Nghiên cứu động thái Proline ở đậu côve (phaseolus vulgaris L.) trong điều kiện gây hạn ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau (LV00273)

1

Bộ giáo dục và đào tạo
Trờng đại học s phạm hà nội 2




Ngô Thị xuyến


Nghiên cứu động thái proline ở đậu cô ve
(Phaseolus vulgaris L.) trong điều kiện gây hạn
ở các giai đoạn sinh trởng khác nhau



Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.30



Luận văn thạc sĩ sinh học



Ngời hớng dẫn khoa học

Pgs.ts nguyễn văn mã






Hà nội, 2009




2
LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài luận văn này, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu
sắc tới thầy giáo, PGS.TS Nguyễn Văn Mã, người đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ, tạo
mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài luận văn này.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Khoa Sinh – KTNN và Trung tâm hỗ trợ
và chuyển giao công nghệ trường Đại học Sư phạm Hà Nội II, Phòng thực hành bộ môn
sinh lý thực vật… đã tạo điều kiện về trang thiết bị để tôi thực hiện tốt đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên khích lệ và giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn.
Hà Nội, tháng 9 năm 2009
Tác giả


Ngô Thị Xuyến

PHẦN MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Đậu cô ve có tên khoa học là Phaseolus vulgaris (L.) là cây họ Đậu
(Fabaceae). Đậu cô ve được trồng rộng rãi trên khắp thế giới, có nguồn gốc từ
Trung Mỹ và được trồng cách đây hơn 600 năm. Ở Châu Á đậu cô ve được sử
dụng nhiều bởi nó có giá trị dinh dưỡng cao, là một trong những loại rau giàu




3
protein chứa khoảng 2,5% đạm trong quả non, 0,2% chất béo, 7% chất đường
bột [26]. Quả tươi giàu vitamin A và C, có thể dùng ăn tươi, đóng hộp và đông
lạnh. Ở một vài quốc gia Châu Á như Ấn Độ, Miến Điện, Nepal, Sri-Lanca,
Bangladesh… sử dụng hạt khô của đậu cô ve trong các bữa ăn kiêng. Đậu cô ve
là một trong những loại hoa màu thích nghi trong hệ thống luân canh với lúa.
Trong các loại đậu rau thì đậu cô ve là quan trọng bậc nhất bởi vì được phân bố
rộng khắp và sản lượng tương đối lớn có tiềm năng là nguồn thu nhập với các
nông hộ nhỏ. Đậu cô ve còn là nguồn cung cấp vitamin và chất khoáng phong
phú trong các loại thực phẩm hàng ngày. Ngoài ra, đậu cô ve còn có tính chất cải
tạo đất, góp phần tăng năng suất và chất lượng các cây trồng khác.
Đậu cô ve có đặc tính chung là cây ưa khí hậu mát, mưa ít, nếu thời tiết
nắng nóng sẽ cho ít quả. Đặc biệt, nếu gặp hạn vào giai đoạn ra hoa, việc đậu quả
và năng suất sẽ giảm đáng kể.
Hạn gây ra sự thiếu nước ở thực vật, có thể do nhiệt độ quá thấp hay nồng
độ dịch đất quá cao, ẩm độ quá thấp hay nhiệt độ cao, gió mạnh. Do đó, hạn gây
ra tác động xấu đến sự sinh trưởng và phát triển của cây đậu cô ve nói riêng và

cây trồng nói chung, làm giảm năng suất và phẩm chất hạt.
Dưới ảnh hưởng của hạn hán, để tiếp tục thích nghi thực vật phải có cơ
chế để bảo vệ tế bào, ổn định sức trương nhằm chống lại sự mất nước do hạn hán
gây ra. Một trong những cơ chế điều chỉnh áp lực nội tại là sự tích lũy các chất
tan thích hợp có khả năng tạo ra áp suất thẩm thấu trong tế bào, các chất này bao
gồm nhóm các axit amin, các hợp chất amôn bậc 4, hợp chất sunfonium bậc 3
Theo kết quả nghiên cứu ở nhiều tác giả (Bùi Huy Thiện (1979) [25] Chen T.H,
Murata N (2002) [31]; Delauley A.J and Verma DPS (1993); Ketchum R.E.B et
al…(1991) [34]) sự tích lũy proline sẽ khởi động tính chịu stress nước. Proline




4
được xem như một chất chỉ thị về khả năng chịu hạn của thực vật . Vì vậy, sự
tích lũy proline là biểu hiện của phản ứng thích nghi của thực vật khi bị stress
nước.
Các công trình nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới về vai trò của
proline trong tính chịu hạn đều thống nhất quan điểm cho rằng proline là chất chỉ
thị về khả năng chịu hạn của thực vật [7][25] [29][31][34][35][37][40]. Tuy
nhiên, để đi sâu vào nghiên cứu sự biến động hàm lượng proline ở đối tượng cây
đậu cô ve trong quá trình gây hạn thì cho đến nay vẫn chưa có tài liệu nào công
bố.
Vì những lí do trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu động thái
hàm lượng proline ở cây đậu cô ve (Phaseolus vulgaris) trong điều kiện gây
hạn ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau”
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu tác động của gây hạn đến sự biến động proline ở lá và rễ của
đậu cô ve.
So sánh mức độ biến thiên giữa pha gây hạn và pha hồi phục

So sánh proline ở các thời kỳ khác nhau khi gây hạn.
Nghiên cứu ảnh hưởng của hạn đến một số chỉ tiêu năng suất và chất
lượng hạt.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
Nghiên cứu sự biến động hàm lượng proline ở các giai đoạn khác nhau và
các pha khác nhau khi gây hạn.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành trên đối tượng là cây đậu cô ve A.
5. Phương pháp nghiên cứu




5
Phương pháp thực nghiệm trên đồng ruộng
6. Giả thuyết khoa học
Proline được xem như chất “chỉ thị” về khả năng chịu hạn của thực vật, nó
có vai trò như chất bảo vệ tế bào khi cây bị hạn. Vì vậy, khi cây bị hạn hàm
lượng proline sẽ biến động theo một quy luật nhất định. Hàm lượng có thể đạt
cao nhất vào một thời điểm nào đó khi tế bào vẫn có khả năng trao đổi chất bình
thường.
Ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau khi bị hạn, sự tích lũy và biến động
proline là khác nhau.

