Tuyển chọn chủng có khả năng chịu axit và muối mặn cao từ các chủng vi khuẩn lactic trong một số sản phẩm lên men lactic trên địa bàn thành phố Huế

DANH SÁCH BẢNG
Hình Tên hình Trang
Bảng 1.1 Các giống khác nhau của vi khuẩn lactic 4
Bảng 1.2 Đặc điểm phân biệt một số loài của chi Lactobacillus 6
Bảng 1.3 Các đặc điểm phân biệt một số loài Pediococcus 10
Bảng 3.1 Các chủng vi khuẩn dùng trong thí nghiệm 23
Bảng 3.2 Thành phần môi trường MRS rắn/Lít 27
1
DANH SÁCH HÌNH
Hình Tên hình
Trang
Hình 1.1 Hình thái tế bào của Lb. axitophilus và Lb. plantarum 5
Hình 1.2 Hình thái tế bào của Leuconostoc mesenteroides 8
Hình 1.3 Hình thái tế bào của Pediococcus halophilus và Aerococcus
urinaeequi 9
Hình 1.4 Hình thái tế bào của Bifidobacterium 11
Hình 3.1. Hình thái tế bào và nhuộm gram của các chủng vi khuẩn lactic sử
dụng trong thí nghiệm 24
Hình 4.1. Thời gian tăng OD 0,3 của các chủng vi khuẩn lactic trong môi
trường MRS có 0,3% muối mật 33
Hình 4.2. Khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn lactic ở pH 2 36
Hình 4.3 Hình ảnh minh họa khả năng chịu axit của chủng DC1 trên đĩa
peptri 38
Hình 4.4 Hình ảnh minh họa khả năng chịu axit của chủng DC2 trên đĩa
peptri 39
Hình 4.5 Hình ảnh minh họa khả năng chịu axit của chủng MC5 trên đĩa
peptri 40
Hình 4.6 Hình ảnh minh họa khả năng chịu axit của chủng MC9 trên đĩa
peptri 41
Hình 4.7 Hình ảnh minh họa khả năng chịu axit của chủng MC10 trên đĩa
peptri 42

Hình 4.8. Đường cong tăng trưởng của chủng MC9 43
Hình 4.9. Trình tự một đoạn gen rDNA 16S của chủng MC9 và Lactobacillus
fermentum SFCB2-3 45
Hình 4.10. Cây phân loại dựa trên trình tự rRNA 16S 46
2
CÁC TỪ VIẾT TẮT
Lb Lactobacillus
Lc Lactococcus
MRS Man, Rogosa, Sharpe
CFU Colony Forming Unit
WHO World Health Organization
FAO Food and Agriculture Organization
OD Optical Density
3
MỤC LỤC
PHẦN 1 : MỞ ĐẦU

1
PHẦN 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3
2.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic

3
2.1.1 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn

3
2.1.2 Các nhóm vi khuẩn lactic

3

2.1.3 Ứng dụng của vi khuẩn lactic 12
2.2 Hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa của người 12
2.2.1 Đặc điểm chung của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa người 12
2.2.2 Chức năng các nhóm vi sinh vật chủ yếu trong đường tiêu hóa người 13
2.3 Tổng quan về probiotics 14
2.3.1 Khái niệm probiotics 14
2.3.2 Những tính chất có lợi của probiotics 16
2.3.3 Các tiêu chuẩn sàng lọc một chủng vi khuẩn làm probiotics 19
2.4. Khả năng tồn tại và sinh trưởng của vi khuẩn lactic trong đường tiêu hóa
người 20
2.5 Tình hình nghiên cứu khả năng chịu axit và muối mật của vi khuẩn lactic
trên thế giới 21
2.6 Tình hình nghiên cứu khả năng chịu axit và muối mật của vi khuẩn lactic
ở Việt Nam 21
PHẦN 3 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
4
3.1 Đối tượng nghiên cứu 23
3.2 Thiết bị, hóa chất sử dụng 26
3.2.1 Thiết bị 26
3.2.2 Hóa chất 26
3.3 Phương pháp nghiên cứu 26
3.31. Phương pháp hoạt hóa giống 26
3.3.2. Phương pháp nuôi cấy tăng sinh 27
3.3.3. Phương pháp bảo quản giống 27
3.3.4. Phương pháp xác định mật độ tế bào trong môi trường lỏng 28
3.3.5. Phương pháp khảo sát khả năng chịu muối mật 29
3.3.6. Phương pháp khảo sát khả năng chịu axit 30
3.3.7. Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng 30
3.3.8 Phương pháp xử lí số liệu 31
PHẦN 4 : KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 32

4.1. Kết quả khảo sát khả năng chịu muối mật 32
4.2. Kết quả khảo sát khả năng chịu axit 34
4.3. Xác định khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối của MC9 43
4.4. Kết quả định danh 44
PHẦN 5 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO 49


5
PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.
Xã hội càng phát triển thì việc nâng cao sức khỏe, phòng chống bệnh
tật lại càng được chú trọng. Lo sợ trước các tác động có hại của việc điều trị
bệnh bằng kháng sinh, con người ngày càng ưa thích những phương pháp giữ
gìn sức khỏe, phòng tránh và điều trị bệnh tật có nguồn gốc tự nhiên, tạo ra sự
cân bằng, ổn định trong cơ thể. Một trong số những phương pháp phổ biến
rộng rãi nhất hiện nay là sử dụng các chế phẩm probiotic.
Probiotic là chế phẩm gồm các vi sinh vật sống, chủ yếu là vi khuẩn
lactic. Đây là những vi khuẩn sống tự nhiên trong đường tiêu hóa của con
người và các loài động vật khác. Chúng có nhiều tác động có lợi cho sức khỏe
như giúp ổn định hệ vi sinh vật đường ruột, ức chế vi khuẩn gây bệnh trong
đường ruột, hỗ trợ tiêu hóa, giảm nồng độ cholesterol trong máu và giảm
nguy cơ bị ung thư.
Để thường xuyên duy trì những tác động này, có thể bổ sung thêm từ
nguồn thực phẩm lên men có chứa chúng như sữa chua, tôm chua, nem chua
hoặc từ các chế phẩm chuyên dụng. Hiệu quả của chúng sẽ càng được tăng
cường khi các chủng vi khuẩn lactic trong đó đã qua những nghiên cứu sàng
lọc để đảm bảo chúng có tiềm năng probiotic mạnh.
Một trong những tính chất quyết định tiềm năng probiotic của các

