Nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin PEG hóa

B Y T



















I  2015









LIPOSOME D


ng dn:
1. ThS. Nguyễn Văn Lâm
2. DS. Lê Phương Linh
c hin:
Bộ môn Bào chế
Trường Đại học Dược Hà Nội





I  2015

LI C

Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn đến toàn thể Ban Giám Hiệu và bộ môn
Bào Chế trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã tạo điều kiện để em hoàn thành khóa luận
này.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới:
ThS. Nguyễn Văn Lâm,
DS. Lê Phương Linh
Là những ngƣời đã tận tình chỉ bảo, hƣớng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian
làm khóa luận.
Em cũng trân trọng cám ơn PGS.TS. Phm Th Minh Hu. Cô đã đƣa ra những
góp ý quan trọng để khóa luận của em đƣợc hoàn thiện hơn.
Xin cảm ơn các thầy cô và anh chị kĩ thuật viên đã hỗ trợ em trong suốt quá trình
nghiên cứu.
Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã thƣờng xuyên động viên, giúp đỡ để

em hoàn thành tốt đề tài của mình.
Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên


Ngô Thị Lan
MC LC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Doxorubicin 2
1.1.1. Công thức, tính chất lý hóa 2
1.1.2. Dƣợc động học, cơ chế tác dụng, chỉ định, các chế phẩm trên thị trƣờng 2
1.2. Đại cƣơng về liposome 3
1.2.1. Khái niệm, cấu tạo 3
1.2.2. Phân loại 4
1.2.3. Những nghiên cứu trong nƣớc về liposome 8
1.3. Liposome biến đổi bằng cách PEG hóa 9
1.3.1. Khái niệm PEG hóa 9
1.3.2. Ƣu, nhƣợc điểm của liposome PEG hóa 9
1.3.3. Đặc tính của PEG 10
1.3.4. Ảnh hƣởng của thành phần PEG lên liposome 11
1.3.5. Phƣơng pháp gắn PEG vào liposome 13
1.3.6. Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin PEG hóa trên thế giới 14
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phƣơng tiện nghiên cứu 16
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu 16
2.1.2. Nguyên vật liệu 16
2.1.3. Phƣơng tiện nghiên cứu 17
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 17
2.2.1. Phƣơng pháp bào chế liposome doxorubicin 17

2.2.2. Phƣơng pháp đánh giá liposome doxorubicin PEG hóa tạo thành 19
2.2.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu 22
2.2.4. Điều kiện thí nghiệm 22
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 23
3.1. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn 23
3.2. Xây dựng công thức bào chế liposome doxorubicin PEG hóa 2 mg/ml 24
3.2.1. Lựa chọn nồng độ DSPE-PEG
2000
24
3.2.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng ngoài tới liposome doxorubicin PEG hóa 28
3.3. Theo dõi độ ổn định của chế phẩm liposome doxorubicin PEG hóa 32
3.4. Bàn luận 37
3.4.1. Về lựa chọn thành phần vỏ lipid cho liposome. 37
3.4.2. Về khảo sát một số yếu tố đến chất lƣợng liposome. 37
3.4.3. Về độ ổn định chế phẩm liposome doxorubicin PEG hóa 40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41


DANH M VIT TT
TT
Vit tt
T/cm t 
1
BP
Dƣợc điển Anh
2
Chol
Cholesterol
3
DĐVN

Dƣợc điển Việt Nam
4
DOX
Doxorubicin
5
DOX.HCl
Doxorubicin hydroclorid
6
DSPC
1,2-Distearoyl-sn -Glycero-3-Phosphocholin
7
DSPE-
PEG
2000

(N-(carbonyl-methoxypolyethylene glycol 2000)-1,2-distearoyl-
sn-glycero-3-phosphoethanolamine sodium salt)
8
EE
Hiệu suất liposome hóa
9
EPR
Hiệu ứng tăng tính thấm và thời gian lƣu
10
Glu
Glucose
11
HEPES
Dung dịch đệm N-2-hydroxy ethyl piperazin – N – 2 – ethan
sulfonic acid

12
HSPC
Phosphatidyl dầu đậu nành đã hydrogen hóa
13
Kl/kl
Khối lƣợng/khối lƣợng
14
KTTP
Kích thƣớc tiểu phân
15
LCL
Long-circulating liposome - liposome tuần hoàn dài
16
LUV
Large unilamellar vesicles - các liposome đơn lớp lớn
17
MPS
Mononuclear phagocyte system - hệ đại thực bào đơn nhân
18
PDI
Polydispersity index - chỉ số đa phân tán
19
PEG
Polyethylen glycol
20
PEG-
DSPE
1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phospho ethanolamin-N-Methoxy
Polyethylene glycol
21

pHSLs
[pH-sensitive (acidic-triggered) liposomes] - liposome nhạy
cảm với pH
22
PP
Phosphat
23
SPC
Phosphatidylcholin dầu đậu nành
24
TCCS
Tiêu chuẩn cơ sở
25
TKKH
Tinh khiết hóa học
26
TLs
[Thermosensitive (heat-triggered) liposomes] - liposome nhạy
cảm với nhiệt
27
Tt/tt
Thể tích/thể tích