NỘI DUNG
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc tính sinh học và nhu cầu về nước của đậu cô ve
1.1.1. Đặc tính sinh học




6
Đậu cô ve là cây một năm, thân thảo, rễ chính phát triển tốt, rễ phụ có
nhiều nốt sần tập trung ở độ sâu khoảng 20cm. Bộ rễ có rất nhiều vi khuẩn cố
định đạm từ khí trời để nuôi cây nên không yêu cầu bón nhiều phân đạm. Cây
đậu có thể trồng được trên đất thiếu đạm, sau khi cây chết đạm do vi khuẩn cố
định được hoàn trả lại cho đất [11] [26].
Thân có 2 dạng: thân sinh trưởng hữu hạn và thân sinh trưởng vô hạn.
Thân sinh trưởng hữu hạn (đậu lùn) cao 30-60 cm, giới hạn bởi chùm hoa ở
ngọn, cây ít nhánh, thời gian sinh trưởng ngắn, cho thu hoạch ít lứa. Thân sinh
trưởng vô hạn (đậu leo): thân tiếp tục mọc dài ra sau khi trổ hoa, dài 2-7m,
không có chùm hoa ở ngọn, nhánh phát triển mạnh ở nách lá, thời gian sinh
trưởng dài, thu hoạch nhiều lứa.
Lá kép có 3 lá phụ với cuốn dài, mặt lá có ít lông tơ. Chùm hoa mọc ở
nách lá trung bình có 2-8 hoa. Sau khi trồng 35-40 ngày đã có hoa nở, hoa lưỡng
tính tự thụ phấn khoảng 95% nên việc để giống rất dễ dàng. Hoa có 5 cánh rời
gồm 1 cánh cờ to ở phía sau và 2 cánh bướm ở 2 bên, 2 cánh lườn nhỏ ở phía
trước, nhị đực gồm 9 dính và 1 rời, nhụy cái với vòi nhụy ngắn. Chùm hoa xuất
hiện khi cây có khoảng 4-8 đốt, ra hoa từng đợt.
Quả ăn tươi thu hoạch từ 13-15 ngày sau khi hoa nở. Quả non có màu
xanh khi chín có màu vàng nâu, có một tâm bì. Quả khô không tự mở mà gãy

thành khúc, mỗi khúc chứa một hạt. Hạt to, hình bầu dục, trọng lượng 1000 hạt
từ 650-1000g.
1.1.2. Nhu cầu về nước
Nước vừa là sản phẩm khởi đầu, trung gian và cuối cùng của các quá trình
chuyển hóa, vừa là môi trường để các phản ứng trao đổi chất xảy ra. Mức độ
thiếu hụt nước càng lớn thì càng ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát




7
triển của cây: thiếu nước nhẹ làm giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu trầm trọng thì
dẫn đến biến đổi hệ keo nguyên sinh chất, tăng quá trình già hóa tế bào. Khi bị
khô kiệt nước nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào, mô bị tổn
thương và chết [26].
Cây họ đậu nói chung tiêu hao khá nhiều nước. Thời kì đòi hỏi nước nhiều
nhất là lúc nảy mầm, cây ra hoa và có quả non. Giai đoạn nảy mầm cần từ 100-
150% so với trọng lượng hạt. Trong thời kì ra hoa và đậu quả nếu không cung
cấp đầy đủ nước cho cây sẽ tạo điều kiện hình thành tầng rời ở cuống hoa, làm
cho hoa rụng. Thiếu nước cây còi cọc, thu hoạch ít lứa, quả nhỏ nhiều xơ, năng
suất và phẩm chất đều kém. Ở những vùng khô hạn biện pháp tưới phun mưa và
tưới rãnh vào thời kì này làm tăng năng suất của cây rất rõ.
Tuy nhiên, khi nước trong đất quá nhiều sẽ làm cản trở quá trình hô hấp
của hệ rễ, làm cho sức hút dinh dưỡng và sức hút nước của hệ rễ bị cản trở, quá
trình trao đổi chất của cây gặp khó khăn, rễ bị thối. Nước nhiều trong đất còn
gây trở ngại cho hoạt động của nhóm vi sinh vật hiếu khí. Thừa nước làm cho
hoa và quả non rụng nhiều, cây dễ mắc bệnh.
Ảnh hưởng của thiếu nước đến từng giai đoạn sinh trưởng cũng khác
nhau, thiếu nước giai đoạn ra hoa làm giảm năng suất, thiếu nước giai đoạn hình
thành quả sẽ ảnh hưởng đến năng suất và phẩm chất hạt.

1.2. Hạn và tình hình nghiên cứu tính chịu hạn ở cây họ Đậu
1.2.1. Hạn
Hạn đối với thực vật là khái niệm để chỉ sự thiếu nước của thực vật do môi
trường gây nên trong suốt quá trình hay trong từng giai đoạn. Do thiếu nước,
lượng nước cây hút vào không đủ bù đắp lượng nước bay hơi đi qua các bộ phận
trên mặt đất, làm cho cây mất cân bằng nước và bị héo [12].