chủng vi khuẩn này là khả năng tồn tại, thích nghi được với môi trường trong
đường tiêu hóa động vật. Chúng phải chịu được môi trường axit ở dạ dày và
6
thích nghi được với nồng độ muối mật ở ruột và các tác động của các enzyme
trong đường tiêu hóa.
Những năm gần đây, các loại thực phẩm có các vi sinh vật probiotic rất
được ưa chuộng ở Việt Nam. Tuy nhiên, chưa có nhiều các nghiên cứu phân
lập và khảo sát tiềm năng probiotic của hệ vi sinh vật lên men lactic ở nước
ta. Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Tuyển chọn chủng có khả năng chịu
axit và muối mật cao từ các chủng vi khuẩn lactic trong một số sản phẩm
lên men lactic trên địa bàn thành phố Huế”, nhằm xác định được một số
chủng có khả năng tồn tại và thích nghi trong đường tiêu hóa động vật, làm
tiền đề cho các nghiên cứu tuyển chọn các dòng vi khuẩn lactic có tiềm năng
probiotic để ứng dụng vào sản xuất.
7
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.
2.1. Tổng quan về vi khuẩn lactic
2.1.1. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn là những những vi sinh vật đơn bào, có cấu tạo đơn giản.
Chúng có thể hô hấp hiếu khí hoặc yếm khí, trong cấu tạo tế bào của chúng
không có diệp lục tố [5]. Ngoài những đặc điểm chung trên thì đối với mỗi
nhóm vi khuẩn khác nhau luôn có những đặc điểm riêng đặc trưng cho nhóm
đó. Vi khuẩn lactic cũng vậy chúng cũng có những đặc điểm sinh lí sinh hóa
khác so với các nhóm vi khuẩn khác và trong mỗi loài sự khác nhau đó càng
thấy rõ hơn. Mặc dù nhóm vi khuẩn này không đồng nhất về mặt hình thái
nhưng nhìn chung tất cả những vi khuẩn lactic đều có những đặc điểm sau.
2.1.1.1. Đặc điểm sinh lí
- Đó là những vi khuẩn gram dương, nói chung là bất động, không sinh

bào tử.
- Chúng là những vi khuẩn kị khí tùy nghi, vi hiếu khí, là loại cơ thể
độc nhất có khả năng lên men hiếu khí cũng như kị khí, chúng có khả năng
sinh trưởng được khi có mặt oxi.
- Chúng không chứa các cytochrom, catalase và nitratoredutase âm tính
2.1.1.2. Đặc điểm sinh hóa
- Dinh dưỡng của nhóm vi khuẩn lactic khá phức tạp do khả năng tổng
hợp các chất cần cho sự sống của chúng rất yếu. Không một đại diện nào
8
thuộc nhóm này có thể phát triển trên môi trường muối khoáng thuần khiết
chứa glucose và NH4
+
. Đa số chúng cần hàng loạt vitamin (lactoflavin,
tiamin, axit pantotenic, axit nicotinic, axit folic, biotin), và các axit amin, các
bazơ purin và pirimidin [5].
- Chúng có khả năng lên men tạo axit lactic bằng cách phân giải nguồn
hydrat cacbon có trong môi trường.
2.1.2. Các nhóm vi khuẩn lactic
Năm 1857 Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm sữa chua là kết
quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt là vi khuẩn lactic. Năm 1878
Lister đã phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên và đặt tên là Bacterium
lactics.Về sau các nhà khoa học đã liên tiếp phân lập được nhiều loài vi khuẩn
lactic khác nhau [1]. Và các loài vi khuẩn này được xếp chung vào họ
Lactobacteriaceae.
Bảng 1.1 Các giống khác nhau của vi khuẩn lactic [2]
Giống
Tế bào Kiểu lên
men
%
G+C

Tài liệu dẫn
Hình Sắp
xếp
Streptococcus
Leuconostoc
Pedicoccus
Lactobacillus
Bifidobacterium
Cầu
Cầu
Cầu
Que
Khác
nhau
tùy
loài
Chuỗi
Chuỗi
Tứ
cầu
Chuỗi
Nhiều
dạng
Đồng hình
Dị hình
Đồng hình
Đồng hình
và dị hình
Lactic và
acetic

34-
46
36-
43
34
-42
32
-53
55
-67
Schleifer 1986
Farrow và cộng
sự 1989
Schleifer 1986
Kandler và
welss, 1986
Scardovi, 1986
Nhóm vi khuẩn lactic rất đa dạng bao gồm rất nhiều chi khác nhau.
Việc phân loại các chi này dựa trên sự khác nhau về hình thái của vi khuẩn
(Tế bào của chúng có thể hình que hoặc hình cầu) và khả năng sinh trưởng và
9
phát triển trên các điều kiện pH khác nhau (4,4; 9,6); ở các nhiệt độ khác nhau
(10
0
C; 45
0
C) cũng như khả năng lên men đồng hình hay dị hình của chúng.
Người ta đã tiến hành phân loại và chia nhóm vi khuẩn lactic thành 5 chi chủ
yếu sau (Thể hiện trên bảng 1.1).
Sự tập hợp của 5 chi này vào cùng một nhóm vi khuẩn lactic đã được

