Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng phân giải lân khó tiêu

PHẦN 1: MỞ ĐẨU
Phân bón là yếu tố quan trọng trong sản xuất nông nghiệp. Từ đầu thế kỷ XX,
việc sản xuất và sử dụng phân bón vồ cơ đã góp phần quan trọng nâng cao sản lượng
nông sản, giải quyết nạn đói cho nhân loại. Tuy vậy, nếu chỉ sử dụng phân vô cơ để
nâng cao năng suất cây trổng sẽ dẫn đến sự ô nhiễm môi trường và suy giảm chất
lượng nông sản vì các lý do sau:
- Để sản xuất phân vô cơ , cần sử dụng một lượng lớn nhiên liệu: Than đá ,
dầu mỏ quá trình thiêu đốt các loại nhiên liệu, đã tạo nên hàng triệu tấn khí thải
độc hại, thổi vào khí quyển và hàng tỷ mét khối nước thải đổ vào các nguồn nước
mặt. Nguồn khí, nước thải này đã góp phần làm ô nhiễm môi trường sinh thái của
trái đất, tăng cường hiệu úng nhà kính [18].
- Sử dụng phân vô cơ lâu ngày với liều lượng cao, sẽ hạn chế sự đa dạng của
quần thể sinh học đất, mật độ tế bào vi sinh vật trong đất giảm, số lượng giun đất
giảm nghiêm trọng thậm chí bị mất đi. Chính những yếu tô này, làm cho đất ngày
càng trở nên chai cứng, độ phì nhiêu của đất giảm nghiêm trọng .
Chính vì vậy, trong những năm gần đây xu hướng xây dựng một nền nông
nghiệp bền vững, nhằm nâng cao năng suất nông sản nhưng vẫn giữ được độ phì của
đất lâu dài đang được phát triển. Sử dụng cân đối giữa phân vô cơ, phân hữu cơ
( phân xanh, phân chuồng, phân ủ ) và phân vi sinh vật là một nội dung quan trọng
của nền sản xuất nông nghiệp bền vững[18].
Phân bón vi sinh vật là sản phẩm sinh học, có tác dụng nâng cao năng suất
và chất lượng nông sản, giảm chi phí, tiết kiệm phân bón vô cơ và góp phần tạo cân
bằng sinh thái. Phânbón vi sinh vật có ý nghĩa quan trọng trọng việc bảo vệ môi
trường và xây dựng nền nông nghiệp sạch bền vững. Do vậy, nghiên cứu sử dụng
rộng rãi phân bón vi sinh vật trong nông - lâm nghiệp đã và đang được nhiều nước
trên thế giới quan tâm và đầu tư phát triển . Kết quả nghiên cứu từ các nước Mỹ ,
Canada, Nga, An Độ, Thái Lan, Trung Quốc, Nhật Bản Cho thấy sử dụng chế
phẩm vi sinh vật có thể cung cấp cho đất và cây trồng từ 30-60 kg N / ha /năm hoặc
thay thế một lượng lớn lân vô cơ bàng quặng photphat. Ngoài ra, qua hoạt động sống
của vi sinh vật cây trồng được nâng cao khả năng trao đổi chất , khả năng chống chịu
bệnh tật và qua đó góp phần nâng cao năng suất và chất lượng nông sản. Các loại

phân bón vi sinh vật đang được thế giới nghiên cứu và sử dụngcó thể kể đến là :
phân vi sinh vật phân giải hợp chất Photpho khó tan; chế phẩm vi khuẩn lam; chế phẩm
nấm rễ
So với lịch sử phát triển của phân bón vi sinh vật trên thế giới, việc nghiên
cứu thử nghiệm phân vi sinh vật ở Việt Nam còn rất mới mẻ. Việt Nam mới chỉ tập
trung nghiên cứu về vi sinh vật cố định Nitơ và đang được sản xuất, ứng dụng tại
một sô đối tượng cây trồng nông nghiệp chính như: Lúa, đậu, lạc song qui mô còn
hết sức hạn chế và chưa đáp ứng được yêu cầu của người sử dụng . Trong khi đó,
thực tế sản xuất nông - lâm Việt Nam lại đòi hỏi một số lượng lớn, không chỉ phân vi
sinh vật cố định Nitơ mà cả phân vi sinh vật phân giải lân - Một loại phân vi sinh vật
mới được dề cập đến trong khuôn khổ đề tài cấp nghành mà Viện KHKTNN Việt
Nam đã tiến hành trong giai đoạn 1992-1995. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sử dụng
vi sinh vật phán giải lân có thể thay thế 30-50% phân vô cơ bằng quặng photphat mà
năng suất cây trồng không thay đổi [18].
Tiếp tục nghiên cứu để mở rộng việc sản xuất và ứng dụng phân bón vi
sinh vật, đề tài KHCN 02-06 giai đoạn 1996-2000 do Ts: Phạm Văn Toản làm chủ
nhiệm đề tài đã nghiên cứu và tạo thêm một số chế phẩm phân vi sinh vật phục vụ
cho sản xuất nông - lâm nghiệp [18].
Nhằm góp phần tạo sản phẩm phân bón vi sinh vật phục vụ cho sản xuất
nông - lâm nghiệp chúng tôi chọn đề tài: ” Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu
đặc điếm sinh học của một số chùng vi sinh vật có khá năng phân giải lân khó
tiêu “
Trong khuôn khổ đề tài này chúng tôi tập chung giải quyết những vấn đề
chính sau:
Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải
Photphat khó tan.
- Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng tuyển chọn
Thực
vật
Sản

phẩm
sử dụngp
P- hữu cơ
photpho khó tan
PHẨN 2: NỘI DUNG
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1Lý thuyết về phân giải photpho
1.1.1 Vai trò của photpho đôi vói sự sinh trưởng phát triển của cây
trồng
Photpho là nguyên tố quan trọng thứ hai trong ba nguyên tố dinh dưỡng đa
lượng chính của cây trồng( N,P,K) là nguyên tố cơ bản cần thiết cho sự sống của tất
cả các loài sinh vật đặc biệt là thực vật. Photpho là thành phần xây dựng nên các hợp
chất quan trọng bậc nhất của tế bào như: Photphoprotein, photpholipit, photphoeste,
trong các vitamin( B,,B
6
).Đặc biệt photpho là thành phần không thể thiếu của ATP,
ADP,GTP,FAD,NADP,coA, đây là những phân tử trao đổi năng lượng, có vai trò
đặc biệt quan trọng trong quá trình quang hợp và hô hấp của thực vật [ 7 ].
Photpho có tác dụng thúc đẩy quá trình sinh trưởng của cây trồng. Dưới tác động
của photpho cây trồng có hạt chín sớm hơn 5 -7 ngày, cây ăn quả có số quả chín sớm
nhiều hơn đạt tới 78%( nếu không bón phân photpho chỉ chín 32%) [2]
Bón photpho làm tăng tính chịu rét, tăng độ đường cho củ cải, tăng lượng tinh
bột cho củ khoai tây, nói chung là photpho có tác dụng tăng chất lượng cùng năng
suất cho cây trồng lên rất nhiều [12].
Ngoài ra, photpho còn giúp cho cây chịu hạn tốt hơn nhờ khả năng ngậm nước
cao của nó. Đối với cây họ đậu photpho còn giúp cho quá trình cố định Nitơ tốt hơn
[3].
Trong quá trình sinh trưởng của cây, photpho có tác dụng khống chế độ độc
của lượng đạm khoáng cao trong cây vì nó giúp cho thực vật tăng cường việc chuyên
hoá đạm khoáng thành đạm Protein. Hơn nữa sự có mặt của photpho làm cây hấp thụ

