Nghiên cứu đặc điểm gen h5 và n1 của virus cúm AH5N1 phân lập tại việt nam để tạo nguồn nguyên liệu sản xuất vaccine thế hệ mới

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC



NGUYỄN THỊ BÍCH NGA


NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ
GEN H5 VÀ N1 CỦA VIRUS CÚM A/H5N1
TẠI VIỆT NAM ĐỂ TẠO NGUỒN NGUYÊN
LIỆU SẢN XUẤT VACXIN THẾ HỆ MỚI



Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 62 42 30 15





THÁI NGUYÊN, 2012


1


MỞ ĐẦU
1.Tính cấp thiết của đề tài
Cúm gia cầm thể độc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza - HPAI) do

virus cúm A/H5N1 gây ra là bệnh truyền nhiễm cấp tính có tốc độ lây lan nhanh với tỷ
lệ gây chết cao trong đàn gia cầm bị bệnh. Virus cúm A/H5N1 là một phân type trong
nhóm virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae, có protein Hemagglutinin (HA) và
Neuraminidase (NA) trên bề mặt capsid của hạt virus mang tính kháng nguyên tham
gia quá trình đáp ứng miễn dịch. Kháng nguyên HA có 16 type (ký hiệu từ H1 đến
H16) và kháng nguyên NA có 9 type (ký hiệu từ N1 đến N9).
Kháng nguyên HA được mã hóa bởi phân đoạn 4 của hệ gen virus cúm A, có
đặc tính kết hợp với thụ thể đặc hiệu trên bề mặt màng của tế bào nhiễm. HA có khả
năng đột biến trong gen tạo nên sự khác biệt làm thay đổi tính kháng nguyên, đặc biệt
là “vùng kháng nguyên 2” (vị trí 152 – 157) và điểm cắt của enzym protease ở vị trí
chuỗi nối giữa HA
1
và HA), hoặc tái tổ hợp biến chủng làm thay đổi kháng nguyên bề
mặt dẫn đến sự thay đổi tương quan đáp ứng miễn dịch.
Kháng nguyên NA do phân đoạn 6 mã hóa, đây là một protein bề mặt làm
nhiệm vụ enzym phân giải thụ thể tế bào và cắt liên kết glycosid của phân tử acid sialic
(N-acetylneuramic acid) giải phóng virus trong quá trình lây nhiễm.
Kháng nguyên NA do phân đoạn 6 mã hóa, đây là một protein bề mặt làm
nhiệm vụ enzym phân giải thụ thể tế bào và cắt liên kết glycosid của phân tử acid sialic
(N-acetylneuramic acid) giải phóng virus trong quá trình lây nhiễm
Từ năm 2003 đến nay, virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao gây dịch cúm gia cầm
đã bùng phát ở nhiều nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Dịch cúm gia cầm liên
tục tái phát hàng năm với tốc độ lây lan nhanh và diễn biến phức tạp tại nhiều quốc gia.
Đặc biệt, chủng virus cúm A/H5N1 có thể xâm nhiễm gây bệnh ở người với tỉ lệ tử
vong rất cao và đang trở thành mối đe dọa nguy hiểm cho sức khoẻ cộng đồng.
Tại Việt Nam, dịch cúm gia cầm bắt đầu xuất hiện từ những tháng cuối năm
2003 đầu năm 2004 và đã nhanh chóng lan rộng ở hầu hết các địa phương trong cả
nước. Hàng chục triệu gia cầm và thuỷ cầm đã bị chết hoặc bị tiêu huỷ gây thiệt hại

2


kinh tế nặng nề cho ngành chăn nuôi. Hiện tại, năm 2011 và những tháng đầu năm
2012, cúm A/H5N1 bùng nổ với clade clade 2.3.2.1 xuất hiện mới tại Việt Nam, làm
cho tình hình dịch tễ quan hệ lây nhiễm và phòng chống bằng vaccine càng phức tạp
hơn.
Tìm hiểu sự thay đổi phân tử các vật liệu di truyền của virus cúm A/H5N1, đặc
biệt là đặc điểm phân tử phân đoạn gen kháng nguyên HA (type 5) và NA (type 1) ở
các chủng phân lập trên gia cầm tại Việt Nam trong giai đoạn 2004 đến nay là cần
thiết, nhằm đánh giá cấu trúc gen, khả năng tiến hoá của virus liên quan đến thay đổi
đặc điểm kháng nguyên để từ đó có thể đưa ra những dự báo về dịch tễ học ở mức độ
phân tử, định hướng sử dụng nguồn gen kháng nguyên để sản xuất và sử dụng vaccine
phòng bệnh cúm gia cầm thích hợp đạt hiệu quả.
Xuất phát từ những yêu cầu trên chúng tôi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu đặc điểm gen H5 và N1 của virus cúm A/H5N1 phân lập tại
Việt Nam để tạo nguồn nguyên liệu sản xuất vaccine thế hệ mới”.
2. Mục tiêu của đề tài
1- Giải mã toàn bộ phân đoạn gen kháng nguyên H5 và N1 một số chủng virus cúm
A/H5N1 thu nhận tại một số địa phương của Việt Nam giai đoạn 2004 - 2011.
2- Lưu giữ các gen H5 và N1 trong vector tách dòng để làm nguồn vật liệu cho
nghiên cứu tiếp theo làm nguyên liệu để tạo vaccine thế hệ mới.
3- Phân tích đặc điểm sinh học phân tử các gen kháng nguyên H5 và N1, xác định
mối quan hệ phả hệ với các chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới.
3. Ý nghĩa của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Đây là công trình giải trình tự toàn bộ gen H5 và N1 theo cặp trong hệ gen của
từng chủng của virus cúm A/H5N1 đại diện của một số địa phương tại Việt Nam được
phân lập theo thời gian từ năm 2004 – 2011.
Các kết quả phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ trong nghiên cứu này cho

thấy sự đa nhiễm các clade của virus cúm gia cầm ở từng thời điểm, từ khi xuất hiện tại
Việt Nam đến nay, đó là clade 1, 1.1, clade 2.3.4 (2.3.4.3) và clade 2.3.2 (2.3.2.1) tại


3


Việt Nam bằng phương pháp sinh học phân tử sử dụng kỹ thuật RT-PCR và giải trình
tự để phân tích thành phần gen.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Do hệ gen của virus cúm A/H5N1 là hệ gen phân đoạn, luôn biến đổi và thích
ứng - đặc biệt là 2 gen kháng nguyên HA (H5) và NA (N1), việc theo dõi thông tin di
truyền của virus cúm A/H5N1 là hết sức cần thiết, vì đây là những dữ liệu cung cấp
thông tin về sự tiến hóa của virus và khả năng tái tổ hợp tạo nên một biến chủng mới
trong quần thể virus cúm gia cầm.
Xác lập trình tự nucleotide và phân tích đặc điểm sinh học phân tử của toàn bộ
phân đoạn gen H5 và N1 của gia cầm, thuỷ cầm ở một số chủng phân lập qua các năm
từ 2004 đến nay sẽ là cơ sở dữ liệu quan trọng để tìm hiểu về dịch tễ học và mối quan
hệ nguồn gốc tiến hoá của loại virus cúm gia cầm lưu hành ở Việt Nam và thế giới
trong thời gian qua. Việc phân tích trình tự nucleotide của các chủng virus còn có ý
nghĩa lớn trong việc xác định biến đối di truyền của các chủng tại các địa phương khác
nhau, các vùng địa lý và quốc gia khác nhau, giúp cho việc sưu tập và duy trì các
chủng theo đặc tính di truyền và nghiên cứu tiến hoá, từ đó có thể biết dịch tễ học ở
mức độ sinh học phân tử.
Mặt khác, do virus cúm có khả năng biến đổi kháng nguyên cao, có thể chủng
virus phân lập ở đầu và cuối ổ dịch đã khác nhau về bộ mã di truyền và đặc tính kháng
nguyên, vì vậy, cần phải có một số lượng các chủng đa dạng theo thời gian tạo tiền đề
định hướng giám sát nguồn gốc dịch bệnh. So sánh giống và khác nhau của trình tự
nucleotide và amino acid từ các chủng phân lập hàng năm, giúp chúng ta tìm hiểu
những vùng gen thường thay đổi và không thay đổi trong toàn bộ hệ gen, góp phần xác

định được loại vaccine phù hợp cho công tác phòng chống dịch cúm gia cầm.