khẳng định qua phương pháp phân loại phân tử [2]. Ngoài ra có một số loài vi
khuẩn sinh nội bào tử có khả năng lên men tạo axit lactic thuộc chi Bacillus,
Tuy nhiên, các loài này không được xem là vi khuẩn lactic do các đặc điểm
sinh lý và hóa sinh của chúng.
2.1.2.1. Lactobacillus
Giống Lactobacillus là chi lớn nhất trong nhóm vi khuẩn lactic, gồm
khoảng 80 loài [27]. Với mức độ khác nhau rất nhiều về hình thái, đặc điểm
sinh hóa và sinh lý. Sự không đồng nhất thể hiện ở phổ tỉ lệ mol G+C rất
rộng, từ 32-55% [27]. Chúng là những trực khuẩn không sinh bào tử thuộc
lớp vi khuẩn Gram dương, catalase âm tính, sinh trưởng trong điều kiện kỵ
khí không bắt buộc hoặc vi hiếu khí. Những trực khuẩn này thường đứng
riêng lẻ hoặc thành chuỗi, thủy phân đường saccharosa mạnh tạo axit lactic,
không khử nitrat, chúng phân giải gelatin, indole và H
2
S. Chúng phát triển
mạnh trong môi trường có tính axit, tùy loài mà pH dao động từ 4,5 đến 6,4.
Đây là những vi khuẩn khuyết dưỡng nhiều loại vitamin, axitamin. Người ta
có thể tìm thấy Lactobacillus trong các sản phẩm sữa, thịt, hoặc trong nước
sạch, bùn, bề mặt thực vật, trái cây. Các loài thuộc chi này cũng là một phần
quan trọng trong hệ thống vi sinh đường ruột ở người và động vật bậc cao, có
trong khoang miệng, đường ruột và âm đạo.
Nhiều kết quả nghiên cứu phân loại sinh hóa và lai DNA cho thấy
Lactobacillus là một nhóm rất đặc biệt.
10
INCLUDEPICTURE " \* MERGEFORMATINET
Hình 1.1 Hình thái tế bào của (a) Lb. axitophilus và (b) Lb. plantarum
a b
Bảng 1.2 Đặc điểm phân biệt một số loài của chi Lactobacillus [2]
(Theo Bottazzi, 1988)
Nhóm Loài GC

%
AD
N
Loại
peptido
Glycane
Dạn
g
axit
lacti
c
Nơi sống chính
I
Lb.delbrueckii
subsp.delbruceckii
Lb.delbrueckii subsp.bulgaricus
Lb delbrueckii subsp lactics
Lb.acidophilus
Lb.gasseri
Lb.helveticus
49-
51
49-
51
49-
51
34-
37
33-
37

38-
40
Lys –Asp
Lys –Asp
Lys –Asp
Lys –Asp
Lys –Asp
Lys –Asp
D
D
D
DL
DL
DL
Mặt thực vật
Sữa chua
Fomat
Miệng, âm đạo
Miệng, âm đạo
Fomat
II
Lb.casei subsp Casei
Lb. casei subsp
pseudoplantarum
45-
47
45-
Lys –Asp
Lys –Asp
Lys –Asp

L
DL
L
Dạ dày đv nhai lại
Fomat, rơm rạ ủ
Mồm, âm đạo
11
Lb casei subsp Tolereas
Lb.casei subsp rhamnosus
Lb. sake
Lb.bavaricus
Lb. Plantarum
47
45-
47
45-
47
42-
44
42-
44
44-
46
Lys –Asp
Lys –Asp
Lys –Asp
m-ADP
L
DL
L

DL
Ruột non người
Bề mặt thực vật
Bề mặt thực vật
Thực vật,fomat
III
Lb.bifementans
Lb. brevis
Lb buchneri
Lb. kefir
Lb.reuteri
Lb. fermentum
Lb.confusus
Lb. Viridescens
Lb. Sanfrancisco
44-
46
45-
47
44-
46
40-
42
40-
42
52-
54
45-
47
45-

47
36-
38
Lys –Asp
Lys –Asp
Lys –Asp
Lys –Asp
Lys –Asp
Orn-D-
Asp
Lys-Ala
Lys-Ala-
Ser
Lys-Ala
DL
DL
DL
DL
DL
DL
DL
DL
DL
Fomat
Thực vật,fomat
Thực vật,fomat
Kefir
Ruột non
Thực vật,fomat
Thực vật

Ccác sản phẩm
thịt
Các loại bánh
12
Giống Lactobacillus được chia làm 3 nhóm (Bảng 1.2) [6]:
Nhóm 1: Được gọi là Thermobacterium, lên men đồng hình và ưa
nhiệt. Không lên men glucose và đường pentosa. Những vi khuẩn này có
fructose 1,6 diphosphate aldolasa, chúng phát triển ở 45
0
C.
Nhóm 2: Được gọi là Streptobacterium, đây là những trực khuẩn lên
men đồng hình và ưa ấm, nhiều loại của nhóm này có khả năng lên men dị
hình. Các hexosa được lên men theo con đường EMP tạo thành axit lactic,
nhưng các pentosa có thể lên men dị hình.
Nhóm 3: gồm những trực khuẩn có tên gọi là Betabacterium, chúng là
những vi khuẩn lên men dị hình bắt buộc. Chúng sinh axit lactic, axit acetic,
CO
2
và ethanol.
2.1.2.2. Streptococuss
Đây là những vi khuẩn gram dương bao gồm các cầu khuẩn, đa số lên
men đồng hình và bất động. Sau khi phân chia chúng thường tạo thành chuỗi,
sống hoại sinh trong đất, bề mặt cây, da người, ruột… Chi này cũng là một
chi rất lớn trong vi khuẩn lactic, bao gồm nhiều nhóm khác nhau.
Ngoài Lactococcus thì trước đây người ta đã xếp thêm Enterococcus
vào chi Streptococcus. Mặc dù ngày nay đã có sự phân tách và tạo thành
những chi mới, chi Streptococcus vẫn là một chi rất lớn và khó phân loại một
cách hoàn hảo. Enterococcus không có vai trò quan trọng trong công nghệ
thực phẩm. Một số loài trong chi này, ví dụ như E. faecalis có thể là những vi
khuẩn gây bệnh cơ hội, vì thế không được ưa chuộng trong chế biến thực

