Bước đầu nghiên cứu nhân nuôi hai chủng nấm linh chi thu thập từ khu bảo tồn thiên nhiên kẻ gỗ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan
- Đề tài này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi.
- Các số liệu trình bày trong luận văn được thu thập và trình bày một
cách trung thực.
- Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình.

Tác giả
NGUYỄN VĂN SÁU








ii


LỜI CẢM ƠN!

Để hoàn thành luận văn này tôi xin chân thành cảm ơn!
Ban lãnh đạo trường Đại học Vinh, Khoa Nông Lâm Ngư, cùng tất
cả các thầy, cô giáo đã tận tình truyền đạt kiến thức cho chúng tôi trong
suốt thời gian học tập tại trường.
Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo, Tiến sỹ Lê Văn Điệp đã
tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo, các kỹ thuật viên
phòng thí nghiệm khoa hóa học trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện, giúp

đỡ tôi trong quá trình phân tích mẫu.
Chân thành cảm ơn Ban giám đốc và cán bộ, nhân viên, công nhân
Trung tâm phát triển nấm ăn và nấm dược liệu Hà Tĩnh đã giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình bố trí thí nghiệm và thu thập số liệu.
Biết ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo điều kiện cho tôi trong
quá trình học tập và thực hiện luận văn này.

Nghệ An, tháng 9 năm 2014
Tác giả
NGUYỄN VĂN SÁU






iii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN! ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v
DANH MỤC CÁC BẢNG SỐ LIỆU vi
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ vii
MỞ ĐẦU 1
1. Lý do chọn đề tài 1
2. Mục đích nghiên cứu 2
3. Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu 2

3.1. Đối tượng nghiên cứu 2
3.2. Phạm vi nghiên cứu 4
3.3. Nội dung nghiên cứu 4
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4
Chương 1 5
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
1.1. Cơ sở khoa học 5
1.1.1. Giới thiệu sơ lược về nấm 5
1.1.2. Sự phát triển của sợi nấm 6
1.1.3. Các giai đoạn phát triển của sợi nấm 8
1.1.4. Giá trị của nấm 9
1.1.5. Giới thiệu về nấm Garnodema lucidum Karst 10
1.1.6. Đặc điểm hình thái và chu trình sống của nấm Garnodema
lucidum 11
1.1.7. Điều kiện sống của nấm Garnodema lucidum 13
1.1.8. Thành phần hóa học chủ yếu của nấm Linh chi 14
1.1.9. Nguyên liệu trồng nấm Linh chi 20
1.1.10. Khả năng chữa bệnh của nấm Linh chi 21
1.1.11. Giới thiệu sơ lược về hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi
25
1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 29
1.3. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 31
Chương 2 33


iv


VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33
2.1. Vật liệu nghiên cứu 33

1.1.1. Môi trường sử dụng 33
2.1.2. Thiết bị 34
2.1.3. Hóa chất 34
2.2. Phương pháp nghiên cứu 34
2.2.1. Phương pháp thực nghiệm 34
2.2.2. Phương pháp xử lý số liệu 37
2.3. Thời gian và địa điểm thí nghiệm 37
Chương 3 38
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 38
3.1. Tốc độ phát triển của hệ sợi nấm Linh chi trên môi trường nhân
giống cấp 1 38
3.1.1. Đánh giá sự phát triển của hệ sợi nấm Linh chi HKG401 và
HKG404 trên môi trường nhân giống cấp 1 (môi tường thạch) 38
3.1.2. Đánh giá sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát
triển của hệ sợi nấm HKG401 và HKG404. 41
3.1.3. Đánh giá ảnh hưởng của pH đến quá trình phát triển của hệ sợi
nấm. 43
3.2. Sự sinh trưởng của hệ sợi nấm HKG401 và HKG404 trên môi
trường nhân giống cấp 2 45
3.3. Sự sinh trưởng của nấm Linh chi trên các môi trường giá thể mùn
cưa cao su 47
3.3.1. Thời gian sinh trưởng hệ sợi nấm từ khi cấy đến giai đoạn lan
kín bịch 49
3.4. Mức độ nhiễm nấm dại trong quá trình nuôi trồng các loại nấm trên
các môi trường khác nhau. 55
3.5. Đặc điểm về hình thái của quả thể nấm HKG401 và HKG404 trên
các môi trường nuôi trồng 58
3.6. Năng suất nấm HKG401 và HKG404 được nuôi trồng trên giá thể
mùn cưa cao su 60
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65

Kết luận 65
Kiến nghị 66
TÀI LIỆU THAM KHẢO 67


v



DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
PGA: Potato + Glucosese + Agar
MNP: (Most Probable Number Method) Đơn vị hình thành khuẩn lạc
TSVSVHK: Tổng số vi sinh vật hiếu khí
KPHĐ: Không phát hiện được
HKG: Hồ Kẻ Gỗ
CT: Công thức
MT: Môi trường




vi


DANH MỤC CÁC BẢNG SỐ LIỆU

Bảng 1.1. Điều kiện môi trường cần thiết cho sự phát triển của nấm Linh
chi 14
Bảng 1.2. Hàm lượng các chất có trong mùn cưa 20
Bảng 1.3. Thành phần dinh dưỡng trong cám 21

Bảng 1.4. Lục bảo Linh chi và tác dụng trị liệu. 22
Bảng 1.5. Một số bài thuốc chữa bệnh của nấm Linh chi 25
Bảng 1.6. Các hoạt chất triterpenoid có tác dụng chữa bệnh trong nấm Linh
chi (Ganoderma lucidum) 27
Bảng 3.1. Chiều dài hệ sợi nấm lan trên môi trường nhân giống cấp 1 38
Bảng 3.2. Sự phát triển của hệ sợi nấm ở các nhiệt độ khác nhau 41
Bảng 3.3. Sự phát triển của hệ sợi nấm ở các pH khác nhau 43
Bảng 3.4. Chiều dài hệ sợi lan trên môi trường nhân giống cấp 2 45
Bảng 3.5. Thời gian sinh trưởng của hệ sợi từ khi cấy giống đến khi lan kín
bịch 49
Bảng 3.6. Thời gian phát triển của quả thể nấm linh chi 51
Bảng 3.7. Mức độ nhiễm nấm dại của các loại nấm trên các môi trường
khác nhau 56
Bảng 3.8. Kích thước quả thể nấm 58
Bảng 3.9. Năng suất của các loại nấm trên các môi trường nuôi trồng khác
nhau. 61
Bảng 3.10. Hàm lượng một số axid amin có trên quả thể nấm 62
Bảng 3.11. Số lượng một số vi sinh vật có trên quả thể nấm linh chi
HKG401 và HKG404. 63




vii


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1. Hình thái quả thể nấm HKG401 3
Hình 2. Hình thái quả thể nấm HKG404 3

