Sàng lọc và nghiên cứu một số chủng Bacillus có khả năng sinh enzyme ngoại bào được phân lập từ rừng Quốc gia Ba Vì và vườn Quốc gia Bidoup Núi Bà của Việt Nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM



VŨ HẢI SƠN


Tên đề tài:
SÀNG LỌC VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS
CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO ĐƯỢC PHÂN LẬP
TỪ RỪNG QUỐC GIA BA VÌ VÀ VƯỜN QUỐC GIA BIDOUP
NÚI BÀ CỦA VIỆT NAM



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy
Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học
Khoa : Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm
Khóa học : 2010 - 2014


Thái Nguyên, năm 2014
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM



VŨ HẢI SƠN

Tên đề tài:
SÀNG LỌC VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS
CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO ĐƯỢC PHÂN LẬP
TỪ RỪNG QUỐC GIA BA VÌ VÀ VƯỜN QUỐC GIA BIDOUP
NÚI BÀ CỦA VIỆT NAM


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC


Hệ đào tạo : Chính quy
Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học
Khoa : Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm
Khóa học : 2010 - 2014
Người hướng dẫn:
1. T.S. Đinh Thị Thu Hằng
(Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam)
2. T.S. Dương Văn Cường
(Khoa CNSH-CNTP - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên)

Thái Nguyên, năm 2014
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc nhất
đến PGS.TS. Đặng Thị Cẩm Hà, TS. Đinh Thị Thu Hằng, KS. Nguyễn Đăng
Thắng và các cán bộ nghiên cứu của phòng phòng Công nghệ sinh học tái tạo
môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam đã tận tình chỉ bảo và dìu dắt tôi trong suốt quá trình học tập,
nghiên cứu hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Dương Văn Cường, cùng

các thầy cô trong Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm đã ân
cần dạy dỗ, truyền đạt kiến thức chuyên môn cũng như kinh nghiệm trong
cuộc sống.
Từ đáy lòng mình, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân và
bạn bè đã tạo điều kiện, giúp đỡ để tôi có được nền tảng đạo đức và kiến
thức vô giá.

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2014
Sinh viên


VŨ HẢI SƠN
MỤC LỤC
Trang
PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

1.1. Đặt vấn đề 1

1.2. Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3. Mục đích nghiên cứu 2

1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1. Enzyme ngoại bào 3

2.1.1. Laccase 3

2.1.2. Protease 8

2.1.3. Chitinase 9

2.1.4. Cellulase 11

2.2. Thuốc nhuộm 12

2.3. Một số phương pháp xử lý nước thải dệt nhuộm 15

2.3.1. Phương pháp hóa lý 15

2.3.2. Phương pháp oxy hóa bậc cao 15

2.3.3. Phương pháp sinh học 15

PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17

3.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị 17

3.1.1. Vật liệu 17

3.1.2. Hóa chất và môi trường nuôi cấy 17

3.1.3. Máy móc và thiết bị 18

3.2. Phương pháp nghiên cứu 18

3.2.1. Sàng lọc các chủng vi khuẩn sinh enzyme ngoại bào (chitinase,
cellulase, protease) 18

3.2.2. Sàng lọc vi khuẩn sinh laccase ngoại bào 19

3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường đến khả
năng sinh trưởng và sinh laccase của chủng BBV11 20

3.3.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy 20

3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ CuSO
4
20

3.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ 20

3.3.4. Ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu 21

3.4. Nghiên cứu khả năng loại màu thuốc nhuộmcủa chủng BBV11 21

3.4.1. Phân loại theo phương pháp truyền thống 21

3.4.2. Phân loại bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự gen mã
hóa 16S rRNA 21

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

4.1. Sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả năng sinh một hoặc một số
enzyme ngoại bào 24

4.1.1. Khả năng sinh protease, chitinase, cellulase 24

4.1.2. Khả năng sinh laccase 26

4.2. Phân loại chủng BBV1 27

4.2.1. Phân loại theo phương pháp truyền thống 27

4.2.2. Phân loại bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự gene mã
hóa 16S rRNA 28

4.3. Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh laccase
ở chủng BBV11 29

4.3.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy 29

4.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ CuSO
4
30

4.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ 31

4.3.4. Ảnh hưởng của pH môi trường 32

4.4. Khả năng loại màu của chủng BBV11 34

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37


DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Trang
Hình 2.1 Cấu trúc không gian của phân tử laccase 5

Hình 4.1 Hình thái khuẩn lạc của chủng BBV11 trên môi trường PDA-M
không bổ sung (A) và có bổ sung guaiacol (B) 26

Hình 4.2 Hoạt tính laccase của 3 chủng vi khuẩn BBV11, BBD9 và
BBD38 27

Hình 4.3 Hình thái khuẩn lạc (A) và hình thái tế bào được quan sát dưới
kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 13000 lần (B) 28

Hình 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ CuSO
4
đến khả năng sinh laccase của
chủng BBV11 30

Hình 4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh laccase của chủng BBV11 32

Hình 4.6 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh laccase 33

Hình 4.7 Hiệu quả loại màu và khả năng sinh laccase của chủng BBV11
sau 6 ngày nuôi 34

Hình 4.8 Màu Dimaren Black CLS tại thời điểm ban đầu (A) và sau 6
ngày nuôi (B) 34

DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Các vi sinh vật sinh laccase 4

