Công nghệ sinh học thực phẩm BIỂU HIỆN các PROTEIN NGỌT BRAZZEIN TRONG NGÔ để sản XUẤT CHẤT tạo NGỌT THƯƠNG mại mới

[Type text] Page 1


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KỸ THUẬT TPHCM
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC THỰC PHẨM
MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM
Tác giả: Barry J. Lamphear và các cộng sự, Plant
Biotechnology Journal (2005)
GVHD: ThS. Nguyễn Minh Hải
SVTH:
Nguyễn Ngọc Phƣơng Anh 11116003
Nguyễn Thanh Trà My 11116040
Đặng Diệp Thảo 11116059
Lƣu Thị Thu Thủy 11116064
Võ Hƣờng Vi 11116080
TP Hồ Chí Minh, tháng 3 năm 2014
Công nghệ sinh học thực phẩm



BIỂU HIỆN CÁC PROTEIN NGỌT BRAZZEIN TRONG NGÔ
ĐỂ SẢN XUẤT CHẤT TẠO NGỌT THƢƠNG MẠI MỚI
Barry J. Lamphear*, Donna K. Barker, Christopher A. Brooks, Donna E. Delaney,
Jeffrey R. Lane, Katherine Beifuss, Robert Love, Kevin Thompson, Jocelyne Mayor,
Rich Clough, Robin Harkey, Miranda Poage, Carol Drees, Michael E. Horn, Stephen
J. Streatfield, Zivko Nikolov†, Susan L. Woodard‡, Elizabeth E. Hood§, Joseph M.
Jilka¶ and John A. Howard**
ProdiGene, Inc , 101 Cổng Boulevard, Suite 100 , College Station , TX 77.845 , Hoa Kỳ.


Nhận được ngày 22 tháng 4 năm 2004, sửa đổi ngày 06 tháng 8 năm 2004, chấp nhận

ngày 09 tháng 8 năm 2004.
*Thư từ (fax 979 690 9527, e -mail )
†Địa chỉ hiện tại: 303F Scoates Hall, Sinh học và kỹ thuật nông nghiệp, Đại học Texas
A & M, 2117 TAMU, College Station, TX 77.845, Hoa Kỳ
§Đại chỉ hiện tại: Đại học Tiểu bang Arkansas, Jonesboro, AR, Hoa Kỳ
¶Địa chỉ hiện tịa: 2308 Ferguson St, College Station, TX 77.845, Hoa Kỳ
**Địa chỉ hiện tại: Stallion Ridge, College Station, TX 77.845, Hoa Kỳ
Từ khóa: brazzein, natural sweetener (chất ngọt tự nhiên), sweet protein (protein
ngọt), Zea mays.


Công nghệ sinh học thực phẩm


MỤC LỤC
Nội dung Trang
TÓM TẮT 1
GIỚI THIỆU 1
KẾT QUẢ 3
Biểu hiện của brazzein trong ngô 3
Đặc tính của protein brazzein biểu hiện trong ngô 7
Phân tích cảm quan brazzein ngô 9
Kiểm tra ứng dụng của sản phẩm bột phôi bắp 11
THẢO LUẬN 12
PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 16
Cấu trúc của plasmid 16
Chuẩn bị dịch chiết protein hòa tan từ hạt ngô 17
Sự chuyển đổi ngô gián tiếp thông qua Agrobacterium 18
Định lƣợng brazzein tái tổ hợp trong ngô biến đổi gen 18
Phân tích trình tự đầu N của amino của đồng phân brazzien 19

Tinh chế brazzen tái tổ hợp loại 3 từ ngô biến đổi gen để
phân tích cảm quan 19
Kiểm tra cƣờng độ ngọt 20
Tách chiết hạt 21
Hiện tƣợng điện chuyển 21
LỜI CẢM ƠN 22
TÀI LIỆU BỔ SUNG 22
TÀI LIỆU THAM KHẢO 23
Công nghệ sinh học thực phẩm

Trang 1

TÓM TẮT
Sự sẵn có của thực phẩm hàm lượng đường thấp nhưng hương vị cao là rất quan
trọng cho hàng triệu cá nhân có ý thức về lượng tiêu thụ carbohydrate với mục đích
phòng hoặc trị bệnh tiểu đường hoặc ăn kiêng. Brazzein là một protein ngọt tự nhiên
có trong thực vật nhiệt đới. Về mặt kinh tế, việc sản xuất kinh tế brazzein trên quy mô
lớn không thực tế, do đó hạn chế tính sẵn có của brazzein cho sản phẩm thực phẩm.
Chúng tôi trình bày ở đây lợi ích của một hệ thống biểu hiện ngô để sản xuất protein
ngọt tự nhiên này. Người ta thu được biểu hiện cao của brazzein với độ tích lũy lên
đến 4% tổng lượng protein hòa tan trong hạt ngô. Brazzein ngô tinh khiết sở hữu mức
độ ngọt lên đến 1200 lần so với đường mía trên mỗi trọng lượng cơ sở. Ngoài ra, kiểm
tra ứng dụng đã chứng minh rằng bột mầm ngô chứa brazzein có thể được sử dụng
trực tiếp trong các ứng dụng thực phẩm, cung cấp vị ngọt cho sản phẩm. Những kết
quả này chứng minh rằng cường độ cao protein ngọt được cho vào các sản phẩm thực
phẩm có thể đem lại các thuộc tính tạo ngọt hữu ích trong ngành công nghiệp thực
phẩm.
GIỚI THIỆU
Sự tồn tại của các protein có nguồn gốc tự nhiên có vị ngọt đã được biết đến
trong nhiều năm (xem xét trong Faus, 2000). Sự quan tâm đến các protein này đã tăng

lên với nhu cầu ngày càng gia tăng cho chất làm ngọt “ít calo” và các sản phẩm thực
phẩm “tự nhiên” và “có lợi cho sức khỏe” để giải quyết các nhu cầu của hàng triệu cá
nhân có ý thức về lượng tiêu thụ carbohydrate vì lý do ăn kiêng và bệnh tiểu đường.
Điều này dẫn tới việc thương mại hóa duy nhất một chất trong loại protein này,
thaumatin, như chất tạo ngọt và tăng hương vị (Witty và Higginbotham, 1994; Faus,
2000). Thật không may, sản xuất thương mại của thaumatin, cũng như tất cả các
protein ngọt khác, đã bị hạn chế do các nguồn tự nhiên cho tất cả các protein là loài
thực vật nhiệt đới mà các loài thực vật này khó có thể trồng trọt. Việc cố gắng lặp đi
lặp lại để sản xuất protein ngọt tái tổ hợp trong các hệ thống vi sinh vật và thực vật
biến đổi gen đã thất bại trong việc mang lại những protein ở mức độ đủ lớn để thương
mại hóa rộng rãi có tính khả thi về kinh tế (Witty và Higginbotham, 1994; Zemanek và
Wasserman, 1995; Faus, 2000). Brazzein là một protein được xác định gần đây có
Công nghệ sinh học thực phẩm

Trang 2

nguồn gốc từ thực vật châu Phi, Pentadiplandra brazzeana Baillon, nó có vị ngọt bên
trong gấp 500 – 2000 lần so với đường mía (Ming và Hellenkant, 1994). Quả chứa
brazzein từ cây P. brazzeana đã được tiêu thụ trong khu vực bản địa của vùng châu Phi
nhiệt đới vì tính chất ngọt của nó, nơi mà nó đã gắn liền với tên tiếng Pháp “l'oubli”,
có nghĩa là “lãng quên” (Hladick, 1989; Hladick, 1993). Điều này là do những đứa trẻ
bản địa trở nên quá tập trung vào việc thu thập nhiều hơn các trái cây chín ngon lành
đến nỗi chúng “quên” mất mẹ của chúng đang tìm kiếm chúng. Tuy nhiên, hạn chế về
quả và sự phức tạp liên quan đến sản xuất quy mô lớn của các cây trồng bản địa làm
cho sản xuất quy mô lớn của brazzein từ các nguồn tự nhiên không đem lại khả năng
kinh tế. Vì vậy, sản xuất thương mại rộng rãi brazzein có thể sẽ yêu cầu việc chuyển
giao biểu hiện protein với một hệ thống dị hợp bằng phương tiện của công nghệ DNA
tái tổ hợp. Sự phù hợp của brazzein cho biểu hiện tái tổ hợp đã được chứng minh bằng
Escherichia coli, cho phép mô tả đặc điểm hơn nữa của đặc tính sinh hóa của protein
(Assadi-Porter và cộng sự, 2000a, b).

