Nghiên cứu sự biến đổi di truyền các gen PB2, PB1 và PA polymerase của virus cúm A-H5N1 đương nhiễm tại Việt Nam [FULL]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI




NGUYỄN MẠNH KIÊN




NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN
CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA POLYMERASE
CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 ĐƯƠNG NHIỄM
TẠI VIỆT NAM



Chuyên ngành : HÓA SINH Y HỌC
Mã số : 62 72 01 12



LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC



Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. LÊ THANH HÒA
2. PGS.TS. ĐẶNG THỊ NGỌC DUNG

HÀ NỘI – 2014
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận án của mình, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu
sắc tới các Thầy (Cô):
- PGS.TS. Lê Thanh Hòa – Viện Công nghệ sinh học,
- PGS.TS. Đặng Thị Ngọc Dung – Trường Đại học Y Hà Nội,
đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận án này.
- Thầy Chủ tịch Hội đồng và các Thầy (Cô) trong Hội đồng chấm luận án,
cùng các nhà khoa học trong cả nước, đã có nhiều ý kiến quí báu, giúp tôi hoàn
thiện luận án của mình.
Trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận án của mình,
tôi nhận được sự giúp đỡ quí báu của Nhà trường, đơn vị công tác, tập thể, các nhà
khoa học, gia đình và bè bạn. Tôi xin trân trọng cảm ơn:
- Ban giám hiệu Trường Đại học Y Hà Nội; Ban lãnh đạo Bệnh viện quân y
7A, Cục Hậu cần, Quân khu 7, đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá
trình học tập và nghiên cứu tại trường.
- Thầy, cô và các anh, chị trong Bộ môn Hóa sinh, Phòng Quản lý đào tạo Sau
đại học, Trung tâm Gen và Protein – Trường Đại học Y Hà Nội, Phòng Miễn dịch
học – Viện Công nghệ sinh học, đã tạo điều kiện giúp đỡ chỉ bảo tôi trong suốt quá
trình thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận án.
- Cơ quan thú y các vùng trong cả nước hết lòng ủng hộ, cung cấp mẫu bệnh
phẩm và thông tin dịch bệnh giúp tôi thực hiện đề tài nghiên cứu.
- Ban chủ nhiệm đề tài: “Nghiên cứu virus cúm A/H5N1 ở Việt Nam và Thái
Lan: Dịch tễ phân tử, chẩn đoán và vắc-xin phòng chống”, trong khuôn khổ Nhiệm
vụ “Nghị định thư hợp tác nghiên cứu với Thái Lan”, đã giúp đỡ hỗ trợ tôi kinh phí
thực hiện đề tài nghiên cứu của mình.
- Cuối cùng, tôi xin được cảm ơn gia đình và người thân, đã hỗ trợ động viên

tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu của mình.
Hà Nội, ngày …tháng 8 năm 2014
NGHIÊN CỨU SINH

Nguyễn Mạnh Kiên
LỜI CAM ĐOAN
- Tôi xin cam đoan số liệu trong luận án là một phần số liệu đề tài nghiên cứu
Nghị định thư hợp tác nghiên cứu với Thái Lan có tên: “Nghiên cứu virus cúm
A/H5N1 ở Việt Nam và Thái Lan: Dịch tễ phân tử, chẩn đoán và vắc - xin phòng
chống”. Phần kết quả trong đề tài luận án này là thành quả nghiên cứu của tập thể
mà tôi là một thành viên chính. Tôi đã được sự đồng ý của Chủ nhiệm đề tài và toàn
bộ các thành viên trong nhóm nghiên cứu, cho phép sử dụng phần số liệu trên vào
trong luận án để bảo vệ lấy bằng tiến sĩ.
- Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là hoàn toàn trung thực. Một
phần số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án đã được công bố trên các Tạp chí
khoa học chuyên ngành, với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần còn
lại chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác.
Hà Nội, ngày ….tháng 08 năm 2014
TÁC GIẢ



Nguyễn Mạnh Kiên


i

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa
Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Mục lục i

Danh mục chữ viết tắt trong luận án iv

Danh mục các bảng v

Danh mục các hình và sơ đồ vii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1. TỔNG QUAN 3

1.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS CÚM A 3

1.1.1. Cấu tạo chung của virus cúm A 3

1.1.2. Đặc điểm cấu tạo hệ gen của virus cúm A 4

1.1.3. Cấu tạo và chức năng của các phân đoạn RNA hệ gen virus cúm A 5

1.1.4. Đặc điểm cấu tạo và chức năng của các gen PB2, PB1 và PA 7

1.1.5. Phức hợp enzym polymerase của virus cúm A 12

1.1.6. Đặc tính biến đổi di truyền các gen và hệ gen virus cúm A 14

1.2. ĐẠI DỊCH CÚM A VÀ ĐẶC ĐIỂM BIẾN ĐỔI CÁC GEN PB2, PB1 VÀ
PA CỦA VIRUS CÚM A GÂY ĐẠI DỊCH CÚM Ở NGƯỜI

16

1.2.1. Các đại dịch cúm A ở người trong lịch sử 16

1.2.2. Đặc điểm biến đổi các gen PB2, PB1 và PA của virus cúm A gây đại dịch
cúm ở người

17

1. 3. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ VÀ SINH HỌC VIRUS CÚM A/H5N1 22

1.3.1. Đặc điểm dịch tễ virus cúm A/H5N1 22

1.3.2. Đặc điểm sinh học của virus cúm A/H5N1 26

1.4. NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI CÁC GEN PB2, PB1, PA LIÊN QUAN ĐỘC
LỰC VÀ LÂY TRUYỀN Ở NGƯỜI CỦA VIRUS CÚM A/H5N1

28

1.4.1. Trên thế giới 28

1.4.2. Tại Việt Nam 30

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 33

2.1.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 33

2.1.2. Dụng cụ, trang thiết bị 35

2.1.3. Các bộ kit sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu 36

2.1.4. Môi trường sử dụng trong dòng hóa 36

2.1.5. Các hóa chất sử dụng trong điện di trên gel agarose 36

ii



2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.2.1. Kỹ thuật tách chiết ribonucleic acid tổng số 38

2.2.2. Thiết kế các trình tự mồi nucleotide sử dụng trong nghiên cứu 38

2.2.3. Kỹ thuật RT-PCR 41

2.2.4. Tinh sạch DNA sản phẩm PCR 44

2.2.5. Kỹ thuật điện di nucleic acid trên gel agarose 45

2.2.6. Kỹ thuật dòng hóa DNA 45

2.2.7. Giải trình tự DNA 48

2.2.8. Xử lí, kiểm chứng, thu nhận trình tự nucleotide và amino acid của các gen
nghiên cứu

50

2.3. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 52

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53

3.1. KẾT QUẢ THU NHẬN VÀ GIẢI TRÌNH TỰ CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA
CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU

53

3.1.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số và chuyển đổi cDNA hệ gen virus 53

3.1.2. Kết quả PCR thu nhận và dòng hóa DNA các gen PB2, PB1 và PA 54

3.1.3. Kết quả giải trình tự DNA các gen PB2, PB1 và PA 60

3.2. KẾT QUẢ SO SÁNH THÀNH PHẦN NUCLEOTIDE VÀ AMINO ACID
CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM
A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG THẾ GIỚI