Bảng 2.2 Một số vi sinh vật sinh laccase và ứng dụng 7

Bảng 2.3 Nguồn vi sinh vật sinh cellulase 12

Bảng 3.1 Thành phần phản ứng xác định hoạt tính laccase 19

Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR 23

Bảng 4.1 Khả năng sinh chitinase, cellulase và protease của một số chủng
vi khuẩn nghiên cứu 24

Bảng 4.2 Hoạt tính laccase của chủng BBV11 trên các môi trường khác nhau 29

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
2,4-DCP 2,4 – dichlorophenol
2,6-DMP 2,6 – dimethoxyphenol
ABTS 2,2’–azino–bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)
DDT 1,1,1-trichloro-2,2-bis(4-chlorophenyl) ethane
LMS Laccase-mediator system
OD Optical density
PAH Polycyclic aromatic hydrocarbons
PCB Polychlorinated biphenyls
POPs Persistent organic pollutants
RBBR Remazol Brilliant Blue R
TNT Trinitrotoluen
U/l Unit per litre


1

PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trong thế kỷ XXI, Các lĩnh vực sản xuất công nghiệp vẫn là xương sống
của hầu hết quốc gia trên Thế giới. Hiện nay ở Việt Nam, sự gia tăng dân số
vượt ngưỡng 90 triệu người là cơ hội và cũng là thách thức không nhỏ. Được
thiên nhiên ưu đãi với nguồn tài nguyên, thiên nhiên phong phú, sự phát triển
nhanh chóng của công nghiệp đang đem lại lợi ích không thể phủ nhận. Tuy
nhiên, cùng với sự phát triển đó thì môi trường ngày càng bị ô nhiễm nghiêm
trọng do những chất thải công nghiệp gây ra. Môi trường đất và nước ở nhiều
đô thị, khu công nghiệp và làng nghề bị ô nhiễm do thiếu các công trình, thiết
bị và biện pháp xử lý chất thải hiệu quả. Mỗi ngành công nghiệp khác nhau
lại tạo ra nguồn ô nhiễm và gây ô nhiễm môi trường đất, nước, không khí ở
những mức độ khác nhau. Tùy vào loại và mức độ ô nhiễm mà có những biện
pháp xử lý riêng biệt. Tuy nhiên, có một số phương pháp xử lý ô nhiễm chính
là phương pháp vật lý, phương pháp hóa học, phương pháp sinh học và sự kết
hợp của các phương pháp này. So với phương pháp vật lý và phương pháp
hóa học thì phương pháp xứ lý ô nhiễm môi trường bằng sinh học sử dụng vi
sinh vật đã và đang được đặc biệt quan tâm do lợi ích về mặt kinh tế và thân
thiện với môi trường mà phương pháp này đem lại.
Vi sinh vật được sử dụng trong xử lý bao gồm nấm, xạ khuẩn và vi
khuẩn sinh enzyme ngoại bào có khả năng chuyển hóa và phân hủy các hợp
chất hữu cơ khó phân hủy. Trong số các enzyme ngoại bào laccase, chitinase,
cellulase, protease đã và đang được quan tâm nghiên cứu trên thế giới cũng
như ở Việt Nam do khả năng những ứng dụng của chúng trong nhiều lĩnh
vực. Đặc biệt, laccase có phổ cơ chất rộng và được ứng dụng trong công nghệ
sinh học môi trường (phân hủy các chất vòng thơm, loại màu thuốc nhuộm
v.v.), công nghệ thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm.
Vi khuẩn Bacillus được tìm thấy nhiều trong tự nhiên, được nghiên cứu
và ứng dụng rộng rãi do chúng có khả năng sinh bào tử, sinh trưởng trong
những điều kiện khắc nghiệt và khả năng sinh một số enzyme ngoại bào đề

cập ở trên. Một số đại diện của vi khuẩn này như Bacillus subtilis, Bacillus
thuringiensis…


2
Do đó đề tài “Sàng lọc và nghiên cứu một số chủng Bacillus có khả
năng sinh enzyme ngoại bào được phân lập từ rừng Quốc gia Ba Vì và
vườn Quốc gia Bidoup Núi Bà của Việt Nam” đã được tiến hành, với nội
dung sau:
• Sàng lọc các chủng vi khuẩn được phân lập từ lá mục và đất mùn rừng
Quốc Gia Ba Vì và vườn Quốc Gia Bidoup Núi Bà có khả năng sinh một hoặc
một số enzyme ngoại bào.
• Phân loại và định tên chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme ngoại
bào với hoạt tính cao theo phương pháp truyền thống và xác định trình tự
gene mã hóa 16S rRNA.
• Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy như môi trường,
pH, nồng độ chất cảm ứng, nhiệt độ lên khả năng sinh tổng hợp laccase của
chủng vi khuẩn đã tuyển chọn.
• Đánh giá khả năng loại màu thuốc nhuộm của chủng được tuyển chọn.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Sàng lọc được chủng Bacillus có khả năng sinh một số enzyme ngoại
bào (laccase, proteinase, chitinase, cellulase).
Xác định một số điều kiện nuôi cấy thích hợp để chủng Bacillus lựa chọn
sinh tổng hợp enzyme ngoại bào có hoạt tính cao và ổn định.
1.3. Mục đích nghiên cứu
Tăng cường, nâng cao kĩ năng thực hành, kiến thức chuyên môn và đóng
góp một phần khả năng nghiên cứu khoa học của sinh viên.
1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Tuyển chọn được các chủng có họat tính enzyme tốt và ứng dụng trong
xử lý ô nhiễm môi trường

