Xây dựng quy trình nhân nhanh một số giống mía YT006, Br3280 và TQ2 bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM





PHẠM THỊ NGUYỆT


Tên đề tài:
XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN NHANH MỘT SỐ GIỐNG MÍA YT006,
BR3280 VÀ TQ2 BẰNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC





Hệ đào tạo :

Chính quy
Chuyên ngành :

Công nghệ Sinh học
Khoa :

CNSH - CNTP
Khóa học :

2010 - 2014






Thái Nguyên, 2014


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM




PHẠM THỊ NGUYỆT


Tên đề tài:
XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN NHANH MỘT SỐ GIỐNG MÍA YT006,
BR3280 VÀ TQ2 BẰNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo :

Chính quy
Chuyên ngành :

Công nghệ Sinh học
Khoa :

Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm
Khóa học :

2010 – 2014
Người hướng dẫn :

1. TS. Hà Thị Thúy
Vi
ện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam
2.
PGS.TS. Ngô Xuân Bình
Khoa CNSH & CNTP
- ĐH Nông Lâm Thái Nguyên




Thái Nguyên, 2014

LỜI CẢM ƠN
Với tấm lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn TS. Hà
Thị Thuý, phó Viện trưởng Viện Di truyền Nông nghiệp, người đã tận tình chỉ bảo
và tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn thầy PGS. TS. Ngô Xuân Bình đã hướng dẫn,
giúp đỡ tôi thực tập và hoàn thành khoá luận.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới chị Đỗ Thị Vân đã tận tình
chỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực tập cùng toàn thể các cô chú, anh chị làm việc
tại Trạm thực nghiệm Công nghệ cao Văng Giang – Hưng Yên, trực thuộc Viện Di
truyền Nông Nghiệp Việt Nam.
Tôi xin gửi lời tri ân và biết ơn sâu sắc nhất tới các thầy cô khoa Công Nghệ
Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã
hướng dẫn. giảng dạy tôi trong suốt quá trình học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè, những người luôn
hỗ trợ, giúp đỡ tôi và động viên tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày 02 tháng 06 năm 2014

Sinh viên


Phạm Thị Nguyệt


DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 2.1. Diện tích, năng suất và sản lượng mía giai đoạn 1995 – 2010 5
Bảng 2.2. Diện tích, năng suất và sản lượng mía phân theo vùng năm 2010 5

Bảng 4.1. Khả năng bật chồi của 3 giống mía YT006, Br3280 và TQ2 sau 3 tuần nuôi cấy 22
Bảng 4.2: Ảnh hưởng của IBA 0,1mg/l kết hợp với 2,4-D ở các nồng độ khác nhau lên quá
trình phát sinh mô sẹo ở lát cắt lá non của 3 giống mía YT006, Br3280 và TQ2 (tính
theo tỷ lệ %) 24
Bảng 4.3: Ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau kết hợp với Kinetin 0,2mg/l lên
quá trình tái sinh chồi từ callus của Giống mía YT006, Br3280 và TQ2 sau 3 tuần
nuôi cấy 27
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nước dừa đến sự hình thành chồi từ callus của 3 giống mía
YT006, Br3280 và TQ2 sau 3 tuần nuôi cấy. 29
Bảng 4.5: Ảnh hưởng của trạng thái môi trường lên quá trình hình thành chồi của giống
mía YT006, Br3280 sau 4 tuần nuôi cấy 31
Bảng 4.6: Ảnh hưởng của trạng thái môi trường lên quá trình hình thành chồi của giống
mía TQ2 sau 4 tuần nuôi cấy. 32
Bảng 4.7. Ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình hình thànhchồi của
giống mía YT006, Br3280 sau 4 tuần nuôi cấy 34
Bảng 4.8. Ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình hình thành chồi của
giống mía TQ2 sau 4 tuần nuôi cấy 35
Bảng 4.9. Ảnh hưởng của NAA ở các nồng độ khác nhau lên quá trình ra rễ của giống mía
YT006 sau 2 tuần nuôi cấy 38
Bảng 4.10. Ảnh hưởng của NAA ở các nồng độ khác nhau lên quá trình ra rễ của giống
mía Br3280 sau 2 tuần nuôi cấy 38
Bảng 4.11. Ảnh hưởng của NAA ở các nồng độ khác nhau lên quá trình ra rễ của giống
mía TQ2 sau 2 tuần nuôi cấy 39
Bảng 4.12. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất nền đến tỷ lệ sống của giống mía YT006 trên
vườn ươm 41
Bảng 4.13. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất nền đến tỷ lệ sống của giống mía Br3280 trên
vườn ươm 42


DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang
Hình 4.1: Phát sinh chồi mới từ chồi đỉnh giống Br3280 và TQ2 23
Hình 4.2: Biểu đồ ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với IBA 0,1mg/l lên quá trình phát
sinh mô sẹo ở lát cắt lá non sau 4 tuần nuôi cấy (theo tỷ lệ %). 25
Hình 4.3: Biểu đồ ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với IBA 0,1mg/l lên quá trình phát
sinh mô sẹo ở lát cắt lá non sau 8 tuần nuôi cấy (theo tỷ lệ %). 25
Hình 4.4: Callus phát sinh sau 4 tuần (bên trái) và 8 tuần (bên phải) 26
Hình 4.5: Biểu đồ ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau kết hợp với Kinetin
0,2mg/l lên quá trình tái sinh chồi từ callus sau 3 tuần nuôi cấy 27
Hình 4.6: Ảnh hưởng của nước dừa đến sự hình thành chồi của giống mía YT006
sau 3 tuần nuôi cấy 29
Hình 4.7: Biểu đồ ảnh hưởng của nước dừa đến sự hình thành chồi của 3 giống mía
YT006, Br3280 và TQ2 sau 3 tuần nuôi cấy 30
Hình 4.8.: Biểu đồ ảnh hưởng của trạng thái môi trường lên quá trình hình thành
chồi sau 4 tuần nuôi cấy. 32
Hình 4.9: Ảnh hưởng của trạng thái môi trường lên quá trình hình thành chồi giống
Br3280 sau 4 tuần nuôi cấy. 33
Hình 4.10: Biểu đồ ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình hình
thành chồi sau 4 tuần nuôi cấy 35
Hình 4.11: Ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình hình thành
chồi giống Br3280 sau 4 tuần nuôi cấy 36
Hình 4.12: Biểu đồ ảnh hưởng của NAA ở các nồng độ khác nhau lên quá trình ra rễ
sau 2 tuần nuôi cấy 39
Hình 4.13: Ảnh hưởng của NAA 0 mg/l (hình bên trái) và NAA 0,5 mg/l (hình bên
phải) lên quá trình ra rễ giống TQ2 sau 2 tuần nuôi cấy 40
Hình 4.14. Mía sau 30 ngày ra cây ngoài vườn ươm trên công thức V. 43