DANH MNG
.
Các nguyên vật liệu được sử dụng
16
.
Kết quả đo mật độ quang các mẫu dung dịch DOX ở bước sóng
233 nm và 481 nm (pH 4)

23
.
Độ ổn định của các công thức liposome chưa mang dược chất
25
.
Độ ổn định của công thức có 1 %mol DSPE-PEG2000…………
25
.
Độ ổn định của công thức có 5 %mol DSPE-PEG2000 …………
26
.
Độ ổn định của công thức có 10 %mol DSPE-PEG2000…
26
.
Độ ổn định của mẫu có môi trường ngoài là HEPES pH 7,5
(HES) và Phosphat pH 7,5 (PP)
30
.
Công thức bào chế mẫu theo dõi độ ổn định
33



DANH M TH
.
Cấu trúc liposome
4
.
Kích thước một số loại liposome
4

.
Mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ
23
H.
Hình ảnh chụp TEM của ba công thức C1, C2, C3
27
.
Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH và loại đệm tới hiệu suất
liposome hóa
29
.
Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hiệu suất liposome hóa của 2 công
thức sử dụng môi trường ngoài HEPES 7,5 và phosphat 7,5
30
.
Hình thức sau 28 ngày của hai mẫu HEPES 7,5 và phosphat
7,5
31
.
Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của tá dược đẳng trương tới hiệu suất
liposome hóa
32
.
Đồ thị biểu diễn độ ổn định của công thức M1 sau 6 tháng
33
.
Đồ thị biểu diễn độ ổn định của công thức M2 sau 6 tháng
34
.
Đồ thị biểu diễn độ ổn định của công thức M3 sau 6 tháng

34
.
Đồ thị so sánh sự thay đổi KTTP, PDI của 3 công thức sau 6
tháng
35
H
Đồ thị so sánh hiệu suất liposome hóa (EE%) 3 công thức sau 6
tháng
35
nh 3.12.
Hình thức 3 công thức M1, M2, M3 sau 6 tháng
36



1

T V
Hiện nay ung thƣ đang là một trong những bệnh nan y gây ra những thách thức
vô cùng to lớn cho nền y học hiện đại. Đặc thù của thuốc điều trị ung thƣ là có độc
tính rất cao với tế bào và gây ra rất nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng trên cơ thể con
ngƣời. Vì vậy mà ngày càng có nhiều nghiên cứu nhằm mục đích nâng cao hiệu quả
điều trị và cải thiện chất lƣợng cuộc sống cho các bệnh nhân.
Ngay từ khi ra đời dạng bào chế liposome đã tạo bƣớc đột phá lớn trong điều trị
ung thƣ do những đặc điểm ƣu việt của nó nhƣ khả năng mang thuốc, kiểm soát giải
phóng thuốc và khả năng đƣa thuốc tới đích. Doxorubicin là một trong những thuốc
chống ung thƣ đƣợc nghiên cứu khá sâu rộng trên thế giới và đã cho ra đời rất nhiều
sản phẩm thƣơng mại nhƣ Doxil, Myocet.
Tại Việt Nam, liposome mới đƣợc phát triển trong vài năm gần đây và trƣờng đại
học Dƣợc là nơi đi tiên phong trong việc nghiên cứu về liposome doxorubicin. Các

nghiên cứu bƣớc đầu đã đạt đƣợc những kết quả khích lệ, tuy nhiên cho đến thời
điểm hiện tại mới chỉ dừng lại ở việc bào chế liposome quy ƣớc với 2 thành phần là
phospholipid và cholesterol. Liposome quy ƣớc rất dễ bị bắt giữ bởi đại thực bào và
nhanh chóng thanh thải khỏi hệ tuần hoàn. Chƣa có nghiên cứu nào về việc sử dụng
dẫn chất polyme nhƣ PEG để tăng thời gian tuần hoàn và giảm tốc độ thanh thải của
liposome. Hơn nữa các nghiên cứu cũng đang gặp khó khăn trong việc nâng cao độ
ổn định cho chế phẩm. Để giải quyết các vấn đề này đề tài 
liposome  đƣợc thực hiện với hai mục tiêu chính:
1. Bào chế và khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến chất lƣợng hỗn dịch
liposome doxorubicin PEG hóa 2 mg/ml.
2. Theo dõi độ ổn định của liposome doxorubicin PEG hóa trong vòng 6 tháng
2

 TNG QUAN
1.1. Doxorubicin
1.1.1. 