phẩm. Người ta quan tâm nhiều đến khả năng kháng kháng sinh và khả năng
chuyển một số tính trạng thông qua các yếu tố di truyền có khả năng dịch
chuyển. Tuy nhiên, vẫn có nhiều nghiên cứu sử dụng E. faecium và E.
faecalis làm probiotic do nhiều loài trong chi Enterococcus cư trú tự nhiên
trong đường ruột của động vật bậc cao và người [10] [36] .
2.1.2.3. Leuconostoc
Chi Leuconostoc là những vi khuẩn hình cầu, gram dương, phần lớn
chúng lên men dị hình theo con đường Hecxoso-monophosphat tạo D-lactic
từ glucose. Một số loài Leuconostoc cùng với Lactobacillus gây nên quá
trình lên men malolactic, đây là quá trình lên men thứ hai sau lên men rượu
13
vang, nó làm chua rượu vang, quá trình xảy ra mạnh trong vang còn nhiều
axit tactric và axit malic. Vì vậy rất dễ nhầm lẫn giữa Leuconostoc với
Lactobacillus lên men dị hình có hình thái dạng cầu-que. Do đó đã có sự tách
ra một số loài từ cả chi Lactobacillus và Leuconostoc đề hình thành nên chi
mới: Weissella, gồm các vi khuẩn “giống như Leuconostoc”, đó chính là các
loài trước đây được xem như Ln.paramesenteroides; Lb.confusus;
Lb.viridesens …[27]. Chi này vì thế có cả dạng hình cầu và que. Người ta
nhận thấy loài Ln. oenos, còn được gọi là Leuconostoc ở rượu, có khả năng
chịu nồng độ rượu và axit cao, vì thể đã được tách ra tạo thành một chi mới,
Oenococcus. Trong khi việc phân biệt giữa Oenococcus và Leuconostoc khá
đơn giản, thì việc phân biệt giữa Weissella và Leuconostoc vẫn là một vấn đề
nan giải.
2.1.2.4. Pediococcus
Pediococcus là một chi trong nhóm vi khuẩn lactic gồm những tứ cầu
hoặc song cầu lên men lactic đồng hình, tạo axit lactic dạng DL hoặc (L+),có
khả năng chịu axit và thủy phân protein yếu. Hầu hết chúng không có khả
năng sử dụng lactosa và được đặc trưng bởi GC% ADN từ 34-42 %. Người ta
phân biệt Pediococcus bởi khả năng chịu nhiệt, chịu pH, chịu NaCl và khả
năng lên men đường (Bảng 1.3).

14
Hình 1.2 Hình thái tế bào của Leuconostoc mesenteroides
Trong công nghệ thực phẩm vai trò của chúng vừa có ý nghĩa tích cực
vừa tiêu cực. Chẳng hạn như và P. pentosaceus được sử dụng làm giống nuôi
cấy khởi đầu trong sản xuất xúc xích và ủ thức ăn gia súc [27]. Chúng cũng
có thể có vai trò quan trọng góp phần vào sự chín của phomat. Ngược lại thì
P. damnosus lại là một tác nhân chính làm hỏng bia, vì sự phát triển của
chúng có thể dẫn đến sự tạo thành diacetyl/acetoin, làm cho bia có vị giống
bơ.
Ngoài Pediococcus thì Aerococcus, Tetragenococcus cũng tạo nên các
vi khuẩn lactic dạng tetrad (4 cầu khuẩn liên kết thành bộ 4). Trong đó chi
Aerococcus nhìn chung chỉ có vai trò thứ yếu trong công nghệ thực phẩm.
Còn chi Tetragenococcus ban đầu được coi là Pediococcus halophilus.
Bảng 1.3 Các đặc điểm phân biệt một số loài Pediococcus [2]
15
Hình 1.3 Hình thái tế bào của Pediococcus halophilus(a) vàAerococcus
urinaeequi(b)
a b
Đặc điểm
Pc.damnosus
Pc.damnvulus
Pc.inopinatus
Pc.dextrinicus

Pc.pentosaceus
Pc.axitolactici
Pc.halophilus
Pc.urinaequi
- Sinh trưởng ở pH 4,5
- Độ mặn cao nhất có

thể chịu (%)
- Lên men :
Lactoza
Maltoza
Melezitoza
Riboza
Saccharoza
Trehaloza
Dextrine
Amidon
- Thủy phân agrinin
+
< 4
-
+/-
+/-
-
+/-
+
-
-
-
+
6.5
-
+
-
-
-
+/-

-
-
-
ND
4-6.5
+/-
+
+
-
-
-
+/-
-
-
-
4
+/-
+
-
-/+
+/-
-
+
+
-
+
6.5
+/-
+
-

+
-
+
-
-
+
ND
6.5
+/-
-
-
+
-
+/-
-
-
+
-
18
-
+
+
+
+
+
-
-
-
-
6.5

+/-
+
-
ND
+
+
+
-
-
+: dương tính; -: âm tính; +/-: khác nhau tùy chủng; ND: không xác định.
Ngoài đặc điểm là chịu được nồng độ muối rất cao (18%) thì chúng còn
một đặc điểm nữa để phân biệt với các vi khuẩn lactic khác là chúng cần nồng
độ muối khoảng 5% để phát triển. Chi này có vai trò quan trọng trong các loại
thực phẩm có hàm lượng muối cao, như nước chấm đậu nành.
2.1.2.5. Bifidobacterium
Chi Bifidobacterium là những trực khuẩn kị khí không sinh bào tử,
Gram dương, bất động. Khi mới phân lập chúng là những trực khuẩn có thể
phân nhánh dạng chữ Y, V tập hợp thành khối. Sau nhiều lần cấy chuyền
chúng trở thành những trực khuẩn thẳng hoặc hơi uốn cong với những hạt dự
trữ nhuộm màu xanh metylen. Vì vậy khi phát hiện vào năm 1899, vào đầu
thế kỉ XX chi này chi được xem như thuộc vào chi Lactobacillus. Theo khóa
phân loại Bergey năm 1920, chúng có tên là Lactobacillus bifidus. Năm 1967,
16
Devries và Stouthamer đã chứng minh sự có mặt của enzyme fructose-6-
phosphate phosphoketolase. Ở nhóm vi khuẩn này và sự vắng mặt của hai
enzyme là aldolase và glucose-6-phosphatase dehydrogenase – hai enzyme có
mặt trong Lactobacilli. Từ đó người ta kết luận rằng việc phân loại nhóm
bifido trong chi Lactobacillus là không hợp lý. Ngày nay, nhóm này được xếp
thành một chi riêng biệt, chi Bifidobacterium, thuộc họ Actinomycetaceae, có
25 loài [2].