4


CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ VIRUS CÚM
1.1.1. Virus cúm và phân loại virus cúm
Virus cúm chủ yếu gây bệnh đường hô hấp ở người và động vật được phân
thành các nhóm:
1/ Nhóm virus cúm A (Influenza A virus) thường tồn tại trong các loài vật (gia
cầm, ngựa, gà, vịt, ngỗng, ngan và các loài chim di cư hoang dã) sau đó tiếp xúc với
con người và gây bệnh cho loài người. Virus cúm A có thể gây nên những vụ dịch hoặc
những trận đại dịch toàn cầu.
2/ Nhóm virus cúm B (Influenza B virus) thường tồn tại trong cơ thể con người,
chủ yếu gây bệnh ở người, một số ít tồn tại trong loài hải cẩu.
3/ Nhóm virus cúm C (Influenza C virus) tồn tại trên người và lợn.
Ba nhóm virus cúm A, B, C được nhận diện bởi sự khác nhau trong cấu trúc
kháng nguyên bề mặt, phức hợp protein cũng như vai trò gây bệnh khác nhau trên động
vật có xương sống. Virus cúm A và B có kháng nguyên bề mặt là protein
hemagglutinin (HA), còn ở cúm C là HEF (hemagglutinin esterase fusion).
4/ Nhóm Thogotovirus gây bệnh cho động vật, người và động vật không xương
sống (muỗi, rận biển). Kháng nguyên bề mặt của Thogotovirus là GP (glycoprotein).
Virus cúm A được định type phụ dựa vào phản ứng huyết thanh học của các
glycoprotein bề mặt HA và NA. Hiện nay, người ta đã xác định được 16 phân type HA
(H1 - H16) và 9 phân type NA (N1 - N9). Từ năm 1980, việc xác định phân type HA
đã được tiêu chuẩn hóa cho tất cả các virus cúm type A từ gia cầm, chim, ngựa và
người. Huyết thanh từ gia cầm và chồn sương phục hồi sau khi mắc bệnh và kháng thể

đơn dòng được dùng để xác định sự có mặt kháng nguyên của virus cúm trong từng
phân type. Kháng thể đơn dòng được dùng trong nghiên cứu chi tiết về các epitope
trong từng kháng nguyên như so sánh HA của các virus H1N1 từ gà tây và lợn để thiết
lập mối quan hệ về tính kháng nguyên của các HA của chúng [18].


5


1.1.2. Đặc điểm tiến hóa tạo nên các phân dòng có độc lực cao của virus cúm
A/H5N1
Năm 1959, lần đầu tiên phát hiện chủng virus cúm A/H5N1 gây bệnh ở gia cầm
được coi là chủng cổ điển. Sau thời gian gần 40 năm không xuất hiện, vào năm 1996,
virus cúm A/H5N1 được phân lập từ ngỗng tại một ổ dịch ở Quảng Đông (Trung Quốc)
cho thấy đây là chủng đã tạo nên các dòng virus gây bệnh cúm gia cầm trong những năm
vừa qua [126]. Chủng virus nguyên thuỷ này cung cấp nguồn gen HA (H5) cho quá trình
tái tổ hợp tạo nên các biến chủng gây dịch bệnh trên gia cầm và người ở Hồng Kông
năm 1997, nguồn gen khung khác của virus cúm A/H5N1 Hồng Kông được kiến tạo từ
virus cúm A có ở chim cút [57]. Riêng nguồn gen NA (N1) trong cấu trúc của gen đã có
hiện tượng xóa đi 57 nucleotide mã hóa cho 19 amino acid, tại vùng đầu N của protein
neuraminidase và đột biến “xóa gen” của N1 có liên quan đến tính thích ứng của virus
cúm từ thuỷ cầm lên gia cầm trên cạn và người [86].
Năm 1997, virus cúm A/H5N1 gây bệnh tại Hồng Kông làm chết 6 người trong
tổng số 18 người bị nhiễm. Do toàn bộ đàn gia cầm bị tiêu diệt, virus cúm A/H5N1
nguyên thủy gốc Quảng Đông không còn gia cầm cạn để gây bệnh, tưởng như virus đã
biến mất, nhưng thực tế chủng nguyên thủy này vẫn tiếp tục tồn tại trong ngỗng ở vùng
Nam Trung Quốc, trở thành nguồn gen tái tổ hợp hình thành biến chủng mới [33],
[120]. Trong các năm 1997 đến 2002, các biến chủng virus cúm A/H5N1 mang nhiều
đặc tính kháng nguyên khác nhau của phân type H5 được hình thành tạo nên clade
(clade) 1 có độc lực cao với gà nhưng thấp đối với vịt, để rồi sau đó bị đào thải trong

những năm 2001 - 2002. Tiếp tục trong năm 2002 - 2003, gen HA(H5) có những đột
biến mới do hậu quả của hiện tượng lệch kháng nguyên (antigenic drift) để tạo nên
biến chủng có tính gây bệnh cao, đặc biệt đối với vịt, và có khả năng lây nhiễm sang
người [56]. Đặc tính thích ứng và gây bệnh trên người càng ngày càng cao dần, cùng
với độc lực tăng cường đối với đa vật chủ để rồi hình thành nhiều biến chủng xâm nhập
xuống các nước phía Nam châu Á trong đó có Việt Nam, Thái Lan [34], [45].
Tại Việt Nam, virus cúm gia cầm H5N1 xuất hiện từ năm 2001, nhưng đến cuối
năm 2004 mới chính thức được công bố [5], [7]. Virus H5N1 thể độc lực cao và H5N2,


6


H9N3 thể độc lực thấp đã được phân lập ở ngỗng và vịt từ năm 2001 và 2003 [122].
Phân tích phả hệ cho thấy nhóm virus này không phải clade 1 thuộc phân dòng Quảng
Đông đã gây bệnh ở người vào cuối năm 2003 [71]. Tiến hóa chủng/phân type và phân
dòng tái tổ hợp mới thường xuất phát từ phía của Nam Trung Quốc [107], [118], [122].
Sau giai đoạn 1997 - 2003, virus cúm A/H5N1 đã đạt đến mức độ hoàn thiện về
đặc tính gây bệnh trở nên mối nguy cơ gây bệnh rất cao đối với gia cầm và người trong
các năm 2004 - 2005 [107]. Tuy nhiên, xét về di truyền học phân tử và tính kháng
nguyên, các chủng virus H5N1 giai đoạn 1997 - 2002 vẫn mang tính đồng nhất kháng
nguyên cùng với chủng nguyên thuỷ A/Gs/Gd/1/96 của Quảng Đông [34] và bắt đầu
phân hóa ở giai đoạn dịch cúm ác liệt xảy ra năm 2003 - 2005 (Hình 1.1).