Brazzein là một chuỗi polypeptide đơn 6,5 kDa với bốn cầu nối disulfua nội
phân tử cho phép nó duy trì tính ngọt đặc trưng ngay cả sau khi ủ ở 80ºC trong 4 giờ
(Ming và Hellenkant, 1994; Ming và các cộng sự, 1995.). Ba hình thức của protein chỉ
khác nhau ở đầu cuối N của amino acid. Brazzein loại 2 tương ứng với sản phẩm dịch
mã 54 - amino acid dự đoán chứa glutamine ở đầu cuối N của nó. Hình thức này xuất
hiện với vòng đời ngắn như đầu cuối N của glutamine phải trải qua chuyển đổi tự
nhiên thành pyroglutamate, kết quả là brazzein loại 1, và sự mất mát đầu cuối N của
glutamine (hoặc pyroglutamate) tạo ra brazzein loại 3 có 53 amino acid. Chỉ có hai
loại cuối được phát hiện trong quả chín. Cường độ ngọt khác nhau giữa các dạng, ở
loại 3 ngọt hơn gấp hai lần so với loại 1 (Izawa và cộng sự, 1996).
Chúng tôi trình bày ở đây thế hệ của các dòng ngô với hàm lượng cao protein
brazzein biểu hiện trong hạt giống. Các phân đoạn của hạt ngô biểu hiện brazzein bởi
các phương pháp xay xát khô tiêu chuẩn dẫn đến làm giàu hơn nữa brazzein trong bột
mầm, được biểu hiện để phục vụ như là chất tạo ngọt trong các ứng dụng sản phẩm.
Hơn nữa, brazzein tinh sạch từ hạt giống ngọt hơn đường mía đến 1200 lần trên mỗi
trọng lượng cơ sở. Những kết quả này hỗ trợ trồng ngô một cách hiệu quả, hệ thống
biểu hiện kinh tế cho sản xuất thương mại của protein ngọt, brazzein.
Công nghệ sinh học thực phẩm

Trang 3

KẾT QUẢ
Biểu hiện của brazzein trong ngô
Chiến lược phát triển các dòng ngô để sản xuất thương mại brazzein được thiết
kế với việc xem xét các mục tiêu tạo ra protein ở mức biểu hiện cao cùng với sự cần
thiết phải tạo ra sản phẩm biểu hiện cấu trúc và chức năng tương đương với các
protein từ nguồn tự nhiên của nó. Chỉ có dạng loại 1 và loại 3 của brazzein được phát
hiện trong các quả chín muồi của P. brazzeana (Ming và Hellenkant, 1994), và do đó
mục tiêu là tạo ra những dạng thông qua một hệ thống biểu hiện thực vật tái tổ hợp.
Tuy nhiên, cơ chế sản sinh ra các dạng trong cơ thể sống có thể liên quan đến việc

chuyển đổi từ một sản phẩm dịch mã brazzein loại 2 làm trung gian (chứa glutamine ở
đầu cuối N của nó) cho loại 1 và loại 3. Như vậy, biểu hiện của một mRNA có chứa
khung đọc mở brazzein loại 2 được lựa chọn gần giống với các thiết kế tự nhiên để
biểu hiện và có khả năng sản sinh ra chủ yếu là protein brazzein loại 1 thông qua việc
chuyển đổi amino ở đầu cuối N của glutamine thành pyroglutamate trong cơ thể sống.
Ngoài ra, để chọn lọc biểu hiện các dạng loại 3 của brazzein, một phương pháp di
truyền phân tử giống hệt sự mất đầu cuối N của glutamine (hoặc pyroglutamate) đã
được lựa chọn bằng cách trực tiếp mã hóa các hình thức cắt ngắn của protein. Vì vậy,
khung đọc mở mã hóa một trong hai brazzein loại 2 hay loại 3 được tổng hợp và hợp
nhất thành các trình tự quy định khác nhau ở thực vật để tạo thành tám cấu trúc biểu
hiện khác nhau. Các khung đọc mở mã hóa brazzein được thiết kế thành một vector
[3]

biểu hiện (cấu trúc biểu hiện) có chứa một promoter cố định (một promoter giống như
polyubiquitin
[
1
]
trong ngô; Hood và cộng sự, 2003), một promoter ưa phôi (globulin-1
trong ngô; Belanger và Kriz, 1991) hoặc một promoter ưa nội nhũ (22-kDa alpha-zein
trong ngô, Tem AF090447). Chúng tôi thử nghiệm sự kết hợp của các promoter, nhắm
đến chuỗi RNA và các yếu tố để xác định các thông số tốt nhất để đạt được mức độ
biểu hiện cao brazzein trong hạt ngô. Sự kết hợp bao gồm promoter mô tả ở trên với
các vị trí được nhắm đến của thành tế bào và tế bào chất. Ngoài ra, để biểu hiện nhắm
đến thành tế bào, ưa phôi, vùng không được phiên mã 5’ (UTRs) từ nguồn gốc virus
thực vật (virus khắc acid thuốc lá) (TEV, Tem M15239) và virus gây bệnh khảm còi


1
Ubiquitin được biết như là một protein điều hòa nhỏ được tìm thấy ở tất cả các mô của sinh vật nhân

thực. Polyubiquitin là chuỗi ubiquitin gắn vào lysine đơn trên protein bề mặt.
Công nghệ sinh học thực phẩm

Trang 4

cọc trên ngô (MDMV, Tem AJ001691)] đã được sử dụng. Hình 1 cho thấy khu vực
bên trong của một vector
[3]
biểu hiện điển hình, cùng với các đơn vị phiên mã trong
tám cấu trúc sử dụng cho Agrobacterium – biến đổi gián tiếp của ngô.
Hình 1: Vector
[3]
chuyển đổi cây trồng.
(A) Bản đồ khu vực intraborder của cấu
trúc chuyển đổi bậc 2 điển hình. Vị trí của
các phần tử trình tự sau đây được chỉ định:
loại promoter [phôi ưa thích và virus khảm
súp lơ 35S (CAMV35S)]; alpha-amylase
lúa mạch::vùng mã hóa bazzein (BAASS ::
Brazzein); khu vực đầu sao chép Pin II
khoai tây; khung đọc mở gen kháng thuốc
diệt cỏ tối ưu hóa ngô (moPAT); đầu cuối
CaMV (CAMV35St); và trình tự mép trái
và phải của một Agrobacterium
tumefaciens Ti plasmid (LB và RB); (B)
đơn vị phiên mã thực vật (PTUs) được sử
dụng để tạo ra thực vật chuyển gen biểu
hiện brazzein loại 2 và loại 3. Số cấu trúc
được thể hiện bên trái của mỗi đơn vị. Loại
promoter và tiêu chí nhắm đến cho mỗi cấu

trúc được chỉ định. Cấu trúc 5 và 6 bao
gồm các yếu tố di truyền giống nhau với
một sự thay đổi vị trí của các điểm hạn chế
thiết kế. Nguồn gốc của vùng không được phiên mã 5’ của các bản sao cho cấu trúc 7 và 8
được chỉ định. BAASS, chuỗi tín hiệu alpha-amylase lúa mạch; MDMV, virus gây bệnh khảm
còi cọc trên ngô; Pin II, gen chất ức chế protease II từ khoai tây; TEV, virus khắc acid thuốc
lá.
Cấu trúc bậc 5 về cơ bản giống như cấu trúc bậc 6, ngoại trừ vị trí của các điểm
hạn chế để thích nghi với tạo dòng phụ sau đó cho việc tạo ra các cấu trúc 7 và 8. Biến
nạp đã được lựa chọn để kháng thuốc diệt cỏ và sau đó thụ phấn tự do sử dụng dòng
bố mẹ ưu tú cho thế hệ của hạt giống T1 (thế hệ đầu tiên, được sàng lọc sử dụng một
brazzein – hấp thụ miễn dịch sử dụng phương pháp ELISA
[
2
]
để đo lường sự tích tụ
của các protein. Kết quả của năm hạt đơn T1 cao nhất (đại diện cho năm cây trồng
riêng biệt) cho mỗi dòng có nguồn gốc từ tám cấu trúc được thể hiện trong hình 2A.
Không có sai lệch so với kiểu hình bình thường về tích hợp của các gen chuyển đổi đã


[
2
]
Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay): phương pháp xét nghiệm hấp thụ
miễn dịch liên kết với enzyme, có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc
hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme.
Công nghệ sinh học thực phẩm

