đề tài ''''thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa legumain”''''

ĐỀ TÀI
“Thiết kế vector biểu hiện gen mã
hóa legumain”
Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS LÊ QUANG HUẤN
Sinh viên thực hiện : Vũ Văn Trường
Lớp : KSCNSH 07-05
Viện Đại học Mở Hà Nội
Khoa Công nghệ sinh học

NỘI DUNG ĐỀ TÀI
1
1
Tổng quan tài liệu
2
2
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3
3
Kết quả và thảo luận
4
4
Kết luận và kiến nghị

TỔNG QUAN
Bệnh nhân ung thư

Tình hình ung thư trên thế giới và
Việt Nam
-
Theo ước tính củaTổ chức ung thư Liên hợp quốc,

vào năm 2030 có khoảng 13,2 triệu người chết
do ung thư.
- Hiệp hội nghiên cứu ung thư quốc tế - IARC
cũng cho biết, khoảng 21,4 triệu người mắc ung
thư mới sẽ được phát hiện vào năm 2030.
- Trung bình mỗi năm ở VN có 75.000 người
tử vong do bệnh ung thư, hơn 126 nghìn ca mới
mắc ung thư trong năm 2010, Hội Phòng chống
ung thư VN.

Các phương pháp điều trị ung thư
- Phương pháp điều trị tại chỗ.
- Phương pháp điều trị toàn thân.
- Ngoài các phương pháp điều trị trên, hiện
nay có nhiều nhà nghiên cứu đã ứng dụng
enzyme trong điều trị ung thư.
+ Điều trị ung thư não bằng E amphinase của ếch.
+ Enzyme CHIP trong điều trị ung thư vú.
+ Enzyme protease legumain.

Gới thiệu protease legumain
Cấu trúc không gian của legumain

+ Legumain là một protease phân giải protein.
+ Tồn tại trong cả động vật và thực vật.
+ Đặc hiệu cho sự thủy phân của liên kết
asparaginyl.
+ Hoạt động tối đa ở pH=5,5.
+ Legumain được biểu hiện cao ở một số loại
khối u như: tuyến tiền liệt, đại tràng và ung

thư vú.

Mục đích đề tài
Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa
legumain

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
Vật liệu
1
1
- Vector tái tổ hợp pBT mang gen mã hóa legumain
do phòng CNTBĐV - VCNSH cung cấp.
- và trang thiết bị tại phòng CNTBĐV – VCNSH.
Các loại hóa chất
- Vector biểu hiện pET-32c(+) do phòng
CNTBĐV - VCNSH cung cấp.

Hình ảnh pET-32c(+)

-
Hai enzyme cắt đầu so le EcoRI và HindIII
5’…G AATTC…3’
3’…CTTAA G…5’
Vị trí cắt của EcoRI
5’…A AGCTT…3’
3’…CTTAA G…5’
Vị trí cắt của HindIII
- Cặp mồi thiết kế đặc hiệu cho phản ứng PCR
T7F: 5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’

T7R: 3’-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-5’

Sơ đồ bố trí nghiệm
2
2
Vector pET-32c(+)
Vector pET-32c(+)
mở vòng
pBT-legumain
pET-32c(+) - legumain
Biến nạp vào
E.Coli chủng DH5α
Gen mã hóa legumain
Tách plasmid từ khuẩn lạc
PCR với cặp mồi T7R/T7F
Giải trình tự sản phẩm PCR

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Kết quả xử lý vector tách dòng pBT-legumain
với enzyme EcoRI và HindIII
1
1
1 2 3
Gen mã hóa legumain(900bp)
1000bp
750bp
Giếng 1: Thang DNA chuẩn (Fermantas)
Giếng 2: pBT-legumain gốc
Giếng 3: pBT-legumain sau khi cắt với 2 enzyme giới hạn

2
2
Kết quả tinh sạch đoạn gen mã hóa legumain
từ agarose
1 2
Gen mã hóa legumain(900bp)
1000bp
750bp
Đường chạy 1: Chỉ thị phân tử DNA (Fermentas)
Đường chạy 2: gen legumain

3
3
Kết quả xử lý vector biểu hiện pET-32c(+)
với enzyme EcoRI và HindIII
1 2
Giếng 1. pET-32c(+) gốc không xử lý với enzyme
Giếng 2. pET-32c(+) sau khi xử lý với 2 enzyme
giới hạn EcoRI và HindIII

4
4
Kết quả biến nạp sản phẩm gắn kết pET-32c(+)
và gen legumain
Đĩa Petri chứa khuẩn lạc sau khi biến nạp

5
5
Kết quả PCR từ khuẩn lạc chọn dòng vector

pET-32c(+)/legumain
1 2 3 4 5 6
1600bp
2000bp
1500bp
Giếng 1: Thang DNA chuẩn của (Fermantas)
Giếng 2
→
6: Sản phẩm PCR từ các khuẩn lạc 1-5

