Nghiên cứu khả năng kháng vi khuẩn Gram âm của chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM





TRƯƠNG ĐỨC HẠNH




Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN GRAM ÂM
CỦA CHẾ PHẨM PHỐI HỢP CHITOSAN – NANO BẠC




KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC




Hệ đào tạo : Chính quy
Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học
Khoa : CNSH – CNTP
Lớp : 42 - CNSH
Khóa học : 2010-2014

THÁI NGUYÊN, NĂM 2014
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM






TRƯƠNG ĐỨC HẠNH



Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN GRAM ÂM
CỦA CHẾ PHẨM PHỐI HỢP CHITOSAN – NANO BẠC





KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC





Hệ đào tạo : Chính quy
Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Khoa : CNSH – CNTP
Lớp : 42 - CNSH
Khóa học : 2010 - 2014
Giáo viên hướng dẫn 1 : Ths. Lương Hùng Tiến
Giáo viên hướng dẫn 2 : Ths. Nguyễn Thị Đoàn




Thái Nguyên, 2014
LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan rằng số liệu và các kết quả nghiên cứu trong luận văn này là
hoàn toàn trung thực và chưa hề sử dụng để bảo vệ một học vị nào.
Trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thiện luận văn mọi sự giúp đỡ đều đã
được cảm ơn và trích dẫn trong luận văn đều được ghi rõ nguồn gốc.
Thái nguyên ngày 29 tháng 05 năm 2014
Sinh viên

Trương Đức Hạnh
LỜI CẢM ƠN
Thực tập tốt nghiệp là một khâu rất quan trọng trong quá trình học tập của mỗi
sinh viên nhằm hệ thống lại toàn bộ lượng kiến thức đã học, vận dụng lý thuyết vào
thực tiễn, bước đầu làm quen với những kiến thức khoa học. Qua đó sinh viên ra
trường sẽ hoàn thiện hơn về kiến thức lý luận, phương pháp làm việc, năng lực công
tác nhằm đáp ứng nhu cầu thực tiễn của công việc sau này.
Được sự giúp đỡ của Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm và Ban chủ
nhiệm khoa CNSH - CNTP, em đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu khả
năng kháng vi khuẩn Gram âm của chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc”.
Trong suốt quá trình thực tập em đã nhận được sự giúp đỡ của các thầy, cô giáo, các
bạn trong lớp 42-CNSH, các chuyên viên nơi em thực tập tốt nghiệp.

Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thái
Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa CNSH - CNTP, các thầy cô bộ môn khoa CNSH -
CNTP và đặc biệt là thầy giáo Ths. Lương Hùng Tiến và cô giáo Ths. Nguyễn Thị
Đoàn người đã trực tiếp hướng dẫn em trong suốt quá trình làm đề tài. Em cũng xin
chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã hết sức cổ vũ, động viên, tạo điều kiện để
em hoàn thiện đề tài này.
Trong quá trình thực tập, cũng như là trong quá trình làm báo cáo, khó tránh
khỏi sai sót, rất mong các thầy, cô bỏ qua. Đồng thời do trình độ lý luận cũng như
kinh nghiệm thực tiễn còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏi những
thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp quý báu của thầy, cô giáo để em
học thêm nhiều kinh nghiệm và kiến thức trong lĩnh vực này được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn !
MỤC LỤC

PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1
1.1. Đặt vấn đề
1
1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài
2
1.2.1. Mục đích
2
1.2.1. Yêu cầu
2
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
2
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
2

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3
2.1. Tổng quan về nano bạc
3
2.1.1. Giới thiệu về bạc kim loại
3
2.1.2. Giới thiệu về hạt nano bạc
3
2.1.3. Phương pháp phân tích hạt nano bạc
4
2.1.4. Đặc tính kháng khuẩn của nano bạc
4
2.1.5. Cơ chế kháng khuẩn của nano bạc
5
2.1.6. Ứng dụng nano bạc trong cuộc sống
6
2.2. Tổng quan về Chitosan
6
2.2.1. Nguồn gốc Chitin và Chitosan
6
2.2.2 Cấu trúc hóa học của Chitosan
8
2.2.3. Tính chất của Chitosan
9
2.2.3.1. Tính chất vật lý
9
2.2.3.2. Tính chất hóa học
11
2.2.3.3. Tính chất sinh học và độc tính của Chitosan
12

2.2.4. Đặc tính kháng khuẩn và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động kháng
khuẩn của Chitosan
13
2.2.4.1. Đặc tính kháng khuẩn
13
2.2.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kháng khuẩn của Chitosan
15
2.2.5. Ứng dụng của Chitosan
18
2.2.5.1. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm
18
2.2.5.2. Ứng dụng trong y học
19
2.2.5.3. Ứng dụng trong mỹ phẩm
19
2.2.5.4. Ứng dụng trong môi trường
20
2.3. Tổng quan về vi khuẩn Gram âm
20
2.3.1. Vi khuẩn Escherichia coli
20
2.3.1.1. Đặc điểm hình thái
20
2.3.1.2. Độc tố của E.coli
21
2.3.1.3. Sức đề kháng
21
2.3.1.4. Khả năng gây bệnh của E.coli
22
2.3.2. Vi khuẩn S. Typhimurium

22
2.3.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn
22
2.3.2.2. Đặc điểm nuôi cấy
23
2.3.2.3. Đặc điểm hóa sinh
23
2.3.2.4. Cơ chế gây bệnh
23
2.3.3. Các chất có khả năng kháng vi khuẩn Gram âm 24
2.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
25
2.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
25
2.4.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
26
PHẦN 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
28
3.1. Vật liệu nghiên cứu
28
3.1.1. Vật liệu
28
3.1.2. Chủng vi sinh vật thí nghiệm
28
3.1.3. Môi trường nuôi cấy
28
3.1.4. Dụng cụ, thiết bị
28
3.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu
29