8
Mức độ tổn thương do hạn gây ra cũng khác nhau: phát triển bình thường,
chậm phát triển thậm chí gây chết. Những cây trồng có khả năng duy trì sự phát
triển và cho năng suất tương đối ổn định trong điều kiện khô hạn là cây chịu hạn
và khả năng thực vật có thể giảm thiểu mức độ tổn thương do thiếu hụt nước gây
ra gọi là tính chịu hạn.
Hạn là yếu tố quan trọng bậc nhất ảnh hưởng đến an toàn lương thực của
thế giới và điều này đã từng xảy ra trong quá khứ. Tài nguyên nước phục vụ cho
nông nghiệp không phải là vô tận khi nhu cầu nước phục vụ cho dân sinh và phát
triển công nghiệp đang ngày càng tăng lên. Do đó vấn đề khan hiếm nước phục
vụ cho nông nghiệp đang được dự báo rất cấp thiết trên quy mô toàn cầu.
Hạn được xem như là một hậu quả nghiêm trọng của sự suy giảm nguồn
nước. Bất kì một loại cây trồng nào cũng phải cần có nước để duy trì sự sống,
sinh trưởng và phát triển. Mức độ cần nước phụ thuộc vào từng loài cây và từng
giai đoạn khác nhau trong sự phát triển của chúng.
1.2.1.1. Các loại hạn đối với thực vật
* Hạn không khí xảy ra khi cây gặp độ ẩm không khí thấp dưới 65% làm
quá trình thoát hơi nước của cây quá mạnh dẫn đến cây mất cân bằng nước. Hiện
tượng này thường gặp ở những tỉnh miền Trung nước ta vào những đợt gió Lào
và ở vùng Bắc bộ vào cuối thu đầu đông, ở một số nước khác hiện tượng này

cũng ảnh hưởng đến các cây trồng như đậu tương, cam, chanh, phong lan [22].
Hạn không khí nói chung ảnh hưởng đến các bộ phận trên mặt đất của cây,
gây ra hiện tượng héo tạm thời. Hạn không khí gây hại nhất ở giai đoạn nảy mầm
và giai đoạn ra hoa, làm cho hạt phấn không nảy mầm mà khô chết, quá trình thụ
tinh không xảy ra làm cho quả không hình thành.




9
* Hạn đất xảy ra khi lượng nước dự trữ cho cây hấp thu trong đất bị cạn
kiệt nên cây không hút đủ nước và mất cân bằng nước. Hiện tượng này thường
xảy ra với các vùng có lượng mưa trung bình rất thấp và kéo dài nhiều tháng
trong năm.
* Hạn sinh lý xảy ra do trạng thái sinh lý của cây không cho phép cây hút
nước mặc dù môi trường không thiếu nước, rễ không lấy được nước nhưng quá
trình bay hơi nước vẫn diễn ra nên cây mất cân bằng nước. Ví dụ, khi đất yếm
khí thiếu oxi cho rễ hô hấp nên thiếu năng lượng cho cây hút nước, hay khi nồng
độ dung dịch trong đất quá cao làm cho áp suất thẩm thấu của đất tăng lên cao
làm cho cây không hút được nước của đất vào rễ. Mức độ hạn phụ thuộc vào sự
bốc hơi trên bề mặt và khả năng giữ nước của đất. Loại hạn này thường gây ra
hiện tượng héo lâu dài và có thể xảy ra ở bất cứ vùng nào hay gặp ở những vùng
có khí hậu, địa hình đặc thù như sa mạc ở Châu Phi, đất trống đồi trọc ở Châu Á,
mùa ít mưa và nhiệt độ thấp ở Châu Âu. Hạn tác động trực tiếp vào hệ thống rễ
của cây, gây ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây.
Khi có cả hạn đất và hạn không khí xảy ra cùng một lúc. Do đó, cây mất
nước mạnh, làm cho nồng độ dịch bào tăng nhanh, dẫn đến cây thường bị héo
vĩnh viễn không có khả năng phục hồi.

1.2.1.2. Tính chịu hạn ở thực vật

Tính chịu hạn là khả năng chống chịu được với sự thiếu nước của cây,
hiện tượng mất nước ở cây có thể do tác động sơ cấp do thiếu nước ở đất hoặc có
thể do sự tác động thứ cấp được gây nên bởi nhiệt độ cao hay thấp, tác động của
muối và nhiều yếu tố khác…




10
Cũng như các loại cây trồng khác, những giống đậu tương chịu hạn tốt
chống lại hoặc hạn chế sự mất nước bằng những biến đổi về hình thái hay những
phản ứng sinh hóa phù hợp.
Cơ thể thực vật đã sử dụng rất nhiều khả năng có thể khi tiếp xúc với
những điều kiện môi trường không thuận lợi. Trong sự phụ thuộc vào các yếu tố
tác động như thời gian tác động, cường độ tác động, thực vật có nhiều sự thích
nghi đặc biệt như là sự tạo thành một hệ thống rễ rộng lớn, sự chống chịu khô
hạn của lá bằng cách làm giảm diện tích lá, hay giảm sự thoát hơi nước qua
màng cuticun, đóng lại của khí khổng, tăng cường độ dẫn nước, tạo thành những
kho chứa nước, hình thành tuyến muối. Ngoài ra, cũng nhận thấy có cả sự biến
đổi của các chất trong cơ thể thực vật như sự tập trung của các chất hòa tan.
Có hai cơ chế bảo vệ của thực vật chống lại sự mất nước là cơ chế tránh
mất nước và cơ chế chịu mất nước. Tránh mất nước phụ thuộc vào sự thích nghi
đặc biệt về hình thái và cấu trúc của rễ nhằm giảm thiểu sự mất nước. Bộ rễ khỏe
là một điều kiện để tăng tính chịu hạn của cây, các rễ phụ với bề mặt lông hút
phát triển mạnh có khả năng giữ ẩm cho cây lâu hơn [26]. Diện tích lá của cây
giảm khi gặp hạn là phản ứng nhằm giảm thiểu sự thoát hơi nước ở lá [36]. Do
vậy, cũng như nhiều cây trồng khác, ở đậu cô ve cùng với những thay đổi về
hình thái, các phản ứng sinh lý về hô hấp, quang hợp, cường độ thoát hơi nước
của đậu cô ve cũng thay đổi theo hướng giảm thiểu để phù hợp với sự giảm thế
nước trong lá cây khi bị hạn.

