Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các chất thứ sinh từ một số loài thực vật Việt Nam (LV00394)

1
MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Ngày nay, khi đời sống kinh tế xã hội của con người ngày càng được
nâng cao và phát triển, vấn đề chăm sóc sức khoẻ con người ngày càng được
quan tâm chú ý. Các ứng dụng khoa học hiện đại trong y học đã giúp phát
hiện, chế tạo nhiều loại thuốc đặc trị những căn bệnh trước kia được xem là
bệnh nan y. Không chỉ dừng lại ở chữa trị, người ta còn đi sâu tìm hiểu
nguyên nhân, cơ chế của bệnh để đưa ra phương pháp điều trị tối ưu. Một
trong những nguyên nhân chính gây ra một số bệnh nguy hiểm ở người, động
vật và thực vật đó là các vi sinh vật.
Hiện nay, chúng ta đã sản xuất trên quy mô công nghiệp rất nhiều loại
kháng sinh tổng hợp cho hiệu quả chữa trị cao đối với các bệnh do vi sinh vật
gây ra. Nhưng, sự lạm dụng kháng sinh tổng hợp lại làm gia tăng khả năng đề
kháng kháng sinh của vi sinh vật. Số kháng sinh mới mà chúng ta đưa vào để
khắc phục vấn đề này còn hạn chế. Do đó, việc phát hiện ra các hợp chất
kháng khuẩn mới có nguồn gốc từ tự nhiên trở thành một hướng nghiên cứu
rất đáng quan tâm. Mặt khác, việc sử dụng các loại thuốc hoá học đang gây ra
các vấn đề về môi trường, về đột biến, về bảo vệ nguồn gen tự nhiên. Rất
nhiều người quan ngại trong việc sử dụng các tác nhân vật lý, hoá học nhân
tạo trong việc chăm sóc sức khoẻ. Người ta bắt đầu hướng đến những sản
phẩm có nguồn gốc thiên nhiên, đặc biệt là các chất chiết xuất từ thực vật.
Từ lâu, nhiều hợp chất tự nhiên từ thực vật đã được sử dụng theo kinh
nghiệm dân gian để điều trị bệnh rất có hiệu quả như tinh dầu gừng, bạc hà,
quế…. Ngày nay, với sự phát triển của Thực vật học, Hoá học, Dược học,
việc xác định các hoạt chất trong cây cỏ dùng làm thuốc đã chứng minh sự
hiệu nghiệm của những kinh nghiệm chữa bệnh dân gian, lấy ánh sáng khoa
2
học hiện đại làm sáng tỏ thực nghiệm khoa học lâu đời của nhân dân [7].
Bằng khoa học thực nghiệm, người ta chỉ ra rằng một số hợp chất trong cây

đặc biệt là các chất thứ sinh có giá trị chữa bệnh. Trong chè xanh, măng
cụt…chứa quercetin có tác dụng diệt khuẩn chữa sâu răng mà không độc với
con người. Silymarin trong cây kê sữa có tác dụng chống oxi hoá và ngăn
ngừa ung thư [26]. Catechin có trong nhiều loài thực vật ngăn chặn và làm
chậm sự phát triển của tế bào khối u [30]. Đồng thời, các hợp chất tự nhiên
của nhiều loài thực vật khác cũng đã được chứng minh là có hoạt tính kháng
sinh chống lại vi khuẩn và vi nấm. Gần đây, nhiều hợp chất tự nhiên còn được
quan tâm và ứng dụng trong các sản phẩm thuốc và mỹ phẩm.
Việc phát hiện, tách chiết và sử dụng các loại hợp chất tự nhiên thực
vật bằng những phương pháp đơn giản (nghiền, sao khô và chiết lấy nước…)
đã được tiến hành từ rất lâu trong y học. Nhưng những nghiên cứu để xác
định và tách chiết các sản phẩm thứ sinh này bằng phương tiện và phương
pháp hiện đại thì chỉ gần đây mới được quan tâm và thực hiện. Để tìm hiểu
thêm và tìm ra các chất thứ sinh trong một số loài thực vật phổ biến ở Việt
Nam, ứng dụng trong việc kháng lại một số vi sinh vật gây bệnh, chúng tôi
lựa chọn vấn đề “Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các chất thứ sinh
từ một số loài thực vật Việt Nam” làm đề tài nghiên cứu trong luận văn Thạc
sĩ.
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của các chất thứ sinh chiết xuất từ
một số loài thực vật; phân tích thành phần và ứng dụng chúng kháng lại một
số vi khuẩn gây bệnh ở thực vật, động vật và người.
2.1. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn dịch chiết đến
sự sinh trưởng và phát triển của một số chủng vi sinh vật.
3
2.2. Khảo sát sơ bộ thành phần hoá học cơ bản trong dịch chiết từ các
đối tượng thực vật.
2.3. Phân lập các nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính trong các mẫu thí
nghiệm.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu

3.1. Đưa ra quy trình chiết, tách các phân đoạn các mẫu lá của 4 loài
thực vật: Ba chạc (Euodia lepta (Spreng) Merr.); Ba đậu (Croton tiglium L.);
Bạc thau (Argyreia acuta Lour.); Khổ sâm (Croton tonkinensis Gragnep.).
3.2. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu.
3.3. Khảo sát thành phần hoá học của các phân đoạn dịch chiết các mẫu
thực vật.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
4.1.Đối tượng
4.1.1.Mẫu thực vật
Bốn loài thực vật: Ba chạc (Euodia lepta (Spreng) Merr.); Ba đậu
(Croton tiglium L.); Bạc thau (Argyreia acuta Lour.); Khổ sâm (Croton
tonkinensis Gragnep.).
4.1.2.Mẫu vi sinh vật
Các vi sinh vật thuộc một số chủng vi sinh vật kiểm định do phòng thí
nghiệm bộ môn Vi sinh vật trường ĐHKHTN, Đại học Quốc gia Hà Nội và
Viện vệ sinh dịch tễ TW Hà Nội cung cấp.
4.2. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của một số phân đoạn dịch chiết
(cao ethanol, phân đoạn n-hexan, phân đoạn chlorofom, phân đoạn
4
ethylacetate) từ 4 mẫu lá cây trên mô hình nuôi cấy vi sinh vật kiểm định
trong phòng thí nghiệm.
5. Phương pháp nghiên cứu
5.1. Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn
Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường thạch đĩa đánh giá hoạt tính
kháng khuẩn.
5.2. Khảo sát thành phần hoá học của 4 mẫu lá cây
Định tính thành phần hoá học của 4 mẫu lá bằng các phản ứng hoá học
đặc trưng.
5.3. Định lượng một số hợp chất tự nhiên trong các mẫu lá thực vật

- Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin- Ciocalteau.
- Phân lập các hợp chất bằng kĩ thuật sắc kí lớp mỏng.
6. Những đóng góp mới của đề tài
- Đưa ra quy trình chiết, tách các phân đoạn từ lá thực vật.
- Phân lập một số hợp chất bằng sắc kí lớp mỏng.
- Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số phân đoạn dịch chiết từ 4
loài thực vật: Ba chạc (Euodia lepta (Spreng) Merr.); Ba đậu (Croton tiglium
L.); Bạc thau (Argyreia acuta Lour.); Khổ sâm (Croton tonkinensis Gragnep.)
đối với một số chủng vi sinh vật.
5
Chương 1
TỔNG QUAN
1.1 VÀI NÉT VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÂY THUỐC
1.1.1. Tình hình nghiên cứu về cây thuốc thế giới
Những năm gần đây, khoa học thế giới đã có những bước tiến dài trong
nhiều lĩnh vực. Trong đó, khoa học nghiên cứu về dược phẩm và chế phẩm
dùng trong điều trị bệnh rất phát triển, đặc biệt ở các nước Mỹ, Anh, Nhật
Bản, Trung Quốc…Họ đã đưa ra trên thị trường rất nhiều sản phẩm thuốc và
thực phẩm chức năng có tác dụng điều trị các bệnh nan y không chỉ đối với
người bệnh mà còn tốt trong việc phòng chống bệnh cho cả người khoẻ mạnh.
Bên cạnh đó, người ta còn đi sâu nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên
có trong nhiều loài thực vật để ngăn ngừa và điều trị các bệnh, đặc biệt là một
số bệnh hiểm nghèo như ung thư, đái tháo đường, nhiễm trùng máu …Các tạp
chí khoa học thế giới, các phòng thí nghiệm y dược và ung thư quốc tế đã
công bố rất nhiều các nghiên cứu về cây thuốc có tác dụng ngăn ngừa và điều
trị ung thư. Người ta đã nghiên cứu về các chất có hoạt tính chống ung thư
trong nhiều loại cây như kê sữa (hợp chất sylimarin), chè xanh, trinh nữ
hoàng cung…[44]. Một số hoạt chất có tác dụng ngăn ngừa và điều trị đái
tháo đường trong cây cỏ ngọt (hợp chất stevirosid), tam thất (gisenoid), nhân
sâm (panaxan), hoàng sâm, lược vàng,… Nhiều loài thực vật chứa các hoạt

chất kháng khuẩn: trinh nữ hoàng cung (chứa lycorin), chè xanh, bạc hà,
hành, tỏi, mùi tây…[28].
1.1.2. Nguồn cây thuốc Việt Nam
Việc sử dụng cây thuốc ở Việt Nam đã có từ rất lâu đời. Từ thực tiễn và
những kinh nghiệm học hỏi từ đông y Trung Quốc đến nay chúng ta biết và
6
sử dụng rất nhiều các loại cây thuốc. Chúng không chỉ chữa các bệnh thông
thường như cảm mạo, sát khuẩn nhiễm trùng mà còn sử dụng trong điều trị
những bệnh nguy hiểm như ung thư, tim mạch,…
Nước ta - một quốc gia có hệ khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm là
điều kiện rất tốt cho sự phát triển của hệ thực vật vô cùng đa dạng và phong
phú. Với khoảng 11.000 loài thực vật bậc cao có mạch, 800 loài rêu, 600 loài
nấm và trên 2.000 loài tảo tạo nên một nguồn nguyên liệu phong phú cho
khoa học Đông y [27]. Nguồn thực vật này đã được cha ông ta khai thác và
chữa bệnh theo kinh nghiệm dân gian từ ngàn xưa.
1.1.3. Tình hình sử dụng và nghiên cứu cây thuốc ở Việt Nam
Đến nay, các nghiên cứu về cây thuốc đã xác định ở Việt Nam có hơn
3.800 loài thực vật và nấm được dùng làm thuốc. Cây thuốc nam có thể chữa
từ những bệnh đơn giản thường gặp đến các bệnh hiểm nghèo thậm chí như
bệnh ung thư, đái tháo đường. Trên thực tế, nhiều bệnh nhân đã được chữa
khỏi những căn bệnh này nhờ sử dụng thuốc nam.
Ở nước ta, khi khoa học về dược liệu và dược phẩm chưa phát triển
mạnh, việc sử dụng thuốc đều dựa vào kinh nghiệm cha truyền con nối và
kinh nghiệm dân gian. Những năm gần đây, nhu cầu chăm sóc sức khoẻ của
con người ngày càng cao thúc đẩy khoa học ứng dụng ngày càng phát triển
đặc biệt là khoa học về thuốc. Trên thế giới, người ta đã tiến hành những
nghiên cứu rất sâu về các hợp chất tự nhiên có khả năng chữa bệnh hiểm
nghèo. Ở Việt Nam, những nghiên cứu về cây thuốc bản xứ cũng đang được
thực hiện và ngày càng phát triển. Hiện nay, chúng ta đã và đang tiến hành
chiết xuất các hợp chất tự nhiên từ nhiều loài thực vật, nghiên cứu tác dụng

