Nghiên cứu một số chủng nấm men lên men kombucha từ trà shan tuyết Hà Giang

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
1.Lý do chọn đề tài 10
2.Mục đích nghiên cứu 11
3.Nhiệm vụ nghiên cứu 11
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 11
5. Những đóng góp mới của của đề tài 11
6. Phương pháp nghiên cứu 12
NỘI DUNG 13
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 13
1.1. Giới thiệu về kombucha 13
1.1.1. Nguồn gốc 13
1.1.2. Đặc điểm cấu tạo 13
1.1.3. Hệ vi sinh vật trong kombucha 14
1.1.3.1. Acetobacter 14
1.1.3.2. Nấm men 15
1.1.3.3. Giống vi khuẩn lên men lactic 18
1.2. Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha 19
1.3. Giới thiệu về trà lên men kombucha 23
1.3.1. Thành phần của trà đường lên men 23
1.3.2. Công dụng của trà đường lên men 23
1.3.3. Một số lưu ý khi sử dụng 25
1.4. Nguyên liệu 25
1.4.1. Đặc điểm của trà 25
1.4.1.1. Nguồn gốc và đặc tính thực vật 25
1.4.1.2. Phương pháp sản xuất trà xanh 26
1.4.1.3. Đặc điểm của trà xanh 26
1.4.1.4. Chỉ tiêu đánh giá chất lượng trà xanh 27
1.4.2. Đặc điểm của trà Shan truyết Hà Giang 28
1.5. Tình hình nghiên cứu kombucha ở trong và ngoài nước 30
1.5.1. Trên thế giới 30

1.5.2. Ở Việt Nam 32
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35
2.1. Nguyên liệu, thiết bị, hóa chất 35
2.1.1. Nguyên liệu chính 35
2.1.2. Hóa chất và thiết bị 35
2.1.3. Các loại môi trường 36
2.2. Phương pháp nghiên cứu 36
2.2.1. Phương pháp vi sinh 36
2.2.1.1. Phương pháp phân lập nấm men và quan sát hình thái tế bào trên tiêu
bản nhuộm Gram 36
2.2.1.2. Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật 37
2.2.1.3. Bảo quản chủng giống 38
2.2.1.4. Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men 38
2.2.2. Phương pháp hóa sinh 38
2.2.2.1. Xác định đường khử 38
2.2.2.2. Xác định độ cồn 41
2.2.2.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường, nitơ, dinh
dưỡng khoáng đến quá trình lên men kombucha 42
2.2.2.4. Phương pháp xác định khả năng lên men các loại đường 43
2.2.2.5. Phương pháp xác định khả năng hình thành hợp chất loại tinh bột 43
2.2.2.6. Phương pháp nghiên cứu sự sinh trưởng trên môi trường có nồng độ
đường cao 44
2.2.3. Phương pháp cảm quan 44
2.2.4. Xử lí số liệu bằng thống kê toán học 46
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 48
3.1. Phân lập và sơ bộ định loại chủng nấm men có khả năng lên men
kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang 48
3.1.1. Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men kombucha 48
3.1.2. Định loại sơ bộ chủng nấm men có khả năng lên men kombucha 49

3.1.2.1. Hình thái tế bào học và hình thức sinh sản của các chủng nấm men 49
3.1.2.2. Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa và thạch nghiêng 50

3.1.2.3. Một số đặc tính sinh hóa của các chủng nấm men 51
3.2. Tuyển chọn chủng nấm men lên men kombucha 51
3.2.1. Hoạt lực lên men 52
3.2.2. Chất lượng cảm quan của kombucha được lên men từ 5 chủng 53
3.3. Động thái phát triển của hai chủng nấm men M
1
, M
2
53
3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng
và phát triển của 2 chủng nấm men M
1
và M
2
trong môi trường lên men 55
3.4.1. Ảnh hưởng của hàm lượng đường glucose 56
3.4.2. Ảnh hưởng của (NH
4
)
2
SO
4
59
3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ MgSO
4
.7H
2

O 60
3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường đối với quá trình lên
men kombucha 61
3.5.1.Ảnh hưởng của hàm lượng men giống 61
3.5.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu 63
3.5.3.Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men tới quá trình lên men 64
3.6. Xây dựng quy trình lên men kombucha 65
3.6.1. Quy trình lên men kombucha quy mô gia đình 65
3.6.2. Xây dựng quy trình lên men kombucha quy mô PTN 66
3.6.3. Kiểm tra, đánh giá chất lượng sản phẩm 70
3.6.3.1. Đánh giá chất lượng sản phẩm kombucha bằng phương pháp cảm
quan 70
3.6.3.2. Kiểm tra chất lượng sản phẩm 70
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 72
1. KẾT LUẬN 72
2. KIẾN NGHỊ 72
TÀI LIỆU THAM KHẢO 73


LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn tôi đã nhận được sự
hướng dẫn, giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị và các bạn. Với lòng
kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới:
PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung – Người đã trực tiếp hướng dẫn, dạy
bảo, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học
tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Đồng thời tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của Ban Giám
hiệu Trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh, các thầy cô giáo và
các anh chị, sinh viên trong phòng thí nghiệm Vi sinh khoa Sinh đã tạo mọi