Thông thường phản ứng của cây khi gặp hạn là khí khổng đóng lại để
ngăn chặn sự thoát hơi nước ra ngoài. Quá trình đóng mở khí khổng liên quan
đến hàng loạt các quá trình khác như quang hợp, hô hấp, trao đổi ion, hấp thu




11
dinh dưỡng…Khi mất nước nặng nề khí khổng không còn khả năng đóng lại, hơi
nước tự do thoát ra ngoài dẫn đến tình trạng cây mất nước, héo và chết.
Cơ chế tự điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào thông qua tích lũy các
chất hòa tan, các protein và axit amin, ví dụ như proline, mannitol, fructans,
glyxin betain và K
+
, các enzym phân hủy các gốc tự do… nhằm duy trì lượng
nước tối thiểu trong tế bào. Cơ chế chịu mất nước liên quan đến những thay đổi
hóa sinh trong tế bào nhằm sinh tổng hợp ra các chất bảo vệ hoặc nhanh chóng
bù lại sự thiếu hụt nước [26][29][31]. Hầu hết thực vật khi sống trong điều kiện
bình thường có hàm lượng proline rất nhỏ ở trong tế bào và các tổ chức. Nhưng
dưới ảnh hưởng của điều kiện khắc nghiệt như hạn hán, thực vật sống đã thể hiện
rõ ràng sự biến đổi trong sự trao đổi chất của của các aminoaxit, đặc biệt là các
aminoaxit tự do như: alanin, glutamin, asparagin, proline trong đó proline
chiếm trên 50% của hàm lượng tất cả các aminoaxit nói trên [25]. Ngoài các
aminoaxit, một số protein cũng tham gia vào sự biến đổi trao đổi chất để chống
chịu với sự mất nước.
Người ta cũng tìm thấy sự tăng proline ở thực vật dưới ảnh hưởng của
thiếu hụt nước trong đất, sự tập trung proline đã được chú ý tới không chỉ ở thực
vật chịu mặn mà còn có thể nhận thấy ở tất cả các thực vật khi có sự mất nước.
Vai trò và chức năng của các chất xuất hiện khi thực vật bị thiếu hụt nước
(bảng 1.1) [22]

Bảng 1.1. Chức năng của một số hợp chất hình thành khi cây thiếu nước
Nhóm
chất
Tên và hợp chất Chức năng
Ion

K
+

Điều chỉnh áp suất thẩm thấu
Loại bỏ và thu nhận Na
+




12

Protein


Axit amin

Đường

Polyol


Polyamine
Amin bậc

4



Sắc tố và
carotenoid

LEA/dehydrin
Osmotin
SOD/catalase
Proline
Ectoine
Saccharose
Fructans
Acyclic (mannitol)
Cyclic (pinitol)

Spermine, spermidine
Glyxinbetaine
β-Alanine betaine
Dimethyl-synfonio
propionate
Carotenoids,
anthocyanins,
betalaines
Điều tiết các chất dinh dưỡng chính
Điều chỉnh áp suất thẩm thấu
Các protein hình thành dưới điều kiện
bất lợi
Phân giải gốc tự do

Điều chỉnh áp suất thẩm thấu
Các chất duy trì thẩm thấu
Điều chỉnh áp suất thẩm thấu
Bảo vệ các chất thẩm thấu, dự trữ cacbon

Dự trữ cacbon, điều chỉnh áp suất thẩm
thấu
Các chất duy trì thẩm thấu, điều chỉnh áp
suất thẩm thấu, loại bỏ gốc tự do
Cân bằng ion, bảo vệ chất nhiễm sắc
Bảo vệ thẩm thấu
Bảo vệ thẩm thấu
Bảo vệ thẩm thấu

Chống lại quang ức chế
Tác dụng bảo vệ tế bào trong điều kiện bị mất nước của các phản ứng hóa
sinh là đảm bảo sự khử độc các sản phẩm được tạo nên trong quá trình phân giải
các hợp chất cao phân tử, hoặc xúc tiến sự phục hồi các cấu trúc phân tử bị hư
hại. Sau khi hạn ngừng tác động, các quá trình phục hồi diễn ra nhanh nếu bộ
gen được bảo tồn khỏi sự hư hại trong thời gian khô hạn. Nhờ có sự tham gia của
protein đặc hiệu mà ADN chỉ bị biến đổi khi ở điều kiện hạn kéo dài. Cơ chế




13
phân tử của khả năng chịu hạn có liên quan đến các chất và các gen tương ứng.
Chúng có vai trò bảo vệ các phức enzym, các cấu trúc trong tế bào, đồng thời
đào thải các chất bị biến tính có khả năng gây độc khi tế bào gặp yếu tố cực
đoan. Những nhóm chất được quan tâm là protein sốc nhiệt (HSP-heat shock

protein) trong đó có các chất môi giới phân tử (molecular chapeone), ubiquitin,
protease. Nhóm môi giới phân tử có vai trò rất quan trọng, chúng tham gia vào
việc cấu trúc đúng cho protein mới tổng hợp, sửa chữa và tạo cấu trúc đúng cho
protein bị biến tính do tác động của điều kiện cực đoan [5][13][18]. Tham gia
vào việc bảo vệ màng tế bào, cô lập ion có một loại protein được tổng hợp với số
lượng lớn ở giai đoạn cuối của quá trình hình thành phôi, ổn định pH tế bào là
LEA (late embryogenesis abundant protein). Sự tăng hoạt độ của các enzym
SOD (superoxide dismutase), catalase… có chức năng loại bỏ gốc phát sinh
trong tế bào khi gặp điều kiện cực đoan [13].
Như vậy ở đậu cô ve có 2 cơ chế khắc phục ảnh hưởng bất lợi của điều
kiện thiếu nước: một là khả năng thích nghi đặc biệt của cấu trúc hình thái của
bộ rễ và lá để tránh mất nước cho tế bào, hai là khả năng chịu mất nước liên quan
đến những thay đổi tinh vi trong quá trình chuyển hóa của tế bào dẫn đến sự xuất
hiện và tích lũy các chất hòa tan, protein, axit amin đặc hiệu. Sự tích lũy các chất
này không làm ảnh hưởng đến chức năng các hệ enzym trong tế bào. Chúng có
vai trò điều chỉnh áp suất thẩm thấu bằng tác động tổng thể nhờ khả năng giữ và
lấy nước vào tế bào hoặc ngăn cản sự xâm nhập của ion Na
+
, tương tác với lipit
hoặc protein trong màng, ngăn chặn sự phá hủy màng và các phức protein khi
cây bị hạn.
1.2.2. Tình hình nghiên cứu tính chịu hạn của các cây họ Đậu