dược lý của chúng trên mô hình tế bào, vi khuẩn và trên chuột.
7
Các nghiên cứu về cây thuốc được sưu tập và biên soạn thành nhiều tài
liệu tham khảo [3, 7, 8, 9]. Những nghiên cứu về tác dụng của các cây thuốc
Đông y bao gồm bộ sách “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, Đỗ Tất
Lợi, Nxb Khoa học kỹ thuật, năm 1986; “999 bài thuốc dân gian gia truyền”,
Âu Anh Khâm, Nxb Y học Hà Nội, 1999; “Từ điển cây thuốc Việt Nam”, Võ
Văn Chi, Nxb Y học Hà Nội, năm 1999; “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở
Việt Nam”, Viện dược liệu, Nxb Khoa học kỹ thuật, năm 2004; “Cây thuốc trị
bệnh thông dụng”, Võ Văn Chi, Nxb Thanh Hoá, 2005; “Nghiên cứu thuốc từ
thảo dược”, Bộ giáo dục và đào tạo, Bộ y tế, Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội,
năm 2006…
Tại các trường Đại học, các phòng thí nghiệm, các viện nghiên cứu, các
đề tài nghiên cứu về thảo dược cũng đã và đang được tiến hành. Một trong
những nghiên cứu mới và nổi bật nhất hiện nay là nghiên cứu về cây Trinh nữ
hoàng cung.
1. 2 KHÁI QUÁT VỀ CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ
THỰC VẬT
1.2.1. Các hợp chất thứ sinh và các chất có hoạt tính sinh học
Quá trình trao đổi chất của sinh vật bao gồm sự tạo thành các hợp chất
sơ cấp và hợp chất thứ cấp (còn gọi là hợp chất thứ sinh).
Hợp chất sơ cấp được tạo thành của quá trình đồng hoá và dị hoá, có
vai trò quan trọng đối với cơ thể sống. Nó bao gồm những chất thiết yếu cho
sự sống như các axit amin, các axit nuleic, cacbohidrat, lipit Chúng là trung
tâm của quá trình trao đổi chất, sinh trưởng và phát triển của sinh vật.
Các hợp chất thứ cấp (hợp chất thứ sinh) được tạo thành từ các hợp
chất sơ cấp và các chất trao đổi trung gian của chu trình đường phân, chu
trình pentose-phosphate, chu trình axit citric v.v. Những nghiên cứu ban đầu
8
về hợp chất thứ sinh thấy rằng những hợp chất này chỉ đơn thuần là sản phẩm

thừa trong quá trình trao đổi chất. Nhưng sau nhiều công trình đi sâu nghiên
cứu, người ta đã phát hiện và có những khẳng định mới về vai trò của hợp
chất thứ sinh. Khác với các chất trao đổi bậc nhất, hợp chất thực vật thứ sinh
không phải là yếu tố đặc biệt cần thiết cho quá trình sinh trưởng, phát triển,
quang hợp và sinh sản [50]. Chúng được tạo ra trong những tế bào chuyên
biệt với vai trò điều hoà mối quan hệ qua lại giữa các tế bào trong cơ thể.
Đồng thời chúng là các hợp chất phòng thủ giúp thực vật chống lại các tác
nhân gây bệnh xâm nhiễm thực vật từ môi trường xung quanh [41].
Cơ chế bảo vệ của hợp chất thứ sinh được thể hiện rất đa dạng. Chúng
tạo ra chất độc tác động trực tiếp hoặc gián tiếp đến hệ thần kinh, làm rối loạn
hệ thống trao đổi chất của các vi sinh vật gây bệnh (như các phytoalexin).
Một số khác lại có mùi, vị khó chịu (đắng, chát, cay, hôi…). Các hợp chất
thuộc nhóm terpen gây độc đối với bọ cánh cứng ăn vỏ, ngăn cản sự phát triển
của sâu bướm. Tannin, polyphenol, alkanoid, flavonoid được coi là chất đề
kháng bệnh tật ở thực vật, gây độc cho các loại nấm gây bệnh, ức chế sự sinh
trưởng và phát triển của nhiều vi sinh vật. Chất màu cũng có vai trò khá quan
trọng. Thực vật sử dụng chất này không chỉ để hấp dẫn động vật và côn trùng
thụ phấn mà còn bảo vệ các mô khỏi bị tổn thương bởi tác dụng của tia tử
ngoại, quá trình ion hoá hay quá trình đột biến. Vì vậy, ở một khía cạnh nào
đó có thể coi hợp chất thứ sinh này là những chất có hoạt tính sinh học.
Với sự phát triển của khoa học hiện đại, số lượng hợp chất thứ sinh
được tìm ra ngày càng nhiều. Người ta tiến hành phân loại chúng dựa trên
nhiều tiêu chuẩn khác nhau. Dựa vào bản chất hoá học chia hợp chất thứ sinh
thành các hợp chất phenolic, flavonoid, alkanoid, coumanrin, glycosid, Dựa
vào lịch sử phát hiện và sử dụng, các hợp chất thứ sinh được chia thành 4
nhóm chính [12].
9
- Terpen (gồm isoprenoid, terpenoid, carotenoid,).
- Glycosid (gồm glycosid trợ tim,…).
- Các phenylpropanoid (gồm flavonoid, tanin, lignin,…).