Hình 1.1 Dịch tễ học các biến chủng virus cúm A ở khu vực Đông Nam Á. Các mũi tên chỉ
vùng xuất phát và thời điểm lan truyền của virus [45]
Từ cuối năm 2005, ngoài phân dòng chính Quảng Đông tiếp tục lưu hành, còn có
nhiều phân dòng khác của virus cúm A/H5N1 cùng lúc được hình thành, đó là sự xuất
hiện của phân dòng Thanh Hải (Qinghai and Qinghai-like sublineage) và phân dòng
Phúc Kiến (Fujian and Fujian-like sublineage), tràn ngập châu Á bao gồm Trung Quốc,


7


Hồng Kông, Việt Nam, Indonesia, Thái Lan [78], [107], tràn sang Trung Á, châu Âu và
châu Phi có tính gây bệnh cao đối với người [47], 106].
Các chủng thuộc phân dòng Phúc Kiến và Thanh Hải có cấu trúc gen N1 không
thay đổi nhiều, nhưng trong gen H5 có motif amino acid ở vùng chuỗi nối của điểm cắt
protease là (-RRRK-) đã giảm mất một lysine (K) so với các chủng thuộc phân dòng
Quảng Đông [107], vì thế kể từ năm 2006 đến nay, có nhiều chủng virus cúm A/H5N1
thuộc nhiều clade (clade) khác nhau cùng tồn tại gây bệnh trên thế giới, trong đó có
Việt Nam [94]. Trong các năm 2006 - 2008, dịch cúm gia cầm xảy ra không ác liệt như
những năm 2003 - 2005, nhưng do xuất hiện nhiều chủng cúm A/H5N1 có biến động
kháng nguyên và độc lực, vấn đề dịch tễ học có thể đã trở nên phức tạp hơn [53], [128].
1.1.3. Sự hình thành genotype của virus cúm A/H5N1 trên thế giới và Việt Nam
Kể từ khi cúm gia cầm A/H5N1 xuất hiện ở ngỗng tại Quảng Đông
(A/Gs/CN/Gd1/1996(H5N1) [126], cho đến nay có tất cả 12 genotype được hình thành

(Hình 1.2A).
Từ năm 2002 trở lại đây, những genotype nguyên thủy của dòng Quảng Đông đã
không còn tồn tại (đó là các genotype A, C, D, E) nhưng thêm nhiều genotype kế tiếp,
bao gồm GD, A, B, C, D, E, X(X
0
-X
3
), V, Y, W, Z(Z
+
) và G, tiếp tục tiến hóa xuất hiện
và tồn tại 8 genotype của H5N1 (V, W, X
1
, X
2
, X
3
, Y, Z và Z+) [85].
Sự xuất hiện của genotype Z với tính gây bệnh cao ở các nước Đông Nam Á là
bằng chứng của sự đột biến “lệch kháng nguyên” của virus cúm A/H5N1 [125].
Các chủng virus A/H5N1 phân lập tại Việt Nam năm 2004 - 2006 thuộc dòng
Quảng Đông, tập trung chủ yếu là genotype Z, gần đây xuất hiện thêm genotype G
nhưng được phân biệt thành 2 nhóm: dưới nhóm N (North) phổ biến ở phía Bắc Việt
Nam và dưới nhóm S (South) phân bố ở phía Nam [94], [107]. Từ năm 2001 đến 2007,
đã có 9 nhóm di truyền là VN1 – VN9 (genotype) xuất hiện hoặc xâm nhập vào Việt Nam,
được xác định dựa trên phân tích trao đổi chéo các phân đoạn để tái tổ hợp hình thành
genotype [117] (Hình 1.2B), theo đó dựa trên thành phần H5 chúng thuộc vào các clade
khác nhau.


8

Hình 1.2 (A). Hình thành các genotype trong quá trình tiến hóa từ các nguồn gen khác nhau,
(B). Các genotype bắt đầu từ khi mới xuất hiện thể độc lực cao HPAI tạo thành từ các trao đổi
chéo tiến hóa tạo genotype mới tại Việt Nam từ 2001 – 2007 [117].

Hình 1.3 Quá trình tái tổ hợp và sự hình thành các genotype của virus cúm A/H5N1 [45].




9


Các nhóm di truyền và clade, cụ thể đó là: VN1, năm 2001 (clade 3), VN2, năm
2003 (clade 5), VN3, các năm 2003 – 2007 (clade 1), VN4, từ năm 2005 (clade 2.3.2),
VN5, năm 2005 (clade 0), VN6, từ năm 2007 (clade 2.3.4), VN7, từ năm 2007 (clade
2.3.4), VN8, từ năm 2007 (clade 2.3.4), VN9, từ năm 2007 (clade 2.3.4) [117]. Các
chủng thuộc clade 7, dòng Á - Âu đã được xác định ở Lạng Sơn năm 2007 - 2008 và
biến mất sau đó [95] và clade 2.3.2 xuất hiện từ 2009 đến nay [42], [117]. Một số
chủng virus chỉ xuất hiện rồi biến mất trong vòng một năm và chỉ trao đổi nguồn gen
trong quá trình tiến hoá (Hình 1.3), một số khác chỉ tồn tại vài năm rồi sau đó không
phát hiện được, số khác mới xâm nhập gần đây, chẳng hạn như phân dòng 2.3.4 có
nguồn gốc từ Phúc Kiến và phân dòng 2.3.2 phát hiện năm 2009 có nguồn gốc từ vùng
hồ Thanh Hải (Trung Quốc) hiện nay có xu hướng tiến hoá nội bộ tạo nên nhiều chủng
biến đổi khác nhau.
Genotype Z phổ biến hầu hết các nước trong khu vực châu Á. Đặc điểm của
genotype Z là các gen NA và NS đều bị mất đoạn, và vùng chuỗi nối HA

1
-HA
2
(điểm
cắt protease) của protein HA (H5) mang nhiều aminno acid qui định độc lực của virus.
Tuy nhiên, một số virus phân lập tại vùng phía Nam Trung Quốc (Quảng Đông, Quảng
Tây và Hồ Nam) có sự đa dạng hơn của các type Z, V, W và G. Sự xuất hiện của
genotype G có thể do quá trình tái tổ hợp của genotype W và genotype Z [36].
1.1.4. Biến đổi thành phần hemagglutinin (HA) tạo nên các clade của virus cúm
A/H5N1
Sự tiến hoá của virus cúm gia cầm A/H5N1 có thể làm thay đổi tính kháng
nguyên dẫn đến ảnh hưởng đáp ứng miễn dịch của gia cầm khi được tiêm phòng vaccine.
Virus cúm gia cầm lưu hành tại Việt Nam đa dạng về kiểu hình HA liên quan nhiều đến
đặc tính kháng nguyên, trong đó clade 1 và clade 2 được xác định gây bệnh cho người và
clade 2 cũng đã phát triển thành các clade khác nhau trên cơ sở thay đổi về một số amino
acid [13].
Thông báo của Tổ chức Nông lương Thế giới (FAO) và Tổ chức Y tế thế giới
(WHO) cho biết, hiện nay đã phát hiện các phân nhánh virus cúm A/H5N1 thể độc lực
cao thuộc clade 1.1 và 2.3.2.1 (9]. Các phân nhánh này không phải là mới xuất hiện mà


10


do trong quá trình tiến hoá tự nhiên được hình thành. Clade 1.1 có nguồn gốc tứ clade
1 trước đây. Phân nhánh 2.3.2.1 được tiến hoá từ clade 2.3.2 đã được phát hiện từ chim
hoang dã sau đó là gia cầm Trung quốc (Hunan, Qinghai), Mông Cổ, Nga, Nhật Bản,
Hàn Quốc, Lào và Hồng Kông và mới đây là Việt Nam [124].
Hiện nay, clade 1.1 đã thay thế cho clade 1 ở phía Nam. Trong năm 2011, clade
2.3.2.1 đã được phát hiện ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam và vùng duyên hải miền