14
Trong những năm qua có nhiều công trình nghiên cứu về tính chịu hạn của
cây trồng như cây lúa, ngô, lạc, cà chua, đậu tương, đậu xanh… Những nghiên
cứu trên nhiều đối tượng cây trồng đi sâu vào nhiều lĩnh vực khác nhau góp phần

làm phong phú thêm về những ứng dụng thực tiễn để tạo giống cây trồng có bản
chất chịu hạn tốt, thích nghi với điều kiện sinh thái nông nghiệp đa dạng. Các
nghiên cứu đã đi sâu vào các nội dung như: phương tiện hình thái, di truyền chọn
giống, sinh học phân tử…[12][13][15][16][20][21][22]
Khi cây bị hạn, biến đổi hình thái nhiều nhất liên quan đến sự phát triển
của bộ rễ và sự giảm diện tích lá. Bộ rễ to khỏe, làm tăng khả năng hút nước cho
cây, bề mặt các rễ phụ rộng lơn có khả năng giữ ẩm cho cây lâu hơn. Nghiên cứu
trên cây đậu tương khi bị hạn cho thấy, diện tích lá giảm khi gặp hạn, nhằm giảm
thiểu sự thoát hơi nước ở lá.
Tính chịu hạn của cây họ Đậu mang tính đa gen thể hiện qua nhiều đặc
tính như sự phát triển nhanh của bộ rễ, tính chín sớm tương đối và bản chất di
truyền của từng cây nhằm mục đích sử dụng nước tiết kiệm trong quá trình sinh
trưởng và phát triển của cây. Trong chu kỳ sống của cây họ Đậu, tùy vào bản
chất di truyền có thể có giống chịu hạn trong tất cả các giai đoạn phát triển của
cây, có giống chỉ chịu hạn trong từng giai đoạn nhất định.
Đi sâu nghiên cứu tính chịu hạn, các nhà khoa học đã phân lập được các
gen chịu hạn: cADN của dehydrin là một trong những LEA (late embryogenesis
abundant protein: protein được tổng hợp với số lượng lớn ở giai đoạn cuối của
quá trình hình thành phôi, tham gia vào bảo vệ màng tế bào, cô lập ion, ổn định
pH tế bào) bảo vệ tế bào khi bị mất nước.
Hiện nay một nhóm gen đang được quan tâm khi nghiên cứu tính chịu hạn
là nhóm gen phản ứng với ABA, nhóm này có tên là RAB (responsive to abscisic




15
acid). Nhiều kết quả nghiên cứu khẳng định có sự liên quan giữa ABA và các
chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu. Các chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu thường
là protein hoặc axit amin được tổng hợp các gen RAB. Bên cạnh đó cũng có một

số chất hoàn toàn độc lập với ABA, không liên quan đến sự tích lũy chất này khi
cây bị hạn, ví dụ như việc gia tăng mARN của gen dehydrin Mat (một gen đặc
biệt không phản ứng với ABA)
Theo hướng tuyển chọn các giống chịu hạn, Trung tâm nghiên cứu và phát
triên rau Châu Á (AVRDC) từ năm 1986 đã tiến hành với quy mô lớn nhất trong
sự kết hợp điều kiện nhà kính và điều kiện đồng ruộng ở những nơi xảy ra hạn tự
nhiên điển hình nhất, kết quả cho ra đời nhiều giống đậu chịu hạn tốt. Việc đánh
giá và tuyển chọn giống đậu xanh có khả năng chịu hạn tốt trong từng mùa vụ
thích hợp cũng được tiến hành bởi Trung tâm nghiên cứu cây trồng Chinat (Thái
Lan) [24].
Tại Trung tâm Nghiên cứu và Thực nghiệm đậu đỗ, Viện Khoa học kỹ
thuật Nông nghiệp Việt Nam cây đậu tương nhập nội và một số giống địa
phương đã được đánh giá khả năng chịu hạn. Phương pháp đánh giá gián tiếp sơ
bộ chọn giống chịu hạn cho kết quả chịu hạn tốt nhưng năng suất không cao (ví
dụ như: PeL112, Ba Lan, Tiền Đài…)[7][10]. Ngược lại, một số giống địa
phương có năng suất cao nhưng chất lượng hạt kém (ví dụ như: Xanh Bắc Hà,
Khâm Đức). Một số giồng đậu tương chọn tạo bằng phương pháp đột biến có
chất lượng hạt tốt, năng suất cao, kích thước và màu sắc hạt có giá trị thương
phẩm cao đã và đang được đưa vào sản xuất đại trà như DT 84, DT 96) [10].
Trong những công trình nghiên cứu về tính chịu hạn của đậu tương ở Việt
Nam trong những năm qua phải kể đến các đóng góp của các thầy cô giáo thuộc
trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2: PGS.TS Nguyễn Văn Mã nghiên cứu đến




16
khả năng chịu hạn của một số giống, dòng đậu tương trên đất bạc màu [15], khả
năng chịu hạn của đậu tương khi sử lí phân vi lượng ở thời điểm khác nhau [14],
so sánh động thái hình thành nốt sần ở một số giống dòng đậu tương khác nhau

[9], đánh giá khả năng chịu nóng của một số mẫu đậu xanh [16]. Điêu Thị Mai
Hoa và cs [7] nghiên cứu sự biến động hàm lượng proline trong mầm và lá đậu
tương
Mặt khác, các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng đặc tính chống chịu là một tính
trạng rất phức tạp, mang tính đa gen. Mối quan hệ giữa tính chịu hạn và các chỉ
tiêu sinh lý thể hiện rất rõ nhất là: thời gian sinh trưởng, chiều cao cây, khối
lượng hạt, số hạt/quả, chiều dài quả, số quả/cây.
1.3. Proline và vai trò của proline đối với tính chịu hạn của thực vật