Trang 5

được quan sát trong các cây trồng mang cấu trúc biểu hiện bất kỳ. Biểu hiện protein
brazzein được quan sát thấy trong các dòng có nguồn gốc từ tất cả các cấu trúc. Biểu
hiện bằng phương pháp ELISA
[2]
phát hiện tương quan với sự hiện diện của một vùng
phản ứng miễn dịch 6,5 kDa trên phân tích Western blot sử dụng huyết thanh chống
brazzein. Kết quả chiết xuất điều chế từ hạt giống của các cấu trúc 1, 3 (hình 2B) và 5
(Hình 3B) được hiển thị. Mức brazzein cao nhất được phát hiện trong hạt giống từ các
dòng thiết kế để biểu hiện các dạng brazzein từ một promoter ưa phôi và nhắm đến các
tế bào thực vật (cấu trúc 2, 5 và 6). Hơn nữa, cả hai dạng brazzein tích lũy được ở mức
cao, khoảng 4% tổng lượng protein hòa tan (TSP) (Hình 2A; cấu trúc 2, 5 và 6), cho
thấy sự khác biệt tinh tế tại đầu cuối N của protein không giới hạn cho biểu hiện
protein brazzein hay sự ổn định trong ngô. Khi trình tự UTR 5’ từ hai loại virus thực
vật (TEV và MDMV) đã được hợp nhất như là UTRs 5’ của cấu trúc 7 và 8, không
làm tăng biểu hiện protein được quan sát thấy khi so sánh với cấu trúc 5 và 6. Điều thú
vị là, chỉ có biểu hiện rất thấp (≤ 0,005% TSP) được phát hiện trong hạt giống từ các
dòng trong đó biểu hiện brazzein được nhắm đến
các tế bào chất (cấu trúc 4).
Hình 2: Protein brazzein trong hạt ngô và trong các
phân đoạn kết quả từ quá trình xay xát khô của hạt
giống. (A) mức độ biểu hiện của protein brazzein
trong hạt T1 cao nhất từ năm cây trồng riêng lẻ hàng
đầu trong tám vector
[
3
]
được sử dụng để tạo ra các
kết quả chuyển gen độc lập cho biểu hiện brazzein
trong ngô. Số liệu cho năm hạt giống biểu hiện cao

nhất từ vector
[3]
1-8 được lấy từ kết quả chuyển gen
4, 15, 13, 9, 12, 19, 10 và 7 tương ứng. TSP, tổng
protein hòa tan. (B) immunodetection (phát hiện
miễn dịch) của brazzein trong chiết xuất từ hạt. Chiết
xuất từ hạt riêng lẻ tùy thuộc vào gel điện di natri


[
3
]
Trong nhân bản phân tử, một vector là một phân tử DNA được sử dụng như một phương tiện để
mang vật liệu di truyền từ bên ngoài vào một tế bào, nơi nó có thể được tái tạo hoặc biểu hiện. Bốn
loại chính của vector là plasmid, vector vius, cosmids và nhiễm sắc thể nhân tạo.
Công nghệ sinh học thực phẩm

Trang 6

dodecylsulphate-polyacrylamide (SDS-PAGE) trên 18% gel, chuyển giao cho polyvinylidene
difluoride (PVDF) và brazzein được phát hiện bởi immunoblotting
4
với kháng thể kháng
brazzein như được mô tả trong “Phương pháp thí nghiệm”. Giếng 1, kiểm soát chiết xuất hạt
giống ngô (20 μg); giếng 2 và 3, nấm men brazzein (100 và 50 pg, tương ứng); giếng 5 -7,
chiết xuất từ cấu trúc 1 hạt giống (10 μg); giếng 8, chiết xuất từ cấu trúc 3 hạt giống (20 μg).
Lượng protein được xác định bằng cách xay nhuyễn hạt từ 5 dòng được chọn. Mục “hạt” và
“mầm” đại diện cho lượng protein trong các cấu tử của nội nhũ và phôi, mục “vỏ” thể hiện
lượng protein ở lớp ngoài của hạt bắp. Mục “sai số” thể hiện độ lệch chuẩn từ các giá trị trung
bình thu thập từ các mẫu.

Cấu trúc bậc 2 và 5 sử dụng một promoter ưa phôi để kích thích biểu hiện lần
lượt của protein brazzein loại 2 hay loại 3 và do đó các protein brazzein được dự đoán
sẽ tích lũy đến mức cao nhất trong phôi. Để đánh giá khả năng tích lũy brazzein trong
các mô hạt giống, ngũ cốc nguyên hạt từ dòng bắt nguồn từ cấu trúc bậc 2 và 5 được
tạo thành, và mỗi hạt gộp đã được phân đoạn sử dụng một phương pháp nghiền khô để
phân tách các thành phần mầm của hạt giống. Brazzein được xác định trong thành
phần từ quá trình nghiền cấu trúc bậc 5 của hạt được thể hiện trong Hình 2C. Brazzein
tập trung gấp năm lần trong phần mầm như một đặc trưng của phần trọng lượng khô
khi so sánh với ngũ cốc nguyên hạt. Kết quả tương tự cũng được tìm thấy trên một
phần của các hạt từ cấu trúc dòng bậc 2 (dữ liệu không hiển thị). Như vậy, hiệu quả
của nghiền khô tiêu chuẩn là làm giàu hàm lượng brazzein sử dụng hạt từ dòng mà
biểu hiện nhằm vào phôi.
Bảng 1: Phân tích trình tự amino acid ở đầu cuối N của brazzein đƣợc tinh sạch từ hạt
ngô của cấu trúc bậc 2 và bậc 5 dòng
Sequence origin (nguồn gốc trình tự)
10 amino acid đầu
Brazzein loại 2
qdkckkvyen†
Cấu trúc brazzein bậc 2
sqdkxkkvye
Brazzein loại 3
dkckkvyeny
Cấu trúc brazzein bậc 5
dkxkkvyeny



[
4
]

Immunobloting hay Western blot: kỹ thuật thẩm tách miễn dịch, là một kỹ thuật phân tích
sử dụng rộng rãi sử dụng để phát hiện các protein cụ thể trong một mẫu của đồng mô hoặc từ
chiết xuất.
Công nghệ sinh học thực phẩm

Trang 7

*Chỉ chu kì trong đó sự phân chia amino acid không được thực hiện.
†Có nghĩa là trình tự mã hóa brazzein dự đoán được mà không cần chuyển amino acid ở đầu
cuối N của glutamine thành pyroglutamate.
Đặc tính của protein brazzein biểu hiện trong ngô
Các dòng biểu hiện brazzein cao nhất sử dụng một trình tự tín hiệu thực vật hợp
nhất để đầu cuối của amino kết thúc brazzein trực tiếp biểu hiện protein với thành tế
bào thực vật. Nói chung, trình tự tín hiệu được lấy ra trong quá trình vận chuyển
protein đến thành tế bào (Hood và các cộng sự, 1997). Vì vậy, để đánh giá xem liệu
việc loại bỏ trình tự tín hiệu có thích hợp không xảy ra trong các dòng ngô chuyển gen,
protein brazzein được tinh chế từ cấu trúc dòng bậc 2 và 5. Sắc ký ái lực miễn dịch sử
dụng kháng kháng thể brazzein liên kết hóa trị cùng với Sepharose đã được sử dụng để
tinh sạch hoặc brazzein loại 2 hoặc loại 3 tương ứng từ cấu trúc dòng bậc 2 và 5. Phần
phân ước lượng mẫu được lấy trong quá trình sắc ký được phân tích bằng gel điện di
natri dodecylsulphate–polyacrylamide (SDS–PAGE) tiếp theo là nhuộm với
Coomassie. Kết quả khi tách brazzein từ cấu trúc bậc 5 của hạt được thể hiện trong
Hình 3. Băng 6.5 kDa lớn phát hiện khi nhuộm với Coomassie trong phân tách rửa
bằng độ pH thấp (Hình 3A, đường 7–9) cũng đã được phát hiện bởi kỹ thuật
immunobloting
[4]
sử dụng kháng thể kháng brazzein (Hình 3B, đường 7–9), và sự hiện
diện của băng tương quan với việc phát hiện brazzein bằng phương pháp ELISA
[2]

(Hình 3C). Sắc ký ái lực miễn dịch của chiết xuất từ hạt của một cấu trúc dòng bậc 2
mang lại kết quả tương tự (con số bổ sung, xem phần sau). Protein brazzein ngô được
tinh sạchcó nguồn gốc từ cả hai cấu trúc dòng bậc 2 và 5 được cho vào sự suy thoái
Edman để có được những trình tự đầu cuối N của amino acid (Bảng 1). Các trình tự
đầu cuối N của amino acid của dạng brazzein tự nhiên loại 2 và 3 được hiển thị để
tham khảo. Acid amin không được gán trong các trình tự phân tích tương ứng với vị trí
của các phần đuôi cysteine trong khung đọc mở rộng brazzein để tạo thành cầu
disulfua nội phân tử trong protein brazzein (Kohmura và các cộng sự, 1996). Kết quả
cho thấy brazzein trong cấu trúc dòng bậc 5 được xử lý chính xác để sản xuất đầu cuối
N loại 3 tự nhiên. Tuy nhiên, brazzein tinh sạch từ cấu trúc dòng bậc 2 có thêm vào
một amino acid bổ sung ở phần kết thúc đầu cuối N, một serine. Amino acid này tương
ứng với amino acid cuối cùng trong trình tự tín hiệu được sử dụng trong cấu trúc bậc
Công nghệ sinh học thực phẩm

Trang 8

2, và do đó các kết quả này cho thấy xử lý các protein dung hợp một acid amin ra khỏi
glutamine.