Chúng lên men lactic dị hình sản phẩm chính của chúng là axit acetic
và axit lactic, cùng với một lượng nhỏ axit formic, ethanol, axit succinic và
một điều đặc biệt khác nữa là trong quá trình lên men không sản sinh ra khí
CO
2
. Là những cơ thể catalasa âm,nitrat dương, indol và gelatine âm. Chi này
chủ yếu sống ở trên cơ thể động vật bậc cao, có thể gặp chúng ở trong khoang
miệng và đường tiêu hóa của động vật và cả ở côn trùng, thậm chí ở cả bùn,
chúng là vi sinh vật tiên phong trong hệ tiêu hóa của người. Chúng có ứng
dụng quan trọng trong việc sản xuất các chế phẩm vi sinh làm probiotic.
2.1.3. Ứng dụng của vi khuẩn lactic
17
Hình 1.4 Hình thái tế bào của Bifidobacterium
Vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều trong công nghiệp bảo quản, chế
biến thực phẩm và thức ăn gia súc [5]. Từ lâu nhân dân ta đã biết bảo quản và
chế biến các sản phẩm rau quả bằng cách muối chua để kéo dài thời gian sử
dụng. Chính các vi khuẩn lactic là tác nhân chủ yếu tham gia qua trình lên
men chua. Chúng có khả năng lên men đường tạo axit lactic trong môi trường
kỵ khí làm cho pH giảm xuống dưới 5, làm ức chế các loại vi khuẩn gây thối
phát triển. Ngày nay, vi khuẩn lactic được sử dụng trong sản xuất sữa chua,
phomat, lên men các sản phẩm rau quả, thịt, hải sản.
Ngoài ra, nhóm vi khuẩn này còn có nhiều đặc tính có tiềm năng
probiotic nên đã được nhiều nhà nghiên cứu đã và đang quan tâm. Việc sử
dụng các chủng vi khuẩn lactic trong phòng ngừa và điều trị bệnh cũng như
phục hồi và duy trì sức khỏe ngày càng phổ biến. Ngày nay, chúng còn được
sử dụng trong điều trị làm tăng hệ miễn dịch, giảm cholesterol, ngăn ngừa ung
thư [20] [21]. Các chủng vi sinh vật được sử dụng làm probiotic thương mại
hiện nay đều thuộc nhóm vi khuẩn lactic, ở hai chi là Lactobacillus và
Bifidobacterium [16]. Trong đó Lactobacillus là nhóm vi khuẩn lactic được
sử dụng nhiều nhất trong lĩnh vực probiotic [20] [19]. Những loài này đều

được xem là các vi khuẩn không gây bệnh ở người. Hiện nay đang có một số
nghiên cứu sử dụng cả Enterococcus, Streptococcus để làm probiotic [14]
[36]. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và sử dụng các sản phẩm probiotic có
nguồn gốc từ vi khuẩn lactic còn rất hạn chế.
2.2. Hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa của người
2.2.1. Đặc điểm chung của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa người
Hệ tiêu hóa của chúng ta chỉ chiếm một khoảng không gian khá khiêm
tốn trong ổ bụng nhưng diện tích bề mặt tiêu hóa của ruột lớn rất lớn. Người
ta ước đoán trong ruột chúng ta có hằng hà sa số các loài vi sinh vật khác
nhau, gấp hàng chục lần tổng số tế bào trong cơ thể một người trưởng thành.
[19].
Khi mới sinh ra, đường tiêu hóa của chúng ta không có bất kì một vi
sinh vật nào kể cả vi khuẩn, do những tiếp xúc đầu tiên với môi trường, từ
sữa mẹ vi khuẩn bắt đầu xâm nhập. Những cá thể vi khuẩn này sau khi thoát
18
qua được dạ dày đến ruột sẽ tăng sinh nhanh chóng, tồn tại và phát triển, dần
dần tạo nên quần thể vi sinh vật với sự cân bằng tự nhiên.
Khi trưởng thành, vi sinh vật đường ruột ổn định và cân bằng hơn. Tuy
nhiên cũng có thể bị mất cân bằng do ảnh hưởng của môi trường, vệ sinh an
toàn thực phẩm, bia rượu, thuốc kháng sinh, thuốc hóa trị liệu, hoặc ngay cả
căng thẳng công việc Vì vậy rối loạn đường ruột vẫn thường xuyên xảy ra.
Với người già, vi sinh vật có lợi có xu hướng giảm nhưng vi sinh vật
gây bệnh lại tăng, do đó người già thường xuyên bị rối loạn tiêu hóa như tiêu
chảy, táo bón, viêm đại tràng, sình bụng, đi phân sống , giảm khả năng hấp
thụ dinh dưỡng, giảm đề kháng, bệnh tật, kể cả ung thư ruột kết.
Về mặt khoa học, chúng được biết là một hệ vi sinh vật sống. Chúng
sinh sôi nảy nở trong đường ruột non, đại tràng của người và phần lớn chúng
tồn tại mà không cần oxy [19]. Hàng trăm ngàn tỷ vi sinh vật sống này là sự
cân bằng giữa vi khuẩn có lợi và vi khuẩn có hại. Bắt đầu từ dạ dày, vi khuẩn
gần như bằng không, chỉ có vi khuẩn gây loét dạ dày Helicobacter pylori là