3
PHẦN 2:
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Enzyme ngoại bào
2.1.1. Laccase
 Giới thiệu về laccase
Laccase (p-benzenediol: oxygen oxyreductase, E.C.1.10.3.2) là một
polyphenol enzyme thuộc nhóm enzyme oxy hóa. Trong phân tử có 4 nguyên
tử đồng có khả năng oxy hóa các hợp chất hữu cơ đa vòng thơm và sử dụng
phân tử oxy làm chất nhận điện tử. Khác với phần lớn các enzyme, laccase có
phổ cơ chất khá đa dạng bao gồm: diphenol, polyphenol, các dẫn xuất phenol,
diamine, amine thơm, benzenthiol, polychlorinated biphenyl (PBC), dioxin và
cả hợp chất vô cơ như iot. Laccase là enzyme rất phổ biến trong tự nhiên,
chúng được tìm thấy ở thực vật, nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn và côn trùng.
Laccase lần đầu tiên được phát hiện ở cây Rhus vernicifera. Các loại laccase
tách chiết từ các nguồn khác nhau thì khác nhau về khối lượng phân tử, tính
chất glycosyl hóa và các tính chất động học [46].
 Nguồn laccase từ vi sinh vật
Laccase được phân bố rộng rãi ở nấm, thực vật bậc cao, vi khuẩn, xạ
khuẩn và côn trùng. Hơn 60 chủng nấm thuộc nhiều lớp khác nhau như:
Ascomycete, Basidiomycetes và Deuteromycetes, được chứng minh là có
khả năng sinh laccase [22]. Martins và cộng sự, cùng các tác giả khác đã
đưa ra 1 số loài vi khuẩn và nấm quan trọng sinh laccase với hoạt tính cao
được trình bày ở bảng 1.1


4
Bảng 2.1 Các vi sinh vật sinh laccase

Nguồn sinh vật
Tài liệu tham
khảo
Nguồn
sinh vật
Tài liệu tham
khảo

Vi
khuẩn
Azospirillium
lipoferum
Faure et al. (1994) Bacillus
subtillis
Martins et al.
(2002)
S. maltophilia
AAP56
Galai et al. (2009) Streptomyces
coelicolor
Dube et al.
(2008)



Nấm
Cerrena
unicolor
D’Souza – Ticlo et
al. (2009

Pleurotus
ostreatus
Abo-State et al.
(2011)
Lentinus
tigrinus
Ferraroni et al
(2007)
Trametes sp. Li et al. (2008),
Guo et al.
(2012)
Pestalotigis
sp.
Verma et al.
(2010)
F. troggi Ciullini et al.
(2008)

 Vi khuẩn Bacillus sinh laccasse:
Nghiên cứu về vi khuẩn sinh laccase đã được công bố lần đầu vào năm
1993 và tiếp tục đẩy mạnh nghiên cứu trong những năm sau đó [24].
Theo Hullo và cộng sự (2001), protein CotA từ áo bào tử của Bacillus
subtilis biểu hiện tương đồng với khả năng của các enzyme oxy hóa đa nhân
đồng, tuy nhiên không phải CotA từ các protein thuộc bào tử khác cũng có
khả năng này. Từ đó chứng minh được CotA là 1 loại laccase [33]. Một
nghiên cứu khác của Meyer và cộng sự cho thấy khả năng sinh CotA-type
laccase từ chủng Bacillus pumilis [44].
Theo Kaushik và Thakur (2014), chủng Bacillussp. được phân lập từ nhà
máy sản xuất rượu có khả năng sinh tổng hợp laccase ngoại bào với hoạt tính
cao nhất là 107,32 U/ml [20].

5
Held và cộng sự (2005) đã tìm được bào tử sinh tổng hợp laccase từ
chủng Bacillus sp. SF và những bào tử tự do này có khả năng loại hoàn toàn
các loại thuốc nhuộm phổ biến như: Mordant Black 9, Mordant Brown
96/Mordant Brown 15 và Acid Blue 74 sau 90 phút [10].
Một nghiên cứu khác của Olukanni và cộng sự (2013) cho thấy, chủng vi
khuẩn Bacillus thuringiensis RUN1 được phân lập từ mẫu đất trồng bắp cải
có khả năng sinh laccase với hoạt tính cao nhất đạt 0,1043 ± U/min/mg
protein, được xác định sau 24 giờ nuôi và sử dụng ABTS là cơ chất. Cũng
trong nghiên cứu này, chủng B. thuringiensis RUN1 có khả năng loại 84,67 ±
1,19% màu malachite green (MG) nồng độ 40mg/l trong 6 giờ [38].
 Cấu trúc phân tử laccase
Phân tử laccase thường ở dạng monomeric protein, chỉ một số ở dạng
oligomeric protein có khối lượng phân tử dao động trong khoảng 60 - 90 kDa.
Tuy vậy, tất cả các laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với 4
nguyên tử đồng thuộc 3 loại khác nhau nằm ở các vị trí khác nhau của
enzyme. Bốn nguyên tử đồng này được chia thành 3 nhóm: loại 1 (T1), loại 2
(T2), loại 3 (T3), chúng khác nhau về tính chất hấp thụ ánh sáng và thế điện
tử. Các nguyên tử đồng T1 và T2 có tính chất hấp thụ điện tử và tạo thành phổ
điện tử mạnh, trong khi cặp đồng nguyên tử T3 không tạo phổ điện tử hấp thụ
điện tử và có thể được hoạt hóa khi liên kết với anion mạnh [40].