3.3. Nội dung nghiên cứu
29
3.4. Phương pháp nghiên cứu
29
3.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
29
3.4.2. Phương pháp phân tích
31
3.4.2.1. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn
31
3.4.2.1. Phương pháp quan sát hình thái tế bào và xác định mật độ tế bào
31
3.4.3. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật
32
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
33
4.1. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của nano bạc đối với vi khuẩn Gram âm
33
4.2. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của Chitosan đối với vi khuẩn Gram âm
34
4.3. Lựa chọn công thức phối trộn Chitosan với nano bạc kháng lại vi khuẩn Gram âm
36
4.3.1. Lựa chọn công thức phối trộn Chitosan với nano bạc kháng lại vi khuẩn
E.coli
36
4.3.2. Lựa chọn công thức phối trộn Chitosan với nano bạc kháng lại vi khuẩn
S.Typhimurium
37
4.4. Khả năng kháng vi khuẩn Gram âm của chế phẩm phối hợp Chitosan –
nano bạc theo thời gian

39
4.4.1. Khả năng kháng vi khuẩn E. coli của chế phẩm phối hợp Chitosan – nano
bạc theo thời gian
39
4.4.2. Khả năng kháng vi khuẩn S. Typhimurium của chế phẩm phối hợp
Chitosan – nano bạc theo thời gian
40
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
42
5.1. Kết luận
42
5.1. Kiến nghị
42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
43
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

Escherichia coli E.coli
Salmonella Typhimurium S. Typhimurium
Minimum Inhibitory Concentration MIC
Colony forming unit CFU
Dgree of Deacetylation DDA
Deoxyribonucleic acid ADN
Messenger Ribonucleic acid mARN
De-ion DI
Ultraviolet-visble spectroscopy UV-VIS
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1. Số nguyên tử bạc trong một đơn vị thể tích.
3

Bảng 2.2. Hàm lượng Chitin trong vỏ một số động vật giáp xác
8
Bảng 3.1. Công thức phối trộn Chitosan và nano bạc
30
Bảng 4.1. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ nano bạc đến hiệu quả kháng khuẩn
Gram âm 34
Bảng 4.2. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ Chitosan đến hiệu quả kháng khuẩn
Gram âm
35
Bảng 4.3. Hiệu quả kháng vi khuẩn E. coli của công thức phối trộn Chitosan và
nano bạc
37
Bảng 4.4. Hiệu quả kháng vi khuẩn S. Typhimurium của công thức phối trộn
Chitosan và nano bạc
38
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 2.1. Ảnh UV-VIS của các hạt nano bạc. 4
Hình 2.2. Ion bạc vô hiệu hóa enzyme chuyển hóa oxy của vi khuẩn 5
Hình 2.3. Một số loại giáp xác chứa Chitin 7
Hình 2.4. Công thức cấu tạo của Chitin 8
Hình 2.5. Công thức cấu tạo của Chitosan 9
Hình 2.6. Vi khuẩn Escherichia coli 21
Hình 2.7. Vi khuẩn S. Typhimurium 22
Hình 4.1. Kết quả xác định MIC của chế phẩm nano bạc kháng vi khuẩn Gram âm 33
Hình 4.2. Kết quả xác định MIC của chế phẩm Chitosan kháng vi khuẩn Gram âm 35
Hình 4.3. Kết quả kháng vi khuẩn E. coli của công thức phối trộn Chitosan và
nano bạc 36
Hình 4.4. Kết quả kháng vi khuẩn S. Typhimurium của công thức phối trộn
Chitosan và nano bạc 38

Hình 4.5. Biểu đồ khả năng kháng E. coli của chế phẩm Chitosan – nano bạc 40
Hình 4.6. Khả năng kháng S. Typhimurium của chế phẩm Chitosan – nano bạc 41


1
PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Xã hội ngày càng phát triển, những mối quan tâm của con người về vấn đề sức
khỏe ngày càng cao thì vấn đề thực phẩm được con người rất chú trọng. Vấn đề
được đặt ra đòi hỏi thực phẩm phải đảm bảo an toàn vệ sinh khi sử dụng, thay vì
những hóa chất bảo quản từ đó việc tìm ra các vật liệu hay các chất bảo quản đảm
bảo an toàn khi sử dụng thực phẩm là rất cần thiết.
Bạc đã được sử dụng để điều trị bệnh y tế trong hơn 100 năm do thuộc tính
kháng khuẩn tự nhiên của nó. Từ khi công nghệ Nano ra đời thì ứng dụng của bạc
mới phát triển lên một tầm cao mới. Sở dĩ nano bạc được nghiên cứu ứng dụng vào
việc kháng khuẩn vì bạc là kháng sinh tự nhiên và không gây tác dụng phụ. Nano
bạc không gây phản ứng phụ, không gây độc cho con người và vật nuôi khi nhiễm
lượng nano bạc bằng nồng độ diệt khuẩn (khoảng nồng độ < 100ppm). Các hạt
Nano bạc có diện tích mặt rất lớn, gia tăng tiếp xúc của chúng với vi khuẩn, và nâng
cao hiệu quả diệt khuẩn. Khả năng kháng khuẩn của nano bạc là nhờ vào các ion
Ag
+
, ion này có khả năng liên kết mạnh với peptidoglican, thành phần cấu tạo nên
thành tế bào của vi khuẩn và ức chế khả năng vận chuyển oxy vào bên trong tế bào
dẫn đến làm tê liệt vi khuẩn. Nếu các ion bạc được lấy ra khỏi tế bào ngay sau đó,
khả năng hoặt động của vi khuẩn lại có thể được phục hồi. Do động vật không có
thành tế bào, vì vậy chúng ta không bị tổn thương khi tiếp xúc với các ion này [4].
Chitosan là một polysaccharide tuyến tính là sự kết hợp ngẫu nhiên gồm β(1-
4)-D glucosamine và N-acetyl-D glucosamine. Chitosan thương mại có nguồn gốc