có thể hiện diện, số lượng tăng dần ở ruột non và ruột già. Trong đó sự có mặt
của vi khuẩn có lợi đóng vai trò vô cùng quan trọng cho chức năng tiêu hóa
và giúp cân bằng hệ vi khuẩn ruột.
2.2.2. Chức năng các nhóm vi sinh vật chủ yếu trong đường tiêu hóa
người
Các nhóm vi sinh vật chủ yếu trong đường đường ruột của chúng ta là
những vi sinh vật sống có hại, có lợi và các loài trung tính khác nhau.
Các vi sinh vật có lợi chủ yếu trong đường ruột của chúng ta là các loài
cộng sinh Bifidobacterium, Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus,
Bacillus và nấm men [11] [19].
Các tác động của nhóm vi khuẩn có lợi :
• Chúng đem lại lợi ích bằng cách tái lập sự cân bằng tự nhiên trong hệ
tiêu hóa, giúp đường ruột khỏe mạnh bằng cách bám chặt, chiếm lĩnh
thành ruột và cạnh tranh chất dinh dưỡng với vi khuẩn có hại; ngăn
ngừa vi khuẩn có hại tấn công và phát triển, tăng cường chức năng
chống đỡ của niêm mạc ruột, giúp khống chế vi khuẩn gây hại.
19
• Một số loại vi khuẩn sinh ra các chất kháng khuẩn như bacteriocins
giúp ngăn ngừa và tiêu diệt mầm bệnh. Ngoài ra vi khuẩn cộng sinh
còn giúp tăng cả phản ứng miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu bằng
cách kích thích các tế bào phản ứng miễn dịch (macrophages,
lymphocytes), tăng cường sự sản xuất ra các thành phần miễn nhiễm
(cytolines, immunoglobulins, interferon).
• Một số vi sinh vật có lợi khác trong ruột non lại hạn chế hấp thu
cholesterol, giúp giảm cholesterol trong máu; sản sinh ra các enzym
khắc phục quá trình tiêu hủy carbohydrat, làm thuận tiện hơn việc hấp
thụ năng lượng từ các chất dinh dưỡng.
• Vi sinh vật có lợi giúp tăng khả năng dung nạp lactose nhờ kích thích
sản sinh lactaze.
Bên cạnh lợi ích của vi khuẩn có lợi thì luôn có sự tồn tại của các vi

khuẩn có hại như Escherichia coli, Shigella, Staphylococcus aureus,
Clostridium, Veillonella… [19]. Các vi khuẩn có hại này khi xâm nhiễm vào
đường ruột sã gây ra các tác động xấu đến sức khỏe mgười tiêu dùng như ngộ
độc thực phẩm ( Salmonella), viêm nhiễm đường ruột (Campylobacter), rối
loạn tiêu hóa (Enterotoxigenic E. coli, Enterotoxigenic E. coli, Enteroinvasive
E. coli, Enterohaemorrhagic E. coli)…
Tuy nhiên khi nào vi khuẩn có lợi và vi khuẩn trung tính này cạnh tranh
nhau để giành lấy không gian trong đường ruột thì vi khuẩn có hại không có
cơ hội nhân lên. Thường thì hệ vi khuẩn trong đường ruột của chúng ta rất
bền vững. Ngay cả khi hệ khuẩn ruột bị rối loạn rất nặng do dùng kháng sinh
hoặc tiêu chảy thì chúng vẫn có thể phục hồi một cách nhanh chóng khi
nguyên nhân gây nên rối loạn này được loại bỏ. Tuy vậy đôi khi vẫn có
trường hợp những vi khuẩn có hại chiếm ưu thế trong đường ruột.
2.3. Tổng quan về probiotic
2.3.1. Khái niệm probiotic
Việc sử dụng vi sinh vật sống nhằm tăng cường sức khỏe con người
không phải là mới. Hàng nghìn năm về trước, trước khi tìm ra thuốc kháng
sinh, con người đã biết tiêu thụ các thực phẩm chứa vi sinh vật sống có lợi
chẳng hạn như các sản phẩm sữa lên men. Các nhà khoa học đầu tiên, như
20
Hippocrates và những người khác cũng chỉ định sữa lên men với tính chất
dinh dưỡng và dược tính của nó, để chữa trị rối loạn ruột và dạ dày
(Oberman, 1985) [10]. Còn đối với nhà sinh lý học người Nga, Eli
Metchnikoff (1907) thì "Sự phụ thuộc của hệ vi sinh vật trong ruột đối với
thực phẩm làm cho nó có khả năng chấp nhận biện pháp thay đổi hệ vi sinh
vật trong người của chúng ta, tức là thay thế vi sinh vật có hại bởi vi sinh vật
hữu ích " [21].
Một vài năm trước bài thảo luận cuả Metchnikoff, Pastuer và Joubert
(1877) [10], trong khi quan sát sự đối kháng giữa các chủng vi khuẩn, đã nhận
thấy sự tiêu thụ vi khuẩn không gây bệnh có thể kiểm soát các vi khuẩn gây