Công thức cấu tạo


Cấu trúc không gian

Proline hay α-pirolidin cacboxylic là một α- iminoaxit ưa nước có công
thức phân tử C
3
H
9
NO
2
, có mạch bên là hidrocacbua khác với các axit amin khác
ở chỗ có nhóm amin bậc 1 ở C
α

liên kết với C mạch bên tạo thành vòng pirolidin.
Proline được tổng hợp từ L-glutamat bởi enzym chìa khóa δ-pyrrolin-
cacboxylat-synthetaza (P5CS), enzym này được điều hòa bởi proline thông qua




17
cơ chế ức chế ngược. Thực vật chịu stress nước, sự điều hòa ngược này đã biến
mất và đây có thể là nguyên nhân làm tăng tích lũy proline dưới các điều kiện
stress.
Theo Delauley A.J và Verma D.P.S (1993) [32][35] con đường tổng hợp
proline ở thực vật diễn ra như sau










Như đã trình bày ở trên proline là chất có khối lượng phân tử nhỏ được
xem là chất có khả năng tạo ra áp suất thẩm thấu cao bao gồm nhóm hợp chất
các amin bậc 4 (glyxinbetain, prolinbetain, B-alaninbetain và cholin-oxy-
sunfate) và nhóm hợp chất bậc 3 (DMSP - dimethylsunfoniopropionate). Các
hợp chất này có chung tính chất là không tích điện ở pH trung tính (như các ion
vô cơ) và có khả năng hòa tan tốt trong nước, nó xâm nhập vào lớp vỏ hidrat của
các protein hình cầu có xu hướng bị đẩy ra khỏi lớp vỏ hydrat của protein hình

cầu và do đó làm ổn định cấu trúc cuộn gấp của protein. Do đó, chúng được cho
là đóng vai trò then chốt trong sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu ở tế bào thực vật
để trả lời các stress thẩm thấu.




18
Hơn nữa các chất này không độc khi tập trung với nồng độ cao và làm ổn
định cấu trúc của các phân tử protein, giúp thành tế bào chống lại ảnh hưởng của
sự tập trung muối cao và các chất tan có hại cho tế bào….[35] [41]. Sự tích lũy
các chất đó có ý nghĩa quan trọng, bởi chúng đóng vai trò lòng cốt trong việc
duy trì sức trương của tế bào và hấp thụ nước ngược gradien nồng độ dưới điều
kiện stress (Balibrea et al., 2000; Naidoo and Naidoo, 2001; Rontein et al.,
2002)[37] [42]
Phân tử proline có cấu trúc vòng, cấu trúc này tạo cho proline một hình
dáng vững chắc hơn các axit amin khác. Như vậy, vai trò proline trong chống
chịu stress nước ở thực vật thể hiện ở việc proline tham gia điều chỉnh áp suất
thẩm thấu nội bào và tham gia vào cấu trúc bảo vệ màng tế bào và protein.
Sự tích lũy proline là một phản ứng chuyển hóa thông thường ở thực vật
trong điều kiện thiếu hụt nước đây là chủ đề được các nhà khoa học nghiên cứu
hơn 20 năm qua (Ketchum,Warren and Nabors ,Stewart and Larher, Thompson,
Stewart, Hanson and Hitz, Rhodes, Delauley and Verma, Samaras, Taylor [32]
[34] [44])
Iminoaxit có khả năng hòa tan mạnh trong nước, nó được tích lũy nhiều
trong lá cây của nhiều loài thực vật bậc cao ưa mặn. Proline được tích lũy trong
mô lá, mô phân sinh chóp rễ được rèn luyện trong điều kiện stress nước, tích lũy
trong hạt phấn bị làm khô, ở vùng chóp rễ đang sinh trưởng nơi thế năng nước
thấp và những tế bào thực vật nuôi cấy trong huyền phù đã thích nghi với stress
nước hay stress muối.

Đã có nhiều công trình nước ngoài nghiên cứu trên nhiều đối tượng thực
vật khác nhau để tìm hiểu về cơ chế tổng hợp và chuyển hóa proline liên quan
đến vai trò của proline đến cơ chế chống chịu hạn của thực vật và kết luận:




19
proline bảo vệ màng tế bào và protein chống lại ảnh hưởng bất lợi của sự tập
trung cao các ion vô cơ và nhiệt độ. Proline cũng có thể có chức năng như là
protein thẩm thấu, ưa nước và như một gốc hydroxyl. Trong dòng tế bào thuốc lá
được nuôi cấy thích nghi với nồng độ 428 mM NaCl, proline chiếm trên 80%
axit amin tự do (Rhodes and Handa, 1989) [41]. Người ta thừa nhận rằng có sự
phân bố đồng đều proline trong toàn bộ thể tích nước ở nội bào, kết quả xác định
axit amin tại thời điểm này vượt quá 129 mM. Tuy nhiên, nếu chỉ hạn chế trong
nội bào thì sự tích lũy proline có thể vượt quá nồng độ 200 mM trong các tế bào
này vì thế nó góp phần căn bản vào việc điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào
(Binzel et al., 1988) [30]. Tương tự như vậy sự tích lũy proline nội bào các tế
bào ở cỏ Distichlis spicata trong điều kiện stress muối (xử lý ở nồng độ 200 mM
NaCl) ước tính trên 230 mM (Ketchum et al., 1991) [34]. Còn trên cây thuốc lá
tác giả Kishor P.B.K và CS (1995) [35] nghiên cứu cây thuốc lá được chuyển
gen (gen liên quan đến tổng hợp proline – P5CS) trong điều kiện hạn nước, hạn
muối kết quả cho thấy hàm lượng proline gấp 10-18 lần so với đối chứng. Thực
vật được chuyển gen P5CS là cây đậu tương cũng được nghiên cứu cho thấy
dòng được chuyển gen P5CS có khả năng chịu hạn tốt hơn dòng không được
chuyển gen.
Ngoài ra, các nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác cũng cho kết quả
tương tự.
Sự tích lũy proline để phản ứng lại stress nước và stress muối hầu như tập
trung ở dịch bào. Đôi khi sự tích lũy proline để phản ứng lại sự khan hiếm nước

cần có mặt của axit abscisis [26] [44]
Mặc dù hàm lượng proline ở thực vật dưới ảnh hưởng của thiếu hụt nước
tăng lên mạnh, nhưng một khối lượng proline vẫn giảm đi để tạo nên sự biến đổi