Trung thay thế cho clade 2.3.4 trước đây [50, 123, 124] (Phụ lục 3).
Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của virus cúm gia cầm A/H5N1 thuộc clade 1 tại
Việt Nam và Campuchia cũng cho thấy có sự hình thành clade 1.1. Clade 1.1 đã được
phát hiện ở gia cầm của Việt Nam tại phía Nam, ở gia cầm và người tại Campuchia gây
chết 9/9 người từ cuối 2010 đến nay [123]. Cho đến nay, sau gần 10 năm xuất hiện tại
Việt Nam, virus cúm gia cầm A/H5N1 đã trở thành một tác nhân nguy hiểm cho gia cầm
và cộng đồng và là mối nguy cơ lại càng gia tăng khi vaccine hiện nay không có đáp ứng
miễn dịch đối với các chủng virus thuộc các clade mới xuất hiện năm 2011. Kết quả thí
nghiệm của Cục Thú y liên quan đến clade 2.3.2.1 xuất hiện năm 2011 cho thấy, sau
khi công cường độc 100% gà bị chết trong vòng 3 ngày và 20% vịt chết trong vòng 7
ngày. Như vậy nhóm virus này có độc lực cao với gà hơn đối với vịt (nhánh cũ có thể
gây chết 60 – 70% vịt) (
Hiện tại chưa phát hiện thấy virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1 ở người. Tuy
nhiên vấn đề chưa có vaccine tiêm phòng cho gia cầm đối với clade 2.3.2.1 này, như
vậy, gia cầm hoàn toàn bỏ ngỏ không được bảo hộ miễn dịch tạo điều kiện cho virus
cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1 có thể tiếp tục biến đổi trở thành nguy cơ đáng lo ngại gây
bệnh trên người [124]. Do đó, việc quan trọng cần làm là phải tăng cường công tác
giám sát virus cúm ở gia cầm, chủ động áp dụng các biện pháp phòng chống dịch thích
hợp. Mục đích nhằm ngăn chặn sự lây truyền dịch ở gia cầm và ngăn chặn lây truyền
từ gia cầm sang người.


11


1.2. ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC CỦA VIRUS CÚM A
1.2.1. Đặc tính cấu trúc chung
Dưới kính hiển vi điện tử, hầu hết các hạt của virus (virion) có dạng hình cầu
đường kính từ 50 - 100 nm (Hình 1.4A). Một số ít có dạng hình sợi đường kính 20 nm
và dài từ 200 - 300 nm. Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ (capsid), vỏ bọc ngoài

(envelope) và lõi chứa RNA. Vỏ virus với bản chất là protein có nguồn gốc từ màng tế
bào nhiễm đã được đặc hiệu hóa để gắn protein màng của virus vào, bao gồm một số
protein được glycosyl hoá (glycoprotein) và một số protein dạng trần không được
glycosyl hoá (non-glycosylated protein).
Protein bề mặt có cấu trúc từ glycoprotein, bao gồm protein gây ngưng kết hồng
cầu HA, protein enzym cắt thụ thể NA và protein đệm M (matrix). Lipid tập trung ở
màng virus, chủ yếu là lipid có gốc photpho, số còn lại là cholesterol, glucolipid và một
ít carbohydrate gồm các loại đường galactose, mannose, ribose, fructose, glucosamin.
Bên trong virus có cấu trúc phức tạp gồm protein capsid và các sợi RNA nối với nhau
thành các nucleocapsid có cấu trúc đối xứng xoắn. Vỏ của virus được cấu tạo bởi 2 lớp
lipid, trên bề mặt có khoảng 500 các gai khác nhau nhú lên từ bề mặt của virus, mỗi gai
có độ dài từ 10 - 14 nm. Các gai này được cấu tạo bởi các glycoprotein. Có hai loại
glycoprotein là hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Các gai HA thường nhiều
hơn và xen kẽ với các gai NA với tỷ lệ là (4-5):1.
Hệ gen virus cúm A là RNA sợi đơn âm, gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt (Hình
1.4B), mã hoá cho 11 protein khác nhau của virus, các phân đoạn được sắp xếp theo
trật tư: PB2, PB1 (PB1 và PB1-F2), PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2), NS (NS1 và
NS2) [91], [103]. Mỗi phân đoạn RNA của virus cúm A có cấu trúc xoắn bậc 2 α đối
xứng dài 50 - 100 nm, đường kính 9 - 10 nm, được bao bọc bởi nucleoprotein (NP) với
bản chất là lipoprotein, tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP) (Hình 1.4C).
Các phân đoạn của hệ gen virus cúm A nối với nhau bằng các cầu nối peptide
tạo nên vòm (loop) tại giới hạn cuối của mỗi phân đoạn và tạo thành một sợi RNA duy
nhất có độ dài từ 10.000 - 15.000 nucleotide (tuỳ theo từng chủng virus cúm A) và có
cấu trúc xoắn α (α-helix) bên trong vỏ virus.


12


HA có chức năng giúp virus bám dính vào tế bào cảm thụ và làm xâm nhập vật

liệu di truyền của virus vào bên trong tế bào. NA có chức năng thúc đẩy sự lắp ráp để
giải phóng virus từ các tế bào cảm thụ. Các glycoprotein HA và NA quyết định tính
kháng nguyên đặc hiệu của từng phân type virus khác nhau và cũng là vị trí để các loại
thuốc kháng virus trong điều trị bệnh sẽ gắn kết và phát huy tác dụng diệt virus. Đồng
thời HA và NA còn có vai trò quan trọng trong việc quyết định tính kháng nguyên
trong sản xuất vaccine. Phân tích thành phần hoá học các hạt virus cúm A có chứa
khoảng 0,8 - 1,1% RNA, 70-75% là protein, 20 - 24% lipid và 5 - 8% là carbohydrate
[91].









(A)

Hình 1.4 (A) Ảnh các dạng hình thái của virus cúm A được nhuộm âm tính trên kính hiển vi
điện từ truyền qua. (Nguồn: Dr. Erskine Palmer, Centers for Disease Control and Prevention
Public Health Image Library), (B) Mô hình cấu tạo hạt virus cúm A (hemagglutinin: phân tử
kháng nguyên HA, neuraminidase: phân tử kháng nguyên NA, PB2, PB1, PA: ba dưới đơn vị
phức hợp enzym polymerase của virus), (C) Cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein RNP
của virus cúm (Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge).
Về mặt dịch tễ học, virus cúm A có nhiều biến chủng khác nhau, thích ứng hầu
như với mọi loài vật chủ và hệ gen luôn luôn biến đổi, định kỳ gây nên những vụ dịch
cúm trong lịch sử ở động vật và người [70], [121]. Do đặc tính biến đổi nội gen nhanh
chóng và trao đổi gen để tái tổ hợp tạo biến thể mới truyền lây trong quần thể sinh vật,
cho nên virus cúm A thuộc nhóm virus nguy hiểm gây bệnh động vật sang người

(zoonotic infections). Virus cúm A/H5N1 được coi là loại biến chủng có mức độ độc


(B)
(B)
(C)
(C)
neuraminidase
heagglutinin
(B)
(B)
(C)
(C)
neuraminidase
heagglutinin


13


lực cao nhất cho các loài động vật và người, có nhiều minh chứng khoa học là chủng
này bắt nguồn từ H6N2 hoặc trao đổi gen thông qua H9N2 (trên lợn) [65], [126].
H5N1 thể độc lực cao gây chết phôi gà gần như ngay lập tức nên không thể sử
dụng nguồn phôi gà để sản xuất vaccine vô hoạt cho gia cầm. Để khắc phục điều này,
Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và các mạng lưới phòng thí nghiệm của WHO đã kiến
tạo thành công hướng sản xuất vaccine H5N1 bằng phương pháp di truyền ngược
(reverse genetics -based technology). Đây là phương pháp tạo virus nhân tạo tái tổ hợp
gen của virus cúm A/H5N1 đương nhiễm có khả năng gây miễn dịch nhưng không gây
bệnh. Tuy nhiên do virus cúm gia cầm A/H5N1 có nhiều biến đổi nội gen và xảy ra
nhanh nên việc sản xuất vaccine cũng gặp không ít khó khăn.