Hình 1.1. Hình thái nấm Garnodema lucidum 13
Hình 1.2. Chu trình phát triển của nấm Garnodema lucidum Karst 13
Hình 1.3: Công thức của một số triterpene trong nấm linh chi 18
Hình 3.1. Chiều dài hệ sợi nấm lan trên môi trường nhân giống cấp 1 theo
thời gian 39
Hình 3.2. Ống nghiệm đựng môi trường cấp 1 trước khi đưa vào hấp thanh
trùng. 29
Hình 3.3. Hệ sợi nấm phát triển trong ống nghiệm 40
Hình 3.4. Biểu diễn sự phát triển của hệ sợi nấm ở các nhiệt độ khác nhau
42
Hình 3.5. Biểu diễn sự phát triển của hệ sợi nấm ở các pH khác nhau 44
Hình 3.6. Biểu diễn chiều dài hệ sợi lan trên môi trường nhân giống cấp 2
46
Hình 3.7. Nấm HKG401 và HKG404 trên các môi trường cấp 2 47
Hình 3.8. Quy trình nuôi trồng nấm Linh chi 48
Hình 3.9. Biểu diễn hệ sợi nấm từ khi cấy giống đến khi kín bịch. 49
Hình 3.10. Nấm HKG401 và HKG404 ở giai đoạn ươm sợi 50
Hình 3.11. Các giai đoạn phát triển của quả thể nấm ở các môi trường khác
nhau. 51
Hình 3.12. Quả thể nấm ở giai đoạn trưởng thành 54
Hình 3.13. Biểu diễn thời gian sinh trưởng và phát triển của nấm HKG401
và HKG404 qua các giai đoạn 54
Hình 3.14. Biểu diễn mức độ nhiễm nấm dại ở các công thúc thí nghiệm
khác nhau 56
Hình 3.15. Các bịch nấm bị nhiễm nấm dại 57
Hình 3.16. Biểu diễn kích thước quả thể nấm ở các môi trường thí nghiệm
khác nhau 59
Hình 3.17. Biểu diễn năng suất quả thể nấm 62

1


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum Karst.) là một trong những dược
thảo quý, quan trọng nhất trong y học cổ truyền [55]. Số lượng các loài
nấm Linh chi được sữ dụng trong công nghệ dược liệu ngày càng tăng, đặc
biệt ở các quốc gia Á Đông [7]. Nấm Linh chi được dùng điều trị các
chứng mệt mỏi, suy nhược, tiểu đường, các chứng bệnh về gan, và làm tăng
sức đề kháng của cơ thể. Hiện nay, Linh chi còn được dùng để điều hòa
huyết áp, lọc máu, và giúp cơ thể chống lại các chứng bệnh lao lực quá độ.
Ngoài ra linh chi còn được dùng để chữa bệnh mất ngủ, loét dạ dày, tê thấp,
suyễn, viêm họng [24].
Với giá trị vượt trội về mặt dược liệu nên nhu cầu sữ dụng nấm Linh
chi ngày càng tăng trong khi đó nguồn nấm Linh chi tự nhiên ngày một
khan hiếm. Từ nhiều năm qua các nhà khoa học trong nước và trên thế giới
đã nghiên cứu, chọn lọc và nuôi trồng thành công nhiều loài nấm linh chi
góp phần đáp ứng nhu cầu thị trường, tăng thu nhập cho người nông dân và
góp phần bảo vệ môi trường thông qua việc sữ dụng các nguồn nguyên liệu
sẵn có trong tự nhiên và sữ dụng các phế thải trong sản xuất nông nghiệp.
Ở Hà Tĩnh nghề trồng nấm nói chung và trồng nấm Linh chi nói
riêng được bắt đầu từ năm 2002, khi đó mới chỉ là những thử nghiệm ban
đầu với rất nhiều khó khăn. Trải qua hơn mười năm tồn tại và phát triển,
đến thời điểm hiện nay nấm Linh chi đã được nuôi trồng ở tất cả 12 Huyện,
Thị xã, Thành phố trên toàn tỉnh. Công nghệ sản xuất nấm Linh chi ở Hà
Tĩnh ngày càng được hoàn thiện, năng suất và chất lượng nấm từng bước
được nâng lên góp phần nâng cao thu nhập cho nhiều hộ dân.
Nguồn giống nấm Linh chi người dân Hà Tĩnh hiện nay sản xuất là
nguồn giống do Trung tâm Công nghệ Sinh học thực vật thuộc Viện di