từ vỏ tôm và động vật giáp xác biển khác [18]. Nó có khả năng tự hòa hợp và tự
phân hủy sinh học, độc tính thấp, hoạt tính sinh học cao và đa dạng như kháng
khuẩn, kháng nấm. Chitosan ức chế vi khuẩn là do liên kết giữa chuỗi polymer của
Chitosan với các ion trên bề mặt vi khuẩn làm thay đổi tính thấm của màng tế bào vi
khuẩn [26]. Các đặc tính này đã thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu
trong thời gian gần đây.

2
Vi khuẩn là tác nhân chính gây hư hỏng thực phẩm và độc tố của chúng ảnh
hưởng đến sức khỏe của con người. Dựa trên các đặc tính của nano bạc và Chitosan,
nhóm nghiên cứu nhận thấy, hai vật liệu này có khả năng kết hợp để tạo ra một chế
phẩm kháng vi sinh vật ổn định, hiệu quả cao. Chính vì vậy, nhóm nghiên cứu tiến
hành đề tài “Nghiên cứu khả năng kháng vi khuẩn Gram âm của chế phẩm phối
hợp Chitosan – nano bạc”. Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là cơ sở dữ liệu cho
việc nghiên cứu tạo ra một chế phẩm phối hợp kháng vi sinh vật hoàn thiện giữa
Chitosan – nano bạc ứng dụng trong công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm.
1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài
1.2.1. Mục đích
Xác định được khả năng kháng vi khuẩn Gram âm của chế phẩm phối hợp
Chitosan – nano bạc.
1.2.1. Yêu cầu
- Tìm ra các điều kiện cho sự kết hợp tối ưu cho sự kháng vi khuẩn Gram âm
của chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc.
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
- Giúp sinh viên có cơ hội tiếp cận với các thao tác kỹ thuật trong thực tế. Qua
đó kết hợp với các kiến thức lý thuyết đã được học sinh viên sẽ có những hiểu biết
chuyên sâu và cái nhìn tổng quát hơn.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc ứng dụng trong bảo quản thực phẩm.

3
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về nano bạc
2.1.1. Giới thiệu về bạc kim loại
Cấu hình electron của bạc: 1s
2
2s
2
2p
6
3s
2
3p
6
3d
10
4s
2
4p
6
4d
10
5s
1
Bán kính nguyên tử Ag: 0,288 nm
Bán kính ion bạc: 0,23 nm
Bảng 2.1: Số nguyên tử bạc trong một đơn vị thể tích.
Kích thước của hạt nano Ag (nm) Số nguyên tử chứa trong đó

1 31
5 3900
20 250000
Bạc nano là vật liệu có diện tích bề mặt riêng rất lớn, có những đặc tính độc
đáo sau [6]:
- Tính khử khuẩn, chống nấm, khử mùi, có khả năng phát xạ tia hồng ngoại đi
xa, chống tĩnh.
- Có khả năng phân tán ổn định trong các loại dung môi khác nhau (trong các
dung môi phân cực như nước và trong các dung môi không phân cực như benzene,
toluene).
- Độ bền hóa học cao, không bị biến đổi dưới tác dụng của ánh sáng và các tác
nhân oxy hóa khử thông thường.
- Chi phí cho quá trình sản xuất thấp.
- Ổn định ở nhiệt độ cao.
2.1.2. Giới thiệu về hạt nano bạc
Hạt nano bạc là các hạt bạc có kích thước từ 1 nm đến 100 nm [4]. Do có diện
tích bề mặt lớn nên hạt nano bạc có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với các vật
liệu khối do khả năng giải phóng nhiều ion Ag
+
hơn.

4
Các hạt nano bạc có hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt. Hiện tượng này
tạo nên màu sắc từ vàng nhạt đến đen cho các dung dịch có chứa hạt nano bạc với
các màu sắc phụ thuộc vào nồng độ và kích thước hạt nano.
2.1.3. Phương pháp phân tích hạt nano bạc
Sử dụng phương pháp phân tích phổ UV-VIS
UV-VIS (Ultraviolet–visible spectroscopy) là phương pháp phân tích sử dụng
phổ hấp thụ hoặc phản xạ trong phạm vi vùng cực tím cho tới vùng ánh sáng nhìn
thấy được.

Do các thuộc tính quang học của dung dịch chứa hạt nano phụ thuộc vào hình
dạng, kích thước và nồng độ của hạt, nên ta có thể sử dụng UV-VIS để xác định các
thuộc tính trên.
Hình 2.1: Ảnh UV-VIS của các hạt nano bạc.
Do hạt nano bạc có kích thước nhỏ hơn 20 nm chỉ có một bề mặt Plasmon duy
nhất nên trong phổ UV-VIS của chúng chỉ xuất hiện 1 đỉnh duy nhất. Người ta xử
dụng tính chất này để xác định hình dạng của hạt nano bạc [17].
2.1.4. Đặc tính kháng khuẩn của nano bạc
Bạc và các hợp chất của bạc thể hiện tính độc đối với vi khuẩn, virus, tảo và
nấm. Tuy nhiên, khác với các kim loại nặng khác (chì, thủy ngân…) bạc không thể
hiện tính độc với con người [24].