6
6
Ảnh Chromas kết quả sequence

1 atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt
51 actcaaagcg gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg
101 gtccgtgcaa aatgatcgcc ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat
151 cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac atcgatcaaa accctggcac
201 tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg ctgttcaaaa
251 acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg
301 aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca
351 ccatcatcat catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga
401 aagaaaccgc tgctgctaaa ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat
451 ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg ggatatctgt ggatccGAAT
501 TCTGATCAAC AGGCCCAATG GCACAGATGT CTATCAGGGA GTCCCGAAGG
551 ACTACACTGG AGAGGATGTT ACCCCACAAA ATTTCCTTGC TGTGTTGAGA
601 GGCGATGCAG AAGCAGTGAA GGGCATAGGA TCCGGCAAAG TCCTGAAGAG
651 TGGCCCCCAG GATCACGTGT TCATTTACTT CACTGACCAT GGATCTACTG
701 GAATACTGGT TTTTCCCAAT GAAGATCTTC ATGTAAAGGA CCTGAATGAG
751 ACCATCCATT ACATGTACAA ACACAAAATG TACCGAAAGA TGGTGTTCTA

801 CATTGAAGCC TGTGAGTCTG GGTCCATGAT GAACCACCTG CCGGATAACA
851 TCAATGTTTA TGCAACTACT GCTGCCAACC CCAGAGAGTC GTCCTACGCC
901 TGTTACTATG ATGAGAAGAG GTCCACGTAC CTGGGGGACT GGTACAGCGT
951 CAACTGGATG GAAGACTCGG ACGTGGAAGA TCTGACTAAA GAGACCCTGC
1001 ACAAGCAGTA CCACCTGGTA AAATCGCACA CCAACACCAG CCACGTCATG
1051 CAGTATGGAA ACAAAACAAT CTCCACCATG AAAGTGATGC AGTTTCAGGG
1101 TATGAAACGC AAAGCCAGTT CTCCCGTCCC CCTACCTCCA GTCACACACC
1151 TTGACCTCAC CCCCAGCCCT GATGTGCCTC TCACCATCAT GAAAAGGAAA
1201 CTGATGAACA CCAATGATCT GGAGGAGTCC AGGCAGCTCA CGGAGGAGAT
1251 CCAGCGGCAT CTGGATGCCA GGCACCTCAT TGAGAAGTCA GTGCGTAAGA
1301 TCGTCTCCTT GCTGGCAGCG TCCGAGGCTG AGGTGGAGCA GCTCCTGTCC
1351 GAGAGAGCCC CGCTCACGGG GCACAGCTGC TACCCAGAGG CCCTGCTGCA
1401 CTTCCGGACC CAAAGCTTgc ggccgcactc gagcaccacc accaccacca
1451 ctgagatccg gctgctaaca aagcccgaaa ggaagctgag ttggctgctg
1501 ccaccgctga gcaataacta g
7
7
Kết quả xác định trình tự legumain

- Gen này có sự tương đồng 100% với các
trình tự có mã số đăng ký AY409389,
DQ895070 và SY:DQ891884 tại ngân hàng
gen quôc tế

8
8
Trình tự amino acid
1 MSDKIIHLTD DSFDTDVLKA DGAILVDFWA EWCGPCKMIA PILDEIADEY
51 QGKLTVAKLN IDQNPGTAPK YGIRGIPTLL LFKNGEVAAT KVGALSKGQL
101 KEFLDANLAG SGSGHMHHHH HHSSGLVPRG SGMKETAAAK FERQHMDSPD

151 LGTDDDDKAM GYLWIRILIN RPNGTDVYQG VPKDYTGEDV TPQNFLAVLR
201 GDAEAVKGIG SGKVLKSGPQ DHVFIYFTDH GSTGILVFPN EDLHVKDLNE
251 TIHYMYKHKM YRKMVFYIEA CESGSMMNHL PDNINVYATT AANPRESSYA
301 CYYDEKRSTY LGDWYSVNWM EDSDVEDLTK ETLHKQYHLV KSHTNTSHVM
351 QYGNKTISTM KVMQFQGMKR KASSPVPLPP VTHLDLTPSP DVPLTIMKRK
401 LMNTNDLEES RQLTEEIQRH LDARHLIEKS VRKIVSLLAA SEAEVEQLLS
451 ERAPLTGHSC YPEALLHFRT QSLRPHSSTT TTTTEIRLLT KPERKLSWLL
501 PPLSNN*

KẾT LUẬN
- Đã thiết kế thành công vector biểu hiện
mang đoạn gen mã hóa legumain
- Đoạn gen này đã được gắn vào vector
pET-32c(+)vào giữa các vị trí nhận biết
của enzyme giới hạn EcoRI và HindIII.

KIẾN NGHỊ
- Tiếp tục nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa
legumain trên các hệ biểu hiện hợp lý.
- Nghiên cứu để tối ưu hóa quá trình biểu hiện
và tinh chế legumain phục vụ cho các nghiên
cứu tiếp theo.