Hình 2.1 Cấu trúc không gian của phân tử laccase


6
Phân tử laccase thông thường bao gồm 3 tiểu phần (vùng) chính A, B ,C
có khối lượng tương đối bằng nhau, cả ba phần đếu có vai trò trong quá trình

xúc tác của laccase. Vị trí liên kết với cơ chất nằm ở khe giữa vùng B và vùng
C, trung tâm một nguyên tử đồng nằm ở vùng C và trung tâm ba nguyên tử
đồng nằm ở bề mặt chung của vùng A và vùng C [32].
 Ứng dụng của laccase
Loại màu: công nghiệp dệt sử dụng một lượng lớn nước và hóa chất để
phục vụ cho xử lý ướt. Những hóa chất này bao gồm các thành phần vô cơ và
các thành phần hữu cơ. Laccase có khả năng phân hủy và loại màu thuốc
nhuộm và các màu tổng hợp, điều đó giải thích vì sao những nghiên cứu về
enzyme này được phát triển và sử dụng hiệu quả trong nhiều ngành công
nghiệp [16]. Cũng theo Blanquez và cộng sự (2004), nấm Trametes
versicolour loại được hoàn toàn màu Reactive Blue 15, Congo Red và
Reactive Black 5, trong khi chỉ loại được một phần màu Brilliant Red 3G-P,
Brilliant Yellow 3B-A và RBBR
Trong công nghiệp giấy: các chất oxy hóa dựa vào clo và oxy được sử
dụng để phân tách và phân hủy lignin – yêu cầu cần thiết để chuẩn bị cho giấy
thành phẩm ở mức độ công nghiệp. Khả năng phân hủy lignin bằng vi sinh
vật đã được nghiên cứu sâu ở nấm, nhưng chưa được thực hiện nhiều ở vi
khuẩn. Bugg và cộng sự (2011) đã đưa ra gợi ý về một số vi khuẩn đất,
thường là vi khuẩn có khả năng phân hủy các hợp chất thơm để phân giải
lignin [9].
Hiện tại, Bacillus sinh laccase kiềm tính,chịu nhiệt đã được nghiên cứu
trong xử lý bột gỗ [51]. Một vài ứng dụng của laccase từ nhiều nguồn vi sinh
vật khác nhau được trình bày ở bảng 1.2.


7
Bảng 2.1 Một số vi sinh vật sinh laccase và ứng dụng
Ứng dụng Nguồn laccase Tài liệu tham khảo
Loại màu thuốc
nhuộm

Aspergillus (chuyển gen) Soares et al., (2001)
Aspergillus niger Soares et al., (2002)
Cerrena unicolor Michniewicz et al., (2003)
Coriolopsis gallica Reyes et al., (1999)
Coriolopsis rigida Gómez et al., (2005)
Trametes hirsute Campos et al., (2001)
Trametes versicolor Claus et al., (2002)
Phân hủy
xenobiotics



Cladosporium sphaerospermum Potin et al., (2004)
Coprinus cinereus Kulys et al. (2003)
Myceliophtora thermophyla Nicotra et al. (2004)
Panus tigrinus Zavarzina et al. (2004)
Pyricularia oryzae Lante et al. (2000)
Cảm biến sinh học


Agaricus bisporus Timur et al. (2004)
T. versicolor Vianello et al. (2004)
P. ostreatus Leite et al. (2003)
Rhus vernicifera Gardiol et al. (1996)
Xử lý nước thải

Gliocladium virens Murugesan (2003)
Lentinula edodes D'Annibale et al. (1999)
Pleurotus spp. Tsioulpas et al. (2002)
Pycnoporus coccineus Jaouani et al. (2005)
Trametes sp. strain AH28-2 Xiao et al. (2003)

Đối với công nghiệp thực phẩm, laccase được sử dụng để loại bỏ những
thành chứa phenolic khi làm bánh [14]. Laccase cũng được dùng vào các quá
trình tăng cường hoặc thay đổi màu sắc xuất hiện trong thực phẩm và đồ
uống. Trong ngành công nghiệp bia, laccase không chỉ đem lại sự ổn định mà
còn giúp tăng thời hạn sử dụng sản phẩm [34], [45].
Trong lĩnh vực xử lý sinh học và phân hủy sinh học, y tế, dược phẩm,
mỹ phẩm và công nghệ nano: hiện tại, các nghiên cứu hữu ích được tập trung


8
vào ứng dụng của laccase như những chất xúc tác sinh học mới trong tổng
hợp các hợp chất hữu cơ [7]. Laccase được ứng dụng trong tổng hợp chất hữu
cơ oxy hóa của các nhóm chức, cặp chất phenol và steroid, tác nhân y sinh
(gây mê, chống viêm, kháng sinh, an thần), cấu trúc của các liên kết nitrogen
– carbon và trong tổng hợp các sản phẩm tự nhiên phức tạp [36].
Trong lĩnh vực xử lý đất ô nhiễm: PAHs kết hợp với các xenobiotics gây
độc cho đất, tuy nhiên với khả năng phân hủy triệt để các hợp chất đó, laccase
có vai trò vô cùng quan trọng với môi trường nhờ tính chất xúc tác tuyệt vời
của chúng [14].
2.1.2. Protease
Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy
phân liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và peptid thành các acid
amin tự do, một vài peptid ngắn, pepton. Protease là một trong những nhóm