5
Từ xa xưa, người ta đã sử dụng đặc tính này của bạc để phòng bệnh. Người cổ
đại sử dụng các bình bằng bạc để lưu trữ nước, rượu dấm. Trong thế kỷ 20, người ta
thường đặt một đồng bạc trong chai sữa để kéo dài độ tươi của sữa. Bạc và các hợp
chất của bạc được sử dụng rộng rãi từ đầu thế kỷ XIX đến giữa thế kỷ XX để điều
trị các vết bỏng và khử trùng [6].
Sau khi thuốc kháng sinh được phát minh và đưa vào ứng dụng với hiệu quả
cao người ta không còn quan tâm đến tác dụng kháng khuẩn của bạc nữa. Tuy
nhiên, từ những năm gần đây, do hiện tượng các chủng vi sinh ngày càng trở nên
kháng thuốc, người ta lại quan tâm trở lại đối với việc ứng dụng khả năng diệt
khuẩn và các ứng dụng khác của bạc, đặc biệt là dưới dạng hạt có kích thước nano.
2.1.5. Cơ chế kháng khuẩn của nano bạc
Các đặc tính kháng khuẩn của bạc bắt nguồn từ tính chất hóa học của các ion
Ag
+
. Ion này có khả năng liên kết mạnh với peptidoglican, thành phần cấu tạo nên
thành tế bào của vi khuẩn và ức chế khả năng vận chuyển oxy vào bên trong tế bào
dẫn đến làm tê liệt vi khuẩn. Nếu các ion bạc được lấy ra khỏi tế bào ngay sau đó,

khả năng hoặt động của vi khuẩn lại có thể được phục hồi. Do động vật không có
thành tế bào, vì vậy chúng ta không bị tổn thương khi tiếp xúc với các ion này.
Có một cơ chế tác động của các ion bạc lên vi khuẩn đáng chú ý được mô tả
như sau: Sau khi Ag
+
tác động lên lớp màng bảo vệ của tế bào vi khuẩn gây bệnh nó
sẽ đi vào bên trong tế bào và phản ứng với nhóm hydrosunfua–SH của phân tử
enzyme chuyển hóa oxy và vô hiệu hóa enzyme này dẫn đến ức chế quá trình hô
hấp của tế bào vi khuẩn [24].
Hình 2.2: Ion bạc vô hiệu hóa enzyme chuyển hóa oxy của vi khuẩn
Ngoài ra các ion bạc còn có khả năng liên kết với các base của DNA và trung
hòa điện tích của gốc phosphate do đó ngăn chặn quá trình sao chép DNA [18].

6
2.1.6. Ứng dụng nano bạc trong cuộc sống
Do thể hiện tính kháng khuẩn tốt nên nano bạc thường được sử dụng để làm
chất khử trùng, kháng khuẩn, khử mùi… Có thể kể một vài sản phẩm chứa hạt nano
bạc như:
Các dụng cụ chứa thực phẩm: Những đồ dùng bằng nhựa có pha thêm hạt
nano bạc có tác dụng khử trùng. Qua kiểm tra cho thấy chúng có khả năng diệt
99.9% vi khuẩn. Đồ may mặc: hạt nano bạc được tẩm vào các loại sợi để diệt khuẩn
và khử mùi. Khẩu trang nano bạc: Được thiết kế với 3-4 lớp gồm 2 lớp vải, một lớp
vật liệu tẩm nano bạc và than hoạt tính ở giữa, loại khẩu trang này có khả năng diệt
khuẩn, diệt virus, lọc không khí rất tốt. Lớp vải tẩm nano bạc có chức năng diệt vi
khuẩn, virus, nấm bị giữ lại trên khẩu trang đồng thời có tác dụng khử mùi. Màng
hô hấp: Đó là một tấm màng mỏng có thể cho khí và hơi nước qua nhưng không thể
cho chất lỏng đi qua, có vô số những lỗ khí nhỏ tồn tại trong tấm film. Các hạt nano
bạc gần đây đã được kết hợp với film polyolefin với đặc tính kháng khuẩn rất tốt.
Sơn kháng khuẩn: Bột nano bạc được trộn với sơn và phủ lên các phím điện thoại di
động, tường nhà và các bề mặt cần được bảo vệ. Với khả năng kháng khuẩn tuyệt

vời nano bạc sẽ giữ cho bề mặt không bị nhiễm khuẩn cũng như tiêu diệt nấm mốc
làm tăng tính thẩm mỹ và tuổi thọ công trình. Thiết bị điện tử: Các nhà khoa học
cũng đang nghiên cứu ứng dụng nano bạc để sản xuất linh kiện điện tử phục vụ nhu
cầu ngày càng cao của người tiêu dùng. Các thiết bị điện tử ứng dụng công nghệ
nano sẽ có kích thước nhỏ gọn hơn nhưng lại có tốc độ xử lý và tuổi thọ cao hơn
các thiết bị sử dụng các công nghệ truyền thống.
2.2. Tổng quan về Chitosan
2.2.1. Nguồn gốc Chitin và Chitosan
Chitin được Bracannot phát hiện đầu tiên vào năm 1811 trong cặn dịch
chiết của một loại nấm và đặt tên là “fungine” để ghi nhớ nguồn gốc tìm ra
nó. Năm 1823 Odier đã phân lập một chất từ bọ cánh cứng và ông gọi là
Chitin hay “Chitine” có nghĩa là lớp vỏ nhưng ông không phát hiện ra sự có
mặt của nitơ. Cuối cùng cả Bracannot và Odier đều cho rằng cấu trúc của
Chitin giống cấu trúc của cellulose [3].
Năm 1929 Karrer đun sôi Chitin 24h trong dung dịch KOH 5% và đun tiếp 50
phút ở 160
o
C với kiềm bão hòa và ông đã thu được sản phẩm có phản ứng màu đặc
trưng với thuốc thử, chất đó chính là Chitosan.