Hình 3: Sự phân tách protein brazzein loại 3 bởi sắc ký ái lực miễn dịch (Immunoaffinity

chromotography) từ hạt ngô có cấu trúc bậc 5. Phần chiết được xử lý sơ bộ từ hạt giống của
cấu trúc dòng bậc 5, và tùy thuộc vào sắc ký ái lực miễn dịch như mô tả trong “Phương pháp
thí nghiệm”. Phần phân ước của phân đoạn tùy thuộc vào natri dodecylsulphate–
polyacrylamide gel điện (SDS–PAGE) trên 18% gel. Băng protein được nhận thấy khi
nhuộm với Coomassie blue (A), khi chuyển sang polyvinylidene difluoride (PVDF), brazzein
được nhận thấy bởi kỹ thuật immunobloting
[4]
với kháng thể kháng lại brazzein (B) hoặc đo
bằng phương pháp ELISA
[2]
(C). Vị trí của các protein tiêu chuẩn của trọng lượng phân tử
được chỉ thị (×10
–3
) được đưa ra trên bên trái của gel và blot. Giếng 1, phosphatebuffered
saline (PBS) chiết xuất từ hạt giống; giếng 2, dịch chảy qua phân đoạn; giếng 3, PBS rửa;
giếng 4, thứ ba PBS rửa;giếng 5–9, các phân đoạn tách rửa với bộ đệm pH thấp.
Một ứng dụng tiềm năng của brazzein là như một loại phụ gia thực phẩm tinh
chế. Do đó, một phương pháp tinh sạch đã được phát triển để tạo ra đủ số lượng
protein brazzein loại 3 đã tinh sạch cho đánh giá cảm quan để kiểm tra xem nguyên
Công nghệ sinh học thực phẩm

Trang 9

liệu tinh khiết vẫn giữ được vị ngọt bên trong cao. Một bản phác thảo của thử nghiệm
được sử dụng để làm giàu thêm protein brazzein được hiển thị trong Hình 4A. Các
phân đoạn được tạo ra trong suốt hoạt động tinh sạch tiêu biểu được thử nghiệm cho
sự hiện diện của protein brazzein, và kết quả được tóm tắt trong Bảng 2. Phân tích các
phân đoạn của SDS–PAGE cũng đã được thực hiện, và kết quả được thể hiện trong
Hình 4B. Brazzein đã được làm giàu thêm tới khoảng 70% protein hòa tan của thử
nghiệm này, và mang lại một băng đơn bởi SDS–PAGE. Thử nghiệm này là lặp đi lặp

lại nhiều lần để tạo ra một lượng vừa đủ brazzein loại 3 tinh sạch để đánh giá cảm
quan.
Bảng 2: Tinh sạch protein brazzein từ hạt đƣợc thu nhận từ ngô cấu trúc bậc 5 dòng.
Bước tinh sạch
Protein
tổng †
(mg)
Brazzein
‡ (mg)
Độ tinh
khiết (%
TSP)
Fold
enrichment
Hiệu
suất (%)
Tách chiết thô
1148.5
7.5
0.65
1
100
Tách chiết nhiệt
697.1
7.1
1.02
1.6
95
SP Sepharose peak
22

4.9
19.7
30.1
65
Superdex 30 peak
6.1
4.3
70.7
108.1
58

TSP, total soluble protein: tổng protein hòa tan.
*Tinh sạch brazzein loại 3 từ 80 g bột bắp thu được từ cấu trúc bậc 5 dòng.
† Protein tổng trong phần bột bắp được xác định sử dụng phép phân tích BCA .
‡ Hàm lượng brazzein của phần bột bắp được xác định bằng phép phân tích sử dụng phương
pháp ELISA
[2]
cho brazzein đặc hiệu (là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể
hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm).






Công nghệ sinh học thực phẩm

Trang 10

Hình 4: Việc làm phong phú thêm brazzein loại 3 để thử nghiệm hương vị. (A) Lưu đồ của hệ

thống làm sạch nhiều bước để phân lập brazzein từ hạt ngô. Hạt gộp từ cấu trúc dòng bậc 5 đã
được sử dụng để tinh chế brazzein loại 3 theo các phương pháp nêu trong “Các phương pháp
thí nghiệm”. Phần phân ước của các phân đoạn được gộp thu được từ các bước khác nhau tùy
thuộc vào natri dodecylsulphate–polyacrylamide gel điện di (SDS–PAGE) trên 18% gel. (B)
Coomassie bluestained gel. Vị trí của các protein tiêu chuẩn với trọng lượng phân tử được chỉ
thị (×10
–3
) được cho ở bên trái. Giếng 1, chiết xuất dầu thô của brazzein loại 3 trong hạt giống
ngô (5 g); giếng 2, nước nóng/trích lọc (5 g); giếng 3, điểm cực đại brazzein từ phương
pháp sắc ký trao đổi cation (5 g); giếng 4, điểm cực đại của brazzein loại 3 từ phương pháp
sắc ký lọc gel (hay phương pháp sắc ký rây phân tử) (5 g).
Phân tích cảm quan brazzein ngô
Như các ứng dụng tiềm năng cho biểu hiện của brazzein trong ngô có thể yêu
cầu sử dụng hoặc là một protein tinh sạch hoặc một phân đoạn tinh sạch ít hơn được
thu nhận từ hạt ngô, thật hữu ích để xác định cường độ ngọt của brazzein cả bên trong
phân đoạn ngô và protein tinh sạch. Để xác định xem protein brazzein trong phân đoạn
mầm sở hữu vị ngọt bên trong hay không , bột mầm được dùng để đánh giá cảm quan.
Bột mầm đối chứng và bột mầm từ cấu trúc dòng bậc 2 và 5 (0.04% và 0.02% tương
ứng với trọng lượng khô của bột và brazzein) đã được sử dụng để tạo ra chiết xuất đã
được đánh giá cường độ ngọt tương đối so với tiêu chuẩn tham khảo dung dịch đường
mía sử dụng phương pháp thử nghiệm tiêu chuẩn. Chiết xuất từ bột mầm có chứa
brazzein loại 2 hoặc loại 3 được nếm thử và có số điểm tương đối so với cường độ
ngọt của tiêu chuẩn tham chiếu đường mía chuẩn bị ở mức 1.0%, 2.0%, 3.0%, 4.0% và
5.0%, chúng đã được tìm thấy có độ ngọt có thể so sánh với dung dịch tương ứng 1.8
% và 2.0% đường mía (Bảng 3). Điều này tương ứng với vị ngọt tương đương khoảng
Công nghệ sinh học thực phẩm

Trang 11

40% và 35% đường mía cho bột mầm có chứa 0.02% brazzein loại 3 và 0.04%

brazzein loại 2 tương ứng. Dựa trên hàm lượng brazzein đo được trong các phần bột
mầm, những kết quả này chỉ ra rằng bột brazzein loại 3 là ngọt nhất trên một đơn vị
brazzein, cung cấp một cường độ ngọt của khoảng 1700 lần so với đường mía trên mỗi
trọng lượng cơ sở tại 2.0% đường mía, so với 900 lần so với đường mía cho ngô
brazzein loại 2. Không có độ ngọt nào được phát hiện theo các điều kiện của phân tích
này trong bột mầm đối chứng. Những kết quả này chứng minh rằng brazzein biểu hiện
trong ngô sở hữu một cường độ ngọt cao, mà vẫn còn khi thu hoạch hạt giống, lưu trữ,
phân đoạn, de-fatting (loại gốc acid béo nhằm giảm hàm lượng béo) và nghiền.
Bảng 3: Độ ngọt tƣơng đối của brazzein trong bột phôi ngô và protein brazzein loại 3
đƣợc tinh sạch từ bắp.
Nguồn vật liệu
Loại
brazzein
Nồng độ
brazzein trong
mẫu thử (p.p.m)
Độ ngọt đo
được (SEV)
(%)†
Độ ngọt
brazzein ‡
Bột phôi
Loại 2
20
1.8
900
Bột phôi
Loại 3
10
2.0

1700
Protein được tinh sạch
Loại 3
40
4.8
1200
Protein được tinh sạch
Loại 3
80
7.5
940
*Bột phôi chứa cả brazzein loại 2 và loại 3 được thu nhận lần lượt từ hạt cấu trúc bậc 2 và 5
dòng.
†SEV (Đường mía Equivalence Value): giá trị đường mía tương đương tương ứng với độ ngọt
của dung dịch đường mía (w/v %).
‡ Độ ngọt tương đối được so sánh với đường mía bằng trọng lượng thành phần brazzein.
Việc ước lượng độ ngọt của brazzein loại 3 được tinh sạch từ bắp cũng được
biểu diễn ở bảng 3. Hai nồng độ brazzein được pha lẫn vào một hệ đệm muối citrate sẽ
được ước lượng bằng cách so sánh với bảng đường mía tiêu chuẩn mà bảng này tạo ra
từ việc hòa tan đường mía vào cùng một hệ đệm muối citrate. Kết quả cho thấy rằng,
brazzein loại 3 đã tinh sạch có độ ngọt từ 940–1200 lần của đường mía ở cường độ
đường mía tương ứng đã được kiểm định. Kết quả này nằm trong phạm vi báo cáo của
brazzein loại 3 biểu hiện trong hệ thống biểu hiện vi khuẩn (Assadi–Porter và các cộng
Công nghệ sinh học thực phẩm

Trang 12

sự, 2000b). Vì vậy, brazzein tái tổ hợp, có nằm trong phần bắp hoặc đã tinh sạch từ hạt
bắp đi chăng nữa, nó vẫn giữ được độ ngọt tự nhiên cao.
Kiểm tra ứng dụng của sản phẩm bột phôi bắp.