bệnh. Ngoài ra, cùng thời gian này, Henry Tissier, một bác sĩ khoa nhi người
Pháp đã phân lập Bifidobacterium, một thành viên của nhóm vi khuẩn lactic,
từ phân của trẻ được nuôi bằng sữa mẹ (Tissier, 1906) [18] và nhận thấy
chúng là một thành phần nổi bật của hệ vi sinh vật ruột (Ishibashi và
Shimamura, 1993).
Như vậy nền tảng cho khái niệm hiện đại về probiotic đã được thành
lập từ rất lâu và việc nghiên cứu về việc sử dụng vi khuẩn lactic trong chế độ
ăn uống đã được tiếp tục suốt các thế kỷ vừa qua.
Vậy thì probiotic là gì?
Từ “probiotic” có nguồn gốc từ Hy Lạp có nghĩa là “cho cuộc sống”.
Tuy nhiên, định nghĩa về probiotic đã phát triển rất nhiều theo thời gian. Lily
và Stillwell (1965) đã mô tả trước tiên probiotic như hỗn hợp được tạo thành
bởi một động vật nguyên sinh có tác dụng thúc đẩy sự phát triển của đối
tượng khác [21]. Sau đó, Parker (1974) đã áp dụng khái niệm này đối với
phần thức ăn gia súc có một ảnh hưởng tốt đối với cơ thể vật chủ bằng việc
góp phần vào cân bằng hệ vi sinh vật trong ruột của nó.
Định nghĩa chung này sau đó chính xác hơn bởi Fuller (1989), ông định
nghĩa probiotic như “một chất bổ trợ thức ăn chứa vi sinh vật sống mà có ảnh
hưởng có lợi đến vật chủ bằng việc cải thiện cân bằng hệ vi sinh vật ruột của
nó [21]. Khái niệm này sau đó được phát triển xa hơn : “vi sinh vật sống (vi
khuẩn lactic và vi khuẩn khác, hoặc nấm men ở trạng thái khô hay bổ sung
trong thực phẩm lên men) mà thể hiện một ảnh hưởng có lợi đối với sức khỏe
21
của vật chủ sau khi được tiêu hóa nhờ cải thiện tính chất hệ vi sinh vật vốn có
của vật chủ” (Havenaar và Huis in't Veld, 1992) [21] [10].
Với Tannock et al., 2000 thì probiotic là “vi sinh vật sống có lợi cho
vùng ruột, góp phần vào việc cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột và có tác
động tốt đến sức khỏe của người tiêu dùng ” [38].
Tóm lại, đó là những vi khuẩn tốt sống trong đường tiêu hóa và ngay cả
trong âm hộ. Thí dụ điển hình về probiotic là vi khuẩn Bifidobacterium và vi

khuẩn Lactobacillus trích từ hệ vi sinh đường ruột [19].
2.3.2. Những tính chất có lợi của probiotic
Probiotic được coi như là một thực phẩm chức năng rất được ưa chuộng
bởi các tính năng của nó mang lại. Những tác động chủ yếu của các chủng vi
khuẩn probiotic tới sức khỏe con người gồm những mặt chính như sau:
• Ngăn chặn sự xâm nhập của các vi khuẩn gây bệnh bằng cách cản
chúng bám vào thành ruột
Probiotic khi được bổ sung vào cơ thể, các vi sinh vật này sau khi vượt
qua các rào cản về lý học và hóa học trong hệ dạ dày- ruột non thì chúng sẽ
tiến hành bám dính vào thành ruột để thực hiện các chức năng có lợi cho cơ
thể vật chủ. Chúng cạnh tranh nơi ở với vi khuẩn gây bệnh, ngăn cản không
cho các vi khuẩn này bám vào thành ruột, từ đó làm giảm số lượng vi khuẩn
ngăn chặn các mầm bệnh [21].
• Giúp cho việc tiêu hóa thức ăn được hữu hiệu hơn
Đối với những người thường bị chứng bất dung nạp đường lactose
trong các sản phẩm sữa do trong ruột không có enzyme tiêu hóa loại đường
này thì probiotic sẽ giúp họ tiêu hóa được dễ dàng hơn [21].
• Giảm nguy cơ bị tiêu chảy do uống nhiều thuốc kháng sinh
Việc sử dụng probiotic để phòng ngừa tiêu chảy gây ra bởi thuốc kháng
sinh rất được quan tâm.
Sự phát triển một cách rộng rãi và đặc hiệu cao của thuốc kháng sinh đã
khiến cho ngành y học quá tin tưởng vào phương pháp trị liệu kháng sinh.
Tuy nhiên, tác động loại bỏ của thuốc kháng sinh không phân biệt được mầm
bệnh thật sự và hệ vi sinh vật có lợi trong ruột. Vì vậy, phương pháp trị liệu
kháng sinh cũng dẫn đến thay đổi hệ cân bằng của ruột và gây ra một vài ảnh
22
hưởng xấu mà có thể tồn tại lâu dài ngay cả sau khi ngừng sử dụng cách điều
trị này.
Bên cạnh đó, sự xuất hiện nhanh của nhiều chủng vi khuẩn kháng lại
kháng sinh chẳng hạn như Enterocci kháng vancomycin và Staphylococcus

aureus kháng methicillin là một vấn đề đáng quan tâm. Hơn nữa, một vài
bệnh lây nhiễm lại gia tăng và trở nên trầm trọng hơn trong điều trị thuốc
khág sinh. Ví dụ, bệnh tiêu chảy có thể do Clostridium difficile, một mầm
bệnh cơ hội, hoạt động và tăng nhanh khi có sự mất cân bằng của hệ vi sinh
vật trong ruột thông thường diễn ra trong suốt quá trình điều trị kháng sinh
[21]. Mặc dù bệnh này nói chung được điều trị thành công với một loại thuốc
kháng sinh thứ hai, tuy nhiên một vài bệnh lây nhiễm vẫn tái diễn mặc cho
các phương pháp trị liệu kháng sinh khác (Sanders, 1999).
Về sau việc sử dụng probiotic đã cải thiện đáng kể hệ vi sinh vật nội
sinh (Markowitz và Bengmark, 2002) bằng cách thay thế các vi khuẩn có ích
bị mất. So với các nhược điểm như đắt, tính hóa học và xâm hại ruột của
thuốc kháng sinh, ưu điểm của probiotic là an toàn, nguồn gốc tự nhiên, và
phần lớn không có bất cứ ảnh hưởng có hại nào.
Ngoài tác dụng giảm nguy cơ bị tiêu chảy do uống nhiều thuốc kháng
sinh thì việc sử dụng probiotic còn có tác dụng ngăn ngừa nguy cơ tiêu chảy
gây ra bởi các loại virut gây bệnh [21].
• Tăng cường hệ miễn dịch
Probiotic như một vị thuốc chứa các phân tử chống viêm cho đường
ruột. Đồng thời góp phần đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào vật chủ để giảm
các phản ứng viêm bằng cách tạo các phản ứng miễn dịch cho cơ thể.
• Ngừa ung thư ruột
Một vài nghiên cứu cho thấy rằng các vi sinh vật probiotic có thể ngăn
chặn hoặc làm chậm quá trình ung thư ruột. Theo như các ghi nhận trước đó
thì các thành viên của hệ vi sinh vật đường ruột có khả năng sản sinh ra chất
gây ung thư nitrosamines. Do dó việc sử dụng Lactobacilii và
Bifidobacterium về mặt lí thuyết có thể giảm bớt được mức độ sản sinh ra các
chất gây ung thư này (Hosada et al, 1996). Tuy nhiên cũng quá sớm để đưa ra
23
kết luận cuối cùng về hiệu quả của probiotic trong việc ngừa ung thư ruột[ 21]
[34]