61

3.2.1. Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB2 61

3.2.1.1 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB2 61

3.2.1.2 Kết quả so sánh tỉ lệ tương đồng về nucleotide và amino acid gen PB2 65

3.2.2. Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 67

3.2.2.1 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 67

3.2.2.2 Kết quả so sánh tỉ lệ tương đồng về nucleotide và amino acid gen PB1 69

3.2.2.3 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1-F2 69

3.2.2.4 Kết quả xác định trình tự khung đọc mở gen PB1-N40 73

3.2.3. Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PA 73

3.2.3.1 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PA 73

3.2.3.2 Kết quả so sánh tỉ lệ tương đồng về nucleotide và amino acid gen PA 77

3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ NGUỒN GỐC CÁC GEN PB2, PB1 VÀ
PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU

79

3.3.1. Kết quả phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PB2 79

3.3.2. Kết quả phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PB1 82

3.3.3. Kết quả phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PA 85

iii

Chương 4. BÀN LUẬN 88

4.1. VỀ KẾT QUẢ THU NHẬN CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN
CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU

88

4.1.1. Về kết quả thu nhận các gen PB2, PB1 và PA 88

4.1.2. Về qui trình nghiên cứu thu nhận các gen PB2, PB1 và PA 88

4.2. VỀ KẾT QUẢ SO SÁNH THÀNH PHẦN NUCLEOTIDE VÀ AMINO
ACID CÁC GEN PB2, PB1, PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM
A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG CỦA THẾ GIỚI


89

4.2.1. Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB2 89

4.2.2. Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 93

4.2.2.1 Về kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 93

4.2.2.2 Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB1-F2 94

4.2.2.3 Về kết quả xác định trình tự khung đọc mở gen PB1-N40 96

4.2.3. Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PA 97

4.3. VỀ KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ NGUỒN GỐC CÁC GEN PB2, PB1,
CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC
CHỦNG CỦA THẾ GIỚI


99

4.3.1. Về kết quả xác định phả hệ nguồn gốc gen PB2 99

4.3.2. Về kết quả xác định phả hệ nguồn gốc gen PB1 102

4.3.3. Về kết quả xác định phả hệ nguồn gốc gen PA 103

4.4. PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI PHỨC HỢP ENZYM POLYMERASE, TỔ HỢP
CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM
A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG CỦA THẾ GIỚI


105

4.3.1. Về đặc điểm biến đổi phức hợp enzym polymerase liên quan bệnh học và
dịch tễ học lây truyền sang người của virus cúm A/H5N1

105

4.3.2. Về nguồn gốc tổ hợp các gen PB2, PB1 và PA polymerase 108

KẾT LUẬN 114

KIẾN NGHỊ 116

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN
QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

iv

DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT

Chữ viết tắt/
Ký hiệu
Tên đầy đủ
bp base pair
Da dalton
DNA Deoxyribonucleic acid
dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate
ddNTP Dideoxynucleotide Triphosphate
FAO Food and Agriculture Organization
HA Hemagglutinin
kb kilobase
M Matrix protein
MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis

NA Neuraminidase
NEP Nuclear Export Protein
NP Nucleoprotein
NS Non-structural protein
OIE Office International des Epizooties
PA Polymerase acidic protein
PB1 Polymerase basic protein 1
PB2 Polymerase basic protein 2
RT-PCR Reverse transcription - polymerase chain reaction
RNA Ribonucleic acid
RNP Ribonucleoprotein
(-) ssRNA Negative single-strand Ribonucleic Acid
WHO
cs.
World Health Organization
Cộng sự

v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Tên bảng Trang

1.1. Tóm tắt đặc tính cấu tạo 8 phân đoạn RNA hệ gen và chức năng các
protein của virus cúm A

6

1.2. Tóm tắt lịch sử các đại dịch và dịch cúm A ở người 17

1.3. Các vị trí thay đổi amino acid trong protein PB2, PB1 và PA, giữa virus
cúm A ở gia cầm với chủng virus A/H1N1/1918 và virus cúm A ở người

19

1.4. Số người nhiễm và tử vong do virus cúm A/H5N1 từ 2003 đến nay 23

1.5. Các vị trí thay đổi amino acid ở 3 protein PB2, PB1 và PA, liên quan đến
độc lực và thích nghi lây truyền của virus cúm A/H5N1 trên người

29

2.1. Danh sách 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 sử dụng trong nghiên cứu 33

2.2. Danh sách 19 chủng virus cúm A/H5N1 đại diện sử dụng trong so sánh
đặc tính di truyền các gen PB2, PB1 và PA

34

2.3. Danh sách 31 chủng virus cúm A/H5N1 bổ sung xây dựng cây phả hệ
nguồn gốc các gen PB2, PB1 và PA

35

2.4. Danh sách mồi chuyển cDNA, kiểm tra cDNA hệ gen, thu nhận và giải
trình tự các gen PB2, PB1 và PA của virus cúm A/H5N1 trong nghiên cứu

39

2.5. Thành phần và qui trình phản ứng chuyển đổi cDNA hệ gen virus cúm

A/H5N1 từ RNA tổng số trong nghiên cứu

42

2.6. Thành phần phản ứng của kỹ thuật PCR kiểm tra cDNA hệ gen 6 biến
chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu

43

2.7. Chu trình nhiệt của kỹ thuật PCR kiểm tra cDNA hệ gen 6 biến chủng virus
cúm A/H5N1 nghiên cứu

43

2.8. Thành phần phản ứng của kỹ thuật PCR thu nhận DNA các gen PB2, PB1
và PA từ cDNA hệ gen của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu

44

2.9. Chu trình nhiệt của kỹ thuật PCR thu nhận DNA các gen PB2, PB1 và PA
từ cDNA hệ gen 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu

44

2.10. Thành phần phản ứng ghép-nối đoạn cDNA sản phẩm PCR vào plasmid
pCR
®
2.1-TOPO
®

47

2.11. Thành phần phản ứng cắt DNA plasmid tái tổ hợp bằng E.coRI 48

2.12. Thành phần phản ứng PCR giải trình tự DNA các gen PB2, PB1 và PA
của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu

49

2.13. Chu trình nhiệt của kỹ thuật PCR giải trình tự DNA các gen PB2, PB1 và
PA của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu

50

3.1. Các vị trí sai khác nucleotide dẫn đến thay đổi amino acid trong trình tự
gen PB2 của 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh

63

vi

Bảng Tên bảng Trang



3.2. Các vị trí thay đổi amino acid trong protein PB2 của 25 chủng virus cúm
A/H5N1 được so sánh

64

3.3. Tỉ lệ tương đồng (%) thành phần nucleotide và amino acid gen PB2 của
25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh

66

3.4. Các vị trí sai khác nucleotide trong trình tự protein PB1 dẫn đến thay đổi
amino acid trong protein PB1 của 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh

68

3.5. Tỉ lệ tương đồng (%) thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 của
25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh

70

3.6. Các vị trí sai khác nucleotide dẫn đến thay đổi amino acid trong trình tự
gen PB1-F2 của 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh

71

3.7. Các vị trí sai khác nucleotide dẫn đến thay đổi amino acid trong trình tự
gen PA của 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh

75

3.8. Các vị trí thay đổi amino acid trong trình tự gen PA của 25 chủng virus
cúm A/H5N1 được so sánh

76

3.9. Tỉ lệ tương đồng (%) thành phần nucleotide và amino acid gen PA của 25
chủng virus cúm A/H5N1 so sánh

78

4.1. Các vị trí thay đổi amino acid ở 3 protein PB2, PB1 và PA polymerase,
liên quan độc lực gây bệnh, lây truyền của virus cúm A/H5N1 trên người

106

4.2. Nguồn gốc tiến hóa xác định theo genotype của các gen PB2, PB1 và PA
polymerase, trong hệ gen 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu và
các chủng virus tham chiếu phân lập từ năm 2003 đến nay


109


vii

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

Hình/
Sơ đồ
Tên hình, sơ đồ Trang

1.1. Mô hình và ảnh chụp các tiểu phần virus cúm A 4

1.2. Mô hình cấu trúc hệ gen virus cúm A 5

1.3. Sơ đồ sắp sếp và trình tự vị trí codon AUG xác định điểm khởi đầ
u các
ORF trong vùng đầu 5’- RNA thông tin gen PB1 virus cúm A

9

1.4. Mô hình phân bố các vùng chức năng của protein PA 12

1.5. Mô hình cấu trúc 3D và vị trí phức hợp polymerase trong cấu trúc mỗ
i
phân đoạn RNP hệ gen của virus cúm A

12

1.6. Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A ở tế bào chủ 13

1.7. Sơ đồ minh họa đặc tính biến đổi di truyền của các phân đoạn và hệ
gen
virus cúm A

15

1.8. Sơ đồ hình thành các virus cúm A gây đại dịch cúm ở người 21

1.9. Cây phả hệ minh họa sự hình thành và lưu hành xâm nhiễm gây bệnh ở

người của các clade HA(H5) virus cúm A/H5N1 ở châu Á từ 2003 – 2011

23

1.10. Sơ đồ minh họa tái tổ hợp hình thành các genotype Z, G và V củ
a virus
cúm A/H5N1

24

1.11. Các genotype virus cúm A/H5N1 hình thành ở Việt Nam 26

2.1. Sơ đồ qui trình tổng quát nghiên cứu các gen PB2, PB1 và PA

polymerase của virus cúm A/H5N1

37

2.2. Sơ đồ bố trí vị trí bám mồi chuyển cDNA, thực hiện kỹ thuật PCR và giả
i
trình tự các gen PB2, PB1 và PA của virus cúm A/H5N1

41

2.3. Sơ đồ nguyên lí của kỹ thuật PCR 41

2.4. Sơ đồ cấu trúc của vector pCR
®
2.1TOPO (Invitrogen) 47

3.1. Kết quả điện di kiểm tra DNA một phần gen HA(H5) với cặp mồi H5F1 – H5R1
của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu

53

3.2. Kết quả điện di kiểm tra DNA gen PB2 của 6 biến chủ
ng virus cúm
A/H5N1 nghiên cứu thu nhận sau PCR

54

3.3. Kết quả điện di kiểm tra DNA gen PB1 của 6 biến chủng virus cúm
A/H5N1 nghiên cứu thu nhận sau PCR

55

3.4. Kết quả điện di kiểm tra DNA gen PA của 6 biến chủng virus cúm
A/H5N1 nghiên cứu thu nhận sau PCR

56

3.5. Kết quả điện di kiểm tra các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp gen PB2 của 6
biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu sau cắt bằng enzym EcoRI

57

viii

Hình/
Sơ đồ
Tên hình, sơ đồ Trang

3.6. Kết quả điện di kiểm tra các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp gen PB1 của 6
biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu sau cắt bằng enzym EcoRI

58

3.7. Kết quả điện di kiểm tra các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp gen PA của 6
biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu sau cắt bằng enzym EcoRI

59

3.8. Các vị trí thay đổi amino acid trong trình tự protein PB1-F2 của 25
chủng virus cúm A/H5N1 so sánh

72

3.9. Cây phả hệ nguồn gốc 56 chủng virus cúm A/H5N1 dựa trên trình tự
nucleotide gen PB2 polymerase

80

3.10. Cây phả hệ nguồn gốc 56 chủng virus cúm A/H5N1 dựa trên trình tự
nucleotide gen PB1 polymerase

83

3.11. Cây phả hệ nguồn gốc 56 chủng virus cúm A/H5N1 dựa trên trình tự
nucleotide gen PA polymerase

86

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae, gồm nhiều phân type (subtype) lưu
hành ở chim hoang dã, có khả năng biến đổi xâm nhiễm, lây truyền sang người và
nhiều loài động vật, nguyên nhân gây ra các đại dịch cúm A ở người trong lịch sử.
Hệ gen của virus cúm A là ribonucleic acid (RNA) sợi đơn âm, gồm 8 phân
đoạn RNA riêng biệt là PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M và NS, lần lượt mã hóa
tổng hợp 12 protein tương ứng được biết cho đến nay, đó là PB2, PB1, PB1-N40,
PB1-F2, PA, HA, NP, NA, M1, M2, NS1 và NS2. Các protein trên tham gia cấu tạo
hạt virus và đảm bảo các chức năng xâm nhiễm, độc lực và thích nghi lây truyền
gây bệnh của virus ở các loài vật chủ. Đặc biệt, phức hợp enzym polymerase của
virus cúm A không có cơ chế “đọc-sửa” bản sao trong quá trình sao chép, tổng hợp
các phân đoạn RNA hệ gen của hạt virus mới. Đặc tính cấu trúc hệ gen và enzym
polymerase giúp virus cúm A có khả năng đột biến cao, hình thành chủng virus mới
thay đổi độc lực hoặc chuyển nhiễm, thích nghi lây truyền sang nhiều loài vật chủ
và người trong quá trình lưu hành tự nhiên. Trong đó, các gen PB2, PB1 và PA mã
hóa tổng hợp 3 protein PB2, PB1 và PA polymerase, là các đơn vị cấu tạo phức hợp
enzym polymerase, có vai trò quyết định khả năng thích nghi nhân lên và lây truyền
của virus ở cơ thể các loài vật chủ. Ngoài ra, gen PB1 còn chứa 2 khung đọc mở
gen PB1-F2 và PB1-N40 mã hóa tổng hợp các protein tương ứng, tham gia biểu
hiện độc lực của virus cúm A ở cơ thể bị nhiễm.
Từ năm 2003 đến nay, virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao nguyên nhân gây ra
dịch cúm gia cầm và gây bệnh có tỉ lệ tử vong cao ở người (khoảng 60%), lan
truyền rộng rãi tới hơn 60 quốc gia trên thế giới. Trong đó, Việt Nam là quốc gia có
dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát vào năm 2003 và liên tục tái bùng phát nhiều
đợt dịch ở gia cầm hàng năm tại các địa phương, với hơn 62 người tử vong trong
tổng số hơn 124 người được xác định nhiễm loại virus này. Các trường hợp người
nhiễm và tử vong bởi virus cúm A/H5N1, được xác định là do virus xâm nhiễm trực