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BAP : 6- Benzyl Amino Purin

IBA : 3-Indol Butyric acid
NAA : α-Naphthyl Axetic acid
2,4 – D : 2,4-Dichlorophenoxy Axetic acid
MS : Mura Shige và Skoog
CTMT : Công thức môi trường
TB : Trung bình
CV : Coefficient of Variation (Độ tin cậy)
LSD : Least Significant Difference Test (Sai số nhỏ nhất có ý nghĩa)
Đ/C : Đối chứng
CTTN : Công thức thí nghiệm




MỤC LỤC
Trang
PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích nghiên cứu 2
1.3. Yêu cầu của đề tài 2
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2
1.4.1. Ý nghĩa khoa học 2
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn 2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Giới thiệu về cây mía 3
2.1.1. Nguồn gốc, vị trí, phân loại cây mía 3
2.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh trưởng và phát triển của cây mía 3
2.1.3. Yêu cầu ngoại cảnh của cây mía 4
2.1.4. Tình hình sản xuất và phân bố 5
2.1.5. Tình hình nghiên cứu nhân giống mía bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào

thực vật in vitro trên thế giới và ở Việt Nam 6
2.2. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng 7
2.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 7
2.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 7
2.2.3. Các bước trong nhân giống in vitro 12
PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
3.1. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 14
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành 14
3.3. Nội dung nghiên cứu và các chỉ tiêu theo dõi 14
3.3.1. Nội dung nghiên cứu 14
3.3.2. Phương pháp nghiên cứu 15
3.3.3. Các chỉ tiêu theo dõi 20
3.3.4. Phương pháp xử lý số liệu. 21
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22
4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng một số chất điều tiết sinh
trưởng đến khả năng tạo chồi và hình thành mô sẹo của 3 giống mía YT006,
Br3280 và TQ2 22
4.1.1. Nghiên cứu khả năng bật chồi của 3 giống mía YT006, Br3280 và TQ2. 22

4.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA0,1mg/l kết hợp với 2,4-D ở các nồng độ
khác nhau kết hợp lên quá trình phát sinh mô sẹo ở lát cắt lá non của Giống mía
YT006, Br3280 và TQ2 24
4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng một số chất điều tiết sinh trưởng và
nồng độ nước dừa đến quá trình tái sinh chồi từ callus của 3 giống mía 26
4.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin 0,2mg/l kết hợp với BAP ở các nồng độ khác
nhau lên quá trình tái sinh chồi từ callus của 3 giống mía YT006, Br3280 và TQ2 26
4.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa lên quá trình tái sinh chồi của 3
Giống mía YT006, Br3280 và TQ2 28
4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của trạng thái môi trường và chất điều tiết
sinh trưởng (BAP) lên quá trình nhân nhanh chồi 31

4.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của trạng thái môi trường lên quá trình hình thành
chồi của Giống mía YT006, Br3280 và TQ2 31
4.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình
hình thành chồi của Giống mía YT006, Br3280 và TQ2. 33
4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA ở các nồng độ khác nhau lên quá
trình ra rễ của Giống mía YT006, TQ2 và Br3280. 37
4.5. Kết quả giai đoạn ngoài vườn ươm 41
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44
5.1. Kết luận 44
5.2. Đề nghị 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO 45
1
PHẦN 1
MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Mía là cây công nghiệp ngắn ngày quan trọng trong nền kinh tế quốc dân đối
với nhiều nước trong khu vực nhiệt đới gió mùa ẩm. Nó cung cấp nguyên liệu cho
ngành công nghiệp đường, phục vụ nhu cầu đường trong nước và đường còn là mặt
hàng xuất khẩu quan trọng. Ở nước ta cây mía là nguồn nguyên liệu duy nhất để chế
biến đường và nó được coi là một trong những cây trồng quan trọng trong cơ cấu
cây trồng của vùng đồi, vùng trung du và miền núi.
Ngoài ra, các phụ phẩm của ngành công nghiệp đường còn là nguồn nguyên liệu
quý báu cho các ngành công nghiệp giấy, bia, rượu, cồn. Nhưng trong những năm gần
đây ngành sản xuất mía đường gặp nhiều khó khăn trong việc tìm nguồn giống mía có
năng suất và chất lượng cao, nhiều giống đã bị thoái hoá, năng suất chất lượng thấp, mức
độ dịch hại nhiều. Trong khi đó, các nhà máy chế biến đường vẫn thiếu một nguồn cung
cấp nguyên liệu mía ổn định và đảm bảo về mặt giá cả và chất lượng.
Mía là loại cây khỏe, có khả năng thích nghi cao với nhiều loại đất từ loại đất
bãi ven sông, cho đến đất pherarít ở vùng đồi thấp cho đến đất phù sa trong đê