2


truyền Nông nghiệp chọn tạo nhân giống từ nấm Linh chi tự nhiên được thu
thập ở rừng thuộc các tỉnh phía Bắc. Do cách xa về vị trí địa lý và khác
nhau về điều kiện khí hậu nên mặc dù các giống nấm do Viện di truyền
nông nghiệp cung cấp đã được huấn luyện để phù hợp hơn với điều kiện
khí hậu vùng Bắc Trung Bộ nhưng các giống nấm vẫn chưa thật sự thích
nghi với điều kiện khí hậu Hà Tĩnh nên quá trình sinh trưởng, phát triển của
nấm có phần hạn chế.
Trong khi đó Hà Tĩnh có hơn 200.000ha rừng, với sự phong phú và
đa dạng về động, thực vật và có các loài nấm Linh chi quý đã được người
dân thu thập và sữ dụng. Nguồn nấm linh chi mọc ở rừng Hà Tĩnh là loài
nấm phù hợp với điều kiện sinh thái ở Hà Tĩnh, nếu được nuôi trồng tại Hà
Tĩnh sẽ là điều kiện tốt nhất để các loài nấm sinh trưởng và phát triển, tuy
nhiên để đưa được nấm tự nhiên về nuôi trồng trong điều kiện nhân tạo cần
có các nghiên cứu khoa học thực hiện một cách bài bản. Do đó việc nghiên
cứu nhân giống và nuôi trồng nấm Linh chi ngay ở vùng xuất xứ của nấm
là hết sức cần thiết. Chính vì vậy chúng tôi thực hiện Đề tài “Nghiên cứu
nhân nuôi hai chủng nấm Linh chi thu thập từ Khu bảo tồn thiên nhiên
Kẻ Gỗ”
2. Mục đích nghiên cứu
- Lựa chọn môi trường nhân giống cấp 1, môi trường nhân giống cấp
2 thích hợp cho hệ sợi nấm phát triển.
- Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển và khả năng cho năng
suất của nấm Linh chi thu thập tại khu bảo tồn thiên nhiên Kẻ Gỗ trên môi
trường mùn cưa cao su ở điều kiện Hà Tĩnh.
3. Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu

3.1. Đối tượng nghiên cứu


3


Hai chủng nấm linh chi tạm thời ký hiệu HKG401 và HKG404 thu
hái vào tháng 4 năm 2013 tại Khu bảo tồn thiên nhiên Kẻ Gỗ tỉnh Hà Tĩnh
đã được phân lập tại phòng thí nghiệm Khoa hóa học trường Đại học Vinh.
3.1.1. Hình thái quả thể nấm HKG401

a) Mặt dưới quả thể nấm b) Mặt trên quả thể nấm
Hình 1. Hình thái quả thể nấm HKG401
Quả thể nấm HKG401 được tìm thấy trên một khúc gỗ lim dài 1,2m
đã bị chặt hạ từ trước. Tại thời điểm tìm thấy, quả thể nấm mặt trên màu
nâu sẫm, có hình lượn sóng, mặt dưới phẳng và có màu cát sẩm. Chân nấm
ngắn, bám rất chặt vào thân gỗ, tán nấm xòe dạng hình quạt.
3.1.2. Hình thái quả thể nấm HKG404

a) Mặt trên quả thể nấm b) Mặt dưới quả thể nấm
Hình 2. Hình thái quả thể nấm HKG404


4


Quả thể nấm HKG404 đươc tìm thấy trong rừng tre ở Khu bảo tồn
thiên nhiên Kẻ Gỗ, nấm có chân dài màu sắc khá đẹp mắt, mặt trên màu
vàng cam nhẵn bóng, mặt dưới phẳng màu hơi trắng, nấm có dạng hình bầu
dục và cuống nấm nằm về một đầu.

3.2. Phạm vi nghiên cứu
- Nghiên cứu môi trường nuôi cấy quả thể nấm Linh chi theo hướng
ứng dụng, bước đầu đánh giá khả năng sinh trưởng phát triển của nấm Linh
chi trong điều kiện ở Hà Tĩnh.
- Hai đối tượng nấm linh chi được thu thập ở khu bảo tồn thiên nhiên
Kẻ Gỗ. Đã được phân lập tại phòng thí nghiệm vi sinh vật khoa Hoá học,
Trường Đại học Vinh.
- Quá trình nhân giống, nuôi trồng và khảo sát quá trình ra quả thể
của hai đối tượng nấm được thực hiện tại Trung tâm phát triển nấm ăn và
nấm dược liệu Hà Tĩnh.
3.3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu lựa chọn môi trường nhân giống cấp một, cấp hai phù
hợp với sự phát triển của hệ sợi nấm của hai đối tượng nấm Linh chi thu
thập từ khu bảo tồn thiên nhiên Kẻ Gỗ.
- Xác định môi trường cơ chất nuôi trồng thích hợp với nấm Linh chi
HKG401 và HKG404 được thu thập ở khu bảo tồn thiên nhiên Kẻ Gỗ.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
- Cung cấp các dẫn liệu khoa học về môi trường dinh dưỡng, điều
kiện nuôi cấy và các đặc điểm sinh trưởng của nấm Linh chi thu thập ở Khu
bảo tồn Thiên Nhiên Kẻ Gỗ.
- Làm cơ sở cho việc nhân giống, cung cấp cho quá trình sản xuất
nấm Linh chi ở Hà Tĩnh và các tỉnh khác.




5


Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cơ sở khoa học
1.1.1. Giới thiệu sơ lược về nấm
Trước đây người ta quan niệm nấm là thực vật không có diệp lục, tuy
nhiên nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy nấm có nhiều điểm khác với thực
vật như: không có lục lạp; không có sự phân hóa thành rễ, thân, lá, hoa;
phần lớn không chứa cellulose trong thành tế bào; không có một chu trình
phát triển chung như thực vật. Nấm chỉ có thể hấp thu chất dinh dưỡng cần
thiết cho cơ thể từ cơ thể khác hay từ đất qua bề mặt của tế bào hệ sợi nấm.
Vì vậy, hệ thống phân loại sinh giới hiện nay đều xếp nấm là một giới
riêng, tương đương với giới thực vật và động vật.
Nấm bao gồm cả nấm mốc, nấm men và các loại nấm lớn có quả thể.
Nấm không quang hợp được, do đó nó bắt buộc sống trên chất hữu cơ hoại
mục hoặc sống nhờ vào động thực vật khác. Nấm là sinh vật hoại sinh,
phân huỷ các chất hữu cơ để lấy chất dinh dưỡng. Nấm dinh dưỡng bằng
cách tiến hành sự hấp thụ thức ăn trên toàn bộ bề mặt của sợi nấm thông
qua phương thức thẩm thấu. Trong trường hợp nấm dinh dưỡng bằng
những chất hữu cơ cần thiết gọi là dị dưỡng (heterotrophe); bằng những
chất hữu cơ chết gọi là hoại sinh (saprophyte). Nấm sử dụng các mô sống
để dinh dưỡng gọi là ký sinh (parasite) [ 12, 15].
Trong tự nhiên nấm đóng một vai trò quan trọng là máy tái chế sơ
cấp. Chúng tạo ra các enzim để phân huỷ các hợp chất hữu cơ (thường là
các cấu tử gỗ). Phần lớn nấm có khẳ năng sản sinh các enzim phá huỷ
nguyên liệu thực vật thuộc lớp nấm túi (Ascomycetes) và nấm đảm
(Basidomycetes). Nấm cư trú trên gỗ đã chết chủ yếu phân huỷ một hoặc
nhiều cấu tử gỗ, gây mục mạnh [4].