tiếp sang người thông qua tiếp xúc với gia cầm bệnh, chất thải ô nhiễm hoặc do sử
dụng các sản phẩm chứa virus từ gia cầm bệnh. Việt Nam cùng với Indonesia và Hy
Lạp, là các quốc gia có tỉ lệ người nhiễm và tử vong do virus cúm A/H5N1 cao nhất
2

trên thế giới, được xác định là vùng dịch tễ trọng điểm cần quan tâm giám sát, ngăn
chặn, khống chế sự lây truyền của virus ở gia cầm và từ gia cầm sang người.
Các chủng virus cúm A/H5N1 clade 1, 2 và 7 với sự hình thành nhiều nhánh
clade thuộc 3 genotye Z, V và G, là các nhóm virus lưu hành phổ biến gây dịch cúm
A/H5N1 ở chim hoang dã, gia cầm và xâm nhiễm gây bệnh với tỉ lệ tử vong cao ở
người, tại Việt Nam và nhiều quốc gia trên thế giới từ năm 2003 đến nay. Gần đây,
nhóm virus clade 1.1 và đặc biệt là nhóm virus clade 2.3.2.1 hình thành từ năm
2009, có sự thay đổi lớn về kháng nguyên H5, có độc lực cao ở gia cầm và người
nhiễm so với các nhóm virus lưu hành trước đó, làm cho vấn đề phòng chống dịch
cho gia cầm và ngăn ngừa virus xâm nhiễm ở người trở nên phức tạp hơn.
Sự biến đổi của các gen PB2, PB1 và PA là cơ sở giúp virus thích nghi nhân
lên trong tế bào cảm thụ, yếu tố chìa khóa quyết định quá trình lây truyền dễ dàng
giữa người với người và gia tăng độc lực của virus ở cơ thể người, một trong các
vấn đề được quan tâm nghiên cứu giám sát ở virus cúm A/H5N1 gây bệnh dịch ở
gia cầm và người hiện nay. Bên cạnh đó, dữ liệu di truyền của các gen PB2, PB1 và
PA cùng với các gen trong hệ gen virus cúm A/H5N1 đương nhiễm, là cơ sở khoa
học cho phép dự báo sớm diễn biến dịch tễ học virus ở mức độ phân tử, nghiên cứu
phát triển vaccine tái tổ hợp và sử dụng vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1
cho người và gia cầm trong tương lai.
Xuất phát từ cơ sở lí luận và thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên
cứu sự biến đổi di truyền các gen PB2, PB1 và PA polymerase của virus cúm
A/H5N1 đương nhiễm tại Việt Nam”.
Nhằm các mục tiêu:
1- Giải trình tự, so sánh biến đổi đặc tính di truyền, tương đồng về nucleotide
và amino acid các gen PB2, PB1, PA, của một số biến chủng virus cúm A/H5N1

đương nhiễm tại Việt Nam từ năm 2007 – 2011 với các chủng A/H5N1 trên thế giới.
2- Tìm hiểu nguồn gốc phả hệ các gen nói trên của các biến chủng virus cúm
A/H5N1 trong nghiên cứu với các chủng virus A/H5N1 của Việt Nam và thế giới.
3


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS CÚM A
Virus cúm A (influenza A virus) là nhóm virus thuộc họ Orthomyxoviridae, bộ
Mononegavirales, còn gọi là virus cúm chim (avian influenza virus, AIV) hay virus cúm gia
cầm. Vị trí phân loại của virus cúm A trong hệ thống phân loại cơ sở (Basic Taxonomy) là:
Viruses; ssRNA negative-stranded viruses; Orthomyxoviridae; Influenzavirus A [1], [2], [3].
Nhóm virus cúm A gồm nhiều phân type (subtype), biểu hiện đặc tính kháng
nguyên của hai protein là hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) gắn trên bề
mặt vỏ capsid hạt virus, cho đáp ứng kháng thể khác nhau của cơ thể nhiễm với mỗi
kháng nguyên này giữa các phân type virus. Cho đến nay, đã phát hiện có 16 phân
type HA (kí hiệu từ H1 đến H16) và 9 phân type NA (từ N1 đến N9) của virus cúm
A lưu hành ở chim hoang dã. Sự tổ hợp của các phân type HA và NA, có thể dẫn
đến sự hình thành hơn 144 phân type virus cúm A khác nhau lưu hành trong tự
nhiên. Trong đó, 3 phân type virus cúm A/H1N1, A/H2N2 và A/H3N2, đã có sự
biến đổi hình thành các chủng virus thích nghi lây truyền dễ dàng trong quần thể
gây ra các đại dịch cúm A ở người trong lịch sử [1], [2], [3], [4], [5], [6].
Đặc trưng virus cúm A là kí sinh nội bào bắt buộc, cấu tạo hạt virus đơn giản
với hệ gen là phân tử RNA sợi đơn âm, gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt có khả năng
tự nhân lên trong nhân của tế bào nhiễm. Bên cạnh đó, phức hợp enzym polymerase
của virus cúm A thuộc nhóm enzym RNA phụ thuộc RNA type II, không có cơ chế
đọc-sửa bản sao, tạo nên khả năng đột biến cao trong hệ gen, qua quá trình lây
truyền và lưu hành gây bệnh của virus ở các loài vật chủ [1], [2], [6].
1.1.1. Cấu tạo chung của virus cúm A
Virus cúm A tồn tại ở dạng các hạt virus (virion) hình cầu hoặc hình khối đa

diện đôi khi có dạng hình sợi, đường kính 80 – 120 nano mét (nm), khối lượng phân
tử khoảng 250 triệu dalton (Da). Hạt virus cúm A có cấu tạo đơn giản, bao gồm vỏ
ngoài (envelope), capsid và lõi là vật chất di truyền (hệ gen) của virus [1], [7].
+ Vỏ capsid có chức năng bảo vệ vật chất di truyền của virus cúm A, gồm
hàng trăm đơn vị cấu trúc gọi là capsomer.
4


+ Lớp vỏ ngoài (envelope) có bản chất là lipoprotein có nguồn gốc từ màng tế
bào nhiễm, mặt ngoài gắn các protein bề mặt đặc hiệu của virus và mặt trong được
lót bởi một lớp màng đệm là protein M1.
- Các protein bề mặt của virus cúm A có bản chất là glycoprotein gồm HA,
NA và M2, được gắn như những gai mấu nhô ra mặt ngoài vỏ capsid của hạt virus.
Có khoảng 500 gai mấu phân bố trên mặt ngoài vỏ capsid của một hạt virus, mỗi gai
mấu dài khoảng 10 – 14 nm và có đường kính khoảng 4 – 6 nm. Tỉ lệ phân bố
khoảng 4 – 5 phân tử protein HA trên 1 cụm protein NA (Hình 1.1A) [1], [7].