• Giảm cholesterol trong máu.
Hàm lượng cholesterol trong huyết thanh ảnh hưởng rất lớn đến các
bệnh về tim mạch. Nếu hàm lượng này cao hơn 1mmol so với mức bình
thường thì người bệnh đang ở mức độ nguy hiểm của các bệnh về tim mạch
(>35%) và có thể gây chết người nếu cao hơn 45 %. Vì vậy chỉ cần giảm 1 %
hàm lượng cholesterol trong máu là có thể giảm được mức độ nguy hiểm của
các bệnh về tim mạch từ 2 đến 3 % (Masnon etal, 1992) [27]. Và việc sử dụng
các sản phẩm probiotic có khả năng làm giảm hàm lượng cholesterol trong
máu [34] [10]. Một trong những bằng chứng đầu tiên đó là việc sử dụng
probiotic lactobaccilii trong các sản phẩm có ảnh hưởng tốt đến tim mạch,
bao gồm cả khả năng ngăn ngừa và điều trị các hội chứng thiếu máu cục bộ
của tim (Oxman et al, 2001) và giảm đáng kể hàm lượng cholesterol trong
máu (De Roos và Katan) , 2000 [18].
• Giảm thiểu hiện tượng dị ứng.
Lb. rhamnousus GG đã được thử nghiệm trên hai đối tượng có mức độ
dị ứng cao đó là phụ nữ 6 tuần trước khi sinh và trẻ sơ sinh trong vòng 6
tháng. Kết quả cho thấy có sự giảm có ý nghĩa về mức độ dị ứng (Kalliomaki
et al , 2001). Nghiên cứu này cho thấy tiềm năng của probiotic trong việc tạo
ra các phản ứng giúp cơ thể chống lại các chất lạ xâm nhập vào cơ thể và
ngăn ngừa hiện tượng dị ứng xảy ra. Trong các nghiên cứu y học khác về
bệnh dị ứng của trẻ em với sữa bò, người ta thấy rằng chứng viêm da di ứng
này có thể giảm bớt khi sử dụng thực phẩm probiotic của chủng Lb.
rhamnousus và B. lactics BB-12 (Majamaa và Isolauri, 1996; 1997; Isolauri et
al, 2000) [18].
Ngoài các ứng dụng chính trên thì probiotic theo như các nghiên cứu
khác còn có khả năng thuyên giảm triệu chứng đường ruột của hội chứng ruột
bị kích thích, nhiễm nấm âm đạo, nhiễm Helicobacter pylori ở dạ dày, bệnh
viêm ruột, và nhiễm trùng đường tiết niệu [21] [34].
24
2.3.3. Các tiêu chuẩn sàng lọc một chủng vi khuẩn làm probiotic

Không phải bất cứ loài vi khuẩn, nấm men hay vi sinh vật đơn bào nào
cũng có khả năng sử dụng làm probiotic. Chính số lượng và sự đa dạng của
các loài vi sinh vật làm cho việc sàng lọc trở nên khó khăn. Vì vậy để quá
trình sàng lọc có hiệu quả hơn trong ứng dụng thì đòi hỏi phải tiến hành cả thí
nghiệm in vitro và in vivo [19].
Các nghiên cứu in vitro được sử dụng để đánh giá các đặc tính của vi
sinh vật, làm cơ sở cho việc sàng lọc các chủng có tiềm năng làm probiotic.
Còn thí nghiệm in vivo đòi hỏi nhiều thời gian và số lượng lớn động vật cho
việc thử nghiệm, do đó, phương pháp này chỉ có thể sử dụng sau khi đã chọn
lọc được một số chủng có tiềm năng làm probiotic (Martins và cộng sự ,
2008) [31].
Những vi sinh vật được sử dụng làm probiotic phải chịu sự tác động
đồng thời hay liên tiếp các điều kiện bất lợi như sốc nhiệt nhẹ (nhiệt độ cơ
thể), tính axit của dịch dạ dày, các enzyme trong dịch tụy, lysozyme và muối
mật (Klaenhammer và Kullen, 1999)[26] và khả năng ức chế sự phát triển của
các vi sinh vật gây bệnh, khả năng cạnh tranh sự bám dính với vi khuẩn gây
bệnh và giảm sự bám dính của vi khuẩn gây bệnh vào đường ruột.Trường hợp
probiotic không có nguồn gốc từ đường tiêu hóa của động vật thì vấn đề này
rất cần được quan tâm.
WHO và FAO trong tuyên bố chung về tiêu chuẩn probiotic đã giới
thiệu một số tiêu chuẩn chủ yếu như sau [22]:
- Khả năng chịu pH thấp của dạ dày.
- Khả năng chịu muối mật.
- Khả năng phân giải muối mật.
- Khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh.
- Khả năng bám dính đường ruột.
- Khả năng bám dính biểu mô âm đạo (chuyên dùng cho cho sản phẩm
probiotic giúp cân bằng hệ vi sinh niệu – sinh dục.
Đây cũng là các kiểm nghiệm in vitro đang được dùng rộng rãi trong
quá trình sàng lọc các chủng vi khuẩn làm probiotic trên thế giới.

25