6

1.1.2. Sự phát triển của sợi nấm
1.1.2.1. Nhu cầu dinh dưỡng cho sự phát triển hệ sợi nấm
- Nguồn cacbon: Nguồn cacbon được cung cấp từ môi trường để
tổng hợp nên các chất như: hydratcacbon, amino acid, acid nucleic, lipid…
cần thiết cho sự phát triển của nấm. Trong sinh khối nấm, cacbon chiếm
nửa trọng lượng khô, đồng thời nguồn cacbon cung cấp năng lượng cho quá
trình trao đổi chất. Đối với các loài nấm khác nhau thì nhu cầu cacbon cũng
khác nhau, nhưng hầu hết chúng dùng nguồn đường đơn giản là glucosese,
với nồng độ đường là 2% [12].
Trong tự nhiên, cacbon được cung cấp chủ yếu từ các nguồn
polysacarit như: cenlulozơ, hemicemulozơ, lignin, pectin,… Các chất này
có kích thước lớn hơn kích thước của thành và màng nguyên sinh chất.
Muốn tiêu hóa được cơ chất này, nấm tiết ra emzyme ngoại bào phân hủy
cơ chất thành các chất có kích thước nhỏ hơn, đủ để có thể xâm nhập được
vào trong thành và màng tế bào [ 10, 16].
- Nguồn đạm (N): Đạm là nguồn cần thiết cho tất cả các môi
trường nuôi cấy, cần cho sự phát triển hệ sợi nấm. Hệ sợi nấm sử dụng
nguồn đạm để tổng hợp các chất hữu cơ như: purin, pyrimidin, protein,
tổng hợp Kitin cho vách tế bào. Nguồn đạm sử dụng trong các môi trường
ở dạng muối: muối nitrat, muối amon. Trong tế bào, ion NH
4
+
thường gắn
với cetoglutamic và những amin khác được hình thành từ những phản ứng
chuyển hóa amin. Sự hiện diện của NH
4
+
trong môi trường ảnh hưởng đến

tỷ số C/N, chúng đánh giá mức độ hoạt động của vi sinh vật [ 12], [16].
- Khoáng: Cần cho sự phát triển và tăng trưởng của nấm [16]
- Nguồn sufure: Được cung cấp vào môi trường từ nguồn sunphat và
cần thiết để tổng hợp một số loại axit amin.
- Nguồn phôtphat: Tham gia tổng hợp ATP, axit nucleic,
phôtpholipit màng. Nguồn cung cấp phôtpho thường là từ muối phôtphat.


7


- Nguồn kali: Đóng vai trò làm đồng yếu tố (cofactor), cung cấp cho
các loại enzym hoạt động. Đồng thời đóng vai trò cân bằng khuynh độ
(gradient) bên trong và ngoài tế bào.
- Magiê: Cần thiết cho sự hoạt động một số loại enzim, nguồn
magiê được cung cấp từ sunfat magiê.
- Vitamin: Những phân tử hữu cơ này được dùng với lượng rất ít,
chúng không phải là nguồn cung cấp năng lượng cho tế bào. Vitamin cần
thiết và giữ chức năng đặc biệt trong hoạt động của enzim. Hầu hết nấm
hấp thụ nguồn vitamin từ bên ngoài và chỉ cần một lượng rất ít nhưng
không thể thiếu. Hai nguồn vitamin cần thiết cho nấm là biotin (vitamin H)
và thiamin (vitamin B1) [10], [20], [22].
1.1.2.2. Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý lên sự sinh trưởng hệ sợi nấm
Các yếu tố vật lý tác động lên sợi nấm khác với tác động lên sự
hình thành quả thể nấm. Tác nhân vật lý ảnh hưởng trực tiếp lên sợi nấm
với mức độ khác nhau: mức độ tác động thấp nhất, mức độ tác động tối ưu,
mức độ tác động lớn nhất. Những yếu tố tác động trực tiếp lên sự sinh
trưởng sợi nấm là nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm và độ thông khí [10, 13].
- Nhiệt độ: Ảnh hưởng trực tiếp đến các phản ứng sinh hóa bên
trong tế bào, kích thích hoạt động các chất sinh trưởng, các enzym và chi

phối toàn bộ các hoạt động sống của nấm. Mỗi loài nấm có nhu cầu nhiệt
độ cho sinh trưởng và phát triển khác nhau. Nhiệt độ nuôi ủ hệ sợi bao giờ
cũng cao hơn so với khi nấm ra quả thể vài độ. Nhiệt độ cao hoặc thấp
hơn nhiệt độ thích hợp sẽ làm cho hệ sợi nấm sinh trưởng chậm lại hoặc
chết hẳn.
Ánh sáng: Không cần cho quá trình sinh trưởng của nấm. Cường độ
ánh sáng mạnh kiềm chế sự sinh trưởng của sợi nấm, có trường hợp giết
chết sợi nấm. Ánh sáng có thể phá vỡ một số vitamin và enzym cần thiết,
ảnh hưởng đến sự sinh trưởng bình thường của sợi nấm. Phòng ủ nấm


8


không nên quá tối, sẽ gây trở ngại cho việc phát hiện bệnh và nhất là tạo
điều kiện thuận lợi cho nấm mốc, côn trùng phát triển. Trong giai đoạn
nuôi hệ sợi tạo quả thể, ánh sáng có tác dụng kích thích hệ sợi nấm kết
hạch (nụ nấm).
- Độ ẩm: Hầu hết các loài nấm cần độ ẩm cao. Một số loài thuộc
nấm đảm cần độ ẩm thích hợp cho sự sinh trưởng tối ưu của sợi nấm (80 -
90%). Nhưng hầu hết các loài nấm cần độ ẩm để sinh trưởng hệ sợi là 50 -
60% (Flegg, 1962).
- Độ thông khí: Hàm lượng O
2
và CO
2
ảnh hưởng trực tiếp đến sự
sinh trưởng của sợi nấm. Oxy cần thiết cho việc hô hấp của hệ sợi nấm.
Còn nồng độ CO
2

tăng cao trong không khí sẽ ức chế quá trình hình thành
quả thể nấm.