7
Việc nghiên cứu về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất lý hóa của Chitosan đã
được công bố từ năm 30 của thế kỷ XX.
Chitin là một polysaccharide tự nhiên quan trọng với số lượng lớn đứng thứ 2
sau cellulose. Chitin tồn tại trong động vật, một số loại nấm [3].
Hình 2.3: Một số loại giáp xác chứa Chitin
Trong động vật, Chitin là một phần cấu trúc quan trọng của vỏ một số động
vật không xương sống như: Côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn. Trong
động vật bậc cao monomer của Chitin là thành phần chủ yếu trong mô da, nó giúp
cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da.

Ngoài ra Chitin còn có trong màng tế bào nấm họ Zygomacetes, các sinh khối
nấm mốc, một số loại tảo Trong nấm men Saccharomyces cerevisiae Chitin chiếm
5% trọng lượng khô của thành tế bào. Hầu hết Chitin nằm giữa các sẹo chồi, chỉ
một phần nhỏ phân bố ở phần khác trên thành tế bào [2].
Trong các loài thủy sản đặc biệt là tôm, cua, mực hàm lượng Chitin khá cao
khoảng 3–41% so với trọng lượng khô. Vì vậy vỏ của chúng là nguồn nguyên liệu
quan trọng để sản xuất Chitin [3].

8
Bảng 2.2: Hàm lượng Chitin trong vỏ một số động vật giáp xác
STT Phân loại Hàm lượng Chitin theo trọng lượng (%)

1 Đầu tôm 11
2 Vỏ tôm 27
3 Vỏ tôm phế thải hỗn hợp 12–18
4 Vỏ tôm hùm 37
5 Càng cua tuyết 24
6 Chân cua tuyết 32
7 Mai mực ống 30–35
8 Đỉa biển 34-49
Chitosan là một polysaccharide sinh học với các đơn phân N-acetyl
glucosamine được deacetyl hóa một phần, hiện diện tự nhiên trong vách một sự
giống nấm như Mucorales. Tuy nhiên phần lớn Chitosan hiện nay được thu nhận và
sử dụng lại chủ yếu từ quá trình deacetyl hóa Chitin.
2.2.2 Cấu trúc hóa học của Chitosan
Chitosan là một polysacarit mạch thẳng, là dẫn xuất deaxetyl của Chitin, trong
đó nhóm (-NH
2
) thay thế nhóm (-COCH
3

) ở vị trí C(2). Chitosan được cấu tạo từ
các mắt xích D-glucosamine liên kết với nhau bởi các liên kết β-(1-4)-glycozit, do
vậy Chitosan có thể gọi là poly β-(1-4)-2-amino-2-deoxi-D-glucozo hoặc là poly β-
(1-4)-D-glucosamine
Hình 2.4: Công thức cấu tạo của Chitin


9
- Công thức cấu tạo của Chitosan (C
6
H
11
O
4
N)
n
.
Hình 2.5: Công thức cấu tạo của Chitosan
- Chitosan thu được nhờ phản ứng deacetyl hóa Chitin, biến đổi nhóm N-
acetyl (-COCH
3
) thành nhóm amin (-NH
2
) ở C
2
. Chitosan được cấu tạo từ các mắt
xích D-glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết β-1-4-glucoside.
- Do quá trình deacetyl xảy ra không hoàn toàn nên người ta quy ước nếu mức
độ deacetyl hóa (degree of deacetylaction–DDA) DDA > 50% gọi là Chitosan còn
DDA < 50% gọi là Chitin.

2.2.3. Tính chất của Chitosan
2.2.3.1. Tính chất vật lý
+ Chitosan tồn tại ở thể rắn, xốp, nhẹ, hình vảy, màu trắng ngà, không mùi,
không vị, có thể xay nhỏ ở các kích thước khác nhau [12].
+ Nhiệt độ nóng chảy 309-311
°
C tùy vào trọng lượng phân tử và mức độ
deacetyl hóa.
+ Mức độ deacetyl hóa: Quá trình deacetyl hóa bao gồm quá trình loại nhóm
acetyl khỏi chuỗi phân tử Chitin và hình thành phân tử Chitosan với nhóm amin
hoạt động hóa học cao. Mức độ deacetyl hóa là một đặc tính quan trọng của quá
trình sản xuất Chitosan bởi nó ảnh hưởng đến tính chất lý hóa, khả năng ứng dụng
của Chitosan.
Mức độ deacetyl hóa vào khoảng 70-100% phụ thuộc vào loài giáp xác,
phương pháp sử dụng. Có nhiều phương pháp để xác định mức độ deacetyl hóa của
Chitosan như: Thử ninhydrin, chuẩn độ theo điện thế, quang phổ hồng ngoại, chuẩn
độ pH…. Trong đó phương pháp sử dụng hồng ngoại thường được sử dụng để thiết
lập các giá trị mức độ deacetyl hóa của Chitosan. Khi ở mức độ deacetyl hóa thấp,
Chitosan có khả năng hút ẩm lớn do vậy trước khi phân tích Chitosan cần phải sấy.