- Các hợp chất chứa nitơ (gồm alkaloid, hợp chất dị vòng thơm,…).
Hiện nay nhiều hợp chất thứ sinh đã được tách chiết và sử dụng để
phòng tránh và điều trị một số bệnh thông thường và cả bệnh hiểm nghèo ở
người. Trong số đó các hợp chất phenolic, flavonoid và alkaloid có nhiều ứng
dụng rất phổ biến nhất. Chúng được bào chế thành các dạng dược liệu hay
được bổ sung vào thực phẩm nhằm nâng cao giá trị dinh dưỡng và tăng cường
khả năng phòng ngừa bệnh tật.
1.2.2. Một số loại hợp chất thứ sinh có hoạt tính sinh học
Chất thứ sinh được tổng hợp trong cơ thể nhiều loài thực vật. Chúng có
thể có ở cây này hoặc cây khác. Vai trò của các chất này đến nay vẫn chưa
được tìm hiểu cặn kẽ. Song nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng chúng có thể tác
động lên nhiều quá trình sinh học của cơ thể sinh vật, đặc biệt là cơ thể vi sinh
vật và côn trùng. Nói cách khác, chúng có hoạt tính sinh học. Nhiều nhóm
hợp chất có hoạt tính sinh học đã được phát hiện và đi sâu nghiên cứu.
1.2.2.1. Một số hợp chất thuộc nhóm carotenoid
Carotenoid là các hợp chất thiên nhiên có màu vàng đến đỏ vàng hoặc
da cam, thuộc nhóm tetraterpen (C
40
H
56
). Trong tự nhiên, có khoảng 70 sắc tố
khác nhau: caroten (bao gồm nhiều đồng phân: , , ,  - caroten), lycopen,
lutein, zeaxanthin, rhotonoxathin, crocetin, bixin, astaxin, fucoxanthin,
pectonoxanthin, echinenon, pentaxathin,… Chúng chủ yếu có trong cây, củ,
quả thực vật có màu như cà rốt, cà chua, gấc và nhiều loại lá…. Hầu hết
chúng đều có giá trị dinh dưỡng động vật. Nhưng một số carotenoid lại có
10
hoạt tính sinh học. Đó là -caroten, lycopen, lutein và zeaxanthin. Đây là
những chất có khả năng chống oxi hoá nên được sử dụng để điều trị và phòng
chống lão hoá và ung thư.

*

- caroten
β-caroten được chiết suất từ củ cà rốt năm 1910. Đến nay, người ta còn
phát hiện rất nhiều các đồng phân khác của  - caroten và tác dụng của chúng
trong điều trị bệnh.
 - caroten có tác dụng như tiền vitamin A cần thiết cho sự phát triển
cơ thể, tham gia sự tạo mô, da niêm mạc, võng mạc mắt, làm tăng sức đề
kháng của cơ thể chống lại sự nhiễm khuẩn. Nó còn giúp bảo vệ chống lại ung
thư biểu mô,  - caroten có khả năng tạo máu nên thường được dùng kết hợp
với sắt protoxalat [37].
*Lycopen
Lycopen là tên gọi bắt nguồn từ tên phân loại của cây cà chua Solanum
lycopersicum được dùng để tách ra nó năm 1910 bởi Willtatter và Escher.
Đây là tên thường của , -caroten, một caroten điển hình thuộc phân lớp
hydrocarotennoid.

Công thức hoá học của lycopen là C
40
H
56
được xác định năm 1928.
Phân tử có cấu trúc mạch hở, đối xứng có 13 liên kết đôi liên hợp.
Trong thực vật, lycopen tồn tại ở dạng cấu hình trans – trạng thái bền
nhiệt. Trong huyết tương người lycopen tồn tại trong hỗn hợp đồng phân chứa
50% dạng cis. Lycopen có khả năng làm ngừng quá trình oxi hoá một cách
đơn giản, bẫy peroxit một cách triệt để, ức chế quá trình oxi hoá ADN,
peroxit hoá lipit và oxi hoá lipoprotein khối lượng nhỏ. Do đó, lycopen chiết
11
suất từ cây cà chua có khả năng làm giảm ung thư tuyến tiền liệt và ung thư

phổi.
*Lutein
Lutein là một loại sắc tố tự nhiên tạo ra màu sắc cho rau quả. Fremy và
Stokes là người đầu tiên đề xuất về sự tồn tại của những chất màu trong lá cây
xanh. Nhưng 30 năm sau chúng mới được nghiên cứu nhiều và sâu hơn [44].
Năm 1831, Kuhn và cộng sự đã tách thành công tinh thể lutein [49].
Hoạt tính sinh học chủ yếu của lutein là khả năng chống oxi hoá.
Chúng có thể phản ứng với các gốc tự do bảo vệ tế bào khỏi bị oxi hoá, chống
ung thư da, lão hoá da, lão hoá thuỷ tinh thể, làm giảm xơ vữa động mạch [3].
Lutein cũng được xác định là có tác dụng ngăn ngừa thoái hoá điểm vàng do
đó phòng được các bệnh thoái hoá ở mắt.
Sự kết hợp lutein, zeaxanthin,  - caroten và lycopen sẽ tạo ra một sản
phẩm chống oxi hoá đa trị vừa tốt cho máu vừa tốt cho mắt và nhiều cơ quan
tổ chức khác của cơ thể. Tác dụng này sẽ tăng lên khi kết hợp thêm các
vitamin C và vitamin E.
1.2.2.2. Một số hợp chất phenol và polyphenol (hợp chất phenolic)
“Hợp chất phenolic” là thuật ngữ dùng để chỉ một nhóm các hợp chất
có ít nhất một vòng thơm và một hoặc nhiều nhóm hydroxyl (OH) tự do (gọi
là aglycol) hoặc kết hợp với các nhóm chức khác như ether, esther hay
glucosid. Phần lớn các phenolic tồn tại ở dạng kết hợp với đường (dạng
glycosid) dễ tan trong nước. Dựa vào đặc điểm cấu tạo, hợp chất phenolic
được phân loại thành:
- Nhóm hợp chất phenol đơn giản: gồm các chất cấu tạo từ một vòng
benzen và một hay nhiều nhóm hydroxyl (OH), được chia thành monophenol
12
(đại diện là phenol), diphenol (đại diện là pyrocatechin, rezoxin…), triphenol
(pyrogalol, oxyhydroquinon).
- Nhóm hợp chất phenol phức tạp: gồm các chất có thành phần cấu tạo
ngoài vòng benzen còn có dị vòng mạch nhánh. Nhóm này được phân thành
các nhóm sau:

+ Dẫn xuất của acid benzoic (C
6
– C
1
): cấu trúc phân tử chứa vòng
benzen có thêm nhóm carboxyl. Chúng tồn tại phổ biến ở dạng tự do, cũng có
ở dạng kết hợp với esther (như acid salicylic) hay glycosid. Một số dẫn xuất
như acid procatechin, acid galic dạng tự do và dạng esther là thành phần cấu
tạo nên catechin và tannin.Chúng thường gặp ở hạt nảy mầm.