điều kiện về cơ sở vật chất và những kiến thức cơ bản phục vụ cho mục đích
nghiên cứu của tôi.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới những người thân
trong gia đình, bạn bè đã giúp đỡ, động viên và khích lệ tôi trong suốt quá
trình thực hiện đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 12 tháng 7 năm 2013
Học viên


Lâm Thị Hồng Liên

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn này đều là sự thật. Đây
là kết quả nghiên cứu của riêng tôi. Tất cả các số liệu đều được thu thập từ
thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không
trùng với kết quả đã công bố.

Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, ngày 12 tháng 7 năm 2013
Học viên

Lâm Thị Hồng Liên

DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT
TRONG LUẬN VĂN

CLCQ: Chất lượng cảm quan
MT: Môi trường
Nxb: Nhà xuất bản
TP: Thành phố
TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam
ĐHSP: Đại học sư phạm
HG: Hà Giang


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Các chỉ tiêu cảm quan của trà xanh 27

Bảng 1.2.: Các chỉ tiêu hoá lý của trà xanh 28

Bảng 2.1. Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha 45

Bảng 2.2. Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu 46

Bảng 2.3 . Bảng quy định đánh giá mức chất lượng sản phẩm 46

Bảng 3.1. Đặc điểm sinh hóa của các chủng nấm men 51

Bảng 3.2. Hàm lượng khí CO
2
giải phóng sau 7 ngày lên men của 5 chủng
nấm men 52
Bảng 3.3. Chất lượng cảm quan của các chủng nấm men…………………… 44
Bảng 3.4. Động thái phát triển của 2 chủng nấm men M
1
, M
2
54

Bảng 3.5. Hàm lượng ethanol, hàm lượng đường khử, độ pH trong dịch lên
men của hai chủng M
1
, M
2
46

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình lên men của chủng
nấm men M
1
56

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình lên men của chủng
nấm men M

2
57

Bảng 3.8. Khả năng lên men của chủng M
1
trên môi trường có hàm lượng
(NH
4
)
2
SO
4
ở các mức khác nhau. 59

Bảng 3.9. Khả năng lên men của chủng M
2
trên môi trường có hàm lượng
(NH
4
)
2
SO
4
ở các mức khác nhau. 60

Bảng 3.10. Khả năng lên men của chủng M
1
trên môi trường có hàm lượng
MgSO
4

.7H
2
O khác nhau 60

Bảng 3.11. Khả năng lên men của chủng M
1
trên môi trường có hàm lượng
MgSO
4
.7H
2
O khác nhau 61

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tỷ lệ men giống M
1
tới quá trình lên men
kombucha………………………… ………………………………….53
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tỷ lệ men giống tới quá trình lên men
kombucha…………………… ……………………………………….53
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men kombucha…… 54
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men…………….55

Bảng 3.16 . Đánh giá chất lượng sản phẩm kombucha bằng

phương pháp cảm
quan ………………………………………………………………………….70

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Kombucha………………………………………………………… 5
Hình 1.2. Lớp màng kombucha…………………………………………… 5
Hình 1.3. Cơ chế phân giải đường trong tế bào nấm men …….……….20

Hình 1.4. Cây chè cổ thụ Shan tuyết Hà Giang……………………….…….20
Hình 1.5. Chè cổ thụ Shan tuyết Hà Giang…………………………….……20
Hình 3.1. Tế bào nấm men M
1
và M
2
trên kính hiển vi quang học có độ phóng
đại 1000 lần………………………………………………………… 40
Hình 3.2. Sinh sản nảy chồi và phân cắt ở nấm men…………………… …40
Hình 3.3. Ảnh chụp khuẩn lạc chủng nấm men M
1
, M
2
trên môi trường thạch
đĩa……………………………………………………………………….……41
Hình 3.4. Ảnh chụp chủng nấm men M
1
, M
2
trên môi trường thạch nghiêng41
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường sót trong dịch lên men ở các hàm
lượng đường khác nhau của chủng nấm men M
1
, M

2
………….………… 48

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn hàm lượng ethanol sinh ra trong dung dịch lên men
ở các hàm lượng đường khác nhau của chủng nấm men M1 và M2…… 49
Hình 3.7. Kết quả thử nghiệm đánh giá sản phẩm kombucha……………….62