Để kiểm tra sự phù hợp của mầm ngô brazzein ứng dụng tiềm năng của sản
phẩm, bột mầm từ hạt thu nhận từ cấu trúc bậc 2 dòng đã được sử dụng vào thử
nghiệm sự phù hợp của sản phẩm. Người ta lấy bột mầm làm thành công thức cho
Sports Protein Bars (Những thanh protein biến dị) và Reduced Carbohydrate Muffins
(bánh nướng xốp sử dụng carbohydrate khử). Người ta xem xét những mẫu sản phẩm
được kiểm tra bằng một bảng vị giác về độ ngọt và loại vị tương ứng với những sản
phẩm mà được đưa vào công thức sử dụng bột mầm từ ngô không chuyển gen đặc
hiệu. Thanh chứa brazzein được mô tả là ngọt hơn những sản phẩm được chuẩn bị
dùng cho mầm đặc hiệu và càng mịn thì tính chất về vị giống đường bấy nhiêu. Người
ta cũng mô tả cảm giác trong miệng là “càng ấm càng trọn vẹn hơn” hơn vật liệu đặc
hiệu. Kết quả tương tự cũng được mô tả cho Reduced Carbohydrate Muffins với sản
phẩm brazzein được mô tả là “càng ngọt thì càng trọn vẹn về vị ngon”. Trong những
đánh giá này, người ta ước tính rằng bột brazzein có độ ngọt từ 25–30% độ ngọt của
đường mía trên một trọng lượng cơ sở, chứng minh rằng độ ngọt của brazzein trong
bột mầm tồn tại được trong những điều kiện dùng để chuẩn bị cho hai sản phẩm tiềm
năng.
THẢO LUẬN
Thực vật đang ngày càng được dùng như những nhà máy sinh học để sản xuất
thương mại những protein có giá trị (được xem xét lại bởi Hood and Jilka, 1999;
Streatfield and Howard, 2003; Horn và các cộng sự, 2004). Dược phẩm sinh học đang
được sử dùng trong việc phát triển vaccine dạng uống, enzyme dùng trong công
nghiệp và protein dược phẩm. Việc sản xuất trong những hệ thống biểu hiện thực vật
cung cấp nhiều thuận lợi hơn những hệ thống biểu hiện khác: (i) thực vật chứa nhiều
protein khác loại phong phú đã trải qua quá trình sau dịch mã phức tạp, (ii) việc sản
xuất có thể được mở rộng một cách nhanh chóng để sản xuất giá rẻ một lượng lớn sản
phẩm; (iii) những thực vật mà không chứa mầm bệnh cho con người, như vậy làm
giảm đến mức tối thiểu lo ngại về những chất gây hại và (iv) sự biểu hiện của protein
Công nghệ sinh học thực phẩm

Trang 13

trong hạt cung cấp vị trí tự nhiên để tồn trữ protein trong thời gian lâu dài. Sự biểu
hiện của những protein chuyển gen trong những cây trồng có thể ăn được có lợi ích
đặc biệt cho quá trình sản xuất những vật liệu chỉ được tiêu thụ một cách trực tiếp, một
đặc tính được khai thác cho mục đích phát triển vaccine uống (Streatfield and Howard,
2003). Ngô là một phương tiện đặc biệt thích hợp cho việc sản xuất thương mại các
protein tiêu thụ được, ở một chỗ phát triển rộng rãi, hiệu quả và đáng tin cậy, cây trồng
phục vụ như là một nguồn chính cho các loại thực phẩm cơ bản, và nó đã được hỗ trợ
bởi một cơ sở hạ tầng kinh doanh nông nghiệp để vận chuyển ngũ cốc, lưu trữ và chế
biến với hiệu quả cao. Hơn nữa, việc sử dụng hệ thống biểu hiện thực vật này dẫn tới
việc sản xuất thương mại nhiều protein (Hood và các cộng sự, 1999; Woodard và các
cộng sự, 2003).
Chúng tôi báo cáo ở đây việc sử dụng một hệ thống biểu hiện ngô cho việc sản
xuất kinh tế của protein ngọt, brazzein , cho cả thị trường chất làm ngọt cường độ thấp
và cường độ cao. Sự biểu hiện cao của protein brazzein trong hạt mầm ngô dẫn đến
một phần mầm với độ ngọt bên trong lên đến 40% giá trị của đường mía tính theo
trọng lượng. Đây là một điều đặc biệt nổi bật rằng phần hạt giống sử dụng cho thế hệ
của các phần mầm kiểm tra sở hữu một mức độ biểu hiện chỉ có khoảng 50 μg
brazzein loại mỗi gram hạt.
Mức độ biểu hiện của brazzein trong hạt thu được lên tới 4% TSP, tương đương
với khoảng 400 μg brazzein trên gam hạt. Điều này cho thấy hạt giống từ các dòng ngô
biểu hiện cao nhất sở hữu mầm có chứa độ ngọt lớn hơn so với đường mía trên mỗi
trọng lượng cơ sở. Hơn nữa, với khả năng tăng brazzein mức độ biểu hiện thông qua
việc lai chéo liên tục của dòng vào tế bào mầm thuần ưu tú và các thế hệ đồng hợp tử
hạt giống bố mẹ cho sản xuất, thật hợp lý để đề ra kế hoạch cho tiềm năng của toàn bộ
hạt không phân đoạn để trội hơn cường độ ngọt của đường mía. Chiến lược này đạt
được sự biểu hiện protein tái tổ hợp cao mà không có gen lặng thông qua việc lựa chọn
dòng duy trì cả biểu hiện ở mức cao qua nhiều thế hệ và cả kháng thuốc diệt cỏ đã
được sử dụng thành công (Hood và các cộng sự, 2003). Hơn nữa, Agrobacterium giới
hạn số lượng bản sao của gen chèn, do đó thêm tính ổn định vào gen ngay cả trong

trạng thái đồng hợp tử (Muller và các cộng sự, 1987; Last và Gray, 1990; Frary và
Hamilton, 2001; Choi và các cộng sự, 2003). Như vậy, cùng với nhau, những cách tiếp
Công nghệ sinh học thực phẩm

Trang 14

cận nên cho phép sự gia tăng hơn nữa trong việc biểu hiện protein brazzein mức độ
cao để các thế hệ tiếp tục sinh sản.
Thực tế là protein brazzein thể hiện trong ngô sở hữu kiểu hình ngọt giống như
sản phẩm tự nhiên, điều này rất quan trọng để sản xuất protein tái tổ hợp. Trong trường
hợp của thaumatin, một số phương pháp sử dụng hệ thống biểu hiện khác tạo ra
protein tái tổ hợp không ngọt mà không rõ lý do (Edens và các cộng sự, 1982; Edens
và van der Wel , 1985; Lee và cộng sự, 1988). Biểu hiện của bột mầm chứa brazzein
có thể được sử dụng trực tiếp trong ứng dụng sản phẩm tiềm năng mà không làm giàu
hơn nữa để cung cấp vị ngọt và cải thiện hương vị sản phẩm cho thấy tiềm năng của
vật liệu chưa lọc này như là một chất làm ngọt cường độ thấp. Sử dụng một phần nhỏ
mầm sản phẩm chất làm ngọt không chỉ cung cấp một sự lựa chọn đường mía có hàm
lượng calo thấp, nhưng cũng cung cấp các thuộc tính của chất xơ cần thiết để thay thế
lượng mất khi loại bỏ đường, sản sinh ra chất tạo ngọt tổng hợp và chất độn. Vì
brazzein loại 3 tinh sạch từ hạt giống ngô biến đổi gen sở hữu một cường độ ngọt 1200
lần so với đường mía trên mỗi trọng lượng cơ sở, nguyên liệu làm giàu trong xu thế
này có thể có khả năng phục vụ như là một chất làm ngọt cường độ cao để tiếp tục mở
rộng hàng loạt các ứng dụng sản phẩm của brazzein biểu hiện trong ngô. Sự ổn định
cao của protein brazzein là một đặc điểm hữu ích cho ngành công nghệ thực phẩm làm
cho brazzein sản xuất từ ngô thích hợp cho một loạt các ứng dụng trên thị trường, với
hai ứng dụng đó được thể hiện ở đây. Cũng có thể là brazzein từ ngô được sử dụng để
làm giàu syrup ngô có hàm lượng đường fructose cao nhằm tạo ra một công thức giúp
tăng độ ngọt.
Những dòng ngô biểu hiện brazzein loại 3 có tiềm năng lớn về ứng dụng
thương mại. Đầu tiên, các dòng chứa brazzein loại 3 có mức độ biểu hiện cao nhất

quan sát thấy trong ngô. Thứ hai, brazzein loại 3 biểu hiện ở ngô sinh ra một protein
mang đầu cuối N của amino acid của dạng brazzein tự nhiên ngọt nhất. Thứ ba, cường
độ vị ngọt cao của brazzein loại 3 biểu hiện ngô có trong bột mầm và trong protein
được tinh sạch. Bột mầm và protein tinh sạch có cường độ vị ngọt xấp xỉ cường độ vị
ngọt của brazzein loại 3, được sản xuất từ một hệ thống vi khuẩn tái tổ hợp (Assadi-
Porteret al,2000b). Thêm vào đó, ngô có thêm ưu điểm là sản xuất protein có hiệu suất
về chi phí từ brazzein loại 3 được đóng gói trong một sản phẩm tự nhiên ăn được.
Công nghệ sinh học thực phẩm