Gallic acid Procatechuic acid
Hình 1.1. Cấu trúc một số polyphenolic điển hình
+ Dẫn xuất của acid cinnamic (C
6
– C
3
): gồm acid p–coumaric, acid
caffeic, ferulic…rất phổ biến trong tự nhiên, một số acid khác như acid o –
coumaric, o – ferulic ít gặp hơn. Các acid phenolic được giải phóng khi thuỷ
phân dịch chiết của cây trong môi trường acid và được tách chiết bằng dung
môi ether.
+ Nhóm đa vòng – Flavonoid (C
6
– C
3
– C
6
): cấu trúc gồm hai vòng
benzen và một vòng pyran. Nhóm này đa dạng và phổ biến trong thực vật, có
vai trò sinh lý quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây.

13
- Nhóm hợp chất polyphenol (phenol polymer): tanin, lignin, melenin, acid
humic…
*Tác dụng:
Đối với thực vật, phenol và polyphenol có vai trò quan trọng trong hô
hấp. Chúng vận chuyển H
+
, hình thành liên kết hydro với các protein và
enzyme tạo hiệu ứng dị lập thể (hiệu ứng không gian) làm thay đổi hoạt tính
của các enzyme. Nó làm tăng hoặc giảm nồng độ enzyme. Trong sinh trưởng
và phát triển, phenol đóng vai trò chất hoạt hoá AIA–oxydase và tham gia quá
trình tổng hợp enzyme này. Nó như là chất điều khiển các chất điều hoà sinh
trưởng. Các phenol có tính phytonxit có đặc tính kháng khuẩn. Nó được hình
thành như một phản ứng tự vệ khi cây bị tổn thương do vi khuẩn gây bệnh
(như cơ chế phản ứng kháng nguyên – kháng thể ở động vật và người). Các
chất phenol có tác dụng kích thích quá trình tái sinh, bảo vệ chống bức xạ,
gốc tự do, tác nhân gây đột biến và có tác dụng chống oxy hoá. Vì vậy, nó
làm tăng nhanh quá trình liền sẹo. Khi được tiết ra môi trường nó có ý nghĩa
to lớn trong việc cảm nhiễm qua lại của cây.
Đối với y học các hợp chất phenol có tác dụng chữa bệnh như là kháng
sinh, chất chống viêm. Chẳng hạn arbutin được dùng để sát trùng đường niệu,
các hợp chất salycylate có tác dụng chống viêm, các esther của acid cinnamic
trong actiso (như cynarin, các acid phenolic) có tác dụng bảo vệ gan [9]. Các
hợp chất phenol trong tế bào sống là một chất độc kìm hãm sự phát triển của
nấm, vi nấm, virus gây bệnh. Do đó, người ta có thể dùng chúng làm các chế
phẩm tăng tính chống chịu cho cây như acid humic.
Như vậy, phenol là một nhóm chất phức tạp có rất nhiều ứng dụng mà
ngày nay chúng ta đang sử dụng và còn tiếp tục phải nghiên cứu. Trong số
hàng nghìn những hợp chất phenol trong cây đã được biết cấu trúc, flavonoid
14

là nhóm hợp chất quan trọng nhất có nhiều ứng dụng nổi trội về hoạt tính sinh
học.
1.2.2.3. Flavonoid (C
6
– C
3
– C
6
)
Flavonoid là một trong những nhóm chất phenol phức tạp thường gặp
trong thực vật. Flavonoid có cấu trúc đa dạng và nhiều tác dụng sinh học đã
được nghiên cứu và kiểm nghiệm. Chúng có ở hầu hết các bộ phận của cây,
đặc biệt trong các tế bào thực vật quang hợp. Đó là những sắc tố có màu vàng,
tan trong nước nên gọi là “Flavonoid” (flavus: vàng). Một số sắc tố khác như
xanh, tím, đỏ cũng thuộc nhóm này. Chúng bao gồm nhiều loại trong đó hợp
chất điển hình nhất là biflavon, ngoài ra còn có flavon, flavonol và
flavanonol.
Đến nay, hơn 4000 flavonoid đã được tìm thấy từ các loài thực vật. Ban
đầu chúng được phát hiện với vai trò chỉ là sắc tố của thực vật vào mùa thu
khi các loại hoa, lá, cây chuyển sang màu vàng, da cam, đỏ. Sau này, các
flavonoid được phát hiện thấy trong quả, hạt, thân cây, chè, rượu vang
đỏ…Chúng là các thành phần nổi bật nhất trong các giống quả cam, quýt và
phổ biến trong thức ăn của con người [5].
Phân tử flavonoid có cấu trúc monomer, dimer, hay oligomer cao hơn.


9
10
8
5

7
6
2
3
O
1
4
1'
5'6'
4'
3'
2'
A
C
B


Hình 1.2. Cấu trúc khung Flavonoid
15
Flavonoid có cấu trúc C
6
– C
3
– C
6
, trong đó phần C
6
là vòng benzen
(A,B) và một vòng pyran C
3

(C). Trong đó vòng A kết hợp với vòng C tạo
thành khung chroman.
Trong cây, flavonoid tồn tại dưới hai dạng: dạng tự do (aglycon) và
dạng liên kết với đường (glycosid). Các glycosid khi thuỷ phân trong môi
trường acid hoặc enzyme sẽ giải phóng ra đường và aglycon. Trong tự nhiên
trừ catechin và leucoantocyanidin (flavan – 3,4 diol), phần lớn các flavonoid
đều tồn tại ở hai dạng glycosid: O – glycosid và C – glycosid.