được lượng đạm khoáng nhiều hơn [1].
Thực tế đã chứng minh rằng khi thiếu photpho sự hình thành tế bào mới bị chậm
lại, cây còi cọc ít phân cành đẻ nhánh, lá có màu xanh lục bẩn, không sáng. . Thiếu
Photpho năng xuất cây trồng bị giảm sút nghiêm trọng , ngay cả khi cây được cung
cấp đầy đủ Nitơ.
1. 12 Vòng tuần hoàn của Photpho trong tự nhiên
Chu trình Photpho ở trong đất được thể hiện qua sơ đồ 1, Sơ đồ 1 cho thấy, vi
sinh vật phân giải Photphat có vai trò đặc biệt quan trọng trong chu trình chuyển hoá
Photpho ở trong đất. Photpho dễ tiêu được giữ lại trong đất dưới dạng các hợp chất
khó tan và chỉ được trả lại cho đất dưới dạng dễ tan cho cây nhờ vào vi sinh vật
Hấp thụ Khoáng hoá
vsv phân giải
Các photphat tan
Sư đồ 1: Chu trình chuyến hoá Photpho trong đất [23]
1.1.3 Các dạng của Photpho trong tự nhiên
Các khoáng chất chứa Apatit, photphorit là những loại quặng chứa Photpho
hoặc từ xác động thực vật. Photpho tồn tại ở trong đất có hai dạng chính: Photpho
vô cơ và Photpho hữu cơ. Trên thực tế Photpho vô cơ chiếm ưu thế.
Cây trổng rất khó sử dụng phohot hữu cơ. Quá trình chuyển hoá từ photpho hữu
cơ thành Photpho vô cơ để cây trồng có thể sử dụng được là nhờ hệ vi sinh vật.
+ Loại Photphat không tan chiếm đa phần, hầu như không tan trong nước.
Thực vật không trực tiếp sử dụng loại Photphat này đó là các Apatit, các muối gốc
Photphat của kim loại mang tính axit như: FeS0
4
, A1S0
4
, Photphat của kim loại kiềm
thổ mang tính kiềm hoặc trung tính: Ca
3
(P0

4
)
2
; A1
3
(P0
4
)
2
.
+ Loại Photphat tan trong nưóc thường gặp là KH
2
P0
4
; Na
2
HP0
4
; K
2
HP0
4
;
Ca(HP0
4
)
2
; Mg(HP0
4
)

2
. Thực vật dễ dàng sử dụng tốt các loại Photpho này, nhưng
đáng tiếc là hàm lượng của chúng lại rất thấp ( chỉ chiếm 0,1- 1% so với lượng
Photpho hữu cơ tồn tại ở các chất có nguồn gốc từ động vật, thực vật. Từ xác
của động thực vật qua sự phân giải của vi sinh vật trong đất tạo thành dạng chất
mùn. Do vậy, việc sử dụng lâu dài phân chuồng có thể làm tăng hàm lượng Photpho
hữu cơ trong đất.
1.1.4 Các dạng chế biến phân Photpho .
Chia làm hai loại: Phân Photpho chế biến bằng axit và phân Photpho chế biến
bằng nhiệt.
1.1.4.1 Phân photpho chê biến bằng axit
Phân photpho chế biến bằng axit còn được gọi là Superphotphat, nó có công
thức là CaHP0
4
.CaS0
4
. về nguyên tắc sản xuất, người ta cho quặng Apatit chứa P
2
0
5
đã nghiền nhỏ tác dụng vói H
2
S0
4
theo tỷ lệ 1: 1.
Phương trình phản ứng xảy ra như sau:
Ca
3
(P0
4

)
2
.CaF
2
+ 3 H
2
SƠ
4
= Ca(HPƠ
4
)
2
+ CaS0
2
+ HF
Trong thành phần của Superphotphat, ngoài monohidrophotphatcanxi còn
có 40% CaCo
3
, một phần axit H
3
P0
4
tự do với hàm lượng 5- 6 %.Superphotphat là
một loại phân mang tính axit nên chỉ sử dụng cho đất bão hoà kiềm hoặc trung tính.
Nếu sử dụng cho đất chua có nhiều Fe, Al sẽ làm mất hiệu lực của phân Photpho
[14] [4],
1.1.4.2 Phân Photpho chê biến bằng nhiệt.
Phân Photpho chế biến bằng nhiệt còn được gọi là phân lân nung chảy, được sản
xuất từ sự gia nhiệt làm nóng chảy Apatit với Mg, Silicat ở nồng độ loãng sau đó
P

2
0
5
: 18-24%; MgO: 13-18%; Si0
2
:17-25%; CaO: 25-35%, Ngoài ra còn có
một số nguyên tố khác như Na, K
Với thành phần và cấu trúc đặc biệt nên phân lân nung chảy không hoà tan vào
trong nước mà chỉ hoà tan trong axit yếu. Trong axit Xitric 2% phân Photpho nung
chảy gần như tan hoàn toàn, nó có thể đạt tới 99%. Phân Photpho nung chảy có hiệu
lực tốt nhất trong đất axit [14][4] nhưng: trong tất cả các loại đất phân Photpho đều
bị các ion của đất giữ lại nhiều hay ít phụ thuộc vào từng loại đất, đặc điểm cây
trồng, độ khoáng hoá, độ mùn của từng loại đất.
1.1.5 Vi sinh vật phân giải hựp chất Photphat khó tan.
Vi sinh vật phân giải hợp chất Photphat khó tan là các vi sinh vật có khả năng
chuyển hoá hợp chất Photphat khó tan thành dạng dễ tiêu cho cây trồng sử dụng.Vi
sinh vật phân giải hợp chất Photphat khó tan được biết đến nay là: Pseudomonas,
Micrococcus, Bacillus, Flavobacterium, Pénicillium, Selerotium, Aspergillus, nấm
rễ (Mycorrhira). Các vi sinh vật này khống chỉ phân giải hợp chất Photphat Canxi
mà cả Photphat nhôm, sắt, mangan và các dạng khác kể cả quặng. Kết quả nghiên
cứu hiệu quả phân giải lân được thể hiện qua bảng 1.
1.1.6 Cơ chê phân giải hợp chất Photphat khó tan nhờ vi sinh vật.
Cơ chế của quá trình phân giải hợp chất Photphat khó tan đến nay vẫn còn chưa
được hiểu đầy đủ và còn rất nhiều tranh cãi trong vấn đề này. Sản sinh ra
axit hữu cơ có thể là nguyên nhân chính song C0
2
, H
2
S, axit, kiềm cũng là các yếu tố
đuợc nhiều nhà nghiên cứu đề cập đến.

1.1.6.1 Phân giải Photphat khó tan do sự tạo thành axit của vi sinh vật
[10].
Theo nghiên cứu của Bardia và Gaur( 1972-1974), cho thấy trong quá trình nuôi
cấy vi sinh vật khi mà pH môi trường bị giảm sút mạnh, lúc đó hàm luợng Photpho
tan trong môi truờng tâng lên. Sau khi nuôi cấy vi sinh vật phân giải hợp chất
Photphat khó tan nguời ta tìm thấy nhiều axit hữu cơ nhu: Axit axetic, axit focmic,
axit glucolic, axit oxalic,axit sucinic, axit malic, axit xitrìc trong môi tnrờng. Các
axit hữu cơ này tác dụng với hợp chất Photphat không tan nhờ sự liên kết với Cation:
Mg
+2
, Ca"
2
, AP
3
, Fe
+3
qua đó tạo nên hợp chất Photpho mới tan trong nuớc.
Kapoor (1998), cho rằng phần lớn các chủng nấm sợi có khả năng phân giải
mạnh các hợp chất Photphat khó tan là nhờ axit hoá mồi trường, do tạo ra các axit
hữu cơ,
Goldstein A.H (1996) đã chứng minh rằng kết quả của sự oxi hoá glucoza sản
sinh ra axit gluconic và 2-ketogluconic có ở vùng xung quanh tế bào vi khuẩn dẫn
đến làm tan Ca
3
(P0
4
)
2
của môi trường.
1.1.6.2 Sự phân giải Photphat khó tan nhò phản ứng Cacbondioxit (C0