Trang 15

Trong báo cáo này, bột mầm từ một dòng được tạo ra biểu hiện brazzein loại 2 được
để kiểm tra việc ứng dụng. Sự chuyển đổi và đồng nhất của dòng biểu hiện brazzein
loại 2 đi trước sự phát triển của dòng loại 3, do đó tại thời điểm ban đầu của việc kiểm
tra ứng dụng thì số lượng dòng loại 3 không đủ. Tuy nhiên brazzein loại 3 có trong bột
mầm đã được chứng tỏ có vị ngọt cường độ cao nên có thể hy vọng sự hiện diện tương
tự cho brazzein loại 3 trong việc kiểm tra ứng dụng bột mầm. Sự phát triển liên tục của
những dòng ngô nhiều hứa hẹn nhất biểu hiện brazzein loại 3 sẽ cho phép việc thử
nghiệm ứng dụng xa hơn để đánh giá tiềm năng của loại vật liệu này.
Điều thú vị là, quá trình chế biến không chính xác của sản phẩm biểu hiện
brazzein loại 2 sinh ra một dạng khác của brazzein mà không có glutamine với đầu
cuối N, nghĩa là không trải qua sự biến đổi thành pyroglutamate để tạo ra brazzein loại
1. Mặc dù biến thể này giữ lại được vị ngọt, mặc dù N-terminus đóng vai trò trong việc
xác định vị ngọt (Assadi-Porter và các cộng sự, 200b), nhưng cường độ vị ngọt của nó
không được cải thiện hơn so với brazzein loại 3. Những hình thức biến thể của
brazzein có cường độ vị ngọt cao hơn được thiết kế với vị ngọt bên trong gấp đôi vị
ngọt của brazzein loại 3 (Assadi-Porter và các cộng sự, 2000b), và việc sử dụng một
hệ thống ngô để biểu hiện những hình thức biến thể có khả năng tạo ra thậm chí đủ
loại ngô có vị ngọt hơn. Tuy nhiên brazzein loại 3 là dạng tự nhiên của protein có
cường độ vị ngọt cao nhất và do đó các dòng ngô có brazzein loại 3 vẫn có lợi thế

được chấp nhận theo quy định và tán thành sử dụng như nguồn thay thế tự nhiên để
tổng hợp chất ngọt.
Có nhiều báo cáo đã chỉ ra kỹ thuật biểu hiện protein ngọt vào thực vật chuyển
gen nhưng việc áp dụng kỹ thuật này để sản xuất thương mại protein thì vẫn chưa có
trên thực tế. Tính khả thi về kinh tế của một hệ thống thực vật tái tổ hợp sản xuất
protein đòi hỏi sự biểu hiện mức cao của protein khác loại. Witty (1990) đã tạo được
Solanum tuberosum sản xuất ra thaumatin tái tổ hợp với một kiểu hình ngọt nhưng
năng suất sản phẩm thì thấp. Penarrubia và các cộng sự (1992) đã báo cáo về sự biểu
hiện của monellin, protein ngọt từ quả mọng đỏ của thực vật phía tây nước Mỹ ,
Dioscoreophyllum cumminsii Diels, trong cà chua và rau diếp chuyển gen nhưng chỉ
có 23.9 µg monellin /khối lượng ướt thấp hơn so với 400 µg/g hạt bắp. Nhiều nỗ lực
đã được tiến hành để biểu hiện mabinlin II, một protein có vị ngọt có nguồn gốc từ trái
Công nghệ sinh học thực phẩm

Trang 16

cây ở Trung Quốc, Capparis masaikai Levl trong những củ S.tuberosum chuyển
gen(Xiong và Sun, 1996), nhưng kết quả rõ ràng vẫn chưa được báo cáo. Ngay cả khi
những hạn chế về sự biểu hiện được khắc phục trong những giống cây này, tính khả thi
của rau diếp, cà chua hoặc khoai tây làm cây trồng thương mại sản xuất protein vẫn
chưa có. Do đó, sự biểu hiện protein mức độ cao được báo cáo ở đây trong một hệ
thống thực vật đã được chứng minh là khả thi với việc sản xuất thương mại của protein
tái tổ hợp, việc này có thể cho phép sự sản xuất thương mại cuối cùng của protein ngọt
trong thực vật chuyển gen.
Việc thương mại hóa sản phẩm chứa brazzein tái tổ hợp sẽ yêu cầu sự chấp
thuận theo quy định. Những báo cáo gần đây của việc xác định các chất gây dị ứng
chính cho tác nhân gây bệnh có liên quan đến protein thaumatin ( dòng PR-5 của chất
gây dị ứng ở thực vật) có nhấn mạnh sự cần thiết của việc đánh giá tính gây dị ứng của
sản phẩm công nghệ sinh học cho việc cung cấp thực phẩm (Hoffman- Sommerguber,
2002). Điều thú vị là, mặc dù tính tương đồng đáng kể của thaumatin với chất gây dị

ứng giống như thaumitin, thaumatin vẫn nhận được sự chấp thuận từ các cơ quan
thông qua thử nghiệm kỹ lưỡng độc tính và sự an toàn. Việc so sánh brazzein với các
peptide trong cơ sở dữ liệu chất gây dị ứng Farrp cho thấy không có sự tương đồng
đáng kể với các chất gây dị ứng được biết đến ( không ≥ 35% tính đồng nhất so với
chiều dài 53 amino acid của brazzein loại 3). Ngoài ra, người dân bản địa châu Phi đã
được sử dụng nguồn tự nhiên của brazzein làm thực phẩm có vị ngọt trong nhiều năm,
điều này cho thấy protein brazzein không có bất kỳ nguy hại nào với sức khỏe. Tuy
nhiên, tính ổn định tương đối cao của protein brazzein (một sự hữu ích cho các ứng
dụng có xử lý nhiệt độ cao) cho thấy rằng sự đánh giá của các chất gây dị ứng trong
thực phẩm sẽ là một yếu tố quan trọng cho việc chấp thuận theo quy định của brazzein.
PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
Cấu trúc plasmid
Bắt đầu với sự thành lập chuỗi amino acid (Ming và Hellenkant, 1994), các
chuỗi brazzein loại 2 và loại 3 được dịch mã ngược bằng chương trình dịch mã ngược
của Wiscosin GCG chống lại bản codon được xếp thành bảng cho các gen biểu hiện ở
ngô một cách nhanh chóng. Kết quả các chuỗi AND được quét bởi sự có mặt của các
Công nghệ sinh học thực phẩm