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Uống trà là một thú vui tao nhã, một nét văn hóa cổ truyền của người Á
Đông nói chung và người Việt Nam nói riêng. Bây giờ văn hóa uống trà cũng
có nhiều thay đổi với nhiều chủng loại trà khác nhau, mỗi hương vị lại có một
nét đặc trưng riêng. Trước đây đơn giản chỉ có trà xanh, ngày nay với sự phát
triển cao về chất lượng cuộc sống đã cho ra nhiều loại trà không những có
hương vị thơm từ các loại hoa mà nó còn có tác dụng cho sức khỏe. Hiện nay
ở nước ta đang xuất hiện một loại thuốc bổ ở dạng lỏng như trà mà mọi người
gọi là trà "thủy sâm" hay còn gọi là kombucha. Thực ra đây chính là một loại
thức uống có từ rất lâu được gọi tên là "The Remedy for Immortality" nghĩa là
"Phương thuốc Trường sinh". Thủy sâm thực sự chỉ là một loại cái giấm phát
triển dưới dạng một váng nhầy dày và dai, màu trắng. Loại giấm này sinh sôi
nhanh trong môi trường nước chè (trà) pha đường.
Thành phần trà kombucha có chứa men tiêu hóa, sinh tố và nhiều hợp
chất hữu cơ. Vì đây là sản phẩm lên men nên chứa khoảng 0,5-1% cồn, acid
axetic, acid gluconic, acid glycuronic, acid L-lactic, acid cacbonic, acid
caprilic, acid xitric, acid oxalic, acid usnic, nhiều vitamin nhóm B như B
1
, B
2
,
B

3
, B
5
, B
6
, B
12
, vitamin C, acid folic, amino acid và một số hợp chất có tác
dụng kháng sinh, sát trùng và giải độc. Kombucha còn chứa một lượng nhỏ
cafein vì nó được lên men từ các loại trà như trà xanh, trà đen, trà ô long.
Ở Việt Nam, trên thị trường đã có bán các loại kombucha dưới dạng
đóng chai, đồ hộp, nước giải khát nhập khẩu từ nước ngoài. Trên thế giới, đã
có rất nhiều nghiên cứu về kombucha như: các nghiên cứu về thành phần các
chất, vitamin có trong kombucha; tác dụng của kombucha trong việc bảo vệ
cơ thể con người tránh các tác hại của hóa chất, tia phóng xạ; các nghiên cứu
về sự cố định đạm của một số chủng vi khuẩn được phân lập từ kombucha.
Tuy nhiên, ở Việt Nam các công trình nghiên cứu về kombucha vẫn chưa đầy
đủ, hoàn chỉnh. Đặc biệt là về khu hệ nấm men cũng như những nghiên cứu
về ảnh hưởng của điều kiện môi trường đối với quá trình lên men kombucha.
Do đó, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu một số chủng nấm men lên men
kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang’’. Trên cơ sở nghiên cứu này có thể lựa
chọn được các chủng nấm men dùng cho lên men kombucha.
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu một số chủng nấm men lên men kombucha từ trà Shan
tuyết Hà Giang.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
3.1. Phân lập và sơ bộ định loại một số chủng nấm men có khả năng lên
men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang.
3.2. Tuyển chọn chủng nấm men lên men kombucha.
3.3. Động thái phát triển của hai chủng nấm men M

1
, M
2

3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng và
phát triển của 2 chủng nấm men M
1
và M
2
trong môi trường lên men.
3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường đối với quá trình lên
men kombucha.
3.6. Xây dựng quy trình sản xuất kombucha.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Các chủng nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Shan tuyết
Hà Giang.
5. Những đóng góp mới của của đề tài
Là công trình nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về kombucha trên đối
tượng trà Shan tuyết Hà Giang. Đặc biệt, đã tiến hành phân lập, tuyển chọn
được chủng nấm men có khả năng lên men kombucha. Từ đó, xây dựng quy
trình công nghệ lên men kombucha quy mô phòng thí nghiệm.
6. Phương pháp nghiên cứu
6.1. Phương pháp vi sinh: gồm có phương pháp phân lập nấm men và quan
sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram; Phương pháp xác định số
lượng tế bào vi sinh vật; Bảo quản chủng giống; Phương pháp xác định
hoạt lực lên men của nấm men.
6.2. Phương pháp hóa sinh: bao gồm phương pháp Xác định hàm lượng
đường khử; Xác định độ cồn; Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của
nguồn đường, nitơ, dinh dưỡng khoáng đến quá trình lên men kombucha.
6.3. Phương pháp cảm quan

6.4. Xử lí số liệu bằng thống kê toán học.















NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về kombucha
1.1.1. Nguồn gốc
Kombucha đã được sử dụng phổ biến qua hơn 200 năm ở vùng Viễn
Đông và khoảng hơn 100 năm ở Đông Âu. Một số tài liệu ghi chép cho thấy
có một số cư dân sống tại vùng Caucase đã thọ trên trăm tuổi. Những người
sống trường thọ như vậy còn tìm thấy tại một số làng mạc ở Poltaya, Ukraine,
Tây Tạng và Tây Ban Nha. Những người trường thọ ở Nga cho biết họ sống
lâu như vậy nhờ từ hàng trăm năm nay họ có thói quen dùng loại trà lên men
kombucha. Thời xưa người Kargasoks tin tưởng rằng trà nấm này có tác dụng
giúp họ được sống khỏe và kéo dài tuổi xuân. Cho nên khi một nữ du khách
quý tộc người Nhật đến thăm thắng cảnh ở làng Kargasok, trông thấy những
người già ở đây khoẻ mạnh lạ thường, gương mặt họ không có nếp nhăn và ít