Cyanidin

Epicatechin Quercetin


OH
O
OH
Glucose



O
OH
OH
O - Rhamnose - glucose

Saponin Rutin

Hình 1.3. Cấu trúc một số flavonoid điển hình
* Tác dụng
- Làm mềm thành mạch (hoạt tính vitamin P).
Một số flavonoid có tác dụng hỗ trợ đối với vitamin C. Chúng thường
được sử dụng phối hợp với vitamin C trong dự phòng điều trị chảy máu cấp
xung huyết, tăng sự thẩm thấu của mao mạch, phù nề…Một số flavonoid khác
16
lại có hoạt tính vitamin P. Chúng tác dụng lên tính chống chịu của mạch máu
và gây ra các biểu hiện lâm sàng khi cơ thể bị nhiễm độc, sốt, rối loạn hoạt
động của hệ tim mạch.
- Tác dụng chống oxy hoá.
Đây là cơ sở quan trọng nhất thể hiện hoạt tính sinh học của các
flavonoid. Các flavonoid có khả năng kìm hãm các quá trình oxy hoá dây
chuyền sinh ra bởi các gốc tự do. Vì vậy, flavonoid thể hiện tính năng bảo vệ
gan một cách tích cực. Trong gan thường diễn ra sự chuyển hoá lipid của
màng tế bào gan. Các gốc acid béo tự do bị oxy hoá thành peroxit. Nhờ khả
năng ngăn cản sự peroxit hoá, các flavonoid có khả năng ngăn cản sự hình
thành acid béo và cholesterol. Vì vậy, chức năng gan được tái sinh nhanh và
phục hồi.
Không những thế, flavonoid còn có khả năng ngăn cản các chất độc
hướng gan, ngăn chặn sự nhiễm mỡ trong gan. Khi vào trong cơ thể, các
flavonoid sẽ giải toả các điện tích trên mạch vòng của nhân thơm và hệ nối
đôi liên hợp của chúng sinh ra các gốc tự do bền vững hơn các gốc tự do hình
thành do bệnh lý. Vì vậy, nó làm triệt tiêu các gốc tự do hoạt động. Các gốc tự
do mà flavonoid tạo ra bền vững hơn nên không tham gia các phản ứng dây
chuyền, phản ứng oxy hoá. Kết quả là hạn chế được quá trình bệnh lý do cắt
đứt dây chuyền phản ứng. Tuy nhiên mức độ tác dụng của các flavonoid phụ

thuộc vào đặc điểm cấu tạo hoá học của từng flavonoide cụ thể [33].
- Tác dụng đối với ung thư.
Một số flavonoid khi tiếp xúc với tế bào khối u thấy có tác dụng trị liệu
dựa trên các cơ chế thường thấy:
+ Kìm hãm hoạt tính enzyme oxy hoá – khử.
17
+ Kìm hãm quá trình hô hấp của tế bào ung thư.
+ Kìm hãm hoạt động giảm phân.
+ Kìm hãm trao đổi chất trong tế bào.
Các cơ chế này cũng diễn ra khi các flavonoid tiếp xúc với các tế bào vi
sinh vật gây bệnh.
- Tác dụng với enzyme.
Nhóm OH của flavonoid phản ứng với nhóm cacboxyl (COOH) của các
peptide tạo thành liên kết hydro. Nhờ đó, flavonoid tương tác với các enzyme
và làm thay đổi hoạt tính của nhiều enzyme trong hệ thống sinh học, đặc biệt
là hệ enzyme màng tế bào. Do đó, các flavonoid có khả năng gây bất hoạt hệ
thống enzyme màng tế bào vi khuẩn. Kết quả là ức chế quá trình sinh trưởng
và phát triển của vi khuẩn.
- Tác dụng đối với chuyển hoá và trên lâm sàng [4].
Các flavonoid có tác dụng sâu sắc lên chức năng của tế bào miễn dịch
và tế bào viêm. Gay (1998) đã chỉ ra rằng quercetin có thể sử dụng để điều trị
hen suyễn và tốt cho bệnh nhân tiểu đường và nhiễm HIV. Flavonoid baicalin
trong các nghiên cứu gần đây cho thấy hoạt tính chống viêm và chống HIV
theo cơ chế gây cản trở sự tương tác giữa protein vỏ của HIV với các recepter
và ngăn chặn HIV tấn công vào tế bào đích.
1.2.2.4. Tannin
Tannin (chất chát) là các polyphenol được cấu tạo dựa trên cấu tạo của
acid tannic và acid gallic, tan tốt trong nước và phản ứng được với protein
(nguyên nhân gây ra tính làm se của một số loại cây sử dụng làm thuộc da).
Chúng phổ biến trong giới thực vật.

18
*Tác dụng
Tannin có khả năng tạo kết tủa với protein nên có tác dụng chữa bệnh
tiêu chảy hay chống chảy máu. Nó có khả năng kết tủa với kim loại nặng và
alkanoid nên thường dùng để chữa ngộ độc kim loại và alkaloid. Các hợp chất
tanin còn có tác dụng ức chế và diệt vi khuẩn [9].
1.2.2.5 Coumanrin (C
6
– C
3
)
Là một nhóm các hợp chất hữu cơ có trong nhiều loại cây. Cấu trúc dị
vòng chứa oxy tạo nên mùi thơm giống mùi thơm của vanilin hay cỏ mới khô.
Coumanrin được phát hiện từ những năm 1820.
Coumanrin là những -pyron có cấu trúc C
6
– C
3
. Trong các phân tử
coumanrin đều có nguyên tử oxy liên kết tại vị trí C
7
nên có thể coi nó là dẫn
xuất của umbelliferon. Coumanrin thuộc nhóm các hợp chất phenol có nhóm
OH bị ether hoá bởi nhóm CH
3
hay một terpennoid chứa từ một đến ba đơn vị
isoprenoid.
Về mặt hoá học, các coumanrin tồn tại ở dạng tự do hay kết hợp với
glucose tạo thành dạng coumanrin glycosid. Mạch đường thường là glucose,

đôi khi là glucose – glucose hoặc glucose – xylose. Phân tử chứa vòng lacton
dễ mở vòng tạo muối tan trong nước khi tác dụng với dung dịch kiềm.
O
O
OH
CH
3
O
O
O
O
O
OH
O
O
OH
O
OH
O
Coumarin
4-hydroxycoumarin
Wafarin
Bishydroxycoumarin

