với phổ IR của β-caroten [28]
Trong nội dung của “Chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ trọng
điểm quốc gia phát triển công nghiệp hóa dược đến năm 2020” của chính phủ số
61/2007/QD-TTg năm 2007, đã đưa ra nội dung của chương trình nghiên cứu các
hoạt chất thiên nhiên để làm nguyên liệu sản xuất thuốc, trong đó có các nội dung:
- Tổ chức nhân giống và trồng đại trà cây gấc và cây hoa cúc giống tốt, có
hàm lượng carotenoid cao ở huyện Lương Sơn, tỉnh Hòa Bình;
- Sản xuất các hoạt chất carotenoid, nguyên liệu để bào chế thuốc viga,
vicuva, vicuga;