lộ vẻ già nua. Bà lấy làm ngạc nhiên và hỏi rõ thì được biết dân chúng ở đây
có thói quen uống kombucha hằng ngày. Bà đã xin một ít nấm để làm giống
và mang về Nhật rồi sau đó chia với bạn bè cùng sử dụng. Sau nhiều tuần lễ,
các bạn của bà đều vô cùng khen ngợi về sự hữu hiệu của loại nấm này. Có
người bảo rằng họ đã hết bệnh huyết áp cao, vết nhăn trên da đã nhạt mờ, tóc bạc
trở lại đen từ từ. Do đó trà nấm này được truyền bá khắp cả Nhật Bản [49].
1.1.2. Đặc điểm cấu tạo
Kombucha là môi trường cộng sinh của vi khuẩn và nấm men. Hệ vi
sinh vật trong kombucha rất phong phú, chủ yếu là các chủng Acetobacter
như: Acetobacter xylinum, Acetobacter ketogenum…và nấm men:
Saccharomycodes ludwigii, Saccharomycodes apiculatus, Saccharomyces
cerevisiae… Ngoài ra còn có thể có các chủng Lactobacillus, Brettanomyces,
Pediococcus, Bacterium gluconicum…Chính sự có mặt của các chủng
Acetobacter (đặc biệt là Acetobacter xylinum) đã hình thành nên cấu trúc của
kombucha. Acetobacter xylinum có khả năng tạo màng hemicellulose khá dày
và chắc, tạo màu xanh với thuốc nhuộm Iod và H
2
SO
4
. Kombucha còn được
gọi là nấm trà. Chúng sinh trưởng tốt trong môi trường nước trà đường. Bởi
vậy, thường được sử dụng để lên men dung dịch trà đường, nên gọi là nấm trà.
Trong quá trình lên men kombucha sẽ tạo ra một lớp màng mỏng trên bề mặt
dịch trà và dần dần tăng bề dày, hình thành nên một kombucha thứ hai (thường
gọi là kombucha con) tách biệt với kombucha ban đầu. Hình dạng và kích thước
của kombucha phụ thuộc vào hình dạng tiết diện của bình chứa [49], [53].


Hình 1.1. Kombucha Hình 1.2. Lớp màng kombucha
1.1.3. Hệ vi sinh vật trong kombucha

1.1.3.1. Acetobacter
Giống vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Pseudomonadaceae, phân bố
rộng rãi trong tự nhiên và có thể phân lập được các vi khuẩn này từ không khí,
đất, nước, lương thực thực phẩm, giấm, rượu, bia, hoa quả… Có khoảng 20
loài thuộc giống Acetobacter đã được phân lập và mô tả, trong đó có nhiều
loài có ý nghĩa kinh tế.
* Đặc điểm chung của chủng Acetobacter
Chủng Acetobacter có dạng hình que, tùy điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ,
thành phần môi trường nuôi cấy) mà các vi khuẩn Acetobacter có thể sinh ra
các tế bào có hình thái khác biệt dạng kéo dài hoặc phình to ra. Kích thước
thay đổi tùy loài (0.3-0.6 x 1.0-8.0μm). Có thể di động (có tiên mao đơn hoặc
chu mao) hoặc không di động (không có tiên mao). Hiếu khí bắt buộc, chịu
được độ acid cao. Vi khuẩn Acetobacter có khả năng đồng hoá nhiều nguồn
thức ăn cacbon khác nhau nhưng không sử dụng được tinh bột. Tế bào đứng
riêng lẽ hoặc kết thành từng chuỗi. Có khả năng tạo thành váng trên môi
trường lỏng, khả năng tạo thành váng thay đổi tùy loại:
Acetobacter xylinum: tạo thành váng cellulose khá dày và chắc.
Acetobacter orleanoe: tạo thành váng mỏng nhưng chắc. Acetobacter
pasteurianum: tạo thành váng khô và nhăn nheo. Acetobacter suboxydans: tạo
thành váng mỏng dễ tan rã. Acetobacter có khả năng đồng hoá muối (NH
4
)
+

và phân giải pepton. Một số loài đòi hỏi một số acid amin nhất định như acid
pantothenic và các chất khoáng K, Mg, Ca, Fe, P, S …ở dạng muối vô cơ, hữu
cơ hoặc hợp chất hữu cơ. Do đó bia, dịch tự phân nấm men, nước mạch nha,
nước trái cây…là nguồn dinh dưỡng rất tốt cho sự phát triển của vi khuẩn
Acetobacter. Ngoài khả năng oxy hoá ethanol thành acid acetic, một số loài
Acetobacter còn tổng hợp được vitamin B