Trang 17

trình tự không mong đợi như các tín hiệu olyadenylation, các vị trí ghép liên ứng thứ 5
và thứ 3, các chuỗi không ổn định mARN và các vị trí enzym giới hạn trong nhân
khác. Các chuỗi AND được sửa đổi để loại bỏ những vị trí này bằng cách chọn các
condon thay thế. Kết quả các chuỗi này được cấu trúc sau đó sử dụng chuỗi
oligonucleotide bổ sung chồng chéo và chuỗi phản ứng trùng hợp (PCR) để khuếch tán
chuỗi tổng hợp hiệu quả. Các vị trí giới hạn thuận lợi cũng được bố trí thành chuỗi kết
tối ưu hóa 5’ và 3’ để tạo điều kiện cho nhân bản. Những chuỗi này được làm cho cận
vô tính thành một hộp biểu hiện ngô trong một vector
[3]
biến tính bao gồm các chuỗi

tiếp giáp bên trái và phải của một khối nông sinh học plasmid Ti và gen hạt bắp tối ưu
đúng lúc của các gen Streptomyces màu xanh lục (White cùng các cộng sự, 1992)
được biểu hiện từ promoter 35S loại vi rút khảm cải hoa lơ (CaMV), gọi là sự giới hạn
tới thuốc diệt cỏ bialaphos, theo chiến lược được báo cáo bởi Hood cùng các cộng sự.
(2003). Tám cấu trúc khác nhau được sinh sản ra. Đối với cấu trúc từ 1-3 và 5-8, mỗi
hạt bắp được codon hóa thành chuỗi tín hiệu lúa mạch alpha-amylase (BAASS;Rogers,
1985) được hợp nhất để cung cấp một tín hiệu tế bào bí mật tại điểm N. Các khung mã
hóa chứa brazzein được làm cho cận vô tính thành các vector
[3]
xuôi dòng của một
promoter cơ bản (vùng khởi động giống như chuỗi protein điều hòa; Hood cùng các
cộng sự. 2003), một promoter ưa phôi (vùng khởi động globulin-1 ở ngô; Benlanger và
Kriz, 1991) hoặc một promoter ưa nội nhũ (hạt bắp cụm 22- gen alpha kDa , ngân
hàng gen tăng thành số.). AF090447, nucleotit 1-867). Đối với cấu trúc 7 và 8, UTR 5’
của TEV (ngân hàng gen tăng thành số M15239, nucleotit 2-143) và MDMV (ngân
hàng gen tăng thành số AJ001691, nucleotit 1-138) được cấu trúc sử dụng một chuỗi
oligonuclotide bổ sung chồng chéo và PCR để khuếch đại các chuỗi tổng hợp hiệu quả
trước để làm cho cận vô tính 3’ của trình tự vùng khởi động và 5’ của BAASS. Cấu
trúc 6 rất quan trọng giống như cấu trúc 5 loại trừ sự thay thế của các vị trí giới hạn để
điều tiết các chất vô tính theo sau bởi sự tạo ra các cấu trúc 7 và 8. Hình 1 bao gồm
một số cấu trúc biểu hiện được sinh ra và được sử dụng cho sự biến đổi hạt bắp
nguyên khai.
Sự chuyển đổi ngô gián tiếp thông qua Agrobacterium
Các cấu trúc biểu hiện của thực vật được đưa vào ngô sử dụng một phương
pháp tiếp cận A.tumefaciens được mô tả trong Streatfield cùng các cộng sự. (2001).
Công nghệ sinh học thực phẩm

Trang 18

Bông từ dòng hạt ngô Hi loại II, hoặc được sinh ra từ dòng hybrid lai tạo bằng cách lai

Hi II với dòng thuần, được thu hoạch và sử dụng để biến đổi. Kết quả biến đổi gen các
dòng thực vật được chọn lọc cho sự phát triển của bialaphos 5 µM (Phòng thí nghiệm
công nghệ Phyto, Overland Park, KS) để bảo đảm sự sinh sản bền vững của vật liệu
gen được xảy ra. Một loạt từ 10-20 loại thực vật được phát triển từ những sự chuyển
đổi độc lập. Cây được thụ phấn với giống cây lai ưu tú, và thế hệ đầu tiên (T1) hạt
giống được khai thác và phân tích protein tái tổ hợp biểu hiện bằng phương pháp
ELISA
[2]
để định lượng protein brazzein. Những dòng biến đổi gen biểu hiện protein
tái tổ hợp mức độ cao được lai ngược với các dòng ngô thương mại. Phấn hoa từ dòng
biến đổi gen cũng được sử dụng cho việc thụ phấn các dòng thương mại để lớn lên hạt
giống biến đổi gen nhanh chóng.
Sự chuẩn bị dịch chiết protein hòa tan từ hạt ngô
Những hạt khô được nghiền thành bột bằng cối và chày và một phần 25-30 hạt
khác được nghiền trong một máy xay cà phê. Vật liệu nghiền thành bột sau đó được
lắc mạnh trong một ống với một quả bóng thép chịu lực chứa 500 ml nước muối được
đệm phosphate có chứa 0,05 % Tween ® 20 (PBST) trong mỗi hạt giống đơn hoặc 0,1
g mẫu hạt giống gộp. Protein hòa tan được thu hồi bằng sự ly tâm mô đồng nhất .
Nồng độ TSP trong chiết xuất thực vật được xác định bằng một xét nghiệm cho sự liên
kết giữa protein - thuốc nhuộm (Bradford , 1976).
Định lƣợng brazzein tái tổ hợp trong ngô biến đổi gen
Một chiếc bánh sandwich-ELISA
[2]
đã được sử dụng để định lượng mức độ
brazzein trong chiết xuất thực vật và các phân đoạn sắc ký. Trong một thời gian ngắn,
những tấm được phủ kháng thể chống brazzein trong dung dịch đệm 0,05 M carbonate
/ bicarbonate pH 9,6 bằng cách ủ trong nhiều giờ ở 4 °C. Các lane được sau đó bị
chặn bằng cách ủ với chặn đệm [PBST có chứa 3% albumin huyết thanh bò (BSA) (
Sigma- Aldrich , St Louis, MO) ] ở 37 °C trong 1 giờ . Chiết xuất protein hòa tan được
thêm vào lane và ủ ở 4 °C qua đêm. Thỏ biotinylated chống brazzein kháng thể, pha

loãng trong việc ngăn chặn đệm, đã được thêm vào lane và ủ ở 37 °C trong 1 giờ .
Streptavidin - alkaline phosphatase ( Jackson Immunoresearch phòng thí nghiệm, Tây
Grove, PA) trong việc ngăn chặn đệm sau đó đã được thêm vào các lane và ủ ở 37 °C
Công nghệ sinh học thực phẩm

Trang 19

trong 1 giờ . Các tấm ELISA
[2]
được rửa bốn lần với PBST giữa mỗi bước. Cuối cùng,
para - nitrophenylphosphate (Sigma) đã được thêm vào mỗi lane , sau đó ủ ở 37 °C
trong 30 phút, và hấp thụ ở 405 nm được ghi nhận . Pha loãng một loạt men tái tổ hợp
có nguồn gốc từ loại tiêu chuẩn protein brazzein loại 1 và một mẫu đối chứng ngô
không chuyển gen được đưa vào khảo nghiệm để tham khảo.
Phân tích trình tự amino ở dầu cuối N của đồng phân brazzein
Tất cả các hạt ngô từ loại 2 và loại 3 được xay riêng và tách chiết với dung dịch
muối đệm phosphat (PBS) ở tỉ lệ v/w là 4,5 : 1 (PBS : mẫu) bằng cách xoay mẫu trong
30 phút ở 4
o
C, và phần nổi trên bề mặt được làm trong bằng cách quay ly tâm ở 20 000
g trong 15 phút. Kháng thể protein A Sepharose tinh khiết ở thỏ chống lại brazzein
(5mg) được kết hợp với 2 mL cột Aminolink Plus (Pierce, Rockford, IL) theo hướng
dẫn của nhà sản xuất. Dịch chiết chứa brazzein nhờ lực hấp dẫn hợp với cột anti-
brazzen (2 mL) tiền cân bằng trong PBS. Cột được rửa sạch bằng PBS (8 mL), tiếp
theo là 3 x PBS đã cô đặc (11 mL), và protein liên kết đã được tách rửa với bộ đệm pH
thấp (20 mM glycine, pH 2.5, 150 mM NaCl) và thu nhận 1 mL phân đoạn trực tiếp
vào ống chứa 1 M MOPS (3-(N-Mor-pholino)propanesulphonic acid), pH 8 (81 µL) để
trung hòa mẫu. Phân đoạn chứa brazzein được gộp chung và cô đặc thông qua siêu ly
tâm trên centricon-3 đơn vị lọc membrane (Billerica, MA). Mẫu brazzein (1 µg cho
mỗi ngô loại 2 và loại 3) điện di trên 10 – 20% SDS-PAGE gel, và sau đó chuyển sang

màng polyvinylidene difluoride (PVDF). Dải nhìn thấy được bằng cách nhuộm với
GelCode Blue (Pierce), được tách từ PVDF và bị phân hủy tự động Edman theo
phương pháp Matsudaira (1987) sử dụng dãy xếp tự động Hewlett-Packard G1000A
tại Phòng thí nghiệm Hóa học Texas A&M Protein.
Tinh chế brazzen tái tổ hợp loại 3 từ ngô biến đổi gen để phân tích cảm quan
Bột ngô từ một dòng lập trình để biểu hiện brazzein loại 3 được tách chiết với
bộ đệm A (20 mM sodium acetate, pH 4.0), có chứa 30 mM NaCl với tỷ lệ 5 : 1 v/w,
bằng cách khuấy ở 4
o
C trong 1 giờ. Phần nổi trên bề mặt được làm trong bằng cách
quay ly tâm, đun nóng đến 80
o
C trong 30 phút, và sau đó làm trong lần thứ hai bằng
cách lọc qua bộ lọc 0.2 μm. Phần nổi trên bề mặt được tiếp tục phân đoạn bằng sắc ký
trao đổi cation bằng cách tải trực tiếp vào SP-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) cân
Công nghệ sinh học thực phẩm