- Ảnh hưởng của pH: Hầu hết các nhóm nấm mọc trên thực vật hay
ký sinh thì thích hợp đối với môi trường pH thấp. Các loài nấm mọc trên
mùn bã hay trên đất thì thích hợp với môi trường pH trung tính hay môi
trường kiềm. Nhưng một số loại nấm có khả năng mọc được ở biên độ pH
khá rộng. Một số loài nấm có khả năng tự điều chỉnh pH môi trường về pH
thích hợp cho sự sinh trưởng chính chúng [10, 12].
1.1.3. Các giai đoạn phát triển của sợi nấm
1.1.3.1. Giai đoạn sinh trưởng
Giai đoạn này thường dài, nấm ở giai đoạn này chủ yếu là dạng sợi.
Sợi nấm (hypha) mỏng manh và gồm 2 nhân, có nguồn gốc từ 2 bào tử
khác nhau nẩy mầm và phối hợp lại. Hệ sợi nấm (mycelium), còn gọi là hệ
sợi dinh dưỡng (vegetative mycelium), len lỏi trong cơ chất để rút lấy thức
ăn. Thức ăn muốn vào tế bào sợi nấm phải thông qua màng tế bào. Khi
khối sợi đạt đến mức độ nhất định về số lượng, gặp điều kiện thích hợp, sẽ
bện kết lại tạo thành quả thể nấm. Trong trường hợp bất lợi, sẽ hình thành
các bào tử tiềm sinh hay hậu bào tử (chlamydospore) [10, 14].


9


1.1.3.2. Giai đoạn phát triển
Giai đoạn này thường ngắn, lúc bấy giờ sợi nấm đan vào nhau, hình
thành 1 dạng đặc biệt, gọi là quả thể nấm hay tai nấm (fruit body). Quả thể
thường có kích thước lớn và là cơ quan sinh sản của nấm. Trên quả thể có 1
cấu trúc, nơi tập trung các đầu ngọn sợi nấm, đó là thụ tầng (hymenium).
Chính ở đây 2 nhân của tế bào sẽ nhập lại thành 1. Sau đó sẽ chia thành 4

nhân con hình thành các bào tử hữu tính (sexual spore), đảm bào tử
(basidiospore) hoặc nang bào tử (ascospore). Khi tai nấm trưởng thành, bào
tử được phóng thích, chúng nẩy mầm và chu trình lại tiếp tục [10, 14].
1.1.4. Giá trị của nấm
Từ lâu, nấm đã biết đến như là một nguồn dinh dưỡng giàu đạm, chất
xơ, vitamin và tất cả những chất cần thiết cho sự tăng trưởng, phát triển và
sự sống của con người khoẻ mạnh.
Ngoài giá trị dinh dưỡng, nấm còn có khẳ năng phòng và trị một số
bệnh. Càng ngày người ta càng phát hiện ra nhiều hợp chất có tính miễn
dịch từ nấm. Quá trình tìm kiếm dược phẩm miễn dịch được diễn ra ở châu
Á (nhất là ở Trung Quốc, Nhật Bản) nhưng ở các nước phương Tây chưa
chú trọng lắm [12].
Dược phẩm miễn dịch có thể được xem như là chất có hiệu quả trong
liệu pháp miễn dịch khi uống vào. Có hơn 50 loài nấm được xếp vào dạng
nấm dược liệu có hoạt tính chữa bệnh in vitro hay trên các mẫu động vật thí
nghiệm. Một số chất trích từ nấm được chứng minh có hoạt tính tăng cường
hệ miễn dịch tiềm năng, hoạt tính miễn dịch chống lại các tế bào ung thư
hơn hẳn hoạt dược tế bào chống ung thư [51, 53]. Tất cả đều không độc,
hiệu quả và dễ dung nạp: nổi bật có 6 nhóm chất sau Lentinan, AHCC
(trích từ nấm hương (Lentinus edodes)), Shizophyllan (Nấm chân chim
(Shizophyllum commune)), Grifron – D (Nấm gà gỗ (Grifola frondosa)),
PSP, PSK (Nấm vân chi (Trametes versicolor)) [54]. Các dịch trích chủ


10


yếu được chiết từ quả thể nấm và sinh khối từ hệ sợi (Nuôi cấy lên men
trong môi trường lỏng). Cả thành phần tế bào và hợp chất biến dưỡng thứ
cấp đều có tác dụng trên hệ miễn dịch của tế bào chủ và do đó có thể chữa