20
về căn bản thế thẩm thấu của tế bào. Điều đó phù hợp với một số dẫn chứng rằng
hàm lượng proline xuất hiện bởi sự kích thích của những yếu tố khắc nghiệt thì
một phần lớn tập trung ở tế bào chất, ở đây nó có vai trò đặc biệt quan trọng
trong điều hòa áp suất thẩm của tế bào chất [30][35][43]. Các chất tan làm tăng
tính thẩm thấu của tế bào do các chất này đối lập với các protein của các hợp
chất bên trong nguyên sinh chất. Các chất thẩm thấu ở nồng độ cao cũng không
làm biến đổi hoạt tính của hệ men, do đó nó có thể bảo vệ cho chất nguyên sinh
chống mất nước.
Một số công trình đã nhấn mạnh sự tăng proline có liên quan với sự bắt
đầu giảm bớt sinh trưởng ở thực vật [25]. Người ta cũng nhận thấy có mối liên
quan giữa tập trung proline trong những thí nghiệm về sự sinh trưởng của thực
vật với các chất kìm hãm hoặc ức chế (CCC, ABA) [35][43]
Ở Việt Nam đã có một số tác giả nghiên cứu về vai trò của proline đối với
tính chịu hạn của cây trồng cũng cho các kết quả khả quan. Tác giả Đinh Thị
Phòng (2003) bằng việc xử lý lạnh, mặn, hạn trên các giống lúa đã cho thấy mối
tương quan giữa tính chống chịu của cây với sự gia tăng hàm lượng proline ở các
giống lúa nghiên cứu [22]. Trên các đối tượng đậu xanh, cà chua khi nghiên cứu
cũng cho thấy sự tích lũy hàm lượng proline trong điều kiện stress tương ứng
Điêu Thị Mai Hoa và cs, (2005) [7]; Trương Thị Bích Phượng và cs, (2003) [23].
Trong đỉnh rễ ngô khi thiếu nước, proline là chất hòa tan chủ yếu đạt tới
120 mM trong rễ đang phát triển ở thế năng nước -1,6 Mpa, do đó góp phần đáng
kể điều chỉnh áp suất thẩm thấu (gần 50%). Mặc dù vậy cho đến nay người ta

vẫn chưa biết sự tích lũy proline trong vùng chóp rễ là kết quả của sự tăng cường
vận chuyển proline đến theo mạch phloem hay sự tổng hợp mới.




21
Sự tổng hợp proline như là một quá trình hóa học làm giảm tính axit của tế
bào và duy trì tỷ lệ NADP
+
/NADPH ở giá trị thích hợp với sự trao đổi chất. Tốc
độ phân giải proline tùy thuộc vào mức độ giải phóng stress của cây trồng [39].
Như vậy, proline có ảnh hưởng lớn đến tính chịu hạn ở thực vật, sự tổng hợp
proline diễn ra khi cây sống trong điều kiện thiếu nước, muối…Do đó, có thể
xem axit amin này như một chất chỉ thị về khả năng chịu hạn của thực vật hay
nói cách khác sự tích lũy proline là biểu hiện của phản ứng thích nghi ở thực vật
với điều kiện stress. Sự tăng proline dẫn đến tăng tính chống chịu của thực vật
trước những điều kiện khắc nghiệt, người ta cũng đã chứng minh được rằng tính
chống chịu của thực vật phụ thuộc vào hàm lượng proline của nó [25] [40]. Sự
cung cấp proline cho thực vật từ bên ngoài vào có thể làm nâng cao tính chống
chịu của nó. Ở những thực vật bình thường có sự tập trung proline ở ngay điều
kiệt khắc nghiệt ít hơn ít hơn ở thực vật chịu đựng. Từ đó cho thấy sự tập trung
proline có hiệu lực cho thực vật có tính chống chịu thấp, điều này phù hợp với
nghiên cứu thu được là cùng với tập trung proline và ảnh hưởng của điều kiện
khắc nghiệt xuất hiện sự kìm hãm sinh trưởng ở thực vật [25].




Chương 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu




22
Nghiên cứu được tiến hành trên đối tượng là cây đậu cô ve A được trồng
phổ biến ở nước ta. Hạt giống được cung cấp bởi Trung tâm nghiên cứu và thực
nghiệm đậu đỗ - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam.
2.2. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm trồng cây trong chậu: Chậu có kích thước 35

45 cm, mỗi
chậu gieo 6 hạt. Hạt được trồng trong các chậu thí nghiệm. Chia các chậu thí
nghiệm làm 4 công thức thí nghiệm (CTTN): lô đối chứng (ĐC), lô gây hạn ở
thời kỳ cây non, lô gây hạn ở thời kỳ ra hoa, lô gây hạn ở thời kỳ quả non. Mỗi
CTTN được nhắc lại 7 lần với tổng số chậu phải trồng là 124 chậu.
Đảm bảo chế độ chăm sóc đồng đều đến ngày thứ 14-15 sau khi gieo, lá
mầm rụng đi, cây thực sự bắt đầu cuộc sống tự dưỡng (khi cây có 3-5 lá thật) sau
đó tiến hành gây hạn.
Phương pháp gây hạn: lô đối chứng vẫn được tưới nước bình thường, lô
thí nghiệm không được tưới nước và cách ly với nước mưa cho đến khi đôi lá
dưới cùng của cây có triệu chứng héo. Trong quá trình gây hạn tiến hành thu
mẫu (lấy lá thứ 3 từ đỉnh sinh trưởng) vào buổi sáng 8h. Đây là lá trưởng thành
của cây thực hiện đầy đủ chức năng quang hợp, sinh tổng hợp và chuyển hóa các
chất cho cây. Sau đó xác định hàm lượng proline.
Ở giai đoạn chuẩn bị ra hoa, tiến hành gây hạn và xác định chỉ tiêu tương
tự như giai đoạn cây non.
Khi quả hình thành hạt non, lấy số liệu về chiều dài quả và số quả trên

cây. Khi quả chín, thu hoạch để lấy số liệu khối lượng 100 hạt và xác định hàm
lượng nitơ tổng số trong hạt.
2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 2 đến tháng 5 năm 2009