1.2.2. Cấu trúc hệ gen của virus cúm A
Nhóm virus cúm A đều có hệ gen là RNA chứa 8 phân đoạn mã hoá cho 11
protein, có độ dài tùy từng phân type, được nối với nhau thành một sợi RNA liên tục,
nhưng hệ gen lại phân thành nhiều đoạn, mỗi phân đoạn chịu trách nhiệm mã hóa cho
một loại protein của virus.
Hai đầu 5' và 3' của RNA của hệ gen có hai chuỗi nucleotide bảo tồn, đó là 5'-
AGUAGAACAAGG và 3'-UCG(U/C)UUUCGUCC [70]. Sáu phân đoạn (từ 1- 6)
mỗi phân đoạn chịu trách nhiệm mã hoá cho một loại protein riêng biệt, phân đoạn 7 và
8 mã hoá cho từng phần của gen, mỗi gen mã hoá cho một phân tử RNA thông tin và
mỗi phân tử RNA thông tin này sau khi được xử lý nhờ cơ chế nối-ghép (splicing) sẽ
được dịch mã tổng hợp protein [70]. Mỗi đoạn RNA được bao xung quanh bởi
nucleoprotein (NP) tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP). RNP kết hợp với 3 loại
polymerase PB2, PB1, PA chịu trách nhiệm cho sự phiên mã và sao chép RNA của
virus.
Protein kháng nguyên bề mặt là HA thuộc protein màng type I liên quan đến sự
bám dính của virus và là thụ thể của virus, có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà,
hợp nhất vỏ virus với màng tế bào nhiễm và tham gia vào phản ứng trung hoà virus.


14


Nucleocapsid protein (NP) là một loại protein được photphoryl hoá, có biểu
hiện đặc tính kháng nguyên đặc hiệu theo nhóm và tồn tại trong hạt virus theo dạng
liên kết với mỗi phân đoạn RNA, cho nên NP còn được gọi là ribonucleoprotein.
Protein mang hoạt tính enzym là NA thuộc protein màng type II có chức năng
của một enzym cắt thụ thể để virus thực hiện quá trình giải phóng ra khỏi tế bào.
Chỉ có các phân đoạn HA, NA (glycoprotein màng) của virus có chức năng
"gắn" vào màng tế bào chủ bị tấn công rồi sau đó tiếp tục thực hiện quá trình nhân lên
và giải phóng virus.

Protein màng không được glycosyl hóa là MA mang tính chất protein đệm, bao
gồm M1 và M2 có vai trò bao gói RNA của hệ gen virus và là kênh vận chuyển các
thành phần của virus qua màng.
Một protein khác là protein không cấu trúc NS (non-structural protein) gồm hai
tiểu phần NS1và NS2, có vai trò bảo vệ hệ gen của virus, nếu thiếu chúng virus sinh ra
không hoàn chỉnh, trở thành virus thiểu năng.
1.2.3. Chức năng các phân đoạn trong hệ gen
Phân đoạn 1 mã hoá cho enzym polymerase PB2 (polymerase basic protein 2) là
tiểu đơn vị của polymerase (RNA transcriptase) chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã,
có độ dài 2341 nucleotide, có trọng lượng phân tử theo tính toán là 84 kDa (thực tế là:
87 kDa) [70].
Phân đoạn 2 mã hoá cho enzym polymerase PB1 (polymerase basic protein 1) là
tiểu đơn vị xúc tác của polymerase (RNA transcriptase), có độ dài 2341 nucleotide, với
trọng lượng phân tử tính toán là 87 kDa (thực tế: 96 kDa) [30].
Phân đoạn 3 mã hoá cho enzym kéo dài phiên mã PA (polymerase acidic protein
2) là tiểu đơn vị của polymerase (RNA transcriptase) tham gia tổng hợp RNA, có độ
dài 2233 nucleotide, trọng lượng phân tử theo tính toán là 83 kDa (thực tế: 85

kDa)
[30].
Phân đoạn 4 mã hóa cho hemagglutinin (HA) điều khiển quá trình tổng hợp
hemagglutinin (protein gây ngưng kết hồng cầu). Có 16 loại HA, trong đó chỉ có H1,
H2, H3 tìm thấy ở các virus gây bệnh cho người. Virus mang gen H5, H7 và H9 có thể


15


lây nhiễm từ chim sang người. HA được phân bố rải rác trên bề mặt của virus, là
protein gắn virus vào thụ thể của tế bào, gây ngưng kết hồng cầu và tham gia vào quá

trình khởi đầu xâm nhiễm của virus. HA có phân tử lượng là 63 kDa (nếu không được
glycosyl hoá), 77 kDa (nếu được glycosyl hoá, trong đó HA
1
là 48

kDa và HA
2
là 29
kDa) [108], chuỗi nucleotide có độ dài thay đổi tùy từng phân type virus, đối với H5N1
là 1704 - 1707 bp, H7N1 là 1683 - 1695 bp, H9N1 là 1683 bp, H1N1 là 1701 bp.
Phân đoạn 5 mã hoá cho protein nucleoprotein (NP) có trọng lượng phân tử tính
toán là 56

kDa, gen NP của H5N1 có độ dài là 1497 bp [70].
Phân đoạn 6 mã hóa cho protein neuraminidase (NA). NA là các gai hình nấm
trên bề mặt của virus, NA vừa có vai trò kháng nguyên vừa có hoạt tính enzym phân
cắt liên kết giữa thụ thể acid sialic và HA, nhờ vậy mà đẩy nhanh quá trình lan truyền
virus trong tế bào chủ. NA có trọng lượng phân tử theo tính toán 50 kDa (thực tế: 48 -
63

kDa), độ dài cũng rất thay đổi, đối với H5N1 là 1350 – 1410 bp [32].
Phân đoạn 7 mã hoá cho phần đệm matrix protein MA, gồm 2 tiểu phần M1 và
M2. Tiểu phần M1 là protein nền, là thành phần chính của virus, có chức năng bao gói
và tham gia vào quá trình nảy chồi của virus. Tiểu phần M2 là protein nội màng, có
chức năng là kênh ion vận chuyển sản phẩm của virus, trọng lượng phân tử tính toán
của M1 là 28 kDa (thực tế: 25

kDa), và M2 là 11 kDa (thực tế: 15 kDa), phân đoạn M
có độ dài khoảng 1027 bp [63].
Phân đoạn 8 là gen NS có độ dài ổn định trong tất cả các chủng cúm A, mã hoá

cho hai tiểu phần protein không cấu trúc NS1 và NS2. Tiểu phần NS1 có chức năng
vận chuyển mRNA ra tế bào chất, dịch mã, là protein kháng interferon và tiểu phần
NS2 có vai trò vận chuyển RNP ra khỏi nhân, trọng lượng phân tử tính toán NS1 là 27
kDa (thực tế: 25 kDa), của NS2 là 14 kDa (thực tế: 12

kDa), NS có độ dài 890 bp [84].
1.3. CẤU TRÚC, CHỨC NĂNG CỦA PROTEIN HEMAGGLUTININ VÀ
NEURAMINIDASE
1.3.1. Protein hemagglutinin (HA)
Protein hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) là kháng nguyên bề mặt
đặc trưng cho bản chất của từng chủng virus cúm A [73], có vai trò đặc biệt quan trọng


16


trong quá trình gây nhiễm và góp phần rất lớn quyết định tính gây bệnh của virus. Gen
mã hóa kháng nguyên HA là một glycoprotein có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà
trong ống nghiệm (in vitro), kháng thể đặc hiệu với HA có thể ngăn cản sự ngưng kết
đó, được gọi là kháng thể ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI, Hemagglutinin Inhibitory
test). Có 16 phân type HA đã được phát hiện, trong đó có 3 phân type (H1, H2 và H3)
thích ứng lây nhiễm gây bệnh ở người liên quan đến các đại dịch cúm đã xảy ra trong
lịch sử [91].