được nhiều bệnh khác nhau. Hướng kết hợp các tác nhân có tiềm năng
miễn dịch với các liệu pháp chống ung thư như giải phẫu, hoá trị, xạ trị, đã
đạt được bước tiến đáng kể ở Trung Quốc, Nhật Bản nơi mà nấm được xem
như một nguồn kháng ung thư hàng thế kỷ qua [53].
1.1.5. Giới thiệu về nấm Garnodema lucidum Karst
Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) có nhiều tên gọi khác nhau
như Bất lão thảo, Vạn niên thảo, Thần tiên thảo, Chi linh, Đoạn thảo, Nấm
lim,… Mỗi tên gọi của Linh chi gắn liền với một giá trị dược liệu của nó.
Tên gọi Linh chi bắt nguồn từ Trung Quốc, hay theo tiếng Nhật gọi là
Reishi hoặc Mannentake. Ở các nước Châu Á, đặc biệt Trung Quốc, Nhật
Bản, Hàn Quốc, Đài Loan…, việc nghiên cứu phát triển và sử dụng Linh
chi đang được công nghiệp hóa với quy mô lớn về phân loại, nuôi trồng
chủ động, chế biến và bào chế dược phẩm. Đồng thời nghiên cứu hóa
dược các hoạt chất có tác dụng dược lý và phương pháp điều trị lâm sàng.
Nấm Linh chi được xếp vào “Thượng Dược“, trong sách “Thần
nông bản thảo“ cách đây khoảng 2000 năm thời nhà Chu và sau đó được
nhà dược học nổi tiếng Trung Quốc, Lý Thời Trân phân ra thành “Lục
Bảo Linh Chi“ thời nhà Minh với các khái quát công dụng dược lý khác
nhau, ứng theo từng màu (Lý Thời Trân, 1590) [8].
Theo Lý Thời Trân thì nấm Linh chi có 6 màu khác nhau:
- Xích chi (Linh chi đỏ còn gọi Hồng chi)
- Hắc chi (Linh chi đen còn gọi Huyền chi)
- Thanh chi (Linh chi xanh còn gọi Long chi)
- Bạch chi (Linh chi trắng còn gọi Ngọc chi)
- Hoàng chi (Linh chi vàng còn gọi Kim chi)


11

- Tử chi (Linh chi tím)
Trong số các loài Linh chi tìm thấy cho đến nay thì xích chi
(Ganoderma lucidum) được nghiên cứu y dược chi tiết nhất. Loài chuẩn
Ganoderma lucidum có thành phần hoạt chất sinh học phong phú và hàm
lượng nhiều nhất [8] .
1.1.6. Đặc điểm hình thái và chu trình sống của nấm Garnodema
lucidum
1.1.6.1. Đặc điểm hình thái nấm Ganoderma lucidum
Các nhóm nấm dược quý cổ truyền ngày nay xác định là thuộc họ
Ganodermataceace, bao gồm 150 – 200 loài: trong đó nổi bật là Ganoderma
(trên 100 loài) và chi Amauroderma (trên 30 loài) [8].
Nấm Linh chi được xem là nấm nhiều lỗ (polypore) sống bám trên
thân cây gỗ. Chúng thường sống đa niên, hoá gỗ cứng, phân tầng, có cuống
hoặc không. Chi Ganoderma rất phong phú và phân bố khá rộng, nhất là
vùng nhiệt đới ẩm, một số dùng làm thực phẩm chức năng hoặc dược
phẩm. Gặp hầu hết ở các nước Châu Á, ở Việt Nam gặp rải rác từ Bắc đến
Nam.
Về hình thái ngoài chúng cũng có nhiều sai khác, quả thể có cuống
dài hoặc ngắn thường đính bên đôi khi đính liền tâm do quá liền tán mà
thành. Cuống nấm có hình trụ, hoặc thanh mảnh (cỡ 0,3 - 0,8 cm đường
kính), hoặc mập khỏe (tới 2 - 3,5 cm đường kính. Ít phân nhánh đôi khi có
uốn khúc quanh queo (do biến dạng trong quá trình nuôi trồng. Lớp vỏ
cuống láng đỏ - nâm đỏ - nâu đen, bóng không có lông , phủ suốt lên bề
mặt tán nấm.
Mũ nấm dạng thận - gần tròn, đôi khi xòe hình quạt hoặc ít nhiều dị
dạng đồng tâm và có tỉa rãnh màu sắc từ vàng chanh - vàng nghệ - vàng
nâu - vàng cam - đỏ nâu - nâu tím, nhẵn bóng. Khi già, sẫm màu lớp vỏ
láng lớp phấn màu đỏ nâu trên bề mặt ngày càng nhiều và dày thêm. Kích

12


thước biến động lớn từ 5 - 12cm, dày 0,8 - 3,3 cm. Phần đính cuống hoặc
gồ lên hoặc lóm xuống.
Phần thịt nấm dày từ 0,4 - 2,2, màu vàng kem - nâu nhạt - trắng
kem, phân chia kiểu lớp trên và lớp dưới. Thấy rõ ở lớp trên các tia sợi
hướng lên. Trên lát cắt trên giải phẫu hiển vi chỉ thấy đầu trên các sợi phình
lên hình chùy, màng rất dày, đan khít vào nhau tạo thành lớp vỏ láng (dày
khoáng 0,2 - 0,5mm), không tan vào nước do đó mà nấm chịu được mưa và
nắng. Ở lớp dưới hệ sợi tia xuống đều đặn tiếp giáp vào tầng sinh bào tử.
Tầng sinh sản (bào tầng - thụ tầng - hymenium) là một ống dày từ
1,8 - 2,2 cm màu kem - nâu nhạt gồm các ống nhỏ thẳng, miệng nhỏ thẳng,
gần tròn, màu trắng vàng, chanh nhạt khoảng 3 - 35 ống/mm. Đảm đơn bào
(holobasidie) hình trứng, hình chùy , không màu dài 16 - 22µm, mang 4
đảm bào tử (Basidiospore).
Bào tử đảm thường được mô tả có dạng trứng cụt (truncate). Đôi
khi có tác giả mô tả là có dạng hình trứng có đầu chóp tròn - nhọn. Bào tử
đảm có cấu trúc lớp vỏ kép, màu vàng mật ong sáng, chính giữa khối nội
chất tụ lại một giọt hình cầu, dạng giọt dầu, kích thước bào tử rất nhỏ giao
động ít nhiều khoảng 8 - 1,1 x 6 - 7,7 µm, phải xem dưới kính hiển vi mới
thấy được. Bào tử nấm linh chi có hai lớp vỏ rất cứng, khó nảy mầm. Trong
bào tử linh chi chứa các thành phần giống như linh chi : Polysacharide,
triterpen, axit béo, axit amin và các nguyên tố vi lượng đậm đặc hơn linh
chi rừ khoảng 7 - 20 lần [24]. Khi linh chi phóng thích bào tử sẽ thấy từng
lớp bào tử bay lên như khói bám vào bề mặt trên linh chi tạo thành một lớp
bụi màu nâu đỏ rất mịn như đất đỏ bazan.
Tuy vậy số lượng bào tử nấm linh chi rất nhỏ. Khi thu hoạch 1 tấn
nấm linh chi sẽ thu được 1kg bào tử. Tác dụng của bào tử giống như tác
dụng của nấm linh chi Thường một số sản phẩm trên thị trường có phối hợp