10
+ Trọng lượng phân tử: Chitosan là polyme sinh học có khối lượng phân tử
cao khoảng 10000 - 1000000Da tùy theo điều kiện sản xuất. Thông thường khi
nhiệt độ cao, sự có mặt của oxy và sức kéo có thể dẫn đến phân hủy Chitosan. Ở
280
°
C sự phân hủy do nhiệt có thể xảy ra và mạch Chitosan nhanh chóng bị phá vỡ
do đó khối lượng phân tử giảm. Nguyên nhân của quá trình thay đổi khối lượng
phân tử là do sử dụng nhiệt độ cao và acid đặc như HCl, H
2

SO
4
[18].
+ Độ nhớt: Độ nhớt là nhân tố quan trọng dể xác định khối lượng phân tử của
Chitosan. Chitosan có phân tử lượng lớn làm cho dung dịch có độ nhớt cao. Một số
nhân tố trong quá trình sản xuất như mức độ deacetyl hóa, khối lượng phân tử, nồng
độ dung dịch, độ mạnh của lực ion, pH, nhiệt độ ảnh hưởng đến độ nhớt của
Chitosan. Ví dụ: Độ nhớt của Chitosan tăng khi thời gian khử khoáng tăng. Độ nhớt
của Chitosan trong dung dịch acid acetic tăng khi pH của dung dịch này giảm, tuy
nhiên độ nhớt lại giảm khi pH của dung dịch HCl giảm. Độ nhớt của Chitosan cũng
bị ảnh hưởng bởi các biện pháp xử lý vật lý (nghiền, gia nhiệt, hấp khử trùng, siêu
âm), hóa học (xử lý bằng ozon), độ nhớt sẽ giảm khi thời gian và nhiệt độ xử lý
tăng. Dung dịch Chitosan bảo quản ở 4
°
C được cho là ổn định nhất [18].
+ Tính tan: Chitosan không tan trong nước, dung dịch kiềm và acid đậm đặc
nhưng tan trong dung dịch đệm có pH<6. Các acid hữu cơ: Acetic, formic, lactic
thường được sử dụng để hòa tan Chitosan. Chitosan cũng tan trong dung dịch HCl
1% nhưng không tan trong H
2
SO
4
và H
3
PO
4
. Dung dịch acid acetic nồng độ cao tại
nhiệt độ cao có thể dẫn đến depolyme hóa Chitosan. Ở pH cao, có thể xảy ra hiện
tượng kết tủa hoặc đông tụ nguyên nhân là do hình thành hỗn hợp với chất keo
anion [18].

Khi hòa tan trong dung dịch acid acetic loãng Chitosan sẽ tạo thành dung dịch
keo dương, nhờ đó keo Chitosan không bị kết tủa khi có mặt một số ion kim loại
nặng như: Pb
3+,
Hg
2+
,…
Tỷ lệ nồng độ giữa Chitosan và acid rất quan trọng. Ở nồng độ dung môi hữu
cơ cao hơn 50%, Chitosan vẫn hoạt động như là một chất gây nhớt giúp cho dung
dịch mịn. Các nhân tố ảnh hưởng đến dung dịch Chitosan: Nhiệt độ, mức độ
deacetyl hóa, nồng độ các chất kiềm, việc xử lý sơ bộ, kích thước các phân tử.

11
+ Tỷ trọng: Tỷ trọng của Chitosan trong động vật giáp xác rất cao khoảng
0,39g/cm
3
phụ thuộc vào loài giáp xác, phương pháp chế biến, mức độ deacetyl hóa.
+ Khả năng kết hợp với nước và khả năng kết hợp với chất béo: Sự hấp thụ
nước của Chitosan lớn hơn rất nhiều so với cellulose hay Chitin [18]. Thông thường
khả năng hấp thụ Chitosan khoảng 581-1150%. Sự thay đổi trong thứ tự sản xuất
như quá trình khử khoáng, khử protein cũng ảnh hưởng đến khả năng giữ nước và
giữ chất béo. Sự khử protein sau quá trình khử khoáng sẽ làm khả năng giữ nước
tăng. Quá trình khử màu cũng là nguyên nhân làm giảm khả năng này của Chitosan.
+ Khả năng tạo màng: Chitosan có khả năng tạo màng sử dụng trong bảo quản
thực phẩm.
Khi sử dụng màng Chitosan dễ dàng điều chỉnh nhiệt độ, độ thoáng khí cho
thực phẩm, màng Chitosan khá dai, khó xé rách, có độ bền tương đương với một số
chất dẻo vẫn được dùng để bao gói [3, 14].
2.2.3.2. Tính chất hóa học
+ Trong phân tử Chitosan có chứa các nhóm chức –OH, - NHCOCH

3
trong
các mắt xích N-acetyl-D-glucosamine và nhóm –OH, nhóm –NH
2
trong các mắt
xích D-glucosamine có nghĩa chúng vừa là alcol vừa là amin và amit.
+ Phản ứng hóa học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O-,
dẫn xuất thế N- hoặc dẫn xuất thế O-, N
+ Chitosan là những polysaccharide mà các đơn phân được nối với nhau bởi
các liên kết β-1-4-glucoside, các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất hóa học
như: Acid, base, tác nhân oxi - hóa và các enzyme thủy phân.
+ Trong phân tử Chitosan có chứa các nhóm chức mà trong đó các nguyên
tử oxy và nitơ của nhóm chức có cặp electron chưa sử dụng nên chúng có khả
năng tạo phức với kim loại như: Hg
2+
, Zn
2+
, Cu
2+
, Ni
2+
, Co
2+
…. Tùy nhóm chức
trên mạch polyme mà thành phần và cấu trúc của phức khác nhau.
Ngoài ra Chitosan còn có một số phản ứng đặc trưng như:
+ Phản ứng Van-Wisselingh: Chitosan tác dụng với Lugol tạo dung dịch
màu nâu.