Mía được trồng rộng rãi ở nhiều địa phương ở nước ta như các tỉnh đồng bằng sông
Hồng, đồng bằng Cửu Long, Thanh Hóa, Nghệ An, Đồng Nai. Nuôi cấy mô tế bào
in vitro là một công nghệ hiện đại cho phép sản xuất những cây giống sạch bệnh với
quy mô lớn, cung cấp cây giống với số lượng lớn cho sản xuất trong thời gian ngắn
nhất, cây con giống hệt bố mẹ về các đặc tính di truyền, hệ số nhân cao, độ đồng
đều lớn, thể hiện tính ưu việt so với các phương pháp nhân giống truyền thống khác.
Nhiều nước như Trung Quốc, Ấn Độ, Đài Loan, Pháp… đều sử dụng công nghệ cấy
mô như một mắt xích ổn định, hiệu quả kinh tế cao trong hệ thống giống của nhà
máy. Nuôi cấy mô còn là biện pháp an toàn trong cung cấp giống sạch bệnh, giảm
chi phí thuốc hoá học, giúp cho việc nhập nội giống và trao đổi nguồn gen.
Xuất phát từ những vấn đề trên, để tìm hiểu và nghiên cứu sâu hơn về kỹ
thuật nuôi cấy mô tế bào in vitro, đặc biệt là nghiên cứu việc nhân nhanh giống mía
bằng công nghệ invitro góp phần cung cấp dữ liệu hoàn thiện công nghệ nhân nhanh
giống mía YT006, Br3280 và TQ2 để có được nguồn giống tốt, đảm bảo cả về số
2
lượng và chất lượng cho người dân, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xây
dựng quy trình nhân nhanh một số giống mía YT006, Br3280 và TQ2 bằng công
nghệ nuôi cấy mô tế bào”.
1.2. Mục đích nghiên cứu
Xác định được các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp và nồng độ cần bổ
sung vào môi trường nuôi cấy một số giống mía YT006, Br3280 và TQ2 bằng công
nghệ nuôi cấy mô tế bào để đạt hiệu quả nhân nhanh cao nhất.
1.3. Yêu cầu của đề tài
- Xác định được ảnh hưởng của hàm lượng một số chất kích thích sinh trưởng
đến khả năng tạo chồi và hình thành mô sẹo của 3 giống mía YT006, Br3280 và
TQ2.
- Xác định được ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng và hàm
lượngnước dừa đến khả năng tái sinh chồi của 3 giống mía.
- Xác định được ảnh hưởng của trạng thái môi trường và hàm lượng một số
chất kích thích sinh trưởng đến quá trình nhân nhanh chồi.

- Xác định được ảnh hưởng của hàm lượng auxin đến khả năng ra rễ tạo cây
hoàn chỉnh của 3 giống YT006, Br3280 và TQ2.
- Xác định được giá thể thích hợp để đưa cây in vitro ra vườn ươm trước khi
đưa cây ra ngoài đồng ruộng.
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
- Bước đầu hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô 3 giống mía YT006, Br3280 và
TQ2 bằng phương pháp invitro.
- Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý và phân tích
số liệu, cách trình bày một bài báo khoa học.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Đề xuất được quy trình nhân nhanh Giống mía YT006, Br3280 và TQ2 bằng
công nghệ nuôi cấy mô tế bào in vitro, tạo ra số lượng lớn 3 giống mía trên góp
phần tạo cơ cấu giống phù hợp cho từng vùng nguyên liệu với tốc độ nhanh nhất,
tạo nguồn vật liệu cho nghiên cứu khoa học, nuôi cấy mô làm trẻ hóa, sạch bệnh,
tăng năng suất mía một cách đáng kể.
3
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về cây mía
2.1.1. Nguồn gốc, vị trí, phân loại cây mía
Cây mía có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới, với hai trung tâm phát sinh là đảo
Tân Ghinê và Ấn Độ, sau đó lan rộng ra toàn bộ khu vực Đông Nam Á và châu Đại
Dương. Sau thế kỷ XVI, mía được người châu Âu đưa sang trồng ở châu Mỹ và
châu Phi…(Nguyễn Minh Tuệ, Lê Thông, 2012) [11]
Tên Việt Nam: Cây mía
Tên khoa học: Succharum officinarum
Ngành: Spermatophyta
Lớp: Monocotyledoneae
Họ Hòa thảo: Poaceae

Chi: Saccharum
Mía là thực vật nhiệt đới và cận nhiệt đới, phân bố từ 35
0
Bắc đến 35
0
Nam,
ít ở xích đạo, tập chung ở chí tuyến, phân bố theo độ cao từ đất thấp duyên hải đến
1000 - 1200m (ở xích đạo) và 700m (chí tuyến) (Trần Văn Sỏi, 1977) [7].
2.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh trưởng và phát triển của cây mía
Mía là cây thân thảo, được trồng chủ yếu ở các nước nhiệt đới, năng suất có
thể đạt 200 tấn/ ha. Chúng có thân to mập, chia đốt, chứa nhiều đường, cao từ 2 – 6
m. Trên cây mía, thông thường phần ngọn sẽ nhạt hơn phần gốc (trong chiết nước
mía). Đó là đặc điểm chung của thực vật: chất dinh dưỡng (ở đây là hàm lượng
đường) được tập trung nhiều ở phần gốc (vừa để nuôi dưỡng cây vừa để dự trữ).
Đồng thời, do sự bốc hơi nước của lá mía, nên phần ngọn cây lúc nào cũng phải
được cung cấp nước đầy đủ để cung cấp cho lá, gây ra hàm lượng nước trong tỉ lệ
đường/nước phần ngọn sẽ nhiều hơn phần gốc, làm cho ngọn cây mía nhạt hơn.
Cấu tạo cây mía gồm 3 phần:
- Thân: Gồm phần nằm dưới đất gọi là thân rễ (Rhizome) và thân cây gồm
lóng và đốt. Mỗi đốt thông thường có một mầm (chồi nách) hoặc nhiều hơn. Ngoài
4
ra mỗi ngọn mía còn có một chồi đỉnh mà tại đây mô phân sinh phát triển mạnh
(Artschwager,1958).
- Lá: Lá mía hình dải gồm phiến lá và bẹ lá. Bên trong bẹ lá là chồi nách, ở
phần ngọn chồi nách non và chồi đỉnh thường được bao bọc bởi nhiều lớp bẹ lá và
lá non nên rất sạch. Trong nuôi cấy mô, chồi nách và chồi đỉnh được bóc cẩn thận
có thể cấy trực tiếp vào môi trường mà không cần khử trùng bằng hoá chất.
- Rễ: rễ mía thuộc loại rễ chùm, so với những cây hoà thảo khác cây mía có
bộ rễ phát triển rất mạnh, một khóm có từ 500 – 2.000 rễ, tổng chiều dài có thể tới
100 – 500 m [1].