2
và H
2
S).
Nhiều nghiên cứu trước đây cho rằng C0
2
sản sinh bởi rễ cây và vi sinh vật có
tác dụng phân giải các hợp chất Photphat khó tan. Sau đó Goerge (1938) tìm ra ràng:
C0
2
làm tăng cường khả năng tan của Photphat và sử dụng Photpho của cây trồng.
Trong quá trình phát triển, cây trồng và vi sinh vật đã tạo ra một lượng lớn
cacbondioxit. Hợp chất này cùng với nước đồng thời tác dụng lên các hợp chất
Photphat khó tan biến chúng thành dạng dễ tan như phương trình sau [24]:
Ca
3
(P0
4
)
2
+C0
2
+H
2
0 = 2 CaHP0
4
+ CaC0
3
Ca
3

(PƠ
4
)
2
+ 2 C0
2
+ 2H
2
0 = Ca(H
2
PƠ
4
)
2
+ 2CaC0
3
Năm 1958 Sawby và Sperber đã chứng minh rằng vi sinh vật phân huỷ
1.2Nhưng thành tựu nghiên cứu vi sinh vật phân giải hợp chất Photphat khó
tan trên thế giới và ứng dụng.
Trên thế giới vấn đề khu hệ vi sinh vật sống dị dưỡng trong đất, vùne: rễ đã
được nghiên cứu khá nhiều. Hàng loạt vi sinh vật phân giải lân khó tiêu đã được thu
thập và tuyển chọn. Đặc biệt có các chủng vi sinh vật có thể pphaan giải tới 70%
quặng Photphat thành lân dễ tiêu. Khi sử dụng loại phân vi sinh này có thể tiết kiệm
được 50% lượng lân cần bón mà vẫn không thay đổi năng suất chất lượng nông sản.
Điều này đã mở ra một triển vọng cực kỳ to lớn cho nhu cầu lương thực toàn cầu. Nó
đã khắc phục được tình trạng bế tắc, thiếu hiệu quả của các loại phân bón hoá học
trước đây .Theo tài liệu công bố tổ chức lương thực thế giới (FAO) thì để tăng sản
lượng nông sản lên 2- 3 lần thì con người phải tạo ra một lượng phân đạm tăng
khoảng 30 lần, Kali 10 lần. Điều đó cho thấy là hết sức tốn kém về công sức và của
cải. Việc sử dụng các chế phẩm phân vi sinh trong đó có vi sinh vật phân giải lân đã

được sử dụng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới như Hoa Kỳ, Canada, Nga, Trung
Quốc chế phẩm “Điền lực bảo “ do Trung Quốc sản xuất là loại phân có nhiều giá
trị sinh học và thực tiễn. Trong mỗi gam phân bón đã phát hiện thấy có chứa tới trên
5.10
9
tế bào vi sinh vật có khả năng chuyển hoá lân khó tan thành dạng dễ tan.
Năm 1970 ở Liên Xô đã dùng Bacillus Megatheriumval Photphatium để sản
xuất chế phẩm Photphohacterin. Chế phẩm này được sử dụng rộng rãi ở Liên Xô và
các nước Đông Âu dùng bón cho lúa mỳ, ngô, lúa nước. Kết quả cho thấy sản lượng
tăng 5-10% so với đối chứng.
Grimer và Mount (1981) đã nghiên cứu tác động của Pseudomonas Putida phân
lập từ đất xung quanh cây họ đậu Phaseollus Vulgaris. Các ông tthấy rằng khi bổ
xung p.putida vào đất trồng làm cho cây họ đậu này tạo ra nhiều nốt sần hơn, do đó
tăng khả năng hấp thu Photphat của cây [22].
Năm 1982, Datta và cộng sự đã ứng dụng thành công vi khuẩn Bacillus firmus
có khả năng phân giải Photphat khó tan làm tăng năng suất lúa ở vùng đông bắc Ân
Độ. Chủng này vừa có khả năng sinh IAA (Inđolactic axit) - là hooc môn sinh trưởng
rất cần thiết cho cây trồng vừa có khả năng chuyển hoá Photphat khó tan [23].
L3 Tình hình nghiên cứu vỉ sinh vật phân giải lân và ứng dụng trong phân bón
vi sinh ở Việt Nam.
Tại Việt Nam, việc nghiên cứu sử dụng vi sinh vật cố định Nitơ cũng như phân
giải Photphat khó tan đã được tiến hành từ những năm 60. Năm 1968 Lê Văn Căn và
Đặng Văn Ngữ đã nghiên cứu một số nấm mốc có khá năng phân giải
Photpho khó tan, trong đó có Aspergiỉlus niger sau 4 tuần nuôi cấy đã chuyển hoá được
17,2% Photpho tổng số trong Photphorit.
Hiện nay, chế phẩm phân hữu cơ vi sinh được công ty Thiên Nông sản xuất lân
đầu tiên ở nước ta từ tháng 10-1990. Đó là một dạng chế phẩm bao gồm nhiều loại vi
khuẩn được công bố là có khả năng chuyển hoá Photpho vô cơ và nhiều tác dụng
khác. Mục tiêu chung của các nhà khoa học Việt Nam là phấn đấu có được nhiều
loại phân bón sinh học tốt, để có thể giảm dần việc sử dụng phân hoá học trên đồng

ruộng đó cũng là mong muốn của những người làm nông nghiệp .
Kết quả nghiên cứu về phân lân vi sinh trong khuôn khổ đề tài cấp nghành mà
Viện Khoa Học kỹ thuật Nông Nghiệp Việt Nam giai đoạn 1992 - 1995 cho thấy sử
dụng vi sinh vật phân giải lân có thể thay thế được 30-35% lượng lân vô cơ cần bón
bằng quặng Photphorit mà năng suất cây trồng không thay đổi [17].
Nguyễn Hoài Hà và cộng sự (1960 )[8], đã phân lập từ đất trồng ngô ngoại thành
Hà Nội được 100 chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải Photphat khó tan, trong đó
có 52% phân giải yếu (D-d <5 mm), 45% phân giải trung bình (D-d =5- 10 mm) và
3% có khả năng chuyển hoá tốt ( D - d >10 ram ). Ba chủng mạnh có khả năng
chuyển hoá được >41% quặng Photphorit .
Nghiên cứu của Nguyễn Phương Chi và cộng sự (1998), Viện CNSH đã lựa
chọn chủng Aspergỉllus awamori Nakazawa MN1 [11]. Chủng này đã chuyển hoá
được 84,7% P
2
O
s
sang dạng dễ tiêu từ quặng Photphorit chứa 20% P
2
0
5
. Mặt khác,
chủng này cũng chuyển hoá được quặng Apatit chứa 25% Pi0
5
sang dạng dễ tan, tuy
nhiên ở mức độ nhỏ hơn (61,5%). Do đó chủng A.awmori Nakazawa MNI được sử
dụng làm phân lân vi sinh, giúp cây trồng sử dụng Photphat hữu cơ hữu hiệu hơn.
Trone khuôn khổ đề tài cấp nhà nước, KHCN 02-04 giai đoạn 1996-1998 do GS-
TS Lê Văn Nhương TTCNSH-Đại học Bách Khoa làm chủ nhiệm, các cán bộ khoa
học, đã phân lập và nghiên cứu chủng nấm sợi Aspergills japonicus VTCCN
n

\ừa có
khả năng phân giải Photphat khó tan vừa có khả năng phân giải Xenluloza. Chủng
nấm sợi này, có thể chuyển hoá 18,4% P
2
0
5
tan từ quặng Photphorit, 6,6% từ quặng
Apatit và 18,84% từ Ca
3
(P0
4
)
2
. Chủng nấm sợi trên đã được sử dụng để tạo chế phẩm
phân vi sinh vật [12].
Đề tài Khoa học cấp nhà nước KHCN 02 - 06 giai đoạn 1996- 2000 do TS Phạm
Tên chỉ tiêu
1. Vi sinh vật phân giải hợp
chất Photphat khó tan
không nhỏ hơn
1,0 X ĨO
9
1,0 X 10
8
1,0 X 10
7
1,0 X 10
6
pseudomonas. Sản phẩm được chứng minh có tác dụng tốt đối với sự sinh trưởng, phát
triển của ngô và lúa [17].