enzyme quan trọng nhất của ngành công nghiệp enzyme, chiếm khoảng 60%
thị trường các enzyme [37]. Các protease của vi sinh vật mới được chú ý
nghiên cứu nhiều từ năm 1950, mặc dù từ năm 1918 – 1919 Waksman đã phát
hiện được khả năng phân giải protein của xạ khuẩn. Trong hơn 10 năm nay,
số công trình nghiên cứu protease vi vinh vật tăng lên đáng kể, nhiều hơn các
công trình nghiên cứu protease của động vật và thực vật. Những kết quả đạt
được trong lĩnh vực nghiên cứu protease vi sinh vật đã góp phần mở rộng quy
mô sản xuất chế phẩm enzyme và ứng dụng enzyme trong thực tế. Trong thời
gian gần đây, các nhà nghiên cứu cũng đã đưa ra những phương pháp thích
hợp để nhận chế phẩm không tan của protease. Kết quả này mở ra triển vọng
to lớn trong nghiên cứu và các ứng dụng của các protease.
Protease là enzyme có giá trị thương mại to lớn và được ứng dụng
trong các ngành công nghiệp khác nhau, đặc biệt là ngành công nghiệp chất
tẩy rửa, thực phẩm và thuộc da [5]. Một số protease kiềm tính được công
bố là có khả năng phân giải các protein dạng sợi từ sừng, lông và tóc [23],
ngoài ra protease còn được ứng dụng trong xử lý các vết máu trên các dụng
cụ phẫu thuật [52].


9
Trên thế giới, khả năng sinh protease từ các chủng Bacillus là hết sức đa
dạng, theo Afia và Shahida (2010) chủng Bacillus subtillis được phân lập từ
vườn ươm cây cảnh đã sinh protease ngoại bào với hoạt tính cao lên tới
198,543 U/ml [21].
Theo Nurullah Akcan và Fikret Uyar (2011), chủng Bacillus subtilis
RSKK96 sinh protease kiềm tính (alkaline protease) được lên men rắn, hoạt
tính enzyme thu được lên đến 5759,2 U/mg [6].
2.1.3. Chitinase
Chitinase (EC 3.2.14) [polyβ-1,4-(2-acetamido-2-deoxy) – D-glucosid
glucanohydrolase] thuộc nhóm emzyme thủy phân (hydrolase), là enzyme có

khả năng thủy phân chitin thành chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự
thủy phân liên kết 1,4-β-glucosid trong chitin [4]. Chitinase có trong nhiều
loại cơ thể sống khác nhau bao gồm vi khuẩn, nấm, thực vật, động vật không
xương sống và động vật có xương sống. Chitinase thực vật là các enzyme có
khả năng xúc tác thủy phân chitin của nấm bệnh. Tuy nhiên không phải cây
trồng nào cũng có khả năng sản xuất chitinase, hoặc hoạt tính chitinase của
chúng đủ cao để kháng lại nấm bệnh. Chitinase còn được tìm thấy trong vi
khuẩn như Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio,
Bacillus và đặc biệt ở nhóm Streptomycetes. Vi khuẩn tổng hợp chitinase để
phân giải chitin trong môi trường nhằm sử dụng làm nguồn cacbon cho sinh
trưởng và phát triển của chúng [39]. Vì vậy, việc tìm ra chủng vi sinh vật có
khả năng sản xuất enzyme này với hoạt tính cao có ý nghĩa rất quan trọng.
Ứng dụng của chitinase:
Trong phòng trừ nấm gây bệnh ở thực vật: theo Hiroshi [26], chitinase luôn
có mặt trong cơ thể thực vật mặc dù trong cây không chứa chitin. Chitinase và β-
1,3-glucanase được tạo ra trong mô thực vật khi tế bào bị kích thích bởi nấm gây
bệnh chứa chitin, xúc tác sự thủy phân vách tế bào nấm và ngăn cản sự phát triển
của nấm bệnh. Sự kích thích hoạt tính chitinase là dấu hiệu trả lời của tế bào đối
với tác động của tác nhân gây bệnh, đi kèm với sự kích thích hoạt tính phân giải
amoniac, phenylalanin làm tiền đề cho sự tổng hợp lignin và phytoalexin ở thực
vật [3]. Bên cạnh đó, các nhà khoa học cũng đã chứng minh quá trình chống lại


10
các mầm bệnh thực vật có liên quan đến việc sản xuất chitinase. Vi khuẩn có khả
năng chống lại nấm bệnh bằng cách sản xuất ra chitinase (Fridlender và cộng sự,
1993; Gay và cộng sự, 1992). Chitinase của Streptomyces có khả năng kì hãm sự
phát triển của nấm [18], [28].
Toyoda đã bổ sung vào đất một lượng thích hợp chitin nhằm kích thích
sự phát triển của các chủng vi khuẩn sinh chititnase (những vi sinh vật này