12

+ Phản ứng Alternative: Chitosan tác dụng với H2SO4 tạo tinh thể hình cầu.
+ Chitosan tác dụng với Iod trong môi trường H
2
SO
4
cho phản ứng tạo màu
tím. Đây là phản ứng dùng trong phân tích định tính Chitosan [3].
2.2.3.3. Tính chất sinh học và độc tính của Chitosan
a. Tính chất sinh học
+ Chitosan là hợp chất tự nhiên không độc, dùng an toàn cho người.
+ Chúng có tính hòa hợp cao với cơ thể, có khả năng tự phân hủy sinh học.
+ Chitosan có nhiều tác dụng sinh học đa dạng: Có khả năng hút nước, giữ ẩm,
tính kháng nấm, tính kháng khuẩn với nhiều chủng vi sinh vật khác nhau, kích thích
sự phát triển tăng sinh của tế bào, có khả năng nuôi dưỡng tế bào trong điều kiện
nghèo chất dinh dưỡng, tác dụng cầm máu, chống sưng u.
+ Chitosan còn có tác dụng làm giảm cholesterol và lipid máu, hạ huyết áp,
điều trị thận mãn tính, chống rối loạn nội tiết [18].
+ Chitosan là chất thân lipid có khả năng hấp thụ dầu mỡ cao, chúng có thể
hấp thụ đến gấp 6 - 8 lần trọng lượng phân tử. Chitosan phân tử lượng nhỏ có điện
tích dương nên có khả năng gắn kết với điện tích âm của lipid và acid mật tạo thành
những chất có phân tử lượng lớn không bị tác dụng bởi men tiêu hóa, do đó không
bị hấp thụ vào cơ thể mà được thải ra ngoài theo phân từ đó làm giảm cholesterol,
acid uric trong máu nên tránh được nguy cơ bệnh tim mạch, bệnh gút, kiểm soát
được tăng huyết áp và giảm cân.
+ Với khả năng thúc đẩy hoạt động của các peptide - insulin, Chitosan kích
thích việc tiết ra insulin ở tuyến tụy giúp điều trị bệnh tiểu đường. Nhiều công trình
đã công bố khả năng kháng đột biến, kích thích làm tăng cường hệ thống miễn dịch
cơ thể. Khôi phục bạch cầu, hạn chế sự phát triển các tế bào u, ung thư, HIV.
+ Ngoài ra Chitosan còn có khả năng chống ngứa, chống tia tử ngoại.
b. Độc tính của Chitosan

+ Độ an toàn và độ độc tích lũy

13
Chitosan được thử nghiệm độ an toàn (LD
50
) trên 123 con chuột trắng (18-
21g), chia làm 5 đợt với liều lượng tăng dần 0,0025-0,020g/ngày. Kết quả chuột vẫn
khỏe mạnh.
Theo dõi độc tính tích lũy trên chuột nhắt, liều uống 0,02g/con/ngày, cho uống
liên tục 14 ngày, chuột vẫn sống khỏe mạnh.
+ Độc tố cấp tính
Trên 5 lô chuột nhắt (50 con) cho uống Chitosan với liều lượng 9g/kg thể
trọng. Theo dõi liên tục 72h. Không có con chuột nào chết. Chứng tỏ Chitosan an
toàn.
Kết quả nghiên cứu dược lý cho thấy Chitosan không gây tổn thương cho các
tổ chức, không gây phù nề tại chỗ trên thỏ và chuột.
Từ các thực nghiệm trên cho thấy Chitosan không gây độc tính tại chỗ, không
ảnh hưởng đến trọng lượng cơ thể, trọng lượng gan, cơ quan tạo máu của động vật
thực nghiệm.
Chitosan được sử dụng là chất phụ gia và làm sạch nước uống tại Mỹ [14].
2.2.4. Đặc tính kháng khuẩn và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động kháng
khuẩn của Chitosan
2.2.4.1. Đặc tính kháng khuẩn
Gần đây những nghiên cứu về tính kháng khuẩn của Chitosan đã chỉ ra rằng
Chitosan có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn.
Chitosan có khả năng ức chế vi khuẩn Gram dương, Gram âm, nấm men, nấm
mốc. Khả năng kháng khuẩn của Chitosan phụ thuộc vào các yếu tố như: Mức độ
deacetyl hóa, khối lượng phân tử của Chitosan, pH môi trường, nhiệt độ, sự có mặt
của các thành phần trong thực phẩm. Khả năng kháng khuẩn của Chitosan đã được
nghiên cứu bởi một số tác giả, trong đó cơ chế kháng khuẩn cũng đã được giải thích

trong một số trường hợp. Tuy nhiên trong các cách giải thích đều chỉ ra rằng việc ức
chế vi khuẩn của Chitosan là do liên kết giữa chuỗi polyme của Chitosan với các
ion kim loại trên bề mặt vi khuẩn làm thay đổi tính thấm của màng tế bào. Trong đó
Chitosan tác dụng trên vi khuẩn Gram (-) tốt hơn vi khuẩn Gram (+) [19].