2.1.3. Yêu cầu ngoại cảnh của cây mía
Cây mía có khả năng thích ứng rộng, tận dụng tốt năng lượng ánh sáng mặt trời.
Cây mía có các yêu cầu cơ bản sau đây để cho năng suất, chất lượng cao:
- Nhiệt độ
Mía là loại cây nhiệt đới nên đòi hỏi điều kiện độ ẩm rất cao. Nhiệt độ bình
quân thích hợp cho sự sinh trưởng của cây mía là 15-26⁰C, thời kì nảy mầm mía cần
nhiệt độ trên 15⁰C tốt nhất là từ 26-33⁰C. Giống mía nhiệt đới sinh trưởng chậm khi
nhiệt độ dưới 21⁰C và ngừng sinh trưởng khi nhiệt độ 13⁰C và dưới 5⁰C thì cây sẽ
chết.
- Ánh sáng
Mía là cây nhạy cảm với ánh sáng và đòi hỏi cao về ánh sáng. Thiếu ánh
sáng, mía phát triển không tốt, hàm lượng đường thấp. Mía cần thời gian tối thiểu là
1200 giờ tốt nhất là trên 2000 giờ.
- Độ ẩm
Mía là cây cần nhiều nước nhưng lại sợ úng nước. Mía có thể phát triển tốt ở
những vùng có lượng mưa từ 1500mm/năm. Giai đoạn sinh trưởng mía yêu cầu
lượng mưa từ 100-170mm/tháng. Khi chín cần khô ráo, mía thu hoạch sau một thời
gian khô ráo khoảng 2 tháng sẽ cho tỉ lệ đường cao.
- Đất trồng
Mía là loại cây công nghiệp khoẻ, dễ tính, không kén đất, vậy có thể trồng mía
trên nhiều loại đất khác nhau. Đất thích hợp nhất cho mía là những loại đất xốp, tầng
canh tác sâu, có độ phì cao, giữ ẩm tốt và dễ thoát nước. Có thể trồng mía có kết quả
trên cả những nơi đất sét rất nặng cũng như trên đất than bùn, đất hoàn toàn cát, đất
5
chua mặn, đất đồi, khô hạn ít màu mỡ. Yêu cầu tối thiểu với đất trồng là có độ sâu, độ
thoáng nhất định, độ pH không vượt quá giới hạn từ 4-9, độ pH thích hợp là 5,5-7,5.
2.1.4. Tình hình sản xuất và phân bố
- Diện tích trồng mía nước ta từ năm 1995 đến năm 2010 có nhiều biến động.
Bảng 2.1. Diện tích, năng suất và sản lượng mía giai đoạn 1995 – 2010
Năm Diện tích (nghìn ha) Năng suất (tạ/ha) Sản lượng (nghìn tấn)

1995 224,8 476,5 10711,1
2000 302,3 497,7 15044,3
2005 266,3 561,3 14948,7
2009 265,6 587,7 15608,3
2010 269,1 600,6 16161,7
Nguồn: Niên giám thống kê Việt Nam năm 2000, 2011[11]
- Phân bố: Cây mía được trồng ở cả 7 vùng sinh thái nông nghiệp và có mặt tại
58/63 tỉnh thành phố, nhưng tập trung nhiều nhất ở 4 vùng: Đồng bằng sông Cửu
Long, Bắc Trung Bộ, Duyên hải Nam Trung Bộ và Đông Nam Bộ
Bảng 2.2. Diện tích, năng suất và sản lượng mía phân theo vùng năm 2010
Các vùng
Diện tích
(nghìn ha)
Năng suất
(tạ/ha)
Sản lượng
(nghìn tấn)
Cả nước 269,1 600,6 16161,7
Đồng bằng song Hồng 1,8 580,6 104,5
Trung du và miền núi Bắc Bộ 24,5 559,8 1371,4
Bắc Trung Bộ 54,3 524,6 2848,4
Duyên hải Nam Trung Bộ 52,8 454,8 2401,3
Tây Nguyên 37,9 573,9 2174,9
Đông Nam Bộ 38,8 613,1 2379,0
Đồng bằng song Cửu Long 59,0 827,5 4882,2
Nguồn: Niên giám thống kê Việt Nam năm 2011[11]
6
2.1.5. Tình hình nghiên cứu nhân giống mía bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào
thực vật in vitro trên thế giới và ở Việt Nam
2.1.5.1. Trên thế giới

Phương pháp nuôi cấy in vitro đã được áp dụng ở nhiều quốc gia như Ấn Độ,
Cu Ba, Trung Quốc, Đài Loan, Tại Cu Ba hệ thống sản xuất và cung cấp mía
giống được hình thành nhằm mục tiêu hình thành dịch vụ giống và hom giống có độ
thuần và chất lượng cao, sạch sâu bệnh để bảo quản tốt tính di truyền và tăng cường
thời gian khai thác giống thương phẩm. Trong đó phương pháp nuôi cấy mô đóng
vai trò then chốt trong việc nhân nhanh giống cơ bản đạt tiêu chuẩn [4].
Tại Trung Quốc nhân giống mía bằng phương pháp này đã được triển khai ở
một số vùng trồng mía. Chỉ trong vòng 4 năm, giống Quế Đường 11 đã phủ kín hơn
32.000 ha, trong khi đó bằng phương pháp nhân truyền thống phải mất hơn 10 năm
mới có được diện tích tương tự [4].
Heinz, 1977 ở Hawaii và sau đó các nhà khoa học Đài Loan, Pháp, Cuba,
Argenetina, đã thành công trong việc tái sinh mía từ callus, từ nuôi cấy túi phấn đã tạo được
cây đơn bội có năng suất cao hơn trong điều kiện tự nhiên so với cây bố mẹ, hoặc phương
pháp chọn dòng soma cho phép phân lập được các dòng kháng bệnh [7].
2.1.5.2. Ở Việt Nam
Ở Việt Nam, các ngành khoa học nói chung và công nghệ nuôi cấy mô tế bào
nói riêng đang tiến triển chậm hơn so với thế giới rất nhiều. Việc ứng dụng những
thành tựu của phương pháp nhân giống in vitro còn là một lĩnh vực khá mới mẻ,
nhưng giàu tiềm năng phát triển.
Phương pháp nuôi cấy in vitro trên cây mía đã được thử nghiệm ở nhiều nơi
như Viện Khoa học Nông Nghiệp Việt Nam, Viện Di Truyền Nông Nghiệp Việt
Nam,… Tại Viện khoa học và công nghệ Việt Nam đã thí nghiệm và nhân giống vô
tính nhiều giống cây trồng như: mía, ngô, dứa, lúa,…có khả năng chống chịu để
phục vụ cho việc trồng trọt ở địa bàn miền Bắc [7].
Tuy việc nghiên cứu sử dụng phương pháp nuôi cấy mô đối với cây mía đã
được tiến hành từ những năm 1970 nhưng cho đến nay thì nuôi cấy mô cây mía vẫn
còn là một vấn đề mới mà các nhà chọn tạo giống đang rất quan tâm nghiên cứu [5].
Trong những năm qua nước ta đã nhập nội một số giống mía, chủ yếu là các
giống mía ROC của Đài Loan. Tuy nhiên do giá thành cao, hệ số nhân của các
7