chiếm ưu thế ở vùng rễ) [2]. Xạ khuẩn Streptomyces anulatus đươc cố định
trong một giọt gel alginate canxi và đưa vào đất, chủng xạ khuẩn này phát
triển mạnh trong đất có chứa chitin và ức chế một cách mạnh mẽ sự phát triển
của những mầm bệnh từ nấm, như kiểm soát bệnh héo của cây cà chua gây ra
bởi nấm Fusarium oxysporum [15].
Trong lĩnh vực y dược, chitinase được ứng dụng trong chẩn đoán các
bệnh do vi nấm. Chitin hiện diện trong vách hầu hết các nấm truyền bệnh, ít
nhất là một giai đoạn trong chu trình sống của nấm, ở nấm men thì hiện diện
trong vết chồi. Do đó, một phương pháp nhuộm chitin đặc hiệu chỉ đặc hiệu
cho nấm, nhờ đó xây dựng một phương pháp chẩn đoán nhanh chóng, hiệu
quả các loài nấm gây bệnh [29].
Hiện nay, các nhà khoa học đã đề xuất một phương pháp chẩn đoán mới
các bệnh truyền nhiễm do nấm là sử dụng chitinase hay protein kết hợp đặc
hiệu với chitin. Một chitinase đã được phân lập và nhân dòng từ Vibrio
parahemolyticus (đặt tên là chitinase VP1), nó có khả năng kết hợp chặt chẽ
với chitin và được sử dụng như một mẫu dò trong việc chẩn đoán với độ nhạy
cao để nhận diện một cách đặc hiệu các vách tế bào nấm hay những vết chồi
nấm men trong những lát cắt mẫu mô bệnh. Bên cạnh đó, với các dịch cơ thể
có thể dùng một test xét nghiệm bằng bộ lọc (Spin-X, Costar Co.), hệ thống
enzyme liên kết sẽ kiểm soát một lượng nhỏ những chất liệu của vách tế bào
nấm hay vết chồi của nấm men hiện diện trong dịch cơ thể. Chitinase VP1
được tạo dòng, biểu hiện và chuyển vào trong E.coli ở mức độ cao và sản xuất
ra khoảng 30mg/L trong môi trường trung tính [29].
Ngoài ra chitinase còn có 1 số ứng dụng khác như: sản xuất
chitooligosaccharides, glucosamine và N- acetylGlucosamine [1], [4].


11
2.1.4. Cellulase
Cellulose là polymer hữu cơ phổ biến nhất trong tự nhiên, hàng năm có

khoảng 1.5x10
12
tấn sinh khối được sản xuất thông qua quá trình quang hợp,
đặc biệt là ở các vùng nhiệt đới và nó cũng được xem như một nguồn vật liệu
thô vô tận để tạo ra các sản phẩm khác nhau [43].
Cellulase là enzyme thủy phân cellulose tạo thành các sản phẩm sơ cấp
như glucose, cellobiose và cello-oligosaccharides. Có 3 dạng cellulase chính
là: cellobiohydrolase (CBH hoặc 1,4-β-D-glucan cellobiose, EC 3.2.1.91),
Endo-β-1,4-glucanase (EG hoặc endo-1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase,
EC 3.2.14) và β-glucosidase (BG-EC 3.2.1.21).
Cellulase từ nấm có cấu trúc đơn giản hơn khi so sánh với cấu trúc hệ
enzyme từ vi khuẩn. [54]. Cellulase điển hình từ nấm có 2 vùng riêng biệt:
vùng xúc tác và phần còn lại là điểm bám của phân tử cellulose (cellulose
binding molecular - CBM). CBM bao gồm khoảng 35 amino acids, vùng nối
giữa 2 vùng riêng biệt chứa nhiều serine và threonine. Điểm khác biệt chủ yếu
giữa cellulosomes (là một phức hợp đa enzyme lớn) và các cellulase tự do là
ở trong thành phần của cellulosomes-cohesin chứa scaffolding và dockerine.
Cellulases tự do chứa CBMs, là điểm được thay thế bởi một phân tử
dockerine trong phức hợp cellulosomal và một scaffolding được tạo ra trực
tiếp từ cellulosomes [17].
Cellulase được tổng hợp từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau như vi
khuẩn, nấm và xạ khuẩn, một số nguồn vi sinh vật sinh cellulase được trình
bày ở Bảng 1.3 [43], [11], [31].


12
Bảng 2.2 Nguồn vi sinh vật sinh cellulase
Chi Loài
Nấm

Aspergillus
A. niger
A. nidulans
A. oryzae
Fusarium
F. solani
F. oxysporum

Penicillium
P. brasilianium
P. occitanis
P. decumbans
Vi khuẩn
Acidothermus A. cellulolyticus

Bacillus
Bacillus sp
Bacillus subtilis
Clostridium C. acetobutylicum
Pseudomonas P. cellulose
Xạ khuẩn

Cellulomonas
C. fimi
C. bioazotea
C. uda
Những sinh vật này có khả năng sinh trưởng trong điều kiện môi trường
đa dạng: hiếu khí, kị khí, chịu nhiệt và ưa nhiệt trung bình. Trong số đó, các
loài thuộc chi Clostridium, Cellulomonas, Thermomonospora, Tricoderma và
Aspergillus đã được nghiên cứu về khả năng sinh cellulase [42]. Cellulase

được ứng dụng trong chuyển hóa sinh khối, đưa ra một phương hướng nghiên
cứu mới ứng dụng vào các ngành công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt,
sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp giấy và trong chăn nuôi [43].
2.2. Thuốc nhuộm
Thuốc nhuộm có nguồn gốc từ tự nhiên hoặc được tổng hợp,là những
chất có màu, hấp thụ mạnh một phần nhất định của quang phổ ánh sáng nhìn
thấy và có khả năng gắn kết vào các vật liệu dệt. Hiện nay, hầu hết thuốc
nhuộm được sử dụng là thuốc nhuộm tổng hợp. Thuốc nhuộm được sử dụng