Hình 1.5 Mô hình cấu trúc hemagglutinin (lipid bilayer of envelope: Lớp màng bao lipid kép,
4 Major antigenic variable regions: 4 vùng biến đổi kháng nguyên chính, Receptor site: vị trí
gắn với receptor) [116].

Phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130 ăngstrom (Å), cấu tạo gồm 3 đơn
phân (trimer) (Hình 1.5), mỗi đơn phân (monomer) được tạo thành từ hai tiểu đơn vị
HA
1
(36 kDa) và HA
2
(27 kDa). Các đơn phân sau khi tổng hợp đã được glycosyl hóa
(glycosylation) và gắn vào mặt ngoài capsid là tiểu đơn vị HA
2
, phần đầu tự do hình
chỏm cầu được tạo bởi dưới đơn vị HA
1
chứa vị trí gắn thụ thể thích hợp của HA trên
bề mặt màng tế bào đích [27].
Gen HA gồm 2 đoạn là HA
1
và HA
2
nối với nhau bằng chuỗi oligopeptide, mã
hóa cho gồm một dãy các amino acid là arginine và lysine (-RRRKK-), tạo nên điểm
cắt của protease. Đây là vùng quyết định độc lực của virus hay tính gây bệnh của
H5N1. Phần HA
1
và HA

2
bộc lộ ra ngoài màng và có khả năng làm ngưng kết hồng cầu

HA
1
HA
2
Màng bao lipid kép


17


và chịu trách nhiệm cho việc gắn kết virus vào thụ thể trên bề mặt tế bào chủ trong giai
đoạn đầu tiên của quá trình xâm nhiễm [109].
Trên phân tử HA có hai vùng kỵ nước ở tận cùng đầu N và đầu C. Vùng kỵ
nước ở đầu tận cùng N định hướng cho protein ra khỏi màng tế bào và bị cắt bỏ khỏi
HA trưởng thành, còn vùng tận cùng đầu C (gốc amino acid từ 186-211 của HA
2
) có
nhiệm vụ neo giữ phân tử protein trên vỏ virus [38]. Sự biến đổi trong gen mã hoá cho
kháng nguyên HA là nguyên nhân gây ra các vụ dịch hằng năm.
Sự kết hợp của HA với thụ thể đặc hiệu (glycoprotein chứa sialic acid) trên bề
mặt màng tế bào, khởi đầu quá trình xâm nhiễm của virus trên vật chủ giúp cho virus
xâm nhập, hòa màng và giải phóng RNA hệ gen thực hiện quá trình nhân lên ở trong tế
bào cảm nhiễm. Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình không gian của
thụ thể chứa acid sialic của tế bào đích với vị trí gắn với thụ thể này trên phân tử HA
của virus cúm, quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus ở các loài vật chủ khác
nhau [116].
Nghiên cứu cấu trúc không gian ba chiều của gen kháng nguyên hemagglutinin

H5 của virus gây bệnh ở gà và H9 ở lợn, cũng như H5 của virus thích ứng gây bệnh
trên người cho thấy : virus cúm gà thích hợp với loại tế bào có thụ thể HA chứa acid
sialic liên kết với đường galactose góc quay α-2,3, trong khi ở lợn và người virus cúm
có thụ thể thich hợp ở góc quay α-2,6. Vị trí amino acid 226 (aa 226) của tiểu đơn vị
HA
1
được xác định là vị trí quyết định phù hợp gắn HA với thụ thể đặc hiệu. Ở hầu hết
các chủng virus cúm A lưu hành trong tự nhiên vị trí này là glycine, thích ứng với thụ
thể Gal α-2,3 sialic acid (chứa sialic acid liên kết với nhóm hydroxyl (4-OH) của
galactose ở góc quay α-2,3) của tế bào biểu mô đường hô hấp của chim và gia cầm (vật
chủ tự nhiên của virus cúm A). Ở các chủng virus cúm A/H1N1, A/H2N2 và A/H3N2
gây bệnh ở người, vị trí này trên protein HA là leucine, thích ứng với thụ thể Gal α-2,6
sialic acid có mặt ở tế bào biểu mô đường hô hấp dưới của người [108]. Các tế bào cảm
thụ với virus cúm A của lợn có cả hai loại thụ thể này, do đó lợn được coi là vật chủ
trung gian để virus cúm A tiến hóa thích ứng lây nhiễm sang người [108].


18


Ngoài ra, một số vị trí amino acid khác: glutamine 222, glycine 224, hay cấu
trúc SGVSS và NGQSGR cũng có sự liên quan chặt chẽ đến khả năng thích ứng với
thụ thể chứa sialic acid bề mặt màng tế bào chủ [73]. Đặc biệt, một số chủng virus
cường độc A/H5Nx, A/H7Nx lưu hành hiện nay có thể xâm nhiễm trên người, khi
chúng có tải lượng cao trong đường hô hấp (do tiếp xúc trực tiếp với chất thải hay gia
cầm nhiễm bệnh) [25], [68].
Trình tự mã hóa chuỗi nối và thành phần chuỗi nối trên protein HA cũng như
các vị trí amino acid liên quan đến khả năng gắn với thụ thể thích ứng, được coi là các
chỉ thị phân tử trong nghiên cứu phân tích gen kháng nguyên HA [73]. Protein HA kích
thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng type HA và tham gia

vào phản ứng trung hòa virus. Vì thế HA được coi là protein vừa quyết định tính kháng
nguyên, vừa quyết định độc lực của virus vừa là đích của bảo vệ miễn dịch nhằm ngăn
chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm và là cơ sở trong điều chế các vaccine
phòng cúm hiện nay [64], [73].
Chuỗi oligopeptide nối giữa HA
1
và HA
2
thuộc loại hình riêng biệt, đặc trưng
cho các biến thể H trong quá trình tái tổ hợp tạo nên biến chủng [58], [115]. Chuỗi này
chứa một số amino acid mang tính kiềm (basic amino acid) làm khung, thay đổi đặc
hiệu theo từng loại hình phân type. Sự biến đổi thành phần của chuỗi nối quyết định
tính độc lực của virus thuộc biến chủng mới [66]. Nếu ở điểm cắt của protease càng có
nhiều amino acid kiềm (arginine và lysine) thì khả năng HA được phân cắt càng lớn, và
quá trình xâm nhập nội bào nhanh dẫn đến tăng độc lực của virus cúm A [27], [115].
Đối với phân type H5N2 chuỗi nối này có cấu trúc VPQRKRKTR. Đối với các
phân type H vô độc (hoặc nhược độc) của H5N1, H5N2, H5N3, H4N6 và H11N1, loại
hình của chuỗi nối này có cấu trúc là VPQRETR [65], [129]. Đối với các chủng H5
cường độc, cấu trúc của chuỗi nối là TPQRERRRKKR, trong đó RRRKK quyết định
tính gây bệnh của H5N1. Sự đột biến ‘‘giãn nở” chuỗi nối giữa HA
1
và HA
2
mã hóa cho
các amino acid kiềm có liên quan đến tiến trình tăng cường độc lực của virus và ở các
chủng thuộc phân dòng Quảng Đông (Guangdong-like sublineage), các amino acid thông