phương pháp nhân giống truyền thống lại thấp không đủ đáp ứng đủ nhu cầu về
giống mía. Gần đây một số Viện nghiên cứu đã tiến hành nhân giống mía in
vitro(Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam
và Viện Nghiên cứu Mía đường).
2.2. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng
2.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.1.1. Tính toàn năng của tế bào
Haberlandt (1902) là người đầu tiên đưa ra quan điểm về cơ sở lý luận của
phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật chính là tình toàn năng của tế bào.
Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang
toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó. Khi gặp
điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh.
2.2.1.2. Sự phản phân hóa và phân hóa của tế bào
Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô
chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau.
Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên,
chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp cần
thiết, ở điều kiện thích hợp chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân
chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào.
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thực chất là
kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. Như vậy kĩ thuật nuôi cấy
mô và tế bào thực vật xét cho cùng là kĩ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của
tế bào thực vật một cách định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế
bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật.
2.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.2.1. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Môi trường nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng
trưởng và phát triển hình thái của tế bào và mô thực vật, nó quyết định cho sự
thành công của việc nuôi cấy mô tế bào thực vật tách rời. Thành phần chính bao gồm:
8

Thành phần vật lý:
- Ánh sáng:
Thời gian chiếu sáng có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái
của mô nuôi cấy, với đa số các loài cây thời gian chiếu sáng thích hợp là từ 12-
18h/ngày. Cường độ ánh sáng cũng là yếu tố quan trọng tác động đến quá trình phát
sinh hình thái của mô nuôi cấy, cường độ ánh sáng cao kích thích sự tạo chồi trong
khi cường độ ánh sáng thấp sẽ hình thành mô sẹo. Nhìn chung cường độ ánh sáng
thích hợp cho nuôi cấy mô là 1000-2500 lux (Vũ Văn Vụ, 1999) [14]. Chất lượng
ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của mô thực vật in vitro. Ánh
sáng đỏ làm tăng chiều cao thân chồi hơn so với ánh sáng trắng. Nếu mô nuôi cấy
trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế sự vươn cao của mô nhưng lại ảnh hưởng tốt tới
sự sinh trưởng của mô sẹo.
- Nhiệt độ:
Nhiệt độ phòng nuôi cấy tế bào là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới sự phân
chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây. Tùy thuộc vào xuất xứ của từng loại
mô nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ phù hợp.
Thành phần hoá học
Môi trường hoá học là nguồn cung cấp các chất cần thiết cho sự tăng trưởng
phát sinh mô trong suốt quá trình sinh hoá của cây. Thành phần môi trường nuôi
cấy mô thực vật thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại tế bào, mô, cơ quan và mục
đích nuôi cấy.
- Nguyên tố khoáng đa lượng: bao gồm các nguyên tố N, P, K, Mg, S, Ca,…
với hàm lượng của mỗi nguyên tố thường lớn hơn 30mg/l, các chất đóng vai trò
quan trọng trong việc cấu thành nên các cơ quan bộ phận của cây (Đỗ Năng Vịnh,
2005) [16]
Nitơ (N): được đưa vào môi trường ở 2 dạng: Nitrat (NO
3
-
) và nguồn amôn
(NH

4
+
) dùng riêng rẽ hoặc phối hợp với nhau.
Phospho (P): là nguyên tố quan trọng trong đời sống thực vật. Nó tham gia vào
quá trình vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nucleic và tham gia vào
cấu trúc màng. Phospho thường được cung cấp dưới dạng đường phospho.
9
Lưu huỳnh (S): Được sử dụng ở dạng muối SO
4-
2-
nồng độ thấp còn dạng
SO
3
2-

và SO
2
2-
kém tác dụng thậm chí còn gây độc cho môi trường nuôi cấy.
Kali (K): K
+
là các cation chủ yếu trong cây. Ion K
+
được chuyển qua màng tế
bào dễ dàng và có vai trò chính là điều hoà pH và áp suất thẩm thấu của môi trường
nội bào. Sự thiếu hụt K
+
trong môi trường nuôi cấy mô thực vật sẽ dẫn đến tình trạng
thiếu nước.
Na