14
Một số cơ chế đã được giải thích:
- Chitosan là polyme tích điện dương trong khi màng tế bào vi sinh vật đa số
tích điện âm, do đó xảy ra tương tác tĩnh điện làm cho màng tế bào vi sinh vật bị
thay đổi, ngăn cản quá trình trao đổi chất qua màng đồng thời xuất hiện các lỗ
hổng trên thành tế bào tạo điều kiện cho protein và các thành phần khác cấu tạo
nên thành tế bào bị thoát ra ngoài từ đó dẫn đến tiêu diệt vi sinh vật [14].
Trong một nghiên cứu khá rộng về tính kháng khuẩn của Chitosan chống lại
E.coli, người ta đã tìm ra rằng nhiệt độ cao và pH acid của thực phẩm làm tăng ảnh
hưởng của Chitosan đến vi khuẩn. Nó cũng chỉ ra cơ chế ức chế vi khuẩn của
Chitosan là do liên kết giữa chuỗi polyme của Chitosan với các ion kim loại trên bề
mặt vi khuẩn làm thay đổi tính thấm của màng tế bào. Khi bổ sung Chitosan vào
môi trường, tế bào vi khuẩn sẽ chuyển từ tích điện âm sang tích điện dương. Quan
sát trên kinh hiển vi huỳnh quang cho thấy rằng Chitosan không trực tiếp hoạt động
ức chế E. coli mà do sự liên kết lại của các tế bào và sự tích điện dương ở màng của
vi khuẩn. Chitosan N-carboxybutyl, một polycation tự nhiên có thể tương tác và
hình thành tương tác tĩnh điện với các polyme acid có trên bề mặt vi khuẩn, do đó
làm dính một lượng vi khuẩn với nhau.
Cũng từ thí nghiệm này người ta thấy rằng có rất nhiều ion kim loại có thể ảnh
hưởng đến đặc tính kháng khuẩn của Chitosan như: K
+
, Na
+
, Mg
2+

, Ca
2+
. Nồng độ
các ion kim loại lớn có thể làm mất tính chất kháng khuẩn của Chitosan, ngoại trừ
ảnh hưởng của Na
+
đối với Staphylococcus aureus. Người ta cũng thấy rằng
Chitosan có thể làm yếu đi chức năng bảo vệ của thành tế bào. Khi sử dụng
Chitosan, một lượng lớn các ion K
+
với ATP bị rò rỉ ở vi khuẩn Staphylococcus
aureus và nấm Candida albicans. Cả Chitosan phân tử lượng 50.000Da và 5.000Da
đều kháng tốt hai loại vi sinh vật trên nhưng Chitosan phân tử lượng 50.000Da làm
mất nhiều gấp 2-4 lần ion K
+
, ATP so với Chitosan 5.000Da. Điều này thể hiện cơ
chế kháng khuẩn khác nhau ở Chitosan có khối lượng phân tử khác nhau. Hoạt
động kháng khuẩn của Chitosan phân tử lượng khác nhau đã được nghiên cứu trên 6
loại vi khuẩn. Cơ chế kháng khuẩn này đã được chứng minh dựa trên việc đo tính
thấm của màng tế bào vi khuẩn và quan sát sự nguyên vẹn của tế bào. Kết quả chỉ ra
rằng khả năng kháng khuẩn giảm khi khối lượng nguyên tử tăng, nó tăng cao ở

15
nồng độ pH thấp và giảm khi có mặt ion Ca
2+
, Mg
2+
. Nồng độ ức chế thấp nhất
khoảng 0,03 -0,25% thay đổi tùy từng loại vi khuẩn và khối lượng phân tử
Chitosan. Chitosan cũng là nguyên nhân làm thoát các chất trong tế bào và phá hủy

thành tế bào [3].
Hoạt tính kháng khuẩn của Chitosan đối với vi khuẩn Gram âm mạnh hơn vi
khuẩn Gram dương. Theo một số nghiên cứu tất cả các vi khuẩn Gram âm đều
có lớp màng ngoài là lipopolysaccharide (LPS), trong đó đóng góp vào sự ổn
định của lớp LPS thông qua tương tác tĩnh điện với các cation, Chitosan loại
bỏ các cation đó. Việc giải phóng LPS làm mất sự ổn định của màng ngoài.
Cơ chế hoạt động kháng khuẩn của Chitosan khác nhau ở vi khuẩn Gram âm
và Gram dương. Trong nghiên cứu này họ phân biệt tác động của Chitosan lên
Staphylococcus aureus (Gram dương) và E.coli (Gram âm). Đối với Staphylococcus
aureus hoạt động kháng khuẩn tăng khi tăng trọng lượng phân tử Chitosan,
Chitosan trên bề mặt tế bào có thể hình thành màng polyme ức chế các chất dinh
dưỡng đi vào tế bào. Đối với E.coli hoạt động kháng khuẩn tăng khi giảm trọng
lượng phân tử khi đó Chitosan sẽ đi vào tế bào thông qua sự khuếch tán [3].
- Các phân tử Chitosan khi phân tán xung quanh tế bào vi sinh vật sẽ tạo ra các
tương tác làm thay đổi ADN ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp mARN, tổng hợp
protein ngăn cản sự hình thành bào tử, ngăn cản sự trao đổi chất và hấp thu các chất
dinh dưỡng của vi sinh vật [18].
- Trong quá trình bảo quản nông sản, Chitosan tiếp xúc với mô thực vật và
kích thích tiết ra các enzyme bảo vệ như: Chitinase, Chitosanase, 1,3-glucanase, từ
đó tiêu diệt vi sinh vật. Tuy nhiên cơ chế này không còn đúng trong trường hợp sử
dụng màng bao Chitosan cho các sản phẩm bảo quản nguyên quả, vì khi đó
Chitosan bao bọc bên ngoài lớp vỏ thực vật, không có điều kiện tiếp xúc với các mô
thực vật nên không thể kích thích tiết enzyme tiêu diệt vi sinh vật.
2.2.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kháng khuẩn của Chitosan
Mức độ kháng vi sinh vật của Chitosan bị ảnh hưởng bởi các yếu tố bên trong
và bên ngoài như khối lượng phân tử, độ deacetyl, pH, nhiệt độ, độ hòa tan, nguồn
gốc và vi sinh vật đích. Để các ứng dụng của hợp chất Chitosan có hiệu quả cần
phải nắm rõ các yếu tố này.