Công thức phân tử: C
27
H
29
NO
11
.HCL.
Khối lƣợng phân tử: 579,99 [30], [31].

- Tên khoa học: (8S, 10S)-10-[(3-Amino-2,3,6-trideoxy- trideoxy-α-L-lyxo-
hexopyranosyl)oxy]-7,8,9,10-tetrahydro-6,8,11-trihydroxy-8-(2-hydroxyacetyl)-1-
methoxy-5,12-naphthacenedion [30].
- Tính chất: Tinh thể hay bột vô định hình màu vàng cam, không mùi. Dung dịch 5

mg/ml có pH từ 4 - 5,5. Tan trong nƣớc, methanol, acetonitril, tetrahydrofuran.
Không tan trong chloroform, aceton, ethyl ether, benzen, ether dầu [30].
Nhóm amino của doxorubicin có Pk
a
là 8,15; doxorubicin bao gồm cấu trúc
anthraquinon thân dầu với đƣờng amin thân nƣớc ở trạng thái bị proton hóa [11],
[15].
Doxorubicin là chất nhạy cảm với ánh sáng ở nồng độ thấp. Tuy nhiên, ở nồng độ
điều trị thì doxorubicin đƣợc cho là không bị phân hủy đáng kể bởi ánh sáng và
không nhất thiết phải có biện pháp riêng để bảo vệ doxorubicin khỏi ánh sáng [30].
1.1.2. ng
1.1.2.1. Dược động học
Sau khi tiêm tĩnh mạch doxorubicin nhanh chóng phân bố đến các mô phổi,
gan, tim, lách, thận. Doxorubicin bị chuyển hóa ở gan tạo thành doxorubicinol.
Khoảng 40 - 50% lƣợng doxorubicin bị đào thải qua mật trong 5 – 7 ngày ở dạng
chƣa chuyển hóa, 5% bị đào thải qua nƣớc tiểu trong 5 ngày. Doxorubicin không
3

qua đƣợc hàng rào máu não nhƣng qua đƣợc nhau thai và bài tiết đƣợc qua tuyến
sữa.
Doxorubicin khi gắn với liposome PEG hóa có thời gian tồn tại trong vòng
tuần hoàn kéo dài hơn và ít phân bố tới các mô hơn. Liposome doxorubicin phân bố
nhiều tới các mô ung thƣ có hệ mạch máu không bình thƣờng [30].
1.1.2.2. Cơ chế tác dụng
Doxorubicin là một thuốc thuộc nhóm anthracyclin [3]. Cơ chế tác dụng của
doxorubicin đã đƣợc nghiên cứu sâu rộng. Doxorubicin là một tác nhân xen vào
giữa phân tử ADN và ức chế topo-isomerase II. Doxorubicin hình thành gốc tự do,
từ đó gây peroxy hóa lipid và có thể phá hủy ADN bằng cách phá vỡ chuỗi đơn,
chuỗi kép và làm tổn thƣơng các base (purin và pyrimidin). Tuy nhiên ngƣời ta vẫn
chƣa chứng minh đƣợc anthracyclin tạo ra các gốc tự do ở trong nhân, do đó cơ chế

này vẫn còn đƣợc tranh cãi [15], [31].
1.1.2.3. Chỉ định
Ung thƣ vú, u xƣơng ác tính (sarcom xƣơng) và u xƣơng Ewing, u mô mềm, u khí
phế quản, u lympho ác tính cả hai dạng Hodgkin và không Hodgkin, ung thƣ biểu
mô tuyến giáp (carcinoma tuyến giáp). Ung thƣ đƣờng tiết niệu và sinh dục: ung thƣ
tử cung, ung thƣ bàng quang, ung thƣ tinh hoàn. Khối u đặc ở trẻ em: Sarcom cơ
vân, u nguyên bào thần kinh, u Wilm, bệnh leucemi cấp [1].
1.1.2.4. Các chế phẩm trên thị trường
Thuốc tiêm dung dịch doxorubicin 2 mg/ml: Adorucin, Adriamycin, Adrim.
Thuốc tiêm liposome doxorubicin: Caelyx, Doxil, Lipo-dox, Myocet.
Bột đông khô pha tiêm 10 mg, 20 mg, 50 mg, 150 mg: Adriblastina, Doxorubicina.
1.2.  liposome
1.2.1. 
Là một hệ mang thuốc gồm một nhân nƣớc ở giữa đƣợc bao bọc bởi một vỏ
phospholipid gồm một hay nhiều lớp đồng tâm có kích thƣớc thay đổi từ hàng chục
nanomet đến hàng chục micromet [6], [7], [8], [25].
4