13
là những loại có độ bền màu cao, tuy nhiên đây cũng là vấn đề trong việc xử
lý nước thải chứa màu. Màu sắc của thuốc nhuộm có được là do cấu trúc hóa
học của chúng. Thành phần của thuốc nhuộm bao gồm các nhóm mang màu
và nhóm trợ màu. Nhóm mang màu là những nhóm có các liên kết đôi liên
hợp với hệ điện tử π linh động như >C=C<, >C=N-, -COOH, -OH, -N=N- ,
nhóm trợ màu là nhóm thế cho hoặc nhận điện tử như –SOH, -COOH, -OH, -
NH
2
đóng vai trò tăng cường màu của nhóm mang màu bằng cách dịch
chuyển năng lượng của hệ điện tử.
Thuốc nhuộm tổng hợp rất đa dạng về thành phần hóa học, màu sắc,
phạm vi sử dụng. Tùy thuộc cấu tạo, tính chất và phạm vi sử dụng, thuốc
nhộm được phân chia thành các họ, các loại khác nhau. Có hai cách phân loại
thuốc nhuộm phổ biến nhất:
Phân loại theo cấu trúc hóa học (dựa vào nhóm mang màu –
chromogen).
Phân loại theo lĩnh vực và phương pháp sử dụng.
Phân loại theo cấu trúc hóa học.
Cách phân loại này dựa trên bản chất của nhóm mang màu (chromogen),

có 12 chromogen chính, từ đây phân thành 20 - 30 họ thuốc nhuộm khác
nhau. Các họ chính là:
Thuốc nhuộm azo: Nhóm mang màu là nhóm azo (-N=N-), phân tử
thuốc nhuộm có một hay nhiều nhóm azo. Đây là họ thuốc nhuộm quan trọng
nhất và có số lượng lớn nhất, chiếm khoảng 60-70% lượng các thuốc nhuộm
tổng hợp, chiếm 2/3 các màu hữu cơ trọng bộ đại từ điển về thuốc nhuộm
(Color Index (CI)).
Thuốc nhuộm anthraquinon: trong phân tử thuốc nhuộm có chứa một
hay nhiều nhóm antraquinon hoặc các dẫn xuất của nó:



14
Họ thuốc nhuộm này chiếm đến 15% số lượng thuốc nhuộm tổng hợp.
Đây là họ phổ biến thứ 2 sau thuốc nhuộm azo trong các số các loại thuốc
nhuộm tổng hợp.
Thuốc nhuộm triaryl metan: triaryl metan là dẫn xuất của metan mà
trong đó nguyên tử C trung tâm sẽ tham gia liên kết vào mạch liên kết của hệ
mang màu:

Họ thuốc nhuộm này phổ biến thứ 3, chiếm 3% tổng số thuốc nhuộm.
Họ thuốc nhuộm phtaloxianin: nhóm mang màu trong phân tử của chúng
là hệ liên hợp khép kín. Đặc điểm chung của họ thuốc nhuộm này là những
nguyên tử H trong nhóm amin dể bị thay thế bởi ion kim loại, còn các nguyên
tử N thì tham gia tạo phức với kim loại làm màu của thuốc nhuộm thay đổi.
Họ thuốc nhuộm này có độ bền màu với ánh sáng rất cao. Chiếm khoảng 2%
tổng số lượng thuốc nhuộm.
Phân loại theo lĩnh vực, phương pháp sử dụng
Đây là cách phân loại thuốc nhuộm thương mại đã được thống nhất trên
toàn cầu và liệt kê trong CI, trong đó mỗi thuốc nhuộm được chỉ dẫn về cấu

tạo hóa học, đặc điểm về màu sắc và phạm vi sử dụng. Theo đặc tính áp dụng,
thuốc nhuộm sử dụng cho xơ sợi cellulose (bông, visco…) đựơc tâm nhiều,
đó là các thuốc nhuộm hoàn nguyên, lưu hóa, hoạt tính và trực tiếp. Sau đó là
các thuốc nhuộm cho xơ sợi tổng hợp, len, tơ tằm như: thuốc nhuộm phân tán,
thuốc nhuộm bazo (cation), thuốc nhuộm acid.
Thuốc nhuộm được sử dụng rộng rãi trong các ngành như: công nghiệp
dệt nhuộm, thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, in ấn và công nghiệp thuộc da.
Các ngành công nghiệp này đã tạo ra nước thải có độ màu cao, chứa các chất
độc tố, khó phân hủy. Ở Việt Nam, ngành công nghiệp dệt nhuộm đang phát