Hình 1.1. Mô hình và ảnh chụp các tiểu phần virus cúm A (xem [8])
Ghi chú: (A): Mô hình cấu tạo virus cúm A; (B): Các hạt virus cúm A chụp dưới kính hiển vi điện tử 4.000.000X.
- Hai protein HA và NA gắn trên bề mặt vỏ capsid, có vai trò quan trọng trong
quá trình xâm nhiễm, giải phóng hạt virus cúm A mới ở tế bào cảm thụ và là hai
kháng nguyên chủ yếu cho đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ chống lại virus, cơ
sở sản xuất vaccine phòng và chống dịch cúm A hiện nay [1], [2], [3].
- Hệ gen của virus cúm A là ribonucleic acid sợi đơn âm (negative-single
stranded RNA, viết tắt là (-)ssRNA) còn gọi là sợi đơn đối mã, nằm bên trong vỏ
capsid của hạt virus [1], [2], [7].
1.1.2. Đặc điểm cấu tạo hệ gen của virus cúm A
Virus cúm A có cấu trúc hệ gen gồm 8 phân đoạn RNA có khả năng tự sao
chép độc lập, giúp cho virus dễ dàng nhân lên và tổng hợp các thành phần của hạt
virus mới ở tế bào cảm thụ trong cơ thể vật chủ [1], [2], [9].

- Các phân đoạn RNA trong hệ gen của virus cúm A tồn tại ở dạng cấu trúc
RNP (ribonucleoprotein) có tổng độ dài từ 10.000 đến 15.000 base pair (bp), chứa
5


khoảng 13.500 bp thông tin di truyền tùy theo chủng virus. Hai đầu 5’- và 3’- của
mỗi phân đoạn RNA có chứa các trình tự không mã hóa (untranslation region), gồm
12 – 15 nucleotide 5’-AGUAGAACAAGG và 3’-UCG(U/C)UUUCGUCC, có tính
bảo tồn cao giữa các phân type virus cúm A.

Hình 1.2. Mô hình cấu trúc hệ gen virus cúm A (xem [8])
Ghi chú: (A): Sơ đồ các phân đoạn PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M và NS trong hệ gen của virus cúm A.
(B): Mô hình cấu trúc một phân đoạn RNP của virus cúm A.
- Mỗi phân đoạn RNA sợi đơn âm trong hệ gen của virus cúm A được bao bọc
bởi các phân tử nucleoprotein (NP) tạo thành phân đoạn RNP tương ứng, có cấu
trúc xoắn đối xứng (α helix) dài 50 – 100 nm, đường kính 9 – 10 nm. Các phân tử
NP liên kết với nhau qua cầu nối peptide và tạo thành vòm (loop) ở giới hạn cuối
mỗi phân đoạn RNP, đầu tận cùng 3’- và 5’- gắn với phức hợp enzym polymerase,
gồm 3 protein dưới đơn vị PB2, PB1 và PA polymerase, tạo thành một phức hệ tự
sao chép độc lập trong quá trình nhân lên của virus ở tế bào nhiễm (Hình 1.2B).
Các phân đoạn RNP cũng được nối với nhau bởi liên kết peptide ở cuối mỗi
phân đoạn, tạo nên hệ gen 1 sợi duy nhất của virus cúm A và được đặt tên theo số
thứ tự từ 1 đến 8, hoặc protein mã hóa tổng hợp là PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M
và NS, ứng với độ dài phân tử giảm dần (Hình 1.2B).
1.1.3. Cấu tạo và chức năng của các phân đoạn RNA hệ gen virus cúm A
Tám phân đoạn RNA gồm PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M và NS trong hệ gen
virus cúm A, lần lượt mã hóa tổng hợp 10 đến 12 protein là PB2, PB1 và/hoặc PB1-
N40 và PB1-F2, PA, HA, NP, NA, M1 và M2, NS1 và NS2 tùy theo chủng virus.
6

Bảng 1.1. Tóm tắt đặc tính cấu tạo 8 phân đoạn RNA hệ gen và chức năng các
protein của virus cúm A [10]
Gene
Độ dài
(bp)
Protein
virus
Độ dài
(aa)
Chức năng của các protein virus
PB2 2.280
PB2
759
- Tiểu đơn vị cấu tạo phức hợp polymerase. Liên
quan độc lực và thích nghi vật chủ của virus.
PB1
757
- Tiểu đơn vị cấu tạo phức hợp polymerase. Liên
quan độc lực và thích nghi vật chủ của virus.
PB1-F2
87 - 90
- Chỉ có ở một số chủng virus. Gây apoptosis tế bào
chủ, liên quan độc lực gây bệnh của virus.
PB1 2.274
PB1-N40

717
- Chưa rõ chức năng, ảnh hưởng đến chu kì nhân
lên của virus ở tế bào nuôi cấy.

PA 2.151
PA
716
- Tiểu đơn vị cấu tạo phức hợp polymerase. Liên
quan độc lực và thích nghi vật chủ của virus.
HA
Từ
1.704
đến
1.707
HA
567 -
568
- Kháng nguyên bề mặt, là yếu tố quyết định độc
lực và thích nghi vật chủ của virus. Liên quan khả
năng xâm nhiễm tế bào cảm thụ của virus và đáp
ứng miễn dịch chống lại virus của cơ thể vật chủ.
NP 1.497
NP
498
- Thành phần cấu tạo phức hệ RNP, liên quan đến
độc lực, khả năng nhân lên và thích nghi vật chủ
của virus cúm A. Kháng nguyên nhân phân biệt các
nhóm virus cúm A, B, C và Thogovirus.
NA
Từ
1.353
đến
1.422
NA

450 -
473
- Kháng nguyên bề mặt, có hoạt tính enzym giải
phóng hạt virus mới ở tế bào nhiễm, ngăn cản
ngưng kết virus. Liên quan khả năng xâm nhiễm và
nhân lên, thích nghi vật chủ của virus, đích tác động
của thuốc Oseltamivir và đáp ứng miễn dịch chống
lại virus của cơ thể vật chủ.
M1
287
- Vận chuyển các RNP, tham gia quá trình bao gói
và nảy chồi của virus. Liên quan đến tốc độ nhân
lên của virus ở tế bào cảm thụ.
M 1.026
M2
97
- Kênh ion H
+
nội màng, tham gia hòa màng và quá
trình nảy chồi của virus. Liên quan tốc độ xâm
nhiễm, nhân lên và kháng Rimantadin của virus.
NS1
228
- Gắn và bảo vệ các RNP, ngăn cản apoptosis của tế
bào và ức chế sản xuất interleukin (INFα). Liên
quan đến độc lực virus và đáp ứng miễn dịch tự
nhiên chống virus của cơ thể vật chủ.
NS
Từ
874

đến
889
NS2
(NEP)
121
- Vận chuyển các RNP của virus từ nhân ra bào
tương tế bào nhiễm. Liên quan đến tốc độ nhân lên
của virus ở tế bào cảm thụ.