13


linh chi và bào tử linh chi có phá vỏ hoặc không phá vỏ. Các sản phẩm này
thường đắt hơn các sản phẩm không có bào tử.

a. Quả thể nấm b. Bào tử nấm






Hình 1.1. Hình thái nấm Garnodema lucidum
1.1.6.2. Chu trình sống của nấm Garnodema lucidum

Hình 1.2. Chu trình phát triển của nấm Garnodema lucidum Karst[12]
1.1.7. Điều kiện sống của nấm Garnodema lucidum
Linh chi phân bố khắp nơi trên thế giới, ký sinh và hoại sinh rộng
khắp ở các loài cây lá rộng đến lá kim, thậm chí ở các tre trúc, dừa, cau, cọ
dừa và nho. Nấm Linh chi tiết ra các men phân giải màng tế bào


14


endopolygalacturonase (endo -PG) và endopectin methyl - translinase
(endo - PMTE) có tác dụng làm nhũn tế bào thực vật rất mạnh gây nên tình

trạng các loại gỗ và rễ cây bị mùn ra [14].
Bảng 1.1. Điều kiện môi trường cần thiết cho sự phát triển của nấm Linh
chi [12, 15]

Nhiệt độ không nên thay đổi quá lớn, nếu thay đổi nấm Linh chi khó
phát triển thành tán mà ở dạng sừng hươu, đuôi gà (Trịnh Tam Kiệt, 1983).
1.1.8. Thành phần hóa học chủ yếu của nấm Linh chi
Theo Wachtel-Galor et al. (2011) trong nấm linh chi tươi, nước là
thành phần chủ yếu chiếm 90% khối lượng. Trong 10% còn lại thì protein
chiếm 10- 40%, chất béo chiếm từ 2- 8%, carbonhydrate chiếm 3- 28%,
chất xơ chiếm 3- 32%, hàm lượng tro chiếm 8- 10% cùng một số loại
vitamin và khoáng chất khác như kali, can-xi, phốt pho, ma-giê, selen, sắt,
kẽm, trong đó đồng chiếm tỉ lệ nhiều nhất (Borchers et al. (1999)). Trong
một nghiên cứu về những thành phần của nấm, Mau et al. (2001) đã xác
định được tỷ lệ của các thành phần chủ yếu trong nấm linh chi gồm: tro
(1,8%), carbonhydrate (26- 28%), chất béo thô (3- 5%), chất xơ (59%) và
protein (7- 8%). Hàm lượng của protein trong nấm linh chi khoảng 7- 8%,
thấp hơn so với nhiều loại nấm khác (Chang et al. (1996); Mau et al.
(2001)). Đặc biệt thành phần protein của nấm linh chi có rất nhiều các
Yếu tố
Nuôi tơ
Ra quả thể
Nhiệt độ
20 – 35
0
C
25 – 30
0
C
Ẩm độ

55 – 60%
90 – 95%
Ph
4,5 – 6
4,5 – 6
Ánh sáng
không cần
Cần ánh sáng tán xạ từ mọi phía


15


amino acid thiết yếu nhất là lysine và leucine. Hàm lượng chất béo tổng
thấp nhưng chứa nhiều acid béo không bão hòa nhiều nối đôi, đây là các
hợp chất rất có lợi cho sức khỏe của con người (Chang et al. (1996) ;
Borchers et al. (1999) ; Sanodiya et al. (2009)). Ngoài ra trong nấm còn
chứa các glycoprotein và các polysaccharide.
Bên cạnh đó, nấm linh chi có chứa rất nhiều những phân tử có hoạt tính
sinh học như các terpenoid, các steroid, các phenol, các nucleotide và
những dẫn xuất của chúng. Hoạt tính sinh học của nấm linh chi có được
chủ yếu là do các polysaccharide, peptidoglycan và các triterpene mang lại
(Boh et al. (2007) ; Zhou et al. (2007)). Về mặt định lượng, trong một thí
nghiệm, Chan et al. (2008) đã phân tích thành phần của 11 mẫu nấm linh
chi thương mại (được mua tại Hồng Kông) và nhận thấy có sự khác biệt về
hàm lượng các triterpene cũng như các polysaccharide giữa các mẫu, trong
đó các triterpen dao động trong khoảng từ 0- 7,8% và các polysaccharide
thay đổi từ 1,1- 5,8%. Theo các tác giả này, có nhiều nguyên nhân dẫn đến
sự khác biệt về hàm lượng của hai nhóm hoạt chất này, một trong những
nguyên nhân chính là sự khác biệt về giống loài, ngoài ra điều kiện môi

trường trong quá trình nấm phát triển cũng ảnh hưởng khá lớn đến thành
phần hoạt chất của nấm.
Địa điểm sinh trưởng của nấm linh chi cũng được xem là yếu tố ảnh hưởng
đến hàm lượng của các hoạt chất sinh học có trong nấm linh chi. Trong một
nghiên cứu về hoạt tính sinh học của 11 mẫu sản phẩm nấm linh chi được
trồng ở Nhật Bản, người ta nhận thấy sự chênh lệch về hàm lượng
triterpenoid giữa các mẫu dao động trong khoảng từ 0- 7,8% và hàm lượng
các polysaccharide dao động trong khoảng từ 1,1- 5,8% (Lu et al. (2012)).
Sự khác nhau về hàm lượng của các hoạt tính sinh học trong các sản phẩm
thương mại cũng chịu ảnh hưởng bởi quá trình chế biến hoặc chiết xuất,