19

thường là -RRRKK- [39], [86] còn ở các chủng thuộc phân dòng Phúc Kiến (Fujian-like
sublineage) các amino acid của vùng chuỗi nối là -RRRK- [6], [9].
Mức độ gây bệnh của virus cúm A còn phụ thuộc rất lớn đến chức năng
hoạt động của vùng tiếp nhận enzym protease để cắt rời HA khỏi thụ thể sialic
acid [108]. Virus cúm A không có gen tổng hợp enzym protease, mà phải nhờ vào
hỗ trợ của tế bào cơ thể bị nhiễm virus. Càng có điểm cắt protease hoàn chỉnh và
cắt đặc hiệu, càng có nhiều enzym tham gia cắt thụ thể, thì virus mới nhanh
chóng xâm nhập vào tế bào thực hiện quá trình nhân lên tạo nhiều virus mới và
mức độ gây bệnh cũng vì thế mà nặng nề hơn. Khi cơ thể gia cầm bị đa nhiễm
nhiều vi khuẩn, đặc biệt là tụ cầu khuẩn Staphylococcus và liên cầu khuẩn
Streptococcus, thì hoạt động tương tác gây bệnh của virus cúm A càng mạnh mẽ
hơn, do các loại cầu khuẩn này có nhiều protease trợ giúp cho virus cúm trong
quá trình thực hiện cắt hemagglutinin khỏi thụ thể để gây bệnh [35].
1.3.2. Protein neuraminidase (NA)
Protein neurominidase còn gọi là sialidase (mã số quốc tế là E.C 3.2.1.18), là
một protein enzyme có bản chất là glycoprotein được gắn trên bề mặt capsid của virus
cúm A, mang tính kháng nguyên đặc trưng theo từng phân type NA [24], [116]. Phân
tử NA có dạng nút lồi hình nấm, đầu tự do (chứa vùng hoạt động) gồm 4 tiểu đơn vị
giống như hình cầu nằm trên cùng một mặt phẳng, và phần kị nước gắn vào vỏ capsid
[32], [116].
Protein NA có 3 chức năng chính:
- NA cắt sialic acid ra khỏi phân tử HA và cắt những phân tử NA khác ra khỏi
các glycoprotein và glucolipit ở bề mặt tế bào, đẩy nhanh sự lây nhiễm của virus trong
cơ thể vật chủ và ngăn cản sự tập hợp của các hạt virus mới trên màng tế bào. Virus
cần phải có NA thì mới có thể xâm nhập được qua lớp màng mucin của biểu mô hô
hấp. Hai phân type N1 và N2 được tìm thấy ở virus cúm người liên quan đến các đại
dịch cúm trong lịch sử [34].

20


- Tham gia vào phân cắt liên kết này trong giai đoạn “hòa màng”, đẩy nhanh
quá trình cởi vỏ bọc “uncoating” giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương tế
bào nhiễm, giúp cho quá trình nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn [116].
- Ngoài ra, NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid
làm tan loãng màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh
chóng tiếp cận tế bào biểu mô và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu.
Virus cúm hình thành nên cơ chế để vượt qua sự bảo vệ của mucin đường hô
hấp. Chức năng của NA liên quan đến khả năng của virus xuyên qua màng nhầy do
phân cắt liên kết giữa mucin và sialic acid, vốn là mối liên kết ngăn cản sự xâm nhập
của virus vào các thụ thể chức năng trên tế bào đích [40], [89]. Mặt khác, NA có thể
phá vỡ trục liên kết màng nhầy và IgA, tạo nên trạng thái ức chế miễn dịch cục bộ từng
phần, nâng cao khả năng lây nhiễm của virus cúm và viêm phổi kế phát do vi khuẩn
[29]. Đột biến trong gen NA thường làm thay đổi hoạt tính của enzym này [55].
Cùng với vai trò của kháng nguyên HA, cả 3 khâu tác động trên của NA đều
tham gia làm gia tăng độc lực gây bệnh của virus cúm A ở cơ thể vật chủ. Do đó, NA
là đích tác động của các loại thuốc, hóa dược ức chế virus không đặc hiệu hiện nay, đặc
biệt là Oseltamivir (biệt dược là Tamiflu) phong tỏa enzym này, ngăn cản sự giải
phóng hạt virus mới khỏi các tế bào đích, bảo vệ cơ thể [22], [32]. Bên cạnh đó, NA
còn là một kháng nguyên bề mặt của virus, tham gia kích thích hệ thống miễn dịch của
cơ thể chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA của các chủng virus
đương nhiễm có tác dụng phong tỏa protein NA [46].
Sự đột biến trượt - xóa gen (slippage-mediated deletion) qua các giai đoạn tiến
hóa là hiện tượng đột biến đặc biệt được phát hiện ở gen NA (N1) và đã được chứng
minh rằng thông qua loại hình đột biến xoá gen này, virus cúm A/H5N1 tạo nên một
subtype N1 mới có độc lực cao hơn [73], [86].
Trong quá trình tiến hoá của giai đoạn 1996 - 1997, cấu trúc gen NA có hiện
tượng xoá đi 57 nucleotide mã hoá cho 19 amino acid và sau đó lại tiếp tục xoá lệch đi

60 nucleotide (mã hoá cho 20 amino acid) tại vùng đầu tận cùng N của protein


21


neuraminidase. Sự đột biến ‘‘xoá gen’’ kiểu này của N1 có liên quan đến tính thích
ứng của virus cúm từ thuỷ cầm lên gia cầm trên cạn và người [86].
Gen N1 của virus cúm A/H5N1 đã trải qua nhiều giai đoạn tiến hoá cho đến khi
hình thành thể độc lực cao HPAI thì độ dài của gen chỉ còn lại 1350 nucleotide so với
gen N1 trước đó có độ dài 1410 nucleotide. Trong hệ gen của virus cúm A, chức năng
của gen NA chịu trách nhiệm trong quá trình tổng hợp neuraminidase.
Gen NP chịu trách nhiệm quá trình tổng hợp nucleoprotein (giúp phân biệt 3
loại A, B, C). Gen M chịu trách nhiệm quá trình tổng hợp matrix protein.
Gen NS chịu trách nhiệm quá trình tổng hợp protein không cấu trúc (non-
structural protein). Các gen còn lại là PA, PB1, PB2 là các thành phần tạo nên các
RNA polymerase.
Như vậy, kháng nguyên NA cùng với kháng nguyên HA của virus là các đích
chủ yếu của cơ chế bảo hộ miễn dịch của cơ thể với virus cúm A và là cơ sở nghiên
cứu và ứng dụng đối với các vaccine phòng cúm hiện nay cho người và gia cầm, nhằm
ngăn chặn dịch cúm ở gia cầm và hạn chế lây truyền sang người [118].
Phân tích hệ gen của các phân lập cúm gia cầm A/H5N1 cho thấy NA, HA và
NS1 thường biến đổi nhất trong hệ gen của virus cúm gia cầm [96]. Biến đổi trượt xóa
amino acid trong protein NA vùng cuống (NA-stalk) có thể làm thay đổi đặc tính sinh
học của virus cúm A/H5N1 dẫn đến mở rộng phạm vi vật chủ cảm nhiễm [119].
1.4. CÁC YẾU TỐ QUYẾT ĐỊNH ĐỘC LỰC
Trong đa số trường hợp độc lực virus do nhiều gen quyết định, nhưng một gen
(hoặc đột biến trong một gen) cũng có thể ảnh hưởng đáng kể đến độc lực của chúng.
Chuỗi nối giữa HA
1

và HA
2
chứa một số amino acid mang tính kiềm được mã hoá bởi
một chuỗi oligonucleotide, là điểm cắt của protease và là vùng quyết định độc lực của
virus [53]. Các HA của virus cúm gia cầm độc lực thấp có một amino acid arginine (R)
ở vùng phân cắt [90]. HA của virus độc lực thấp chỉ bị phân cắt trong một số ít cơ
quan, do đó chỉ gây bệnh nhẹ hoặc gây bệnh không biểu hiện triệu chứng. Ngược lại,
virus cúm gia cầm độc lực cao có các amino acid mang tính kiềm ở vùng phân cắt,
được nhận diện bởi các protease nội bào. Protease nội bào có mặt ở khắp nơi nên dễ