+
và Cl
-
: Cần ở nồng độ thấp và được đưa vào môi trường cùng với muối
khoáng khi diều chỉnh pH môi trường.
- Các nguyên tố khoáng vi lượng: là các nguyên tố như: Fe, Mn, Mo, B, I, Cu, Zn,
Co… với hàm lượng mỗi nguyên tố nhỏ hơn 30g/l. Chúng là thành phần của
coenzim để xúc tác phản ứng sinh hoá diễn ra trong tế bào sống (O.L. Gamborg,
1995) [20].
Sắt (Fe): Hầu hết thực vật chỉ hấp thu Fe
2+
, còn Fe
3+
cần được khử thành
Fe
2+
ở bề mặt rễ trước khi nó được chuyển vào trong tế bào chất. Nếu thiếu Fe thì
quá trình tổng hợp protein bị ngưng lại, số lượng ribosom cũng giảm mạnh. Thiếu
sắt ở rễ kéo theo những thay đổi hình thái, sự dài rễ giảm nhưng diện tích và số
lượng long rễ tăng.
Bo: Bo cần thiết cho sự hoạt động của đỉnh sinh trưởng. Thiếu Bo sẽ làm
giảm sự tổng hợp cytokinine, sự phân chia tế bào bị kìm hãm do có sự giảm sinh
tổng hợp ARN trong nhân.
Đồng (Cu): trong thực vật, đồng tồn tại dưới dạng ion hoá trị 1 và 2. Hàm
lượng thường dùng từ 0,1 - 10µM.
Mangan (Mn): thiếu Mn làm cho AND và các axit amin tự do tăng lên nhưng
lượng mARN và sự sinh tổng hợp protein bị giảm làm giảm sự phân bào.
Kẽm (Zn): Zn được hệ rễ hấp thu dưới dạng Zn
2+
. Thiếu Zn thì sự sinh tổng

hợp protein, acid nucleic và diệp lục tố sẽ bị giảm đi.
- Nguồn Cacbon:
Cây in vitro chủ yếu phát triển theo phương thức dị dưỡng (hoàn toàn sử
dụng các chất dinh dưỡng của môi trường). Trong nuôi cấy nhân tạo, đường cung
cấp nguồn cacbon để mô tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ, giúp tế bào
10
phân chia, tăng sinh khối khi tế bào chưa có khả năng quang hợp hoặc chưa đảm
nhận hoàn toàn chức năng quang hợp. Dạng đường hay được sử dụng gồm:
Saccarose, glucose, Mantose, Fructose (Đỗ Năng Vịnh, 2005) [16]. Thông dụng
nhất đã được kiểm chứng là saccarose, nồng độ thích hợp phổ biến là 2-3%.
- Vitamin:
Tế bào và mô thực vật trong điều kiện in vitro vẫn có khả năng tổng hợp
vitamin nhưng lượng tổng hợp được không đủ nên phải bổ sung thêm vitamin vào
môi trường nuôi cấy. Các vitamin được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là:
thiamin (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol (Đỗ Năng Vịnh,
2005) [16].
- Các chất bổ sung
Trong môi trường nuôi cấy mô, tuỳ từng loại cây ta có thể bổ sung thêm một
số chất thích hợp để đảm bảo sự sinh trưởng của cây là tối ưu nhất
Nước dừa: được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và
chất kích thích sinh trưởng (George, 1993; George,1996). Nước dừa được sử dụng
để kích thích phân hoá và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây, trong đó có mía.
Dịch chiết nấm men (YE): chủ yếu chứa đường, nucleic acid, amino acid,
vitamin, auxin, muối khoáng. YE có tác dụng rất tốt với rễ.
Dịch thuỷ phân casein (CH): được bổ sung rộng rãi trong kỹ thuật vi sinh
vật, ở nuôi cấy mô và tế bào thực vật chủ yếu được sử dụng làm nguồn bổ sung
amino acid.
Chất làm đông đặc môi trường (agar): đây là polysaccharide của tảo biển,
hoà tan với nước khi ở nhiệt độ lớn hơn 80
0

C

thì ở dạng lỏng còn khi nhiệt độ nhỏ
hơn 40
0
C lại ở dạng rắn (gel).
- Chất điều khiển sinh trưởng:
Là thành phần quan trọng nhất của môi trường nuôi cấy, giúp điều khiển
được quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào, thể hiện được tính toàn năng của
tế bào trong nuôi cấy tế bào và mô thực vật tách rời. Bằng cách cung cấp các chất ở
một mức độ hợp lý chúng ta có thể điều chỉnh được chiều hướng phát sinh hình thái
của mẫu nuôi cấy (Vũ Văn Vụ, 1999) [14]. Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật
được chia thành các nhóm chính sau:
11
Auxin: kích thích quá trình tăng trưởng của tế bào, gây ức chế sinh trưởng
của chồi bên, kích thích sự hình thành mô sẹo và rễ bất định. Các loại thường dùng
là IAA, NAA, IBA, 2,4 – D.
Cytokinin: kích thích sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hoá
chồi, tạo chồi bất định trong nuôi cấy mô. Các loại thường dùng là kinetine, BAP…
Người ta sử dụng phối hợp auxin và cytokinin với tỷ lệ và hàm lượng phù
hợp để đạt mục đích mong muốn. Quy luật tương đối: auxin/ cytokinin lớn thì các
mẫu cấy tạo rễ bất định, tỷ lệ trung bình thì mẫu cấy tạo mô sẹo, còn tỷ lệ thấp thì
tạo chồi.
Gibberillin: có vai trò quan trọng trong sinh lý ngủ nghỉ của hạt, chồi, phát triển
của hoa, tăng trưởng chiều dài thực vật, sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô phân sinh.
- pH môi trường:
pH môi trường có ảnh hưởng tới khả năng trao đổi chất với môi trường dinh
dưỡng của tế bào, mô nuôi cấy. pH thích hợp cho nuôi cấy là 5,6 – 6. Nếu pH thấp
môi trường không thể đông kết còn pH cao làm cho môi trường đông cứng lại ức
chế trao đổi chất của mô, tế bào nuôi cấy (Vũ Văn Vụ, 1999) [14].