1
, vitamin B
2
, oxy hoá sorbit thành
đường sorbose (dùng trong công nghiệp sản xuất vitamin C) [4], [53].
1.1.3.2. Nấm men
* Hình thái và cấu tạo tế bào
Tế bào nấm men thường có dạng hình cầu, ovan, elip, hình trụ… kích
thước rất lớn gấp từ 5 – 10 lần tế bào vi khuẩn. Kích thước trung bình: Chiều
dài: 9 – 10μm, chiều rộng: 2 – 7μm. Hình dạng và kích thước tế bào thay đổi,
không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổi khác nhau và điều kiện
nuôi cấy khác nhau. Nấm men là sinh vật đơn bào, tế bào nấm men cũng như
nhiều loại tế bào khác được cấu tạo chủ yếu từ các phần cơ bản như: glucan,
protein, lipid và một số thành phần nhỏ khác như kitin…. Màng nguyên sinh
chất: gồm các hợp chất phức tạp như protein, phospholipit, enzyme
permeaza…Chất nguyên sinh: thành phần cấu tạo chủ yếu là nước, protit,
gluxit, lipit và các muối khoáng, enzyme và có các cơ quan trong đó. Nhân tế
bào và những thành phần cơ quan con khác: không bào, ty lạp thể,
riboxom,…[4], [53].
* Sự sinh sản của nấm men
Nấm men có một số hình thức sinh sản: nảy chồi; phân đôi; sinh sản
bằng bào tử và hình thành bào tử (tiếp hợp đẳng giao; tiếp hợp dị giao; sinh
sản đơn tính) [4].
* Phân loại nấm men
Chủ yếu có hai lớp: nấm men thật (Ascomyces) và nấm men giả (Fungi
imporfecti) [4], [53].
Lớp nấm men thật (Ascomyces): phần lớn nấm men dùng trong công
nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống Saccharomyces; Giống
Endomyces; Giống Schizosaccharomyces
Lớp nấm men giả (Fungi imporfecti): Crytococus (toscula, tornlopsis);

Mycoderma; Candida; Geotrichum (đã được xếp vào lớp nấm mốc);
Rhodotorula.
* Các quá trình sinh lí của tế bào nấm men
Nấm men cũng như các sinh vật sống khác cần oxy, hydro, cacbon, nitơ,
phospho, kali, magiê…[4], [53].
Dinh dưỡng cacbon: nguồn cacbon cung cấp là các loại đường khác
nhau: saccharose, maltose, lactose, glucose…Dinh dưỡng oxy, hydro: được
cung cấp cho tế bào từ nước của môi trường nuôi cấy hay dịch. Dinh dưỡng
nitơ: nấm men không có men ngoại bào để phân giải protein, nên không thể
phân cắt albumin của môi trường mà phải cung cấp nitơ ở dạng hòa tan, có thể
là đạm hữu cơ hoặc vô cơ. Dạng hữu cơ thường dùng là acid amin, pepton,
amid, urê. Đạm vô cơ là các muối amon khử nitrat, sulfat…Các vitamin và
chất khoáng: Chất khoáng có ảnh hưởng to lớn đến hoạt động sống của nấm
men. Phospho: có trong thành phần nucleoprotein, polyphosphat của nhiều
enzyme của sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu, chúng tạo ra liên
kết có năng lượng lớn. Lưu huỳnh: tham gia vào thành phần một số acid amin,
albumin, vitamin và enzyme. Magiê: tham gia vào nhiều phản ứng trung gian
của sự lên men. Sắt: tham gia vào các thành phần enzyme, sự hô hấp và các
quá trình khác. Kali: chứa nhiều trong nấm men, nó thúc đẩy sự phát triển của
nấm men, tham gia vào sự lên men rượu, tạo điều kiện phục hồi phosphorin
hóa của acid pyruvic. Mangan: đóng vai trò tương tự như magiê.
* Cơ chế vận chuyển các chất dinh dưỡng vào trong tế bào nấm men
Nấm men hoàn toàn không có cơ quan dinh dưỡng riêng biệt, các chất
dinh dưỡng mà nó sử dụng chủ yếu được vận chuyển qua thành tế bào theo
hai con đường cơ bản.
Thẩm thấu bị động: trên thành tế bào nấm men có những lỗ nhỏ, những
lỗ này có tác dụng làm cho chất dinh dưỡng vận chuyển vào trong tế bào từ
môi trường bên ngoài nhờ áp suất thẩm thấu, ngược lại chất thải trong quá
trình trao đổi cũng được thải ra theo con đường này.
Hấp thu chủ động: các thành phần dinh dưỡng không có khả năng xâm