1.1. C[11]
1.2.2. 
1.2.2.1. Theo kích thước và số lớp
Gồm các loại: Liposome đa lớp đồng trục (MLV), liposome kép (liposome trong
liposome – MVV), liposome đơn lớp lớn (LUV), liposome đơn lớp nhỏ (SUV),
liposome đơn lớp khổng lồ (GUV), liposome đa lớp nhỏ (OLV) [12], [32], [33].

1.2. c mt s loi liposome [5]
1.2.2.2. Theo cấu tạo, thành phần
Liposome quy ước
Là liposome có cấu tạo lớp vỏ chủ yếu là phospholipid và cholesterol. Liposome

quy ƣớc không đƣợc biến đổi bề mặt cũng nhƣ lớp vỏ nên chúng chỉ có chức năng
nang hóa, bảo vệ dƣợc chất bên trong, nếu đƣờng dùng là tiêm tại chỗ thì liposome
có tác dụng giải phóng dƣợc chất kéo dài [7], [27]. Liposome quy ƣớc có nhƣợc
5

điểm là rất dễ bị bắt và phá hủy bởi các đại thực bào trong máu và hệ thống lƣới nội
mô ở gan và lách; khả năng hƣớng tới đích tác dụng còn kém và thụ động chủ yếu
phụ thuộc vào kích thƣớc của liposome và khả năng đi qua khe hở thành mạch ở các
mô ung thƣ; chƣa kiểm soát đƣợc khả năng giải phóng dƣợc chất. Mặc dù vậy, nếu
tế bào bị bệnh thuộc hệ thống thực bào đơn nhân thì chính việc bắt giữ khi di
chuyển trong hệ tuần hoàn lại là ƣu điểm của các liposome quy ƣớc [27].
Liposome biến đổi.
Là những liposome đƣợc biến đổi thành phần vỏ hoặc bề mặt để có những đặc tính
mới.
A. Bin v liposome bằng cách sử dụng các loại phospholipid
khác nhau sẽ nhận đƣợc những liposome nhạy cảm với các tác nhân bên
ngoài nhƣ nhiệt độ, ánh sáng, từ tính. Khi nhận đƣợc các kích thích từ bên
ngoài, lớp vỏ lipid sẽ biến đổi dẫn đến tăng tính thấm đối với dƣợc chất, do
đó dƣợc chất sẽ nhanh chóng giải phóng ra khỏi liposome. Do vậy những
liposome này gọi là những liposome kiểm soát giải phóng (trigger release).
B. Bii b mt liposome bằng các phân tử khác nhau sẽ đƣợc liposome
tuần hoàn dài hay liposome vận chuyển chủ động đến đích tác dụng. Các
chất hay đƣợc sử dụng để làm phối tử gắn lên bề mặt liposome vận chuyển
chủ động là những chất có số lƣợng thụ cảm (receptor) lớn tại mô đích [7].

A. Liposome bin v
Liposome nhạy cảm nhiệt độ [Thermosensitive (heat-triggered)liposomes - TLs]
Hệ liposome đƣợc bào chế bằng các lipid có nhiệt độ chuyển pha (Tm) cao hơn
nhiệt độ sinh lý, dƣợc chất đƣợc giải phóng tại vị trí khối u bằng cách tăng thân
nhiệt tại chỗ. TLs có ƣu điểm là không phụ thuộc vào hiệu ứng EPR (hiệu ứng tăng

tính thấm và thời gian lƣu) do đƣợc kiểm soát trong suốt quá trình điều trị, thuốc
đƣợc giải phóng rất nhanh trong các mạch máu của khối u, sau đó là sự hấp thu
nhanh chóng của các tế bào xung quanh. Ngoài ra, thuốc đƣợc phân phối tới khối u
ở dạng tự do, góp phần cải thiện sinh khả dụng và khả năng xâm nhập khối u.
6

Nhƣợc điểm chính khi sử dụng liposome loại này là không hiệu quả trong điều trị
khối u đã di căn vì sử dụng TLs đòi hỏi phải có hiểu biết chính xác về vị trí khối u
[14]. Tại thời điểm hiện nay công ty Celsion Corporation (USA) đã bào chế thành
công thuốc tiêm liposome doxorubicin nhạy cảm nhiệt độ (ThermoDox) và đang