15
triển ở những quy mô khác nhau. Nước thải dệt nhuộm thường có nhiệt độ,
pH và độ màu cao, chứa nhiều loại hóa chất khó phân hủy. Nếu không được
xử lý, nước thải dệt nhuộm sẽ gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Do đó,
việc xử lý nước thải dệt nhuộm trước khi xả thải ra môi trường là rất cần thiết,
đò hỏi phải có biện pháp xử lý triệt để.
2.3. Một số phương pháp xử lý nước thải dệt nhuộm
Nhìn chung, các phương pháp xử lý nước thải dệt nhuộm được áp dụng
phổ biến ở các cơ sở dệt nhuộm ở nước ta hiện nay chủ yếu theo 3 phương
pháp và thường được ứng dụng riêng rẽ hoặc kết hợp để xử lý nước thải dệt
nhuộm là: phương pháp hóa lý, phương pháp oxy hóa bậc cao và phương
pháp sinh học.
2.3.1. Phương pháp hóa lý
Các phương pháp hóa lý như keo tụ tạo bông, tuyển nổi và hấp phụ chỉ
chuyển chất màu từ pha này sang pha khác mà không làm biến đổi bản chất,
cấu trúc chất màu. Do đó, trong xử lý nước thải màu thì các phương pháp trên
có nhược điểm là không xử lý triệt để chất màu và các chất gây ô nhiễm, chất
ô nhiễm này sẽ tích lũy ở bùn hay chất hấp phụ và phải mất chi phí để xử lý
bùn và chất hấp phụ này. Riêng đối với thuốc nhuộm hoạt tính, keo tụ - tạo

bông hiệu quả rất thấp, chi phí cho hóa chất cao, tạo thành nhiều bùn (0,5 –
2,5 kg TS/m3 nước thải xử lý) [8].
2.3.2. Phương pháp oxy hóa bậc cao
Đối với phương pháp oxy hóa bậc cao, các chất oxy hóa thường được sử
dụng là chloride (Cl
2
), hydroxyl peroxide (H
2
O
2
) và ozone (O
3
), trong đó Cl
2

được đánh giá là chất oxy hóa kinh tế nhất [56].
2.3.3. Phương pháp sinh học
So với hai phương pháp trên thì phương pháp xử lý nước thải nhuộm
bằng sinh học hiện đang được quan tâm, phương pháp này có chi phí rẻ hơn
và thân thiện với môi trường hơn.
Xử lý sinh học nước thải dệt nhuộm bao gồm: hấp thụ sinh học, phân
hủy bằng enzyme, kết tụ bông sinh học hoặc kết hợp cả ba biện pháp trên


16
[53]. Hiệu quả loại màu phụ thuộc vào loại thuốc nhuộm cũng như các nhóm
thế khác nhau của mỗi loại thuốc nhuộm và các đặc tính hóa lý của nước thải,
chẳng hạn như nguồn carbon, nitrogen, pH, nhiệt độ, hàm lượng muối và
nồng độ các chất hữu cơ trong nước thải.
Dưới các điều kiện phù hợp, thuốc nhuộm có thể bị phân hủy bởi các

enzyme reductase nội bào và ngoại bào. Các enzyme reductase nội bào xúc
tác cho phản ứng phân hủy thuốc nhuộm khi có sự hiện diện của các chất
tương đương như FADA, NADH, NADPH [12]. Hầu hết các loại thuốc
nhuộm azo có nhóm thế sulfonate và trọng lượng phân tử cao không có khả
năng đi qua màng tế bào. Do đó, các hoạt động khử thuốc nhuộm azo không
phụ thuộc nhiều vào sự hấp thu nội bào. Sự oxy hóa thuốc nhuộm được xúc
tác bởi các enzyme ngoại bào là peroxidases và phenoloxidases như laccase
(Lac), manganese peroxidase (MnP), lignin peroxidase (LiP), tyrosinase
(Tyr), N-demethylase và cellobiose dehydrogenase. Những enzyme ngoại bào
này được tìm thấy trong nấm sợi, nấm men và vi khuẩn [48].
Trong đó laccase có tiềm năng trong phân hủy sinh học do khả năng oxy
hóa không đặc hiệu của chúng, không đòi hỏi co-factor và sử dụng oxy có sẵn
như một chất nhận điện tử [30].



17
PHẦN 3:
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị
3.1.1. Vật liệu
Chủng vi khuẩn:
Năm mươi tư chủng vi khuẩn được phân lập từ rừng Quốc Gia Ba Vì và
vườn Quốc Gia Bidoup Núi Bà của Việt Nam, nằm trong bộ sưu tập giống
của phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường, Viện Công nghệ sinh học,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Cặp mồi: 27F và 1492R được sử dụng để nhân đoạn gene mã hóa 16S
rRNA có trình tự như sau:
Mồi xuôi (27F): 5’ – GTT TGA TCC TGG CTC AG – 3’
Mồi ngược (1492R): 5’ – GGY TAC CTT GTT ACG ACTT – 3’

3.1.2. Hóa chất và môi trường nuôi cấy
 Hóa chất
Các loại hóa chất sử dụng trong nghiên cứu có xuất xứ từ Việt Nam,
Trung Quốc, một số hóa chất tinh khiết được cung cấp bởi các hãng Sigma,
Merk, Aldrich.
 Môi trường
o Môi trường nuôi cấy sàng lọc định tính chủng sinh laccase, chitinase,
cellulase, protease ngoại bào:
 LB (g/l): NaCl, 10; Tryptone, 10; Cao nấm men, 5; Nước cất, 1000; pH 7.
 PDA-M (g/l): Dịch chiết khoai tây, 150; Bột ngô, 4; Glucose, 8;
Khoáng Cleanoilser 3, 2; Cám gạo, 5; Agar, 18; pH 7.
o Môi trường thạch cơ chất định tính hoạt tính chitinase, cellulase, protease
ngoại bào: môi trường cơ chất chitin, môi trường cơ chất casein, môi trường cơ
chất CMC (g/l: Agar, 18; chitin, casein và CMC: 0,5; nước cất, 1000)