nhập vào tế bào theo con đường thứ nhất thì lập tức có hệ permeaza hoạt hóa.
Permeaza là một protein hoạt động, chúng liên kết với chất dinh dưỡng tạo
thành hợp chất và hợp chất này chui qua thành tế bào trong, tại đây chúng lại
tách ra và permeaza lại tiếp tục vận chuyển tiếp [53].
* Quá trình sinh trưởng và phát triển
Trong quá trình nuôi cấy, trong điều kiện dinh dưỡng đầy đủ, tế bào
nấm men tăng nhanh về kích thước và đồng thời sinh khối được tích lũy
nhiều. Các nấm men sinh sản bằng phương pháp nhân đôi thường cho lượng
sinh khối rất lớn sau một thời gian ngắn. Trong trường hợp sinh sản theo
phương pháp này thì trong dịch nuôi cấy sẽ không có tế bào già. Vì rằng tế
bào được phân chia thành hai, cứ như vậy tế bào lúc nào cũng ở trạng thái
đang phát triển. Tế bào chỉ già khi môi trường thiếu chất dinh dưỡng và tế bào
không có khả năng sinh sản nữa. Tuy nhiên đa số nấm men sinh sản bằng
phương pháp nảy chồi nên hiện tượng phát hiện tế bào già rất rõ. Khi chồi non
tách khỏi tế bào mẹ để sống độc lập thì nơi tách đó trên tế bào mẹ tạo thành
một vết sẹo. Vết sẹo này sẽ không có khả năng tạo ra chồi mới. Cứ như vậy tế
bào mẹ sẽ chuyển thành tế bào già theo thời gian [4], [53].
Để xác định số lượng tế bào nấm men phát triển theo thời gian hiện nay
người ta dùng nhiều phương pháp khác nhau như: xác định số lượng tế bào
bằng phương pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi hay trên mặt thạch. Đo độ
đục của tế bào trong dung dịch nuôi cấy trên cơ sở xây dựng một đồ thị chuẩn
của mật độ tế bào [4].
Quá trình sinh trưởng của nấm men trong nuôi cấy không liên tục sinh
trưởng theo một đường cong gồm 4 pha: pha tiềm phát (pha lag): nấm men
thích nghi với môi trường, số lượng tế bào chưa tăng. Pha lũy thừa (pha log):
nấm men sinh trưởng với tốc độ lớn nhất và không đổi, số lượng tế bào trong
quần thể tăng lên rất nhanh. Pha cân bằng: số lượng nấm men đạt cực đại và
không đổi theo thời gian. Pha suy vong: số tế bào trong quần thể giảm dần do
tế bào trong quần thể bị phân hủy ngày càng nhiều, chất dinh dưỡng cạn kiệt.
1.1.3.3. Giống vi khuẩn lên men lactic

Vi khuẩn lên men lactic thuộc họ Lactobacterium. Đây là những trực
khuẩn, cầu khuẩn không tạo bào tử và hầu hết không di động, hô hấp tùy tiện.
Chúng có khả năng lên men nhiều loại đường đơn và đường đôi nhưng không
có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột. Sự phát triển của nó
cần có sự có mặt của pepton, acid amin hay muối amon. Chúng có yêu cầu
đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu vitamin, acid amin và khoáng chất. Nhiệt
độ thích hợp cho quá trình lên men từ 15 ÷ 50
0
C. Tuy nhiên mỗi loài có
khoảng nhiệt độ thích hợp khác nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn 80
0
C vi khuẩn
lactic bị tiêu diệt hoàn toàn [53].
1.2. Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha
Theo kết quả nghiên cứu về thành phần cấu tạo của kombucha thì quá
trình lên men dịch trà có thể xảy ra như sau:

* Lên men ethanol (len men rượu):

Hình 1.3. Cơ chế phân giải đường trong tế bào nấm men
Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm
men, chúng sẽ chuyển hóa đường lên men thành ethanol. Quá trình lên men
rượu chia làm hai thời kỳ chính:
Thời kỳ phát triển sinh khối: giai đoạn này với sự có mặt của oxy, tế
bào nấm men phát triển sinh khối.
Thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu: giai đoạn này nấm men hấp
thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện
xúc tác sinh học trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành
rượu. Sau khi được vận chuyển vào trong tế bào chất, đường hexose được
chuyển hóa theo chu trình đường phân để tạo thành acid pyruvic. Tiếp theo
acid pyruvic sẽ được chuyển hoá thành acetaldehyde rồi thành ethanol.
Dihydroxyacetone phosphat là một sản phẩm trung gian trong chu trình đường
phân, hợp chất này có thể chuyển hoá thành glyxerol. Trong môi trường pH
acid, glycerol chỉ được tạo ra với hàm lượng nhỏ. Ngược lại, trong môi trường
pH kiềm lượng glycerol sinh ra sẽ tăng lên rất nhiều và glycerol sẽ trở thành
một trong những sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men.
Phương trình tổng quát của quá trình lên men trong môi trường pH acid:
C
6
H
12
O
6
+ 2ADP +2Pi → 2C
2
H
5