23
Địa điểm nghiên cứu được tiến hành tại Trung tâm hỗ trợ nghiên cứu khoa
học và chuyển giao công nghệ và khu nhà lưới thí nghiệm thuộc khoa Sinh –
KTNN trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
2.4. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu
2.4.1. Hàm lượng proline
* Lý thuyết của máy đo quang phổ (Spectrophotometer)
Những hợp chất có màu là do trong phân tử có chứa các nhóm mang màu
là các liên kết đôi, liên kết ba và nhóm trợ màu là các hệ liên hợp
Theo lý thuyết MO-Huckel (thuyết obital phân tử): liên kết trong nhóm
mang màu là kết quả của sự phân bố các electron vào các MO. Phân tử sẽ hấp
thụ photon có năng lượng E
p
chuyển lên trạng thái kích thích.
E
p
=

hc
=
E
= E

*
- E
cb

Trong đó, E
*
: năng lượng ở trạng thái kích thích
E
cb
: năng lượng ở trạng thái cơ bản của phân tử
H: Hằng số Planck
C: vận tốc ánh sáng

: bước sóng của ánh sáng kích thích
Năng lượng kích thích phụ thuộc vào cấu trúc electron của phân tử hay
phân tử chỉ hấp thụ tia sáng có bước sóng nhất định, đặc trưng cho phân tử. Khi
đưa một dải photon trong vùng tử ngoại khả kiến UV (ultraviolet-visible spectre,
UV-VIS) qua dung dịch chiết, sẽ cho ta một phổ UV-VIS đặc trưng cho cấu trúc
phân tử. Do đó có thể sử dụng phổ UV-VIS để nghiên cứu cấu trúc phân tử hữu
cơ nói chung và các hợp chất màu nói riêng. Dựa vào phổ UV của phân tử ta có
thể biết bước sóng hấp thụ đặc trưng của của phân tử đó, tươnng ứng với các




24
pick trên phổ UV. Theo những nghiên cứu cho thấy phân tử proline hấp thụ tia
sáng có bước sóng 520nm.
Nguyên tắc hoạt động của máy đo quang phổ spectrophotometer
Nguồn sáng - Bộ tách sóng -

Cuvet mẫu - Bộ phân tích - Bộ phận in
Mối quan hệ giữa mật độ quang và nồng độ dung dịch
Dựa vào định luật Lambert – Bert:
D

= log
I
Io
= log
T
1
=


C d
Trong đó, D

: mật độ quang đo ở bước sóng


T: độ truyền qua, có giá trị từ 0-100%
C: nồng độ dung dịch, mol/l
I, Io: cường độ bức xạ trước và sau khi ra khỏi dung dịch


: hệ số hấp thụ
d: chiều dày lớp dung dịch hay chiều dày cuvet
Như vậy, với d,



không đổi thì giá trị của D phụ thuộc vào nồng độ C của
dung dịch và bước sóng

khi đó D = f (

), D = f(C)
* Xác định hàm lượng proline theo phương pháp của Bates và cộng sự (1973)
và cải tiến của Đinh Thị Phòng [22]
Lấy mỗi mẫu 0,5 g nghiền kỹ với 5ml dung dịch axit sulfosalicylic.
Thêm 5ml dung dịch axit sulfosalicylic, trộn đều, tráng cối chày bằng 5ml
dung dịch axit sulfosalicylic nữa trộn đều toàn bộ hỗn hợp.
Quay ly tâm 7000 vòng/phút trong thời gian 20 phút, thu lấy dịch trong.
Lấy 2ml dịch chiết cho vào bình (hoặc lọ thủy tinh penixilin, ống nghiệm…),
thêm 2ml axit axetic và 2ml dung dịch nynhydrin-axit (dung dịch này gồm 30ml




25
axit axetic + 1,25g nynhydrin), đậy kín vì axit axetic bay hơi mạnh, ủ trong nước
nóng 100
o
C trong 1 giờ, sau đó ủ trong khay đá 5 phút.
Bổ sung vào bình phản ứng 4ml toluen, lắc đều, lấy phần dịch màu hồng ở
trên đem đo mật độ quang học (OD – Optical density) ở bước sóng

= 520nm
trên máy quang phổ UV - Visible – Spectrophotometer, UV- 2450 do hãng
SHIMADZU – Mỹ sản xuất.

Hàm lượng axit amin proline được tính theo công thức sau:
Y = 1,408

X + 0,014 R
2
= 0,9991
(Công thức được suy ra từ việc lập đường chuẩn proline)
Trong đó:
Y: hàm lượng proline được tính bằng mg/l
X: giá trị mật độ quang học OD đo được ở bước sóng 520 nm.
Quy đổi ra hàm lượng mg/g
R
2
: Là hệ số tương quan.
Y
x
V
A =
P
x
1000
A: Hàm lượng Proline (mg/g)
P: Khối lượng mẫu (g)
V: Thể tích dịch proline chiết được
Tất cả các L-axit amin đều phản ứng màu với nynhydrin tạo thành hợp
chất màu xanh tím, riêng Iminoaxit như proline tạo thành màu vàng với cơ chế
phản ứng phức tạp. Hợp chất màu vàng có cực đại hấp thụ ở bước sóng

=
520nm.

2.4.2. Các yếu tố cấu thành năng suất