Hình 1.4 Khung cấu trúc của Coumarin và các dẫn xuất của nó

19
*Tác dụng
Tác dụng dược lý chủ yếu là chống viêm, kháng khuẩn và nấm. Ngoài
ra một số khác có tác dụng chống sốt rét (daphnetin, dentatin và clausarin),

chống đông máu (dicoumanron), gây giãn mạch (othrol, seopron) [9].
1.2.2.6. Glycosid
Glycosid là các carbohydrat có nhiều trong lá, hạt, và vỏ cây dạng kết
tinh có vị đắng. Dưới tác dụng của enzyme hoặc acid các glycosid bị thuỷ
phân tạo ra đường và phần không đường là aglycon. Các aglycon có cấu trúc
kiểu cardenolid và bufadienolid. Cardenolid thuộc loại steroid C
23
có chuỗi
bên là vòng ,  lacton 5 cạnh không no và một nhóm C
14
hydroxyl như
strophanthidin, oleandrigenin. Bufadienolid là steroid C
24
, chuỗi bên là vòng
lacton 6 cạnh, hai lần không no và một nhóm hydroxyl 14, hướng  hoặc
nhóm tương tự như bufalin, marinobufagin
…
Các glycosid tìm thấy phổ biến trong thực vật dưới nhiều dạng như:
glycosidephenolic (arbutin, salixin, phloridin…), các sắc tố, các tinh dầu
(sinigrin), glycosidesaponin…

Hình 1.5. Cấu trúc một glycosid điển hình

20
*Tác dụng:
Nhiều nghiên cứu cho thấy một số glycosid có tác dụng ức chế sinh
trưởng và phát triển của vi sinh vật. Ngoài ra một số glycosid còn được sử
dụng làm thuốc trợ tim [9, 14].
1.2.2.7. Alkaloid
Alkaloid là thuật ngữ dùng để chỉ nhóm các hợp chất thiên nhiên có cấu

trúc dị vòng chứa nitơ, có tính bazơ có trong một số loài thực vật nhất định,
đôi khi có cả trong động vật. Alkaloid có nghĩa là giống như (oid) chất kiềm
(alcali).
Nguyên tử nitơ trong alkaloid có thể là một phần, hoặc không phải là
một phần của hệ thống dị vòng. Chúng có cấu trúc phân tử phức tạp, có hoạt
tính Sinh-dược rõ rệt và phân bố hạn chế trong giới thực vật 42. Hiện nay đã
có hơn 12000 loại alkaloid khác nhau được phân lập. Trong cây, alkaloid tồn
tại dưới 3 dạng: dạng tự do, dạng muối của các axit phổ biến như citric, lactic,
oxalic, axetic, malic…và dạng oxit nitơ. Alkaloid không phổ biến ở tất cả các
loài thực vật mà chỉ tập trung ở một số ít loài. Chúng chủ yếu được tìm thấy
trong các loài thực vật có hoa, nhưng chỉ có khoảng 20% số loài thực vật có
hoa là có thể sản sinh ra alkaloid. Đa số alkaloid không có mùi, vị đắng, một
số ít có vị cay, ở dạng chất rắn có màu trắng, trừ một vài chất có màu vàng
(berberin, palmatin). Về vai trò sinh học, các alkaloid được coi là một trong
những “hàng rào phòng thủ hoá học hữu hiệu” bảo vệ cây trước sự tấn công
của vi sinh vật gây bệnh và các loại côn trùng, sâu bệnh ăn lá 43. Về y học,
alkaloid được sử dụng rất đa dạng: làm thuốc gây ức chế, hoặc kích thích hệ
thần kinh trung ương, dùng làm thuốc điều hoà huyết áp, chữa loạn nhịp tim,
thuốc diệt ký sinh trùng, kháng khuẩn, thuốc chống ung thư và nhiều tác dụng
quan trọng khác. Dưới đây là 3 dạng alkaloid điển hình:
21
N
N
N
N
CH
3
CH
3
O

O
CH
3

O
N
H
OH
H

N
N
CH
3

Caffein Morphine Nicotine
Hình 1.6. Cấu trúc một số Alkaloid điển hình
1. 3 CHẤT KHÁNG SINH CÓ NGUỒN GỐC THỰC VẬT
1.3.1. Chất kháng sinh
Chất kháng sinh là chất hoá học do một số vi sinh vật tạo ra có hoạt
tính chống lại các vi sinh vật khác. Đó là các nhân tố hoá trị liệu đặc biệt.
Chúng là những sản phẩm tự nhiên mà không phải là những hoá chất tổng
hợp. Kháng sinh là các sản phẩm của trao đổi chất bậc hai. Chúng là một
trong những nhóm chất quan trọng nhất được sản xuất nhờ các quá trình vi
sinh vật ở quy mô lớn. Các chất kháng sinh như: penicillin, streptomycin, các
chất kháng sinh thế hệ 2 và thế hệ 3…đã được sản xuất từ thế kỷ trước. Hiện
nay, khoảng hơn 8.000 chất kháng sinh đã được biết đến và mỗi năm có
khoảng vài trăm kháng sinh mới được phát hiện [1].
Việc sử dụng kháng sinh để điều trị các bệnh do vi sinh vật gây ra có ý
nghĩa to lớn đối với y học. Nhưng không phải chất kháng sinh nào cũng có