Ghi chú: PB2: polymerase basic protein 2; PB1: polymerase basic protein 1; PA: polymerase acidic protein;
PB1-F2: polymerase basic protein 1–frame 2; PB1-N40: polymerase basic protein 1–none 40 amino acid;
HA: hemagglutinin; NA: neuraminidase; M: matrix; M1: matrix protein 1; M2: matrix protein 2; NP:
nucleoprotein; NS: non structural protein; NS1: non structural protein 1; NS2: non structural protein 2; NEP:
nuclear export protein.
7


- Hai protein PB1-N40 và PB1-F2 được mã hóa tổng hợp từ 02 khung đọc mở
(open reading frame, ORF) lồng trong khung đọc của gen PB1.
- Bốn protein M1 và M2 cùng với NS1 và NS2 lần lượt được mã hóa tổng hợp
từ các khung đọc mở, hình thành bởi hiện tượng “cắt-ghép” (splicing) RNA thông
tin của 2 gen M và NS tương ứng.
- Các protein virus kể trên đảm nhận chức năng khác nhau trong quá trình lưu
hành và lây truyền gây bệnh của virus cúm A, được trình bày tóm tắt ở bảng 1.1.
Như vậy, hệ gen virus cúm A gồm 8 phân đoạn RNA được cấu tạo, tổ chức
hợp lí, tương tác chặt chẽ và đa dạng về phương thức biểu hiện như: gen lồng trong
gen ở gen PB1, cắt-ghép gen ở các gen M và NS, mã hóa tổng hợp 10 – 12 protein
đảm bảo các chức năng cấu tạo, xâm nhiễm, lây truyền, độc lực và biểu hiện kháng
nguyên, trong quá trình lưu hành của virus ở các loài vật chủ [1], [6], [9], [11].
1.1.4. Đặc điểm cấu tạo và chức năng của các gen PB2, PB1 và PA

* Gen polymerase basic protein 2 (PB2):
Phân đoạn PB2 của virus cúm A có độ dài tổng số 2.341 nucleotide chứa
khung đọc mở có độ dài 2.280 nucleotide, mã hóa tổng hợp protein PB2 polymerase
(viết tắt là protein PB2) gồm 759 amino acid [1], [2], [6], [12].
Protein PB2 là một đơn vị cấu tạo trong thành phần phức hợp enzym
polymerase, chịu trách nhiệm khởi đầu quá trình tổng hợp và phiên mã RNA của
virus ở nhân tế bào nhiễm. Bên cạnh đó, protein PB2 còn là một trong các yếu tố
quan trọng, liên quan đến khả năng chuyển nhiễm thích nghi lây truyền của virus
cúm A từ gia cầm sang động vật có vú và người [1], [2], [6].
Đầu C-tận (carboxy terminal) của protein PB2 chứa các vị trí amino acid quan
trọng ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng phức hợp enzym polymerase, liên quan
đến khả năng thích nghi vật chủ của virus cúm A. Bao gồm:
- Vùng 37 amino acid đầu tiên liên kết với đầu tận cùng N (đầu N-tận, N-
terminal) của dưới đơn vị protein PB1, tham gia điều hòa hoạt tính phức hợp enzym
polymerase, liên quan đến khả năng nhân lên của virus cúm A trong tế bào cảm thụ
ở cơ thể các loài vật chủ [13], [14], [15].
- Các vùng tín hiệu định vị nhân (nuclear localization signal domain, NLS)
tương tác với thụ thể importin-α (importin-α nuclear import receptors) trên màng
8


nhân, trong quá trình vận chuyển các phân đoạn RNP hệ gen virus cúm A vào nhân
tế bào nhiễm. Có 7 dạng cấu trúc (isoforms) khác nhau của thụ thể importin-α, kí
hiệu từ importin-α1 đến importin-α7, phân bố trên màng nhân tế bào cảm thụ với
virus cúm A ở các loài vật chủ. Ở tế bào cảm thụ gia cầm có thụ thể importin-α1, ở
người là các importin-α1, 3, 5 và 7, trong khi ở tế bào cảm thụ của chuột lại có sự
thiếu hụt importin-α7 [16], [18]. Khả năng tương tác giữa các vùng NLS của protein
PB2 với các dạng thụ thể importin-α, liên quan đến đặc tính thích nghi xâm nhiễm,
lây truyền của virus cúm A ở loài vật chủ mới [16], [17], [18].
- Bên cạnh đó, các vị trí amino acid đầu C-tận của protein PB2 còn tham gia

tương tác với protein NP trong phức hợp RNP của virus cúm A, làm thay đổi khả
năng tương tác giữa các vùng NLS của PB2 với thụ thể importin-α1 trên màng nhân
tế bào cảm thụ ở động vật có vú [16], [19], [20].
- Ngoài ra, vùng đầu C-tận của protein PB2 còn tương tác với vùng chuỗi nối
giữa 2 tiểu phần HA
1
và HA
2
của protein HA, liên quan đến biểu hiện độc lực gây
bệnh của virus cúm A ở các loài vật chủ [21], [22], [23].
Như vậy, các đột biến về nucleotide xảy ra trong trình tự gen PB2, có thể làm
thay đổi amino acid được mã hóa trong protein PB2, dẫn đến thay đổi hoạt tính của
phức hợp enzym polymerase liên quan đến độc lực, thích nghi lây truyền của virus
cúm A giữa các loài vật chủ.
* Gen polymerase basic protein 1 (PB1):
+ Phân đoạn PB1 có độ dài tổng số là 2.341 nucleotide chứa khung đọc mở
2.274 nucleotide, mã hóa tổng hợp protein PB1 polymerase (viết tắt là protein PB1)
gồm 757 amino acid, một đơn vị cấu tạo trong thành phần phức hợp enzym
polymerase của virus cúm A. Bên cạnh đó, khung đọc mở gen PB1 còn chứa 02
khung đọc mở của các gen PB1-N40 và PB1-F2, mã hóa 2 protein tương ứng có
chức năng khác nhau, trong quá trình nhân lên và gây bệnh của virus cúm A ở cơ
thể vật chủ [1], [2], [6], [12].
Trình tự nucleotide vùng đầu 5’- RNA thông tin của gen PB1 chứa đựng nhiều
chức năng phức tạp và chồng lấn, bao gồm tín hiệu bao gói RNA hệ gen của virus,
thông tin xác định và điều hòa tổng hợp các protein chức năng, được mã hóa từ các
khung đọc mở khác nhau lồng trong khung đọc mở gen PB1. Bao gồm 5 vị trí mã
9


khởi đầu (innitiation codon) từ -AUG1- đến -AUG5-, xác định điểm khởi đầu dịch

mã các khung đọc mở khác nhau lồng bên trong khung đọc gen PB1, được nhận
diện bởi cơ chế chuyển dịch khung đọc của ribosome. Trong đó, các vị trí AUG1, 4
và 5 là mã khởi đầu của 3 khung đọc mở mã hóa cho các protein: PB1, PB1-F2 và
PB1-N40 theo thứ tự, các vị trí AUG2 và 3 là mã khởi đầu của 2 khung đọc mở
ngắn (short open reading frame, sORF) là sORF1 và sORF2, mã hóa các polypeptid
tương ứng (Hình 1.3) Wise et al., 2009 [11], 2011 [24].