22


dàng gây nhiễm virus cho cơ thể [66]. HA của tất cả các virus cúm gia cầm gây chết
người đều có khả năng phân cắt cao. Điều này chứng tỏ các amino acid mang tính kiềm
ở vùng phân cắt của HA là yếu tố cần thiết quyết định độc lực của loại virus này.
Protein NS1 cũng đóng vai trò như một yếu tố độc lực của virus nhờ khả năng
thoát khỏi tác động của IFN (interferon) trong quá trình lây nhiễm virus cúm A [75] do
ức chế sự tổng hợp IFN. Cùng với việc ngăn chặn đáp ứng của IFN, protein NS1 còn
liên kết đặc hiệu với protein của tế bào nhiễm và phá vỡ chức năng của chúng [96]. Sự
đột biến xoá đi 15 nucleotide (vị trí 263 - 277) của NS làm gia tăng độc tính của virus
cúm A/H5N1 [83].
Nhóm RNA-polymerase bao gồm protein PB1, PB2 và PA cũng liên quan đến
độc lực của virus cúm A. Một số đột biến có thể nâng cao hoạt lực của polymerase và
làm tăng độc lực của virus cúm A/H5N1 chủng độc lực cao đã được phát hiện trên
chuột [52]. Chủng virus cúm A/H5N1 có độc lực trên chuột mã hoá Lysine ở vị trí 627
trong PB2, trong khi đó các chủng A/H5N1 không độc lực trên chuột mã hoá glutamic
acid ở vị trí này [59], [77].
Các gen M2 và PB1-F2 có liên quan đến sự thích ứng của virus H5N1 trên vật

chủ mới, cũng như sự lây truyền giữa các loài [72], [107]. Protein PB1-F2, được tạo
thành bởi một khung đọc mở của gen PB1 của virus cúm A, đã làm gia tăng độc lực
của virus trên chuột [127]. Protein PB1-F2 làm tăng độc lực của virus cúm A do gây
chết tế bào theo chương trình (apoptosis) ở các đại thực bào, do đó làm giảm đáp ứng
miễn dịch của cơ thể vật chủ đối với sự lây nhiễm của virus cúm A [37].
1.5. CÁC PHƯƠNG THỨC BIẾN ĐỔI KHÁNG NGUYÊN
Đặc tính cơ bản của virus cúm A là hệ gen luôn biến đổi, sự thay đổi kháng
nguyên theo thời gian tồn tại giúp cho virus lưu hành rộng rãi trong tự nhiên ở nhiều
loài vật chủ khác nhau [91].
Có ba phương thức chủ yếu làm biến đổi kháng nguyên ở virus cúm A [125].
1.5.1. Hiện tượng «lệch kháng nguyên»
«Lệch kháng nguyên» (antigenic drift) thực chất là các đột biến điểm xảy ra
trong các phân đoạn gen/hệ gen của virus, chủ yếu là ở phân đoạn 4 của phân đoạn HA


23


(Hình 1.6). Do virus cúm A ký sinh nội bào bắt buộc, không có cơ chế “đọc và sửa bản
sao” (proof-reading) trong quá trình phiên mã và sao chép ở nhân tế bào đích, cho nên
sự thiếu hụt enzym sửa chữa RNA dẫn đến các enzym sao chép phụ thuộc RNA sẽ có
thể thêm nucleotide (đột biến thêm), làm mất đi (đột biến xoá) hoặc thay thế (đột biến
điểm) [12] một hay nhiều nucleotide mà không được sửa chữa trong phân tử RNA
chuỗi đơn mới trong quá trình nhân lên của virus [41], [91].

Hình 1.6 Minh họa đột biến điểm của hiện tượng “lệch kháng nguyên” (antigenic drift) ở virus
cúm A [88].
Tuỳ thuộc vị trí xảy ra các đột biến trong bộ ba mã hóa, mà có thể trực tiếp làm
thay đổi các amino acid trong trình tự của protein được mã hóa biểu hiện, dẫn đến thay
đổi đặc tính sinh học của protein, hoặc được tích lũy trong phân đoạn gen xảy ra đột
biến (đột biến điểm). Tần suất xảy ra đột biến điểm (point-mutation) rất cao, cứ mỗi
10.000 nucleotide (tương ứng với độ dài của RNA hệ gen của virus cúm A) thì có 1
nucleotide sai khác [103]. Như vậy, gần như mỗi hạt virus mới được sinh ra đều chứa
một hoặc hai đột biến điểm trong hệ gen của nó và như vậy, các đột biến này được tích
lũy qua nhiều thế hệ virus sẽ làm xuất hiện một phân type virus mới có gen HA với
những đặc tính kháng nguyên mới có thể bị sai lệch.
Sự chuyển dịch lệch kháng nguyên cũng có thể xảy ra với gen NA. NA có chứa
nhiều phần dư amino acid quan trọng, những phần dư này khi đột biến sẽ làm cho virus
kháng lại các thuốc ức chế neuramidase. Các đột biến này thường xảy ra tại các vị trí
amino acid R152K, E119V, H274Y, R292K. Đột biến tại vị trí H274K liên quan đến
vấn đề kháng thuốc Oseltamivir (Tamiflu) [76]. Lysine (K) thay thế cho arginine (R) ở



24


vị trí 292 của NA sẽ đưa đến sự kháng thuốc hoàn toàn. Đột biến R thành K gắn liền
với sự trao đổi nucleotide AGA thành AAA trong gen NA.
1.5.2. Hiện tượng «trộn kháng nguyên»
Hiện tượng «trộn kháng nguyên» (antigenic shift) (còn gọi là trao đổi hay tái tổ
hợp) các gen kháng nguyên chỉ có ở virus cúm và ở rất ít một số virus RNA gây bệnh
gia cầm khác, cho phép virus có khả năng biến chủng rất cao (Hình 1.7).

Hình 1.7 Minh họa đột biến tái tổ hợp của hiện tượng “trộn kháng nguyên” (antigenic shift)
của virus cúm A [88]
Hiện tượng này xảy ra như sau : Hệ gen gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt của
virus cúm A được hai chủng virus cúm A khác nhau khi đồng nhiễm trong một tế bào
có thể trao đổi cho nhau, để có thể xảy ra sự hoà trộn (reassort) hoặc trao đổi (swap)
các phân đoạn gen giữa hai chủng virus đó trong quá trình kết hợp lại thành một hệ gen
mới, tạo ra các dạng khác nhau của RNA hệ gen ở các hạt virus mới sinh ra, hỗn hợp từ
thành phần các phân đoạn của hệ gen từ những virus ban đầu. Kết quả là tạo ra thế hệ
virus mới có các phân đoạn gen kết hợp, và đôi khi giúp cho chúng có khả năng lây
nhiễm ở loài vật chủ mới hoặc gia tăng độc lực gây bệnh [35], [61], [85].
1.5.3. Hiện tượng glycosyl hoá
Thông thường, các virus cúm A nói chung và cúm A/H5N1 nói riêng có mức độ
đột biến điểm cao làm thay thế một số nucleotide tại những vị trí mà ở đó có thể tạo
nên các amino acid mới có khả năng tiếp nhận carbon hydrate tạo nên hiện tượng
glycosyl hoá (glycosylation). Hay nói cách khác, ở virus cúm A (và A/H5N1), glycosyl