khả năng chống lại mọi vi sinh vật. Mỗi kháng sinh có thành phần, cấu tạo
hoá học, tính chất, đặc tính và cơ chế tác dụng riêng biệt tác động đặc hiệu lên
một vài vi sinh vật. Do đó, mỗi một loại kháng sinh chỉ có tác dụng với một
nhóm vi sinh vật nhất định. Đó là tính chọn lọc của kháng sinh [1]. Chính vì
vậy một số vi sinh vật gây bệnh sau quá trình tiếp xúc lâu dài với kháng sinh
22
đặc hiệu đã hình thành tính đề kháng kháng sinh. Và những vấn đề mới về
kháng sinh lại được đưa ra. Người ta hướng đến những chất kháng sinh có
nguồn gốc thực vật.
1.3.2. Chất kháng sinh có nguồn gốc thực vật
Khái niệm chất kháng sinh thực vật chỉ mới xuất hiện gần đây. Năm
1973, Ingham là người đầu tiên đưa ra định nghĩa kháng sinh thực vật
“phytoalexin”. Phytoalexin là các chất kháng khuẩn hình thành trong cơ thể
thực vật thông qua một chuỗi liên tiếp các quá trình chuyển hoá trước những
biến đổi sinh lý học để phản ứng lại với điều kiện môi trường nhằm thích nghi
với điều kiện sống tốt hơn hoặc chống lại sự tấn công của các vi sinh vật gây
bệnh.
Phytoalexin được tìm thấy dưới nhiều dạng có bản chất hoá học khác
nhau như: alkaloid, flavonoid, glycosid, terpenoid…[19]. Chúng được sản
xuất bởi cơ thể thực vật như là các chất độc với các sinh vật tấn công chúng.
Cơ chế tác động của các phytoalexin tương tự như cơ chế tác động của các
chất kháng sinh. Chúng có khả năng phá vỡ thành tế bào, làm trì hoãn quá
trình sinh trưởng, phá vỡ quá trình trao đổi chất của các sinh vật có hại. Kết
quả là các phytoalexin ức chế sự sinh
trưởng, phát triển hoặc gây độc cho tế bào
vi sinh vật gây bệnh.
Những năm gần đây, người ta đã
phân lập được nhiều phytoalexin có khả
năng chống lại các tổn thương tới thực vật.
Một ví dụ tiêu biểu là Allixin (3-hydroxy-

5-methoxy-6-methyl-2-penthyl-4H-pyran-
4-one), một hợp chất có cấu trúc khung γ-
O
V
4-
O
+
O
O
O
O
+
O
O
O
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3

Hình 1.7. Cấu tạo hoá học của
Allixin

23
pyrone đã được phân lập đầu tiên từ tỏi. Alixin là một sản phẩm được sản
xuất bởi thực vật khi phản ứng với các stress liên tiếp. Hợp chất này có nhiều
hoạt tính sinh học như chống oxi hoá, chống vi khuẩn, chống sự tăng sinh của
khối u, ức chế quá trình hình thành ung thư da, ức chế quá trình liên kết của
aflatoxin B2 với ADN. Chính vì vậy, allixin hoặc các dẫn xuất của nó có thể
là một tác nhân tiềm tàng trong việc chữa trị bệnh ung thư và các bệnh khác
[34].
Trong lịch sử y học dân gian, nhiều phytoalexin được sử dụng để chống
lại các tác nhân bệnh lý vi sinh vật một cách hiệu quả như: emetine, quinin,
berberine…Ngày nay, việc tìm ra bản chất của các hợp chất tự nhiên (là các
alkaliod, flavonoid, glycosid, indole alkaloid, biflavonoid ) hứa hẹn những
phương thuốc đặc trị cho những bệnh do vi sinh vật gây nên, thậm chí cả
AIDS [38].
Các phenolic trong thực vật trong đó có flavonoid là các chất thứ sinh
được nghiên cứu sâu rộng và phổ biến nhất. Trong dịch chiết từ hầu hết các
bộ phận của cây đều chứa loại hợp chất này. Chúng có tiềm năng kháng
khuẩn rất lớn. Một đại diện điển hình trong số đó là quinon. Khả năng kháng
vi sinh vật của hợp chất tự nhiên này đã được nghiên cứu và chứng minh. Nó
tác dụng lên vi sinh vật dựa trên cơ chế tác động lên bề mặt tế bào, phá hủy
lớp vỏ peptidoglycol hoặc phá huỷ hệ thống enzyme màng và làm vi sinh vật
chết. Các hydrophenolic và các phenolic loại hydroxylcianic như caffeic acid,
ferulic acid, coumaric acid…có khả năng ức chế sự sinh trưởng của các chủng
vi khuẩn Staphylococcus aureus, Salmonela typhi, Bacillus subtilis,
E.coli…Các polyphenolic như Tannin có thể ức chế cả một số liên cầu khuẩn
Streptococcus, Listeria monocytogenens,…Các hydroxylatephenol như
catechol và pyrogallon không ức chế mà gây độc cho vi sinh vật. Thực vật
thuộc họ Lamiaceae chứa rosmaric acid kháng khuẩn rất tốt theo cơ chế tác
24
dụng lên hệ thống enzyme màng của vi sinh vật [36]…Ở nhiều họ thực vật

khác cũng đã nghiên cứu và chiết suất được các chất tự nhiên có hoạt tính
kháng khuẩn có trong tinh dầu hoặc các chất thơm trong cây.

25
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng thực vật
Mẫu lá của 4 loài thực vật bao gồm: Cây ba chạc (Euodia lepta
(Spreng) Merr.); Cây ba đậu (Croton tiglium L.); Cây bạc thau (Argyreia
acuta Lour.); Cây khổ sâm (Croton tonkinensis Gragnep.). Mẫu được thu hái
ở Tam Đảo – Vĩnh Phúc và Trạm đa dạng Sinh học – Ngọc Thanh – Vĩnh
Phúc. Người thẩm định phân loại các mẫu thực vật nghiên cứu cho đề tài này
là TS. Võ Văn Chi, Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh.
2.1.1.1. Đặc điểm sinh học của cây Ba chạc (Euodia
lepta (Spreng) Merr)
Ba chạc hay còn gọi là Chè đắng, Chè cỏ, Cây
dầu dầu; có tên khoa học là Euodia lepta (Spreng)
Merr, thuộc họ Cam. Ba chạc thuộc loại cây nhỡ cao 2
– 8m. Lá có 3 lá chét, với lá chét nguyên. Cụm hoa ở
nách các lá và ngắn hơn lá. Quả nang, thành cụm thưa,
có 1 – 4 hạch nhẵn, nhăn nheo ở cạnh ngoài, chứa mỗi
cái một hạt hình cầu đường kính 2mm, đen lam, bóng.
Hoa nở tháng 4 - 5. Quả tháng 6 – 7.
Ba chạc mọc phổ biến khắp nước ta trên những đồi cây bụi, ở bìa rừng
và trong rừng thưa, cả ở vùng núi và đồng bằng.

Hình 2.1. Cây Ba chạc
(Euodia lepta Spreng Merr)