Hình 1.3. Sơ đồ sắp xếp và trình tự vị trí codon AUG xác định điểm khởi đầu các
ORF trong vùng đầu 5’- RNA thông tin gen PB1 virus cúm A [24]
Ghi chú: (A). Vị trí mã khởi đầu –AUG– các OFR trong vùng đầu 5’- của RNA thông tin gen PB1, tương
ứng với protein được mã hóa; Số thứ tự từ 1 đến 9: các vị trí AUG1 đến AUG9. B. Trình tự nucleotide và các
vị trí mã khởi đầu –ATG– trong vùng đầu 3’- xác định trên DNA của gen PB1 virus cúm A.
+ Protein PB1 chịu trách nhiệm xúc tác và gắn mũ cho các phân tử RNA thông
tin, cũng như các phân đoạn RNA hệ gen của hạt virus mới được tổng hợp trong
nhân của tế bào nhiễm [1], [2].
- Bên cạnh cấu trúc liên kết với đầu C-tận của protein PB2, trình tự đầu N-tận
của protein PB1 còn chứa 48 amino acid cấu tạo nên cấu trúc anpha (α) có vùng
trung tâm gồm 12 amino acid đầu tiên, liên kết với protein PA polymerase trong
phức hợp enzym polymerase của virus cúm A [14], [25], [26], [27], [28].
10


- Sự thay đổi thành phần amino acid trong vùng N-tận của protein PB1, làm
thay đổi liên kết giữa các protein PB2-PB1-PA, dẫn đến thay đổi cấu trúc và hoạt
tính enzym phức hợp polymerase, liên quan đến khả năng nhân lên, biểu hiện độc
lực và thích nghi của virus cúm A ở các loài vật chủ.
+ Protein PB1-F2 có khối lượng phân tử nhỏ, biểu hiện hoạt tính khi chứa đầy
đủ từ 87 – 90 amino acid, được mã hóa bởi khung đọc mở PB1-F2 có độ dài 273
nucleotide, giới hạn từ vị trí nucleotide 95 đến 367 trên khung đọc mở gen PB1.
Protein PB1-F2 trực tiếp tham gia và là yếu tố chủ yếu biểu hiện độc lực gây bệnh

của virus cúm A ở cơ thể nhiễm [9], [13], [29], [30], [31], [32].
- Protein PB1-F2 gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis), do làm thay
đổi hình thái và mất điện thế màng ty thể, gây ngưng trệ chuyển hóa nội bào, kích
thích sự nhạy cảm với TNFα (α-tumor neucrosis factor) và khởi động quá trình
apoptosis của tế bào nhiễm. Qua đó, protein PB1-F2 tham gia điều biến đáp ứng
miễn dịch của cơ thể vật chủ với virus, gây tổn thương tế bào và mô, chủ yếu là các
tế bào biểu mô đường hô hấp và đại thực bào phế nang (alveolar macrophage) “bắt
giữ” virus, rút ngắn thời gian đào thải virus, gia tăng độc lực và mức độ trầm trọng
của bệnh học cúm A [9], [33], [34], [35].
- Trong quá trình lưu hành, nhiều chủng virus cúm A có đột biến nucleotide
trong trình tự khung đọc mở PB1, làm xuất hiện một hoặc nhiều bộ ba kết thúc (stop
codon), thường gặp ở các vị trí sau bộ ba mã hóa amino acid thứ 11 trong trình tự
khung đọc PB1-F2. Kết quả đột biến trên dẫn đến protein PB1-F2 được mã hóa
không đầy đủ (truncated), làm mất hoạt tính protein này và độc lực của virus trở nên
“ôn hòa” hơn [5], [9], [32], [36], [37]. Có khoảng 95% virus cúm A ở chim và gia
cầm, 90% ở người, 76% ở lợn và 100% ở các loài động vật có vú khác, chứa protein
PB1-F2 chứa đầy đủ 87 – 90 amino acid [9], [37], [38], [39].
- Bên cạnh đó, đột biến nucleotide làm thay đổi amino acid asparagine (N)
thành serine (S) tại vị trí 66 (N66S), dẫn đến tăng hoạt tính protein PB1-F2 và gia
tăng độc lực của virus cúm A ở cơ thể nhiễm [29], [30], [31], [32].
+ Protein PB1-N40 được Wise và cộng sự (cs.), (2009, 2011) [11], [24] phát
hiện gần đây ở chủng virus A/PuetoRico/8/34(H1N1), thiếu hụt 39 amino acid đầu
11


tiên ở vùng N-tận so với protein PB1, chiếm khoảng 5% so với lượng protein PB1
được tổng hợp trong tế bào nhiễm.
- Chức năng của protein PB1-N40 chưa được biết rõ, theo nghiên cứu của
Wise và cs., (2009, 2011) cho thấy protein PB1-N40 không tham gia cấu trúc
enzym polymerase như protein PB1, nhưng sự biểu hiện của protein này có ảnh

hưởng đến chu kì phát triển của virus cúm A ở tế bào nuôi cấy [11], [24].
- Hiện chưa có các nghiên cứu về protein PB1-N40 ở các subtype virus cúm A
lưu hành trong quần thể các loài chim hoang dã, gia cầm, động vật có vú và người.
+ Đặc biệt, polypeptid ngắn sOFR2 có vai trò như yếu tố điều hòa, tác động
đối nghịch trong quá trình tổng hợp 2 protein PB1-F2 và PB1-N40. Trong đó:
sOFR2 là tín hiệu thông tin làm tăng tổng hợp protein PB1-F2, nhưng lại điều hòa
ngược sự tổng hợp protein PB1-N40, qua cơ chế tái khởi đầu của ribosome bỏ qua
vị trí mã khởi đầu AUG4 (vị trí khởi đầu của khung đọc mở PB1-F2) [24].
* Gen polymerase acidic (PA):
Phân đoạn PA có độ dài tổng số 2.233 nucleotide chứa khung đọc mở 2.151
nucleotide, mã hóa tổng hợp protein PA polymerase (protein PA) gồm 716 amino
acid, là một đơn vị cấu tạo phức hợp enzym polymerase của virus cúm A [1], [2].
+ Protein PA chịu trách nhiệm xúc tác kéo dài sự phiên mã và sao chép RNA
trong quá trình tổng hợp RNA của virus ở nhân tế bào cảm thụ. Bên cạnh đó,
protein PA có hoạt tính enzym endonuclease, phân cắt RNA thông tin của tế bào
chủ thành các đoạn oligonucleotide, làm mồi nucleotide cho quá trình tổng hợp
RNA virus, tham gia độc lực của virus cúm A ở các loài vật chủ [1], [6], [40].
+ Protein PA được phân cắt bởi enzym trypsin thành 2 vùng polypeptide có
khối lượng và chức năng khác nhau. Phần đầu N-tận protein PA chứa 256 amino
acid, khối lượng phân tử khoảng 25 kilo Dalton (kDa), có vai trò quan trọng biểu
hiện hoạt tính của phức hợp enzym polymerase và phân cắt các RNA thông tin của
tế bào chủ. Phần đầu C-tận gồm 560 amino acid, có khối lượng phân tử khoảng 55
kDa, chứa các vị trí amino acid K328, K539, R566 và K574 tạo thành trung tâm,
liên kết với trung tâm cấu trúc α đầu N-tận của protein PB1, trong phức hợp enzym
polymerase của virus cúm A (Hình 1.4) [14], [28], [40], [41], [42].
12



Hình 1.4. Mô hình phân bố các vùng chức năng của protein PA [42].