OH + 2CO
2
+ 2ATP
Sự chuyển hóa đường thành ethanol và khí CO
2
diễn ra trong tế bào
chất của nấm men. Đây là quá trình trao đổi năng lượng của nấm men trong
điều kiện kỵ khí. Ethanol và CO
2
trong tế bào chất sẽ được nấm men thải vào
môi trường lên men. Ngoài ra tế bào nấm men còn tổng hợp và thải vào dịch
lên men hàng trăm sản phẩm phụ và sản phẩm lên men khác, những hợp chất
này được tìm thấy với hàm lượng rất nhỏ, chúng được chia thành 4 nhóm:
glyxerol cùng rượu bậc cao, aldehyde, acid hữu cơ và este.
Trong quá trình lên men ethanol, nhiều acid hữu cơ được tạo thành.
Một số acid hữu cơ được sinh tổng hợp từ chu trình Krebs, nếu như quá trình
lên men không diễn ra trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt, các acid hữu cơ
chiếm hàm lượng cao nhất trong dịch lên men là: acid citric, malic, acetic,
lactic [53].
* Lên men acetic:
Lên men acid acetic là quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic dưới tác
dụng của vi khuẩn [49].
C
2
H
5
OH + O
2
→ CH
3

CHO (Acetaldehyd) + H
2
O
CH
3
CHO + H
2
O → CH
3
CH(OH)
2
(Hydrat acetaldehyd)
CH
3
CH(OH)
2
+ O
2
→ CH
3
COOH + H
2
O
* Lên men lactic:
Lên men lactic là một quá trình trao đổi năng lượng. Các phân tử ATP
được hình thành trong quá trình chuyển hóa cơ chất sẽ được vi khuẩn giữ lại
trong tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi chất và sinh trưởng của vi sinh
vật. Ngược lại, các sản phẩm như acid lactic, ethanol, CO
2
được vi khuẩn thải

vào môi trường lên men. Kết quả là hàm lượng acid lactic tích lũy trong môi
trường lên men ngày càng tăng, làm giảm pH môi trường và kéo theo những biến
đổi hóa lý khác. Bản chất: là quá trình chuyển hóa đường thành acid lactic nhờ
vi sinh vật. Trong quá trình lên men lactic ngoài sản phẩm acid lactic (lên men
đồng hình), acid acetic, ethanol, CO
2
(lên men dị hình) trong dịch lên men còn
xuất hiện nhiều hợp chất hóa học mới khác, đây là sản phẩm trung gian hoặc
sản phẩm phụ của quá trình lên men. Một số hợp chất trong nhóm trên rất dễ
bay hơi, chúng đóng vai trò quan trọng trong việc góp phần hình thành nên
mùi vị đặc trưng cho những sản phẩm lên men lactic. Lượng sản phẩm phụ tạo
thành hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật, vào môi trường dinh dưỡng
và điều kiện ngoại cảnh, acid lactic thường chiếm 40% lượng đường đã được
phân hủy, acid sucxinic 20%, rượu etylic chiếm 10%, acid acetic 10% và các
loại khí gần 20% [53].
1.3. Giới thiệu về trà lên men kombucha
Đây là một loại thức uống được lên men trong dung dịch trà đường bởi
kombucha. Kombucha có thể sử dụng một số loại trà để lên men, nhưng
không sử dụng được trà thảo mộc vì kombucha dễ bị hỏng khi lên men trà có
nhiều tinh dầu. Một số loại trà có chứa dầu thơm, có thể làm cho kombucha bị
chết hoặc bị ảnh hưởng xấu. Sử dụng các loại trà khác nhau sẽ cho ra những
loại thức uống với những hương vị khác nhau [51].
1.3.1. Thành phần của trà đường lên men
Khi các vi sinh vật được nuôi trong môi trường trà dược, cung cấp đủ
nitrogen, vitamin và khoáng chất cùng những chất dinh dưỡng căn bản khác
như đường. Chúng phát triển và biến đổi đường thành gluconic acid, đồng
thời sản xuất ra một lượng nhỏ alcohol, alcohol này sau đó biến đổi thành
acetic acid (tối đa khoảng 3%) tạo cho trà có vị ngọt và có mùi chua của rượu
táo lên men. Thành phẩm trà sau cùng chứa trung bình 0.5 - 1% alcohol, một
lượng nhỏ acid lactic, acid malic, acid acetic, acid malonic và acid oxalic.