16


qua đó cho thấy chiết xuất bằng nước sẽ cho hàm lượng triterpenoid ít hơn
khi chiết xuất bằng ethanol (Lu et al. (2012)). Bên cạnh đó, điều kiện sinh
trưởng cũng ảnh hưởng đến hàm lượng của các hoạt chất sinh học có trong
nấm linh chi (Lu et al. (2012)).
1.1.8.1 Các polysaccharide và các peptidoglycan
Hàm lượng carbonhydrate và hàm lượng chất xơ có trong nấm linh
chi được xác định lần lượt từ 26- 28% và 59% (Mau et al. (2001)). Nấm
linh chi có chứa rất nhiều polysaccharide có khối lượng phân tử lớn, các
hợp chất này mang hoạt tính sinh học và được tìm thấy ở tất cả các bộ phận
của nấm linh chi. Nhiều nhóm polysaccharide có thể được chiết xuất từ
thân nấm, bào tử và khuẩn ty. Các polysaccharide của nấm linh chi có tác
dụng sinh học như chống viêm, hạ đường huyết, chống loét, chống lại sự
hình thành khối u và tăng cường khả năng miễn dịch (Miyazaki et al.
(1981); Hikino et al. (1985); Tomoda et al. (1986); Bao et al. (2001);
Wachtel-Galor et al. (2004)). Người ta thường chiết xuất các

polysaccharide trong nấm linh chi bằng nước nóng sau đó tiến hành kết tủa
chúng bằng dung dịch ethanol hoặc methanol. Đôi khi cũng có thể chiết
xuất bằng nước và dung dịch kiềm. Theo kết quả phân tích, thành phần chủ
yếu trong polysaccharide của nấm linh chi (Ganoderma lucidum-
polysaccharides: GL- PSs) là đường glucose (Bao et al. (2001); Wang et al.
(2002)). Ngoài ra, GL- PSs cũng có cấu trúc polymer mạch thẳng, bao
gồm: xylose, mannose, galactose và fucose với nhiều vị trí liên kết β hoặc α
khác nhau như 1- 3, 1- 4 và 1- 6 với các dạng đồng phân - D hay L (Lee et
al. (1999); Bao et al. (2002)). Khả năng chống lại sự hình thành khối u của
GL- PSs phụ thuộc vào cấu hình mạch nhánh cũng như tính tan của
polysaccharide này (Bao et al. (2001); Zhang et al. (2001)). Ngoài ra, nấm
linh chi cũng có chứa một mạng lưới chitin, đây là thành phần mà cơ thể


17


người không tiêu hóa được và đóng vai trò tạo nên độ cứng cho nấm linh
chi (Upton et al. (2000)).
Có rất nhiều peptidoglycan có hoạt tính sinh học trong nấm linh chi
đã được phân lập, bao gồm proteoglycan (GLPG) có tác dụng kháng virus
(Li et al. (2005)), tăng cường miễn dịch (Ji et al. (2007)) và F3 là một
glycoprotein trong cấu trúc có chứa fucose (Chien et al. (2004)).
1.1.8.2 Triterpenes
Terpenoid là nhóm chất tự nhiên, có độ dài mạch carbon là một bội
số của 5, ví dụ như menthol (monoterpene) và β- carotene (tetraterpene).
Phần lớn các terpenoid thuộc nhóm alkene, một số có chứa những nhóm
chức năng, đa phần các terpenoid có cấu trúc mạch vòng. Những hợp chất
này được tìm thấy trên rất nhiều loài thực vật. Terpenoid có tác dụng chống
viêm, chống lại sự hình thành các khối u và giúp giảm hàm lượng chất béo.

Terpenoid được tìm thấy trong các loại thực vật thuộc nhóm bạch quả, ví
dụ như hương thảo (Rosemarinus officinalis) và nhân sâm (Panax ginseng)
có tác dụng tăng cường sức khỏe (Mahato et al. (1997); Mashour et al.
(1998); Haralampidis et al. (2002)).
Triterpene là một phân lớp của terpenoid và có độ dài mạch carbon
là 30. Khối lượng phân tử khoảng từ 400 đến 600 kDa, triterpene có cấu
trúc hóa học phức tạp và có khả năng bị oxy hóa cao (Mahato et al. (1997);
Zhou et al. (2007)). Nhiều loài cây có khả năng tổng hợp triterpene trong
quá trình sinh trưởng và phát triển. Một số có chứa nhiều triterpene trong
nhựa, qua đó giúp các cây này chống lại các loại bệnh. Mặc dù có hàng
trăm loại triterpene đã được phân lập từ rất nhiều loại thực vật khác nhau
và phân nhóm này cũng đã cho thấy có rất nhiều tiềm năng nhưng hiện nay
có rất ít những ứng dụng của triterpene được sử dụng trong thực tế.


18


Trong nấm linh chi, cấu trúc hóa học của triterpene có dạng
lanostane, đây là chất tham gia vào quá trình tổng hợp nên lanosterol, quá
trình sinh tổng hợp giúp hình thành nên các squalene mạch vòng
(Haralampidis et al. (2002)). Trong quá trình chiết xuất triterpene, người ta
thường sử dụng các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, acetone,
chloroform, ether hoặc là hỗn hợp của chúng. Dịch chiết sau đó sẽ được
phân tách bằng nhiều phương pháp khác nhau, có thể dùng HPLC thông
thường hoặc HPLC pha nghịch đảo (Chen et al. (1999); Su et al. (2001)).
Những triterpene đầu tiên được Kubota phân tách từ nấm linh chi là
ganoderic acid A và B (Kubota et al. (1982)).

Hình 1.3: Công thức của một số triterpene trong nấm linh chi

Nấm linh chi rất giàu hàm lượng các triterpene, những chất này cũng
góp phần tạo nên vị đắng của nấm linh chi. Chúng mang nhiều hoạt tính
sinh học có lợi cho sức khỏe, như khả năng chống oxy hóa và giảm hàm
lượng chất béo trong cơ thể. Tuy nhiên, hàm lượng triterpene trong nấm
linh chi lại không ổn định. Chúng phụ thuộc rất nhiều vào giống, loài, nơi
trồng, điều kiện canh tác cũng như phương pháp chế biến, điều này đã được