Trang 20

bằng trong đệm A. Protein liên kết được tách rửa với một gradient tuyến tính đến 500
mM NaCl tạo ra lượng hơn 15 cột, và các phân đoạn được kiểm tra có chứa brazzein
bằng phương pháp ELISA
[2]
. Phân đoạn chứa brazzein được gộp lại và cô đặc qua
màng siêu lọc 3-kDa. Sau bước này đầu ra thường chứa > 95% brazzein, và sau đó
được cho vào cột Superdex 30 307 mL (Amersham Biosciences, Upsala, Thụy Điển)
cân bằng trong đệm A có chứa 300 mM NaCl. Brazzein được tách rửa trong một peak
duy nhất ở vị trí tương đương thể tích rửa giải (6.5 kDa) như brazzein tinh chế từ nấm
men. Quy trình này được lặp đi lặp lại nhiều lần để tạo ra đủ nguyên liệu cho đánh giá
cảm quan. Brazzein tinh khiết đã được cô đặc qua siêu lọc màng 3 kDa, được khử

muối trên một cột G-25(Amersham Biosciences) cân bằng trong nước, và sau đó lạnh
đông khô. Năm mươi phần trăm trọng lượng mẫu đông khô như ước tính có chứa
brazzein dựa trên giá trị ELISA
[2]
và khối lượng mẫu, với lượng hơi ẩm còn lại chiếm
khoảng 20% trọng lượng mẫu.
Kiểm tra cƣờng độ ngọt
Để đánh giá cường độ ngọt của bột mầm ngô, giá trị tương đương đường mía
được xác định bởi bảng điều khiển sử dụng các mẫu chuẩn bị dưới dạng dung dịch 5%
bột ngô hòa trong nước. Mẫu bột mầm ngô loại 2 và loại 3, có chứa protein brazzein
0.04% và 0.02 % trọng lượng khô, được so sánh với mẫu bột mầm ngô không chuyển
gen kiểm chứng. Các mẫu bột qua máy trộn tốc độ cao và các dịch chiết được lọc
trước khi nếm thử. Để đánh giá cường độ ngọt, dịch được nếm thử và ghi điểm tương
đối so với cường độ ngọt của đường đường mía tiêu chuẩn ở mức 1.0%, 2.0%, 3.0%,
4.0% và 5.0% trong nước. Để đánh giá cường độ ngọt của brazzein loại 3 tinh chế từ
ngô, mẫu dịch brazzein thử nghiệm được chuẩn bị trong đệm nước ngọt citric/citrate.
Một mẫu protein brazzein đông khô loại 3, ước tính chứa brazzein 50% trọng lượng
khô, được hòa tan ở mức 80 p.p.m và 160 p.p.m. để tạo ra nồng độ brazzein 40 p.p.m.
và 80 p.p.m., tương ứng. Nếm dãy đã được thực hiện để xác định nồng độ xấp xỉ 4%
và 8% đường mía. Các dung dịch đường mía dao động 0,5% nồng độ từ 3% đến 9% ở
các bước, chuẩn bị trong đệm citric/citrate, được sử dụng làm tiêu chuẩn tham chiếu
cho điểm của cường độ ngọt mẫu. Kết quả định lượng cường độ ngọt ngào được thể
hiện trong Bảng 3.
Công nghệ sinh học thực phẩm

Trang 21

Đối với đánh giá của bột mầm ngô brazzein trong các thử nghiệm ứng dụng,
sản phẩm đã được xây dựng sử dụng bột mầm ngô đối chứng và bột mầm ngô chứa
brazzein loại 2 từ 2 dòng cấu trúc như sau. (i) Đối với thử nghiệm ứng dụng Sports

Protein Bar, cô lập protein đậu nành (26 g) được pha trộn với mầm ngô không béo
(12.63 g), syrup Fructo-oligosaccharide (46.14 g), inulin (7.43 g), glycerol (1.86 g),
dầu hướng dương (5.57 g) và chất nhũ hóa (0,37 g) để sản xuất một thanh với một hàm
lượng protein cao. Chuẩn bị được tiến hành trong một máy trộn dạng hành tinh; các
thành phần chất lỏng của công thức được đun nóng đến 60°C, trộn với bột khô và sau
đó bao gói và cắt trước khi nếm thử nghiệm. (ii) Đối với thủ nghiệm ứng dụng Muffin
giảm Carbohydrate, Polydextrose (19.35 g), mầm ngô không béo (20.43 g), whey
protein (3.6 g), nước (13.5 g), toàn bộ quả trứng (18 g), shortening (13.5 g), baking
soda (1.35 g), muối (0.27 g), quả việt quất khô (6.64 g) và lúa mì vụn (3.36 g) được
trộn và nướng trong lò quay ở nhiệt độ 160°C trong 35 phút. Sản phẩm được đánh giá
bởi một bảng đánh giá cảm quan cho hình thức bên ngoài, kết cấu, hương vị và dư vị.
Đặc biệt chú ý đến các ảnh hưởng trên vị ngọt và hương vị do kết hợp bột mầm
brazzein vào công thức.
Tách chiết hạt.
Hạt được đem xay xát để tách chiết những thành phần cấu thành chứa trong hạt,
về bản chất nó đã được miêu tả trước đây (Lamphear và các cộng sự, 2002).
Hiện tƣợng điện chuyển.
SDS-PAGE được thực hiện tại 100-150V từ 90-150 phút sử dụng một hệ thống
điện NOVEX XCell II. Dải protein được hình dung bằng cách nhuộm với Coomassie
(chất nhuộm protein trong phân tích sinh hóa) sử dụng thuốc thử GelCode Blue
(Pierce) hay kỹ thuật “immunoblotting
[4]
. Với kỹ thuật immunoblotting
[4]
, protein
không nhiễm được chuyển đến màng PVDF tại 30 – 35V trong 60 phút sử dụng một
hệ thống điện NOVEX XCell II. Blots được ủ ở nhiệt độ phòng trong dung dịch kín
(dung dịch nước muối đệm từ 0.05 đến 20%, pH 8.0 và 5% sữa gầy) trong 1 giờ, và
sau đó với kháng huyết thanh anti-brazzein thỏ pha loãng 1 : 10000 trong dung dịch
kín để qua đêm, tiếp theo là ủ trong 1 giờ với liên hợp peroxidase lừa anti-thỏ (Jackson

Immunoresearch Laboratories) pha loãng 1 : 10000 trong dung dịch kín. Dải
Công nghệ sinh học thực phẩm

Trang 22

immunoreactive sẽ được phát hiện khi sử dụng thuốc thử ECL (Amersham
Biosciences, Upsala, Thụy Điển) theo khuyến nghị của nhà sản xuất.
LỜI CẢM ƠN
Chúng tôi cảm ơn Larry Dangott và Phòng thí nghiệm Hóa học Protein tại
Texas A&M University để phân tích chuỗi các brazzein đồng dạng; Malcolm
Gerngross và phòng thí nghiệm chế biến thực phẩm Texas A&M GLP cho quá trình
xay xát khô mẫu hạt và Mike Lindley và Lintech cho hương vị của cảm giác và ứng
dụng thử nghiệm trên brazzein mẫu. Chúng tôi cũng cảm ơn James Eckles, Nektar, hỗ
trợ dự án chung, và phòng thí nghiệm của Charles E. Glatz để được giúp đỡ với sự
phát triển của một quá trình dùng để xử lý brazzein từ hạt giống ngô. Công trình này
được hỗ trợ bởi Bộ Nông Nghiệp Mỹ giai đoạn 1 và 2 trợ SBIR # 99 - 33.610-9.435 và
# 00-33610-9435 để ProdiGene.

TÀI LIỆU BỔ SUNG
Các tác giả đã cung cấp các con số bổ sung sau, có thể được tải về từ
/>m.htm : Hình S1 cách ly của protein brazzein từ ngô mang hạt giống xây dựng 2 bằng
sắc ký immunoaffinity. Trích đã được chuẩn bị từ hạt của một cấu trúc loại 2, và bị sắc
ký immunoaffinity như mô tả trong “thủ tục nghiệm”. Phần ước các phần phân đoạn
đã phải chịu natri dodecylsulphate - polyacrylamide gel điện di (SDS-PAGE ) trên
18% gel. Băng protein đã được phát hiện bằng cách nhuộm với Coomassie màu xanh
(A), và chứa brazzein được đo bằng xét nghiệm miễn dịch enzymelinked (ELISA
[2]
)
(B). Vị trí của các protein tiêu chuẩn của trọng lượng phân tử chỉ ( × 10-3 ) được hiển
thị trên bên trái của gel. Ngõ 1 , đệm phosphat mặn (PBS) chiết xuất hạt; ngõ 2, chảy

qua (không ràng buộc) phần ; ngõ 3 , PBS rửa ; ngõ 4 , thứ ba PBS rửa ; đường 5-9 ,
phân tách rửa với bộ đệm pH thấp.