Lượng vitamin B trong thành phẩm khá cao. Trà lên men kombucha được xác
định là có khả năng kháng khuẩn mạnh. Khả năng chống vi khuẩn được quan
sát thấy trong các mẫu lên men có chứa tổng số acid là 33g/l (trong đó acid
acetic chiếm 7g/l). Tuy nhiên, Candida albicans không bị ức chế bởi
kombucha. Nghiên cứu này cũng chỉ ra khả năng kháng khuẩn của kombucha
là nhờ acid acetic [51], [57].
1.3.2. Công dụng của trà đường lên men
Kombucha đã được Cục quản lí Thực phẩm và Dược phẩm của Mỹ
(FDA) chứng nhận là an toàn đối với con người [50]. Việc sử dụng rộng rãi
thức uống từ kombucha đã được nghiên cứu qua nhiều tài liệu trong suốt thế
kỷ qua. Dạng kombucha lỏng và dạng đặc cũng được nghiên cứu và kết quả
ban đầu cho thấy trong dịch trà này có chứa chất kháng sinh (diệt khuẩn và
kìm hãm vi khuẩn) có tác dụng chống lại một số vi sinh vật gây bệnh và đã
được sử dụng cho mục đích điều trị trong thuốc thú y và thuốc cho người. Đầu
thế kỷ XX, chủ yếu là những nghiên cứu y học của người Đức, chứng minh
kombucha có tác dụng điều tiết đường ruột và có ảnh hưởng tốt đến chức năng
nói chung của cơ thể, nhưng cũng dần có hiệu quả cụ thể trong những trường
hợp như rối loạn tiêu hóa, táo bón, trĩ, sỏi thận, các vấn đề về túi mật, tiểu
đường, cholesterol, cao huyết áp, xơ cứng động mạch, đau đầu, mệt mỏi
…Vào gần giữa thập kỷ, giám đốc “Học viện hóa học” (“Academy of
Chemists”) tại Braunschweig ghi nhận rằng kombucha cung cấp năng lượng
cho toàn bộ hệ thống các tuyến, dùng cho bệnh gút, thấp khớp, nhọt, xơ cứng
động mạch, huyết áp cao và vấn đề về lão hóa, bằng cách làm hài hòa và cân
bằng sự trao đổi chất và chuyển các dạng có hại của acid uric và cholesterol
thành dạng hòa tan dễ dàng được bài tiết qua thận và ruột. Theo nhiều nghiên
cứu trên thế giới thì trà kombucha có nhiều lợi ích đối với con người, thường
được tìm mua ở các cửa hàng thực phẩm chức năng. Tác dụng của trà
kombucha dựa trên các thành phần sau: Acid lactic: cần thiết cho hệ thống
tiêu hóa. Giúp cho việc lưu thông máu, cân bằng độ acid và kiềm trong cơ thể.
Trong kombucha, acid này tồn tại ở dạng có lợi nhất (lactic – L). Acid acetic:

là 1 chất bảo quản chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn có hại. Acid usnic: là 1
loại chất kháng sinh tự nhiên, giúp chống lại nhiều loại virus. Có báo cáo cho
rằng môi trường nuôi cấy kombucha có chứa acid usnic nhưng kết quả chưa
được xác nhận. Acid oxalic là một chất bảo quản hiệu quả và cung cấp năng
lượng. Acid gluconic tạo ra bởi vi khuẩn, có lợi cho người mắc các bệnh như
nhiễm nấm Candida. Acid malic giúp giải độc gan. Acid butyric tạo ra bởi
nấm men, bảo vệ màng tế bào, kết hợp với acid gluconic tăng cường thành
ruột chống lại kí sinh trùng, trong đó có nhiễm nấm như Candida. Các hợp
chất tanin trong trà: có khả năng kháng khuẩn và phòng chống bệnh ung thư,
làm chậm quá trình lão hóa. Caffein trong thành phần của trà có khả năng
giảm mệt mỏi, căng thẳng, giảm cảm giác buồn ngủ, cung cấp năng lượng
hoạt động cho cơ thể. Trà kombucha còn tốt cho da đầu và tóc, kích thích sự
phát triển của tóc [50], [51], [53].
1.3.3. Một số lưu ý khi sử dụng
Với những bệnh nhân trong giai đoạn điều trị ung thư do xạ trị hoặc hóa
trị, nếu dùng trà cần sự giám sát của thầy thuốc. Do trà chứa quá nhiều acid
lactic, uống trong một thời gian dài có thể dẫn đến đau khớp, chóng mặt và
viêm xoang. Trẻ em có thể dùng nhưng liều lượng thay đổi theo tuổi, cân nặng
và quan trọng cần phải được pha loãng với nhiều nước, không nên cho trẻ
dưới 2 tuổi uống. Phụ nữ có thai không nên dùng vì có đến 1% lượng cồn
trong nước trà. Không nên uống trong thời gian cho con bú vì gây đau bụng
cho trẻ sơ sinh. Người tiểu đường chỉ nên dùng trà đang lên men vì hầu hết
lượng đường bị biến đổi, tuy nhiên nếu ủ men trà với quá ít đường (dưới 50
gam/lít) thì khó xuất hiện các đặc tính hữu ích của trà kombucha. Vì vậy
người tiểu đường cũng không nên uống nhiều. Trà kombucha gây loãng máu,
cần giảm liều và chú ý ngưng một tuần trước khi phẫu thuật; phụ nữ bị rong
kinh cũng cần thận trọng và nên ngưng sử dụng trước kinh kỳ tối thiểu một
tuần. Men trà kombucha có thể bị hư và mất hết tác dụng nếu ủ không đúng
quy cách [51], [53], [54].
1.4. Nguyên liệu

1.4.1. Đặc điểm của trà
1.4.1.1. Nguồn gốc và đặc tính thực vật
Cây trà có tên khoa học là Camellia sinensis, có nguồn gốc ở khu vực
Đông Nam Á, nhưng ngày nay nó được trồng phổ biến ở nhiều nơi trên thế
giới, trong các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trà là loài cây xanh lưu
niên mọc thành bụi hoặc các cây nhỏ, thông thường được xén tỉa để thấp hơn