2.2.2.2. Vật liệu nuôi cấy
Tùy theo đặc điểm của từng đối tượng cũng như mục đích nghiên cứu mà lựa
chọn mô nuôi cấy cho phù hợp. Trong vi nhân giống in vitro người ta thường sử
dụng đỉnh chồi, mắt ngủ, vẩy củ Để tạo cây đơn bội thì ta nuôi cấy bao phấn, hạt
phấn, túi noãn; mô sẹo thường được tạo từ lát cắt lá non hoặc chóp rễ…(Vũ Văn
Vụ, 1999) [14].
Nguyên tắc chung là: cây cho mẫu phải là cây khoẻ mạnh, sạch bệnh, sinh
trưởng tốt. Nên thu mẫu vào đầu mùa sinh trưởng và vào buổi sáng sớm
(S.Narayanaswamy, 1994) [23]. Cơ quan nuôi cấy được lựa chọn theo mục đích
nghiên cứu, mẫu cấy càng non (chưa biệt hóa sâu) cho hiệu quả càng cao( O.L.
Gamborg và cs, 1995) [20].
2.2.2.3. Điều kiện vô trùng
Đây là điều kiện đầu tiên quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô tế
bào. Môi trường và các thiết bị sử dụng cấy phải được vô trùng tuyệt đối. Nếu điều
kiện, thiết bị không đảm bảo thì môi trường sẽ bị nhiễm, mô cấy sẽ bị chết.
12
2.2.3. Các bước trong nhân giống in vitro
Ngày nay, hầu hết các nhà nghiên cứu khoa học đều thống nhất rằng thành công của
nuôi cấy mô tế bào chỉ đạt được khi nó trải qua 4 bước cơ bản sau:
Bước 1: Giai đoạn vào mẫu
Đây là giai đoạn khó khăn nhất có ý nghĩa quyết định tới toàn bộ quy trình
nhân giống. Giai đoạn này phải đảm bảo được các yêu cầu sau:
- Tỷ lệ chết thấp.
- Tỷ lệ sống cao.
- Mô cấy sinh trưởng và phát triển tốt.
Một số hoá chất thường dùng HgCl
2
, CaOCl
2
, NaOCl, H

2
O
2
Tuỳ thuộc vào
từng mô thực vật mà lựa chọn nồng độ, thời gian xử lý và hoá chất thích hợp [14].
Bước 2: Nhân nhanh mẫu
Toàn bộ quá trình nuôi cấy mô tế bào xét cho cùng chỉ nhằm mục đích chính
là tạo ra hệ số nhân chồi cao nhất. Ở giai đoạn này, môi trường dinh dưỡng nhân tạo
để nuôi cấy thường được đưa thêm vào chất kích thích sinh trưởng, các chất bổ sung
khác như nước dừa, nước chiết nấm men, kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sang
nhằm đạt được hệ số nhân chồi cao nhất mà vẫn đảm bảo sức sống, bản chất di
truyền, có thể tạo thành cây hoàn chỉnh, đạt tiêu chuẩn cây giống ở giai đoạn sau.
Bước 3: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Khi đạt được một kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường nhân
nhanh vào môi trường tạo rễ. Thường sau 2 – 3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất
hiện rễ. Ở giai đoạn này, người ta bổ sung vào môi trường tỷ lệ auxin nhỏ vì auxin là
nhóm hormone thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy.
Bước 4: Thích ứng cây in vitro trong điều kiện tự nhiên
Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của
quy trình nuôi cấy mô tế bào. Cây lấy ra ống nghiệm phải được rửa sạch agar bám
trên bề mặt rễ để tránh sự xâm nhập của côn trùng và nấm mốc. Để cây đưa ra ngoài
vườn ươm được phát triển tốt cần đảm bảo một số yêu cầu sau:
+ Cây phải đảm bảo về chiều dài của rễ, lá, thân…
+ Giá thể dùng để trồng cây phải tơi, xốp, thoát nước tốt.
+ Phải điều chỉnh độ ẩm, cường độ chiếu sáng, chế độ dinh dưỡng phù hợp.

13
Quy trình nhân nhanh của các giống mía được thể hiện trong sơ đồ dưới đây:

Chọn và xử lý
m
ẫu

Chọn và xử lý
m
ẫu

Tạo callus từ lát
c

ắt lá non

Nuôi cấy chồi
đ
ỉnh

Chọn cây ưu việt
từ giống
ưu việt
Tái sinh chồi
Kéo dài

chồi

Tạo cụm chồi
Ra rễ tạo cây
hoàn ch
ỉnh

Đưa cây ra vườn
ươm

Đưa

cây
ra
ngoài
đồng ruộng

14

PHẦN 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu
Đối tượng sử dụng trong các thí nghiệm là 3 giống mía YT006, Br3280 và
TQ2 nhập nội có năng suất và trữ lượng đường cao.
Mẫu dùng để nuôi cấy được trồng tại vườn ươm mía Trạm thực nghiệm Sinh
học Công nghệ cao Văn Giang – Hưng Yên, thuộc Viện di truyền Nông nghiệp –
Từ Liêm – Hà Nội.
Vật liệu đưa vào là chồi đỉnh, chồi nách gần ngọn và lá non của các cây mía
đang giữa thời kỳ sinh trưởng mạnh.
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành
Địa điểm: Trạm thực ngiệm Sinh học Công nghệ cao, Văn Giang – Hưng
Yên; trực thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp, Đường Phạm Văn Đồng – Từ Liêm –
Hà Nội.
Thời gian tiến hành: Từ 12/2013 đến 5/2014.
3.3. Nội dung nghiên cứu và các chỉ tiêu theo dõi
3.3.1. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng một số chất điều tiết sinh
trưởng đến khả năng tạo chồi và hình thành mô sẹo của 3 giống mía YT006, Br3280
và TQ2.
Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng và
hàm lượng nước dừa đến khả năng tái sinh chồi của 3 giống mía.
Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng agar và một số chất điều
tiết sinh trưởng (BAP) đến quá trình nhân nhanh chồi.
Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng auxin đến khả năng ra rễ
tạo cây hoàn chỉnh của 3 giống YT006, Br3280 và TQ2.
Nội dung 5: Nghiên cứu giá thể thích hợp để đưa cây in vitro ra vườn ươm
trước khi đưa cây ra ngoài đồng ruộng.
15