Sự biến đổi thành phần amino acid của protein PA, có thể làm thay đổi hoạt
tính endonuclease và khả năng liên kết của protein PA với PB1 trong phức hợp
enzym polymerase, ảnh hưởng đến tốc độ sao chép tổng hợp các RNA hệ gen trong
tế bào nhiễm và độc lực gây bệnh của virus cúm A ở gia cầm và người.
1.1.5. Phức hợp enzym polymerase của virus cúm A
+ Phức hợp enzym polymerase của virus cúm A cấu tạo từ 3 dưới đơn vị
protein PB2, PB1 và PA, thông qua liên kết giữa vùng N-tận của protein PB1 với
vùng C-tận của các protein PB2 và PA, sau khi được dịch mã tổng hợp trong tế bào
cảm thụ. Trong đó, dưới đơn vị protein PB1 có vai trò như khung xương liên kết với
2 protein dưới đơn vị PB2 và PA, cấu tạo và tham gia điều hòa hoạt tính của phức
hợp enzym polymerase. Phức hợp này được gắn với vùng đầu tận 3’- và 5’- của cấu
trúc xoắn α của mỗi phân đoạn RNP trong hệ gen virus cúm A, tạo thành cấu trúc
có khả năng tự sao chép trong tế bào cảm thụ (Hình 1.5) [1], [2], [43].

Hình 1.5. Mô hình cấu trúc 3D và vị trí phức hợp polymerase trong cấu trúc mỗi
phân đoạn RNP hệ gen của virus cúm A [43]
Ghi chú: A: Mô hình cấu trúc 3D của phức hợp polymerase; B: Vị trí gắn phức hợp polymerase trong cấu
trúc 1 phân đoạn RNP hệ gen virus cúm A; Các vùng cấu trúc của protein PB2, PB1 và PA được tô màu;
Màu đỏ: vùng N-tận của protein PB2; Màu xanh đậm: vùng C-tận của protein PB1; Màu xanh lá: vùng C-tận
của protein PA.
13


+ Phức hợp enzym polymerase của virus cúm A thuộc nhóm enzym RNA
polymerase phụ thuộc RNA (RNA polymerase dependant RNA, RdpR) type II,
cùng với protein NP có vai trò quyết định quá trình sao chép RNA hệ gen, RNA
thông tin tổng hợp các protein chức năng và thành phần cấu tạo hạt virus mới ở tế
bào nhiễm [1], [2], [3], [4].
- Bên cạnh đặc tính chung của các enzym là biểu hiện hoạt tính phụ thuộc vào
nhiệt độ, liên quan đến khả năng thích nghi của virus ở cơ thể loài vật chủ. Đặc tính

cơ bản của nhóm enzym RNA polymerase phụ thuộc RNA là không có cơ chế “đọc-
sửa” bản sao (proof-reading), giúp virus cúm A có khả năng đột biến cao trong quá
trình sao chép tổng hợp hệ gen RNA của hạt virus mới [1], [2], [6].
Vận chuyển RNP
virus ra bào tương
Bao gói
Endosome
Hòa màng và giải
phóng hệ gen
virus
Vận chuyển hệ gen virus vào
nhân tế bào
Nảy chồi
và giải phóng hạt virus mới
Dịch mã
Tổng hợp các
protein virus
Nhân tế
bào
Gắn thụ thể

Hình 1.6. Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A ở tế bào chủ [44]
Ghi chú: Các ký hiệu RNP: phức hợp ribonucleoprotein (ribonucleoprotein); mRNA: RNA thông tin
(messenger RNA); vRNA: RNA hệ gen virus (viral RNA); cRNA: RNA bổ sung (complement RNA).
- Trong quá trình xâm nhiễm lây truyền ở tế bào, sau khi virus cúm A được
hấp phụ và hòa màng giải phóng hệ gen ở bào tương, các phân đoạn RNP hệ gen
virus được vận chuyển vào trong nhân tế bào, nhờ sự tương tác giữa vùng NLS của
protein PB2 với thụ thể importin- trên màng nhân tế bào nhiễm (Hình 1.6). Tại đây,
với sự có mặt của NP trong phức hợp PA-PB1-PB2-NP, protein PB2 được hoạt hóa
và hoạt hóa 2 protein PB1 và PA của phức hợp enzym polymerase, khởi động quá

14


trình sao mã tổng hợp RNA hệ gen và RNA thông tin mã hóa tổng hợp các thành
phần của hạt virus mới. Trong đó, protein PA xúc tác kéo dài sự phiên mã RNA và
protein PB1 gắn mũ cho các phân tử mRNA của virus [1], [44].
Như vậy, hoạt tính enzym của phức hợp polymerase virus cúm A là kết quả
tổng hợp tương tác giữa các protein PB2-PB1-PA trong phức hợp polymerase và
PB2-PB1-PA-NP trong cấu trúc RNP, liên quan đến tốc độ sao chép, tổng hợp các
protein chức năng và thành phần hạt virus mới ở nhân tế bào cảm thụ. Sự biến đổi
của các protein PB2, PB1 và PA, do đột biến nucleotide ở các phân đoạn tương ứng,
dẫn đến thay đổi tương tác giữa các protein này trong phức hợp polymerase. Kết
quả của sự biến đổi trên làm thay đổi hoạt tính enzym của phức hợp polymerase,
liên quan đến khả năng nhân lên trong tế bào cảm thụ, độc lực và đặc tính thích nghi
gây bệnh của virus cúm A ở cơ thể loài vật chủ [13], [20], [28], [45].
1.1.6. Đặc tính biến đổi di truyền các gen và hệ gen virus cúm A
Virus cúm A luôn biến đổi trong quá trình lưu hành tự nhiên ở các loài vật
chủ, thông qua đột biến điểm xảy ra ở mỗi phân đoạn RNA hoặc tái tổ hợp các phân
đoạn trong hệ gen giữa các chủng virus khác nhau, dẫn đến làm thay đổi các đặc
tính lây truyền gây bệnh của biến chủng virus mới.
* Đột biến điểm:
Đột biến điểm là loại hình biến đổi thường gặp xảy ra trong trình tự nucleotide
ở mỗi phân đoạn RNA hệ gen của virus cúm A, do enzym polymerase của virus
không có khả năng “đọc-sửa” bản sao RNA, trong quá trình phiên mã và sao chép
RNA hệ gen virus ở nhân tế bào nhiễm.
- Các enzym sao chép phụ thuộc RNA có thể gài thêm, hoặc làm mất đi hay
thay thế một hoặc nhiều nucleotide mà không được sửa chữa trong trình tự RNA
phân đoạn gen mới của virus (Hình 1.7) [6], [46].
- Đột biến điểm xảy ra thường xuyên, liên tục ở tất cả các phân đoạn trong hệ
gen virus cúm A, với tần suất xuất hiện khoảng 1/10.000 nucleotide (tương ứng với

độ dài hệ gen virus) trong một chu kì sao chép hệ gen của virus. Hầu như mỗi hạt
virus cúm A mới được hình thành đều chứa đựng một đột biến điểm trong hệ gen
của nó và được tích lũy qua nhiều thế hệ, làm xuất hiện biến chủng virus mới thay
đổi đặc tính di truyền so với chủng virus ban đầu [2], [46], [47].