1.3.1 Tình hình sản xuất và sử dụng phân vi sinh vật phân giải Photphat
khó tan ở Việt Nam .
1.3.1.1 Các loại phân lân vi sinh .
Hiện nay trên thị trường phân lân vi sinh thường được chia làm hai nhóm sau:
+ Phân lân vi sinh vật trên nền chất mang thanh trùng
Quy trình sản xuất phân vi sinh trên nền chất mang thanh trùng được thể hiện
thông qua sơ đồ 2. Các loại phân vi sinh vật trên nền chất mang thanh trùng có mật
độ vi sinh vật hữu hiệu lớn từ 10
s
- 10
9
tế bào / gam, vi sinh vật tạp ít. Sử dụng phân
bón vi sinh vật này để nhiễm vi sinh vật vào hạt, tưới vào gốc cây non. Hiệu quả của
phân dựa trên năng suất và phẩm chất của nông sản [14].
Vi sinh vật phân giải lân
Than bùn, chất mang
Nhân sinh khối
Xử lý tiềm sinh
Đóng gói bảo quản, sử dụng
+Phân lân vi sinh vật trên nên chất mang không thanh trùng
Phân lân vi sinh được sản xuất trên nền chất mang không thanh trùng có
mật độ vi sinh vật hữu ích thấp chỉ khoảng 10
6
-10
8
tế bào /gam và vi sinh vật tạp khá
cao. Hiệu quả của phân bón dạng này thường dựa trên các chất dinh dưỡng có trong
chất mang. Chất mang ở đây thường là các chất hữu cơ: than bùn, phế thải nông
nghiệp, rác thải thành phố và các chất vô cơ khó tiêu: Apatit, Photphorit, bột đá
vôi Các loại chất mang hữu cơ thường được ủ háo khí hay yếm khí tuỳ

loại nguyên liệu hữu cơ.Nhược điểm của loại phân này là chất lượng không ổn định và
khó bảo quản.
1.3.1.2 Hiệu quả sủ' dụng các loại phân lân vi sinh vật.
Hiệu quả của các loại phân lân vi sinh thường được đánh giá thông qua các chỉ
tiêu sau:
- Tăng cường cung cấp thêm lân dễ tiêu cho cây trổng
- Tăng cường sức hoạt động của các loại vi sinh vật khác trong đất
- Cung cấp các chất điều hoà sinh trưởng
- Cung cấp các chất kháng sinh phòng chống sâu bệnh hại cây trồng
Cho đến nay, tuy rằng phân vi sinh vật phân giải lân khó tiêu được sản xuất, bán
trên thị trường nhưng số lượng không nhiều vì lý do sau: Hiệu quả của chúng chưa
được ổn định, giá thành đắt, khó khăn về bảo quản và vận chuyển [14].
1.3.2 Yéu cầu về chất lượng, thòi gian bảo quản phân lân vi sinh .
Theo TCVN của Bộ Nông Nghiệp và phát triển nông thôn -Viện khoa học kỹ
Trong đó: CFU là đơn vị hình thành khuẩn lạc.
Cho đến nay, có nhiều nhà sản xuất phân lân hữu cơ vi sinh như: Phân hữu
cơ Thiên Nông, phân lân sinh hoá hữu cơ Komlx của công ty hoá sinh nông níĩhiệp
và thương mại Thiên Sinh, phân sinh hoá hữu cơ Biomix của công ty phân bón hoá
chất Kiên Giang, Biofer của Hội Phân Bón Việt Nam đều sản xuất phân lân vi sinh
nhưng số lượng không nhiều, hiệu quả chưa thật ổn định, giá thành đắt, khó khăn về
bảo quản và vận chuyển hơn nữa không phải bón cho vùne đất nào cũng phù hợp và
cho hiệu quả cao [14].
Mặt khác thành phần, số lượng , hoạt tính của các vi sinh vật phân giải hợp chất
Photphat khó tan trong các mẫu đất ở các vùn2 địa lý khác nhau cũng rất khác nhau
[17]. Bởi vậy, việc tìm kiếm và bổ xung các vi sinh vật phân giải lán khó tan từ các
vùng đất có khí hậu và điều kiện địa lý đặc thù, để đưa vào ứng dụng trong thực tế
II.2 Môi trường nuôi vi
sinh vật phân giải Photphat.
II.2.1 Môi trưòng Pikovskaya [27,6] (dùng phân lập giữ giống và nghiên cứu khả nâng
phân giải photphat của các chủng vi sinh vật).

II. 2.2 Môi trường Pikovskav lỏng: dùng để nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả
năng sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật phân giải lân khó tiêu.
Khử trùng ở 0,8 atm / 30 phút.
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứư.
II. 1 Vật liệu và thiết bị:
11.1.1 Vật liệu.
11.1.1.1 Chung vi sinh vật: Các chủng vi khuẩn được phân lập từ các mẫu đất
trồng ngô, lúa, đậu tương và đất vườn trên địa bàn Hà Nội.
11.1.1.2 Giông cây trồng thí nghiệm đỏi với chủng vi sinh vật phân giải lân
khó tiêu,
Sử dụng giống đậu tương DT
84
do bộ môn giống cây trồng Trường Đại học
Nông Nghiệp cung cấp.
II. 1.2 Thiết bị thí nghiệm.
Thiết bị được sử dụng của phòng các chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật
-Viện CNSH.
Nồi khử trùng ướt (Trang Quốc)
Nổi khử trùng khô (Trang Quốc)
Máy đo pH Mettler Toledo -320 (Nhật)
Kính hiển vi quang học Olympus (Nhật)
Máy lắc do Viện Khoa học Việt Nam chế tạo 220 vòng /phút
Tủ ấm (Trung Quốc)
Cân phân tích ADNHR- 200 (Nhật)
11.2.3 Môi trường nước chiết đất.
Cân 1.5kg đất (đất Cổ Nhuế) +1000 ml nước máy, hoà đều rồi đem đun sôi
trong 30- 40 phút . Để lắng rồi gạn ra và ly tâm bỏ cặn . Phân phối vào các bình tam
giác và đem khử trùng ở 1 atm / 45 phút.
11.3 Phương pháp nghiên cứu.
II. 3.1 Phương pháp lấy mẫu.

Dùng thìa vô trùng lấy đất ở vùng bể mạt ( độ sâu từ 2-5 cm ) cho vào bình
tam giác, túi nilon sạch. Mỗi khu đất thường lấy từ 8-10 vị trí khác nhau,mỗi vị trí
lấy từ 10-15g đất, buộc kín hoặc đậy nút và ghi lý lịch, ngày lấy mẫu.
II.3.2 Phương pháp phân lập trên môi trường thạch đĩa [6].
Các mẫu đất lấy ở mỗi địa điểm khác nhau được trộn đều. Cân mỗi mẫu đất
lOg cho vào bình tam giác chứa 99 ml nước vô trùng lắc thật đều. Sau đó pha loãng
liên tục bằng nước vô trùng sao cho đạt đến độ pha loãng từ 10'-10
7
.
- Dùng Pipet vô trùng lấy 0,1 ml dịch từ ống nghiệm có độ pha loãng
nhất định nhỏ lên bề mặt môi trường thạch đĩa. Thông thường ta lấy dịch ở độ
pha loãng 10
2
, 10\ 10
5
, và 10
7
,.
- Dùng que trang thuỷ tinh dàn đều dịch vừa nhỏ lên bề mặt thạch sao
cho bề mặt thạch thật khô. Các thao tác làm trên ngọn lửa đèn cồn trong tủ Box
để tránh nhiễm vi sinh vật.
Nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 25-30'C từ 3- 5 ngày vi sinh vật phát triển
thành các khuẩn lạc có vòng phân giải Ca
3
(P0
4
)
2
. Mỗi khuẩn lạc khác nhau về mặt
hình thái được coi là một chủng vi sinh vật.

- Cấy truyền vào các ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng, giữ ở
tủ ấm 3- 5 ngày. Khi các chủng vi sinh vật đã phát triển dày kín mặt thạch ở
trong ống nghiệm thì cất giống vào tủ lạnh ỏ nhiệt độ 4°c.
II. 3.3 Phương pháp giữ giông [6 ].
Các chủng vi khuẩn có thể giữ ở 4- 5°c trong tủ lạnh khoảng 2- 3 tháng. Cấy
khuẩn lạc phát triển từ một tế bào (hay bào tử) lúc đầu , của một loại vi sinh vật trên môi
trường dinh dưỡng trong đĩa thạch mà mắt thường ta quan sát được.
Cách đếm: Tiến hành pha loãng như phương pháp phân lập trên môi trường
thạch đĩa. Sau khi nuôi cấy một thời gian thích hợp (3- 5 ngày) ở 30°c trong tủ ấm,
lấy ra đếm số lượng khuẩn lạc vi sinh vật phát triển trong một đĩa Petri, từ đó tính ra
số lượng tế bào trong lg ( hay lml) cơ chất theo công thức:
N = a.b.c
Trong đó : N: Tổng số CFU trong lg (lml) cơ chất đem phân tích
a: Số CFU trung bình đếm được trên một đĩa Petri (số tế bào trên
0,1 ml dịch mầu phân tích ở độ pha loãng b)
b: độ pha loãng
c: Số lượngvi sinh vật trong lml dịch ở độ pha loãng b.
Số khuẩn lạc trên dĩa Petri được coi là tốt để tính CFU nếu khi lấy 0,lml dịch
pha loãng mẫu trên môi trường có khoảng 5- 100 khuẩn lạc. Nếu sô lượng này nhỏ
hơn 5 thì kết quả loại bỏ.
II. 3.5 Phương pháp xác định khả năng phân giải Ca
3
(P0
4
)
2
[12].
- Cấy chấm điểm vi sinh vật đã phân lập được trên môi trường thạch đĩa
Pikovskaya.
- Theo dõi khả năng hình thành vòng phân giải của các chủng vi sinh vật

trong thời gian 3- 7 ngày.
- Vi sinh vật có hoạt tính phân giải sẽ tạo thành vòng tròn trong suốt
xung quanh khuẩn lạc còn vùng chưa phân giải có màu đục hơn.
-
Hoạt tính phân giải được đánh giá bằng hiệu số D - d (mm) trong đó D
là đường kính vòng phân giải, d là đường kính của khuẩn lạc vi sinh vật.
Nhỏ một giọt nước vô trùng lên phiến kính.
Khử trùng que cấy. Dùng que cấy lấy ít vi khuẩn trong ống thạch nghiêng,
đưa vào giọt nước trên phiến kính, giàn đều một lớp mỏng có diện tích 1- 2 cnr.
Cố định vết bôi: Hơ nhẹ phía dưới vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn.
Tiến hành nhuộm:
Nhuộm vết bôi bàng cách nhỏ vài giọt thuốc Saĩrarin giữ trong 1 - 2 phút.
Rửa nước.
Làm khô tiêu bản.
Đem quan sát bằng vật kính dầu.
II. 3.6.2 Phương pháp nhuộm Gram.
Nhuộm Gram là một phương pháp nhuộm đặc biệt do nhà khoa học Đan
Mạch Chriatian Gram tìm ra năm 1884. Muc đích của phương pháp này là xác định
được chủng là vi khuẩn Gram (+) hay Gram (-), để có thể phân biệt sự khác nhau
giữa các loại vi khuẩn giống nhau về hình thái và kích thước.
Phương pháp nhuộm Gram được tiến hành như sau:
Làm vết bôi (giống như nhuộm đơn)
Nhuộm bằng tím gential lên vết bôi giữ trong 1-2 phút
Rửa nước làm khô tiêu bản.
Nhuộm fucsin ziel trong 1-2 phút. Hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn đến
khi thấy bốc hơi.
Để nguội, rửa sạch.
Dùng cồn 33° hayH
2
S0

4
tẩy mầu cho đến khi hầu như không còn mầu
hổng đỏ nữa ( khoảng 1- 2 phút).
Rửa nước, nhuộm lại bằng xanh Metylen - loeffler trong lphút.
Rửa nước, làm khô. Khi quan sát tế bào vi khuẩn sẽ nhuộm mầu xanh,
còn bào tử bắt mầu hồng đỏ ( mầu của fucsin ziel).
II. 3.8 Phương pháp xác định các yêu tô ảnh hưởng đến sự sinh trương và
phát triển của chủng vi khuẩn phân giải Photphat.
11.3.8.1 Ảnh hưởng của pH ban đầu
Chủng vi khuẩn phân giải photphat được tuyển chọn, cấy vào bình tam giác
chứa 100ml môi trường Pikovskaya đã được điều chỉnh các độ pH khác nhau: 4 ; 5 ;
6 ; 7 ; 8 .
Nuôi cấy trên máy lắc ( 220 vòng/ phút ), nhiệt độ 30°c trong 60 giờ. Xác
định khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng bằng cách đo độ đục OD ở bước
sóng 560 ran trên máy so màu.
11.3.8.2 Ảnh hưởng của nguồn cacbon khác nhau.
Sử dụng 1% các nguồn cacbon khác nhau là: sacaroza, rỉ đường và tinh bột để
thay thế lần lượt cho glucoza trong lOOml dịch lỏng Pikovskaya .
Nuôi trên máy lắc t 220 vòng/ phút) trong 60 giờ ở 30°c. Cứ sau 12 giờ lại đo
OD một lần để xác định sinh khối.
II. 3.8.3 Ảnh hương của nguồn nitơ khác nhau.
Số
Ký
Có khả năng di động
Gram (-)
Tế bào có dạng trực
khuẩn, thường xếp
thành đôi, có bào
Khuẩn lạc dạng chấm tròn,
bóng nhầy hơi lồi,màu

trắng đục sau ngả sang
Nhiệt độ
khác nhau từ 20- 40°c, mỗi thang cách nhau 5°c . Sau 60 giờ nuôi cấy xác định khả năng
sinh trưởng và phát triển của chủng bằng cách đo đục OD ở bước sóng 560 nm trên
máy so màu .
II .3.9. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải lân đối
với sự sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương DT
84
Chuẩn bị đất đất thanh trùng .
Đất phù sa được đem phơi khô, đập nhỏ, thanh trùng ử 1.2atm trong 1.5 giờ
Sử dụng giống đậu tương DT
84
ngâm trons H
2
0
2
3 % trons 3phút. Sau đó rửa sạch
nhiều lần bằng nước cất vô trùng. Mục đích là nhằm loại bỏ hết các vi sinh vật tạp
nhiễm như: Nấm mốc, xạ khuẩn, vi khuẩn có trong hạt đậu tương, đảm bảo tính vô
trùng, hiệu quả chất lượng cao của hạt đậu tương trước khi gieo.Tiến hành ủ hạt đậu
tương như sau : Cho hạt vào hộp Petri đặt lên trên tấm giấy lọc, khi hạt nảy mầm
đem đi gieo vào các bình đối chứng không phân , đối chứng có phân ( Bình đối
chứng là bình đã loại bỏ hết vi sinh vật) và đất đã nhiễm vi sinh vật phân giải lân
(Bình thí nghiệm) mỗi bình gieo khoảng 30 hạt đậu tương. Theo dõi sự nảy
mầm,sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương
Công thức bón phân cho hạt đậu tương.
Phân được bón vào các thời điểm như sau: Bón lót trước khi gieo, bón lần
một khi đậu tương được 6-8 ngày, bón lần 2 khi đậu tươne được 15-17 ngày, tỷ lệ N:
P: K là 180 kgN : 120 kg P
2

0
5
: 100 kgK/ha . Các vi khuẩn được nhiễm vào hạt đậu
tương đạt 10
s
tế bào / sam đất.
Chăm sóc và theo dõi thí nghiệm .
Để đảm bảo độ ẩm thích hợp cho cây đậu tương , hàng ngày tưới bằng nước vô
trùng (với các bình đối trứng) và bằng nước máy đối với bình lây nhiễm vi sinh vật
( bình thí nghiệm). Theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương thông
qua các chỉ tiêu : Tỷ lệ nảy mầm , chiều cao thân lá của chúng
Xác định số hạt nảy mầm, số cây sống sót ở các mẫu [9]:
+ Theo dõi hạt nảy mầm như : Hạt nảy mầm sau bao nhiêu ngày , phần trăm
(%) hạt nảy mầm tính như sau :
số hạt nảy mầm
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
III. 1. Phân lập các chủng có khả năng chuyên hoá photphat:
Từ các mẫu đất trổng ngô, đậu tương, trồng lúa và đất vườn ở Viện Di Truyền
Nông Nghiệp, Từ Liêm, cổ Nhuế Chúng tôi tiến hành phân lập nhằm tuyển chọn
các chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hoá các hợp chất photphat khó tan trên môi
trường Pikovskaya.
Các mẫu đất được pha loãng trong nước vô trùng ở các độ pha loãng 10
2
-10
7
Sau
đó được cấy gạt trên bề mặt thạch đỉa. Đê tủ ấm 25 - 30°c sau 48 giờ quan sát khuẩn
lạc. Chọn chủng có vòng phân giải Ca
3
(P0

4
)
2
cấy truyền vào ống nghiệm . Sau đó tiếp
tục tuyển chọn bằng phương pháp cấy chấm điểm trên môi trường chứa Ca
3
(P0
4
)
2
và
xác định hoạt tính phân giải Ca
3
(P0
4
)
2
trên mồi trường lỏng.
Bảng 3: kết quả phân lập và tuyển chọn vi sinh vật phân giải photphat
khó tan.
Ánh 1: Kết quả phân lập vỉ sinh vật phân giải Photphat ử mẫu đất vườn Hà Nội
IIĨ.2 Lựa chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải Ca
3
(P0
4
)
2
cao
Từ 4 mẫu đất trên, đã phân lập được 23 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải
Ca

3
(P0
4
)
2
. Chúng tôi tiến hành lựa chọn các chủng có khả năng phân giải Photphat
mạnh , nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ 30°c trong 60 giờ sau đó đo đường kính vòng phân
giải lân xung quanh khuẩn lạc. Đã chọn được 4 chủng sau có hoạt lực phân giải
Photpho manh . Kết quả trình bày trên bảng 4 , trong đó chủng DV
9
có hoạt lực
mạnh nhất.
Bảng 4: các chủng có hoạt tính phân giải Ca
3
(P0
4
)
2
cao.
Chúng tôi đã chọn chủng DVạ chủng có hoạt lực mạnh nhất để nghiên cứu kỹ hơn .
Ảnh 2: Khả năng phân giải Ca
3
(P0
4
)
2
của chủng vi khuẩn DV
9
.
III. 3. Nghiên cứu đặc điểm hình thái của chủng vi khuẩn DV

9
.
Chủng DV
9
là vi khuẩn .
Kết quả nghiên cứu được thể hiện trong bảng 5.
Như vậy chủng DV
9
là vi khuẩn Gram âm (-) thể hiện qua ảnh 3.
Ảnh 3: Tế bào vi khuẩn DVụở độ phóng đại 1800 lần.
II. 4. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy chủng DV
9
.
III. 4. 1. Ảnh hưởng của nhiệt độ khác nhau lén khả năng sinh trưởng
và phát triển của chủng DV
9
Nhiệt độ là một trong những yếu tố môi trường ảnh hưởng manh đến sự sinh
trưởng phát triển cũng như hoạt động sống của vi sinh vật. Nhiệt độ trong đất ở mỗi
khu hệ sinh thái là khác nhau và phụ thuộc vào mùa, chính vì thế mà khi bổ xung vi
sinh vật vào đất chúng ta cần quan tâm xem chúng tổn tại tốt nhất ở dải nhiệt độ
nào?
Chủng DV
9
được cấy trong các ống nghiệm chứa môi trường lỏng Pikovskaya vô
trùng có pH -1 và để ở các thang nhiệt độ khác nhau từ 20°c - 40°c mỗi thang cách
nhau 5°c. Sau 60 giờ nuôi cấy xác định khả năng sinh trưởng và phát triển của chúng
bằng cách đo độ đục OD ở bước sóng 560 nm trên máy so màu Kết quả được thể
hiện qua bảng 6 và hình 1
của chủng DVụ
40 0.417 0.612 0.771 0.628 0-402

Qua bảng trên ta thấy chủng vi khuẩn DVy sinh trưởng và phát triển tốt trong
III. 4. 2. Ánh hưởng của pH ban đầu lên sụ sinh trưởng phát triển của
chủng DV
9
.
pH là một nhân tố quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát
triển của vi sinh vật. Vì vậy, nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu, nhằm xác định
dải pH thích hợp cho chủng vi khuẩn DV
9
sinh trưởng và phát triển tốt.
Chủng DVạ được nuôi trong các bình tam giác có chứa lOOml môi trường
Pikovskaya lỏng. pH môi trường ban đầu được điều chỉnh từ 4 - 8, cách nhau mỗi
khoảng là 1. Máy lắc với tốc độ 220 vòng/phút trong 60giờ. Cứ 12 giờ đo OD một
lần.
Kết quả thu được trình bày qua bảng 7 và hình 2.
Bảng 7: Ảnh hưởng của pH ban đầu lẽn sự sinh trưởng và phát triển của
chủng DV
9
.
Số
Nguồn cacbon
Số
Nguồn Nitơ
^ - \ !
Môi trường lỏng
Pỉkovskaya chuẩn
Môi trường nước
chiết đất
Môi trường nước
chiết đất bổ sung

Thời gian
(ngày)
Lô đối chứng không phân
Lô đối chứng có phân
Lô thí nghiệm
Số hạt nảy
mầm
Tỷ lệ nảy mầm
(%)
Số hạt nảy
mầm
Tỷ lệ nảy mầm
(%)
Số hạt nảy
mầm
Tỷ lệ nảy mầm
(%)
Sô ngày sau khi
gieo
Kết quả trình bày trên bảng 7 cho thấy, với môi trường axit hoặc môi trường kiềm
thì sự phát triển của chủng DVạ kém hơn môi trường trung tính pH=7. Tuy nhiên, ở
môi trường axit nhẹ chủng DVọ lại phát triển mạnh hơn so với môi
trường kiềm. Như vậy, khả năng thích ứng của chủng này là tương đối rộng trong
khoảng pH từ 5 - 8. Kết quả thí nghiệm của chúng tôi cũng phù hợp với nghiên cứu
của hai nhà khoa học Lê Văn Căn và Đặng Văn Ngữ đã nghiên cứu và nhận thấy vi
khuẩn phân giải hợp chất photphat khó tan hoạt động trong một phạm vi pH khá
rộng.
Như vậy, pH thích hợp nhất cho việc sinh trưởng và phát triển của chủng vi
khuẩn phân giải lân DV
9

là pH=7. Chúng tôi đã tuyển chọn để tiếp tục cho các thí
nghiệm sau.
III. 4. 3. Ảnh hương của nguồn cacbon lên khả năng sinh truơngvà
phát triển của chủng vi khuẩn DVy
Khả nãng sử dụng các nguồn cacbon đa dạng cho phép vi sinh vật tồn tại dễ
dàng trong tự nhiên, đó cũng là tiêu chuẩn rất quan trọng dùng tuyển chọn các chủng
vi sinh vật để ứng dụng trong sản xuất. Vì vậy, chúng tôi tìm hiểu ảnh hưởng của các
nguồn cacbon khác nhau lên sự sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn DVụ.
Chủng này được nuôi cấy trong môi trường Pikovskaya lỏng chứa 1 % sacaroza, rỉ
đường, tinh bột lần lượt thay thế glucose . Sau 60 giờ xác định khả năng sinh trưởng
và phát triển của chủng DVạ bằng cách đo độ đục OD trên máy so màu .
Kết quả được trình bày ở bảng 8 và hình 3.
Bảng 8: Ánh hương của nguồn các bon lên khả năng sinh trương và phát triển
của chủng DV
9
.
Kết quả trình bày ở bảng 8 cho thấy, rỉ đường là nguồn cacbon số 2 sau glucoza mà
chủng DV
9
sử dụng tốt. Nhìn chung , chúng dễ đồng hoá nguồn cacbon mà ta đưa
vào để nghiên cứu . Nguồn cacbon có giá trị cao nhất chính là glucoza , đây là nguồn
cacbon dễ đồng hoá nhất cho tất cả các loại vi sinh vật nói chung và chủng vi khuẩn
phân giải hợp chất photphat nói riêng.Tuy nhiên, để dùng trong sản xuất dùng ri
đường có thể tận dụng một nguồn phụ phẩm trong công nghiệp mía đường và giá
thành rẻ hơn . Trong rỉ đường, ngoài đường còn có nhiều Vitamin , các nguyên tố
III, 4. 4 Ảnh huờng của nguồn nitơ khác nhau lên sụ sinh trương và
phát triển của chủng DVạ.
Giống như nhiệt độ, pH và nguồn cacbon, nitơ là một nhân tố quan trọng, ảnh
hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, việc tìm ra nguồn nitơ thích
hợp cho chủng DV

9
sinh trưởng và phát triển là điều rất cần thiết, giúp cho quá trình
chuyển hoá các hợp chất phospho khó tan thành dạng dễ tan một cách tốt hơn.
Đổ nghiên cứu sự ảnh hưởng của nguồn nitơ khác nhau chúng tôi tiến hành
nuôi cấy chủng trên máy lắc (220 vòng/phút) ở 30°c trong 100 ml dịch môi trường
Pikovskaya lỏng có bổ sung 1% các nguồn nitơ sau: NaN0
3
, (NH
4
)^S0
4
, pepton và
ure. Sau 60 giờ xác định khả năng sinh trưởng và phát triển của chúng bàng cách đo
độ đục OD trên máy so màu .
Kết quả thu được trình bày ở bảng 9 và hình 4:
Bảng 9: ảnh hương của nguồn nitơ đến sự sinh trương và phát triển của
chủng DV
9
.
Kết quả cho thấy với các nguồn nitơ khác nhau vi khuẩn DV
9
đều có thể sử
dụng và phát triển tốt. Tuy nhiên qua bảng 9 ta thấy rằng chủng DV
9
sử dụng nguồn
ure là tốt nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng. Điều này rất thuận lợi cho
việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh sau này, bởi ure là nguồn dễ
III. 5 Môi trường có triển vọng dùng trong sản xuất để nuôi chủng DV
9
.

Sau khi nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát
triển của chủng vi khuẩn trên , chúng tôi có kết quả như sau: Chúng DV
9
sinh
trưởng, phát triển tốt nhất trong môi trường có pH = 7, nhiệt độ từ 25 -30 °c , nguồn
cacbon mà nó đồng hoá dễ nhất là glucose và nguồn Nitơ tốt nhất là Ure . Chính vì
Nuôi cấy chủng DVy trên máy lắc tốc độ 220 vòng / phút ở 30 trong 100 ml địch
Pikovskaya lỏng chứa nguồn cacbon là glucose , nguồn Nitơ là Ure và được điều
chỉnh pH = 7 . Sau 60 giờ nuôi cấy , xác định khả năng sinh trưởng , phát triển của
chúns .
Kết quả thu được trình bày qua bảng 10 Bảng 10: Động thái sinh trưởng,
phát triển của chủng DV
9
sau 60 giờ nuôi cấy
III.6 Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng
DVytrong môi trường nước chiết đất có bổ sung N , p , K.
Chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng DVạ trên máy lắc (220 vòng/ phút) ở 30
(,
c
trong môi trường nước chiết đất , môi trường nước chiết đất có bổ sung N , p , K và
môi trường Pikovskaya lỏng làm môi trường chuẩn ( môi trường tối ưu ). Sau 60 giờ
nuôi cấy xác định khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng .
Bảng 11 : Khả năng sinh trương và phát triển của chủng DV
9
trong môi trường
nước chiết đất có bổ sung N, p, K.
Sau khi nuôi cấy chủng DV
9
vào mồi trường nước chiết đất, nước chiết đất có
bổ sung N, p, K. Ta thấy rằng, trong môi trường nước chiết đất bình thườn 2 chủng

này vãn có thể phát triển được. Tuy nhiên trong môi trường nước chiết đất có bổ sung
N, p, K thì chủng DVy sinh trưởng và phát triển khá mạnh ( mặc dù không tốt so với
môi trường chuẩn). Kết quả này có thể chấp nhận được bởi vì đây là môi trường dễ
kiếm lại rẻ tiền, có thể sử dụng môi trường này để thay thế cho môi trường Pikovskaya
lỏn2 chuẩn được .
IH.7 Ảnh hương của chủng DVy đối với cây đậu tương .
Đổ có thể ứng dụng được các vi sinh vật phân lập được vào thực tiễn , không chỉ
dựa trên các hoạt tính phân giải Photphat khó tan mà ta còn phải xác định sự an toàn
của vi sinh vật này đối với cây trồng.
Để đánh giá sự an toàn của vi sinh vật phân giải lân và mức độ ảnh hưởng của
chún2 lên sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng, chúng tôi nhiễm chủng DV
Ọ
vào
đất vô trùn2 (lô đất thí nghiệm ) với mật độ vi sinh vật đạt 1 o
8
tê bào / 1 gram đất. Sau
đó gieo mỗi lô đất 30 hạt đậu tương. Tương tự như vậy, trên lô đất đối chứng không
phân và lô đối chứn2 có phân chúng tôi cũng gieo 30 hạt đậu tươn2 DT
g4
( đất đối
chứng là đất khônư lây nhiễm vi sinh vật).
Bảng 12 : Ánh hưởng của chủng DVy đến tỷ lệ nảy mầm của hạt đậu tương DT
84
Qua bảng 12 và biểu đồ 1 ta thấy rằng, khi lây nhiễm chủng DV
9
vào các bình thí nghiệm
không những không gây ảnh hưởng xấu đến sự nảy mầm của hạt giống mà còn kích
thích sự nảy mầm cũng như rút ngắn thời gian nảy mầm của hạt
Tính vô hại của chủng vi khuẩn phân giải photphat khó tan đối vói cây đậu tương
còn được chứng minh bằng các thí nghiệm ảnh hưởng của chủng DVg lên chiều cao

thân lá của cây đậu non.
Sau khi gieo 8,10,13,15,17,20 ngày chúng tôi bắt đầu đo chiều cao thân lá của
Bảng 13: Động thái sinh trương của cây đậu tương DT
84
Bảng 13 và biểu đồ 2 cho thấy các cây đậu tương DT
g4
tính từ ngày thứ 8 trở đi , ở cả lô
thí nghiệm và lô đối trứng cây non vẫn tiếp tục phát triển . Tuy nhiên , trong các lô thí
nghiệm khả năng phát triển của các cây đậu cao hơn các lô đối chứng không phân và
đối chứng có phân. Ở các lô thí nghiệm chiều cao thân lá của cây đậu non sau 20 ngày
đạt 24,9 cm , ô đối chứng có phân chiều cao thân lá của cây đậu non đạt 23,1 cm và ở
lô đối chứng không phân chỉ đạt 19,0 cm . Như vậy, chủng DVạ không những không
gây hại , gây bệnh cho các cây đậu tương mà còn kích thích sự sinh trưởng và phát
triển của chúng (xem ảnh 4).
Ánh 4: Sinh trưởng của cây đậu tương DT
84
dưới sự tác động của vi khuẩn
phân giải Photphat khó tan.
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ
IV.1 Kết luận.
1. Từ các mẫu đất trồng ngô, trồng lúa, trồng đậu tương và đất vườn, đã phân lập
được 4 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải mạnh các hợp chất photphat khó
tan ( vòng phân giải > 5 mm ). Trong đó, chủng vi khuẩn (ký hiệu là DV
9
) có
hoạt tính phân giải mạnh nhất ( đường kính vòng phân giải >12 mm sau 10 ngày
nuôi cấy).
2. Chủng DV
9
là trực khuẩn hình que thường xếp đôi, có bào tử, là nhóm Gram ( - )

có khả năng di động. Được xác định là một loài nào đó trong giống Bacillus, tạm
gọi là Baciỉlus sp. Khuẩn lạc hình chấm tròn, bóng nhầy, hơi lồi màu trắng đục,
sau ngả sang màu nâu.
3. Chủng DVụ có thể phát triển tốt ở pH = 7 ( Môi trường trung tính ). Sử dụng
nguồn Cacbon tốt nhất cho quá trình sinh trưởng và phát triển là glucose, nguồn
Nitơ tốt nhất đối với chủng là Ure và nhiệt độ tối ưu là 30°c.
4. Đã xác định tính an toàn của chủng DVạ đối với cây trồng đó là giống đậu tương
DT
g4
. Không những DV
9
khống gây bệnh đối với cây đậu tương DT
84
mà còn có
khả năng kích thích sự nảy mầm của hạt, tăng chiều cao của cây đáng kế.
IV.2 Đề nghị.
Do thời gian nghiên cứu có hạn, chúng tôi mới chỉ phân lập được 4 chủng vi khuẩn,
trong đó có một chủng có khả năng phân giải lân khó tiêu khá cao và đã tiến hành
thử nghiệm trên cây đậu tương. Cần có sư nghiên cứu sâu hơn nữa và áp dụng vào
MỤC LỤC
Trang
Phần 1. Mở đầu 1
Phần 2 . NỘI DUNG 3
Chương I. Tổng quan tài liệu 3
1.1Lý thuyết về phân giải các hựp chất photpho 3
1.1. 1 Vai trò của photpho đối với sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng
3
1.1.2 V
òng tuần hoàn của photpho trong tự nhiên 3
1.1.3 Cá

c dạng của photpho trong tự nhiên 4
1.1.4 Cá
c dạng chế biến phân photpho 5
1.1.4.1 Phân photpho chế biến bằng axit
5
1.1.4.2 Phân photpho chế biến bằng nhiệt
5
1.1.5 Vi sinh vật phân giải hợp chất photphat khó tan
6
1.1.6 Cơ chế phán giải photphat khó tan nhờ vi sinh vật
CHƯƠNG II: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 13
II. 1 Vật liệu và thiết bị 13
II. 1.1 Vật liệu 13
II. 1.1.1 Chủng vi sinh vật 13
II. 1.1.2 Giống cây trổng thí nghiệm đối với vi khuẩn phân giải lân 13
II. 1.2 Thiết bị thí nghiệm 13
II. 1.3 Hoá chất 13
II.2 M
ôi trường nuôi vi sinh vật phân giải Photphat 14
11.2.1 Mồi trường Pikovskaya
14
11.2.2 M
ồi trường Pikovskaya lỏng 14
11.2.3 M
ôi trường nước chiết đất 15
11.3 Ph
ương pháp nghiên cứu 15
11.3.1 Phương pháp lấy mẫu
15
11.3.2 Ph

ương pháp phân lập trên môi trường thạch đĩa 15
II.3.8.4 Ản
h hưởng của nhiệt độ khác nhau 18
II. 3.9 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải lân
đối với sự sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương DTg
4
19
CHƯƠNG III: Kết quả và thảo luận 20
III.1 Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hoá Photphat khó
tan 20
111.2 Lựa chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải Photphat khó tan
cao 21
111.3 Nghiên cứu đặc điểm hình thái của chủng vi khuẩn phân giải Photphat
khó
tan 22
111.4 Ng
hiên cứu đặc điểm sinh lý của chủng vi khuẩn DVạ 23
III.4.1 Ánh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh trưởng và phát triển
của chủng vi khuẩn DVg 23
PHẨN 3: TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Lê Văn Căn.Gỉáo trình nông hoá - NXB Nông Nghiệp, 1968.
2 Lê Văn Cãn.Gía trị một số nguồn lân địa phương. NXB Nông Nghiệp, 1968.
3 Lê Văn Căn. Đất Việt Nam và vấn đề Super lân. NXB Nông Nghiệp, 1968
4 Lê Văn Căn.Sử dụng phân lân ở Miền Nam. NXB Nông Nghiệp, 1985.
5 Nguyễn Phương Chi và cộng sự. Phối hợp các chủng cố định Nitơ và hoà tan
Photphat để nâng cao hiệu quả chế phẩm phân vi sinh vật. Đề tài KHCN 02-
06, 1998.
6 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh
Phước, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Vãn Ty. Một số
phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học. Tập I, II. NXB Khoa Học

KỹThuật,1978
7 Hoàng Thị Hà.Dinh dưỡng khoáng thực vật. NXB Đại Học Quốc Gia, 1998.
8 Nguyễn Hoài Hà, Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Anh Đào.Nghiên cứu đặc điểm
sinh học của ba chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hoá Photphat khó tan.
Tạp chí khoa học công nghệ, 1998.
9 Đỗ Ngọc Huyền, Nguyễn Thanh Mai và cộng sự.Tuyển chọn vi sinh vật phân
giải lân có hoạt tính cao để sản xuất chế phẩm phân vi sinh. Đề tài KHCN 02-
06, 1998.
14 Võ Minh Kha.Hướng dãn thực hành sử dụng phân bón. NXB Nông Nghiệp,
1996
15 Phương pháp kiểm tra vi sinh vật Nông Nghiệp. Phòng thử nghiệm vi sinh
vật, viện khoa học kỹ thuật Việt Nam, 1999.
16 Phạm Văn Toản, Nguyễn Kim Vũ, Đặng Đức Nhuận, Võ Văn Thuận.
Nghiên cứu khả năng phân giải lân của vi sinh vật bằng kỹ thuật đổng vị P
32
. Kỹ thuật
nghiên cứu hạt nhân trong nghiên cứu sinh học và Nông Nghiệp, 1994.
17 Phạm Văn Toản, Nguyễn Ngọc Viết, Lê Hồng Sơn.Kết quả nghiên cứu ứng
dụng phân bón vi sinh hỗn hợp trong sản xuất Nông Nghiệp. Đề tài khoa học
công nghệ 02-06, 2000.
18 Phạm Vãn Toản.Nghiôn cứu ứng dụng giải pháp công nghệ mới nhằm mở
rộng việc sản xuất, ứng dụng phân bón vi sinh vật cố định Nitơ, phân giải lân
trong Nông, Lâm nghiệp. Đề tài khoa học công nghệ 02-06, 1998.
19 Phạm Vãn Toản.Sự tồn tại của các chủng vi sinh vật giống trong chế phẩm vi
sinh vật và đất trồng. Đề tài khoa học 02-06, 2000.
20 Phạm Văn Toản, Phạm Ngọc Sinh.Báo cáo kết quả sản xuất và thử nghiệm
phân lân hữu cơ vi sinh KOMIC.Đề tài khoa học công nghệ 02-06, 1998.
21 Phạm Văn Ty, Đào Thị Lượng.Nghiên cứu khả năng phân giải Photphat khó
tan và xenluloza của Aspegillus Japonicus. Tạp chí khoa học công nghệ, 1998.
22 Craven, P.A and Hayasuka. s. s. Inorganic Phosphate Solubilization