3.3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.3.2.1. Phương pháp nghiên cứu nội dung 1
- Phương pháp tạo vật liệu vô trùng:
+ Chọn những cây mía còn non có sức nảy mầm và tái sinh cao.
+ Ngọn mía được cắt bỏ phiến lá, bóc tất cả phần bẹ già và các lá vàng, héo
rồi mang mẫu vào phòng cấy.
+ Xử lý mẫu: Mẫu được lau sạch bằng cồn 70
0
trong box cấy vô trùng, bóc
bỏ lần lượt các bẹ và lá non bên ngoài đến khi sát chồi đỉnh.
+ Dùng dao cắt chồi nách, chồi đỉnh và lá non theo kích thước: chồi nách: đường
kính 1,0 cm x 1,0 cm; chồi đỉnh: 1,5 cm x 1,5 cm; lát cắt lá non: 1,0 cm x 1,0 cm.
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu khả năng tạo chồi của Giống mía YT006, Br3280 và TQ2.
- Mục đích của thí nghiệm: Nghiên cứu khả năng tạo chồi của Giống mía
YT006, Br3280 và TQ2 trong môi trường MS.
- Thí nghiệm được nghiên cứu trong điều kiện:
+ Nhiệt độ từ: 25-27
0
C.
+ pH = 5,7
+ Thời gian chiếu sáng: 12 giờ/24 giờ .
+ Mẫu nuôi trong môi trường: MS + đường saccharose 30g/l + agar 6g/l +
nước dừa 15%.
+ Mẫu cấy được làm sạch, cắt đúng kích thước quy định.
+ Mẫu được cấy trong bình tam giác 250ml với số lượng: 2 chồi nách/1 bình
và 1 chồi ngọn/1 bình, mẫu cấy thẳng đứng phần mắt chồi hướng lên trên.
+ Chỉ tiêu quan sát: Số chồi tạo thành sau 3 tuần, số mẫu nhiễm và số mẫu chết.
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D ở các nồng độ khác nhau kết hợp
với IBA 0,1mg/l lên quá trình phát sinh mô sẹo ở lát cắt lá non của Giống mía
YT006, Br3280 và TQ2

- Mục đích của thí nghiệm: Xác định được nồng độ của 2,4-D cần thiết để bổ
sung vào môi trường sao cho tỉ lệ tạo callus là lớn nhất.
- Thí nghiệm được nghiên cứu trong điều kiện tối ưu về nhiệt độ, pH, ánh sáng.
- Môi trường nuôi cấy gồm: MS + đường saccharose 30g/l + agar 6g/l +
nước dừa 15%, bổ sung thêm chất kích thích sinh trưởng 2,4-D với nồng độ tăng
dần từ 0mg/l tới 1mg/l kết hợp với IBA 0,1mg/l.
16
-
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với 7
công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần cấy 3 đĩa, mỗi đĩa cấy 10 lát. Thí
nghiệm được bố trí như sau:
Công thức Nồng độ 2,4 - D (mg/l)
1 (Đ/C) MT nền + 0,0
2 MT nền + 0,1
3 MT nền + 0,2
4 MT nền + 0,3
5 MT nền + 0,4
6 MT nền + 0,5
7 MT nền + 1,0
MT nền: MS + đường saccharose 30g/l + agar 6g/l + nước dừa 15% + IBA 0,1mg/l.
- Chỉ tiêu quan sát: Số callus tạo thành sau 4 tuần và sau 8 tuần sau đó tính
được tỉ lệ phần trăm.
3.3.2.2. Phương pháp nghiên cứu nội dung 2
- Phương pháp tái sinh chồi của 3 giống mía YT006, Br3280 và TQ2.
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau kết hợp
với Kinetin 0,2mg/l lên quá trình tái sinh chồi từ callus của Giống mía YT006,
Br3280 và TQ2
- Mục đích của thí nghiệm: Xác định được nồng độ thích hợp của BAP cần
để bổ sung vào môi trường sao cho khả năng tạo chồi là lớn nhất.
- Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiên tối ưu về nhiệt độ, pH, ánh sáng.

- Môi trường nền gồm: MS + đường saccharose 30 g/l + agar 6 g/l + Kinetin 0,2 m/l.
-
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với
6 công thức, 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 3 bình x 10 mẫu. Thí nghiệm
được bố trí như sau:
Công thức Nồng độ BAP (mg/l)
1 (Đ/C) MT nền + 0,0
2 MT nền + 0,5
3 MT nền + 1,0
4 MT nền + 1,5
5 MT nền + 2,0
17
6 MT nền + 2,5
- Chỉ tiêu quan sát: Số chồi thu được sau ba tuần nuôi cấy, chất lượng chồi và
tính được hệ số nhân chồi.
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa lên quá trình tái sinh chồi từ
callus của 3 giống mía YT006, Br3280 và TQ2
- Mục đích của thí nghiệm: Xác định được phần trăm thể tích của nước dừa
cần bổ sung vào môi trường nuôi cấy sao cho môi trường là tối ưu nhất.
- Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện tối ưu về nhiệt độ, pH, độ ẩm,
ánh sáng.
- Công thức môi trường nền gồm: MS + đường saccharose 30g/l + agar 6 g/l.
- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn.
Với 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 3 bình x
10 mẫu. Thí nghiệm được bố trí như sau:
Công thức Nước dừa %
1 (Đ/C) MT nền + 0
2 MT nền + 5
3 MT nền + 10
4 MT nền + 15

5 MT nền + 20
- Chỉ tiêu quan sát: Số chồi thu được sau 3 tuần nuôi cấy, quan sát chất
lượng, màu sắc chồi và tính được hệ số nhân chồi.
3.3.2.3. Phương pháp nghiên cứu nội dung 3
-
Phương pháp nhân nhanh in vitro
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng agar đến quá trình hình thành
chồi của Giống mía YT006, Br3280 và TQ2
- Mục đích của thí nghiệm: Xác định được hàm lượng agar cần bổ sung vào
môi trường nuôi cấy sao cho tạo được môi trường tối ưu nhất.
- Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện tối ưu nhất về nhiệt độ, pH, độ
ẩm, ánh sáng.
- Công thức môi trường nền gồm: MS + đường saccharose 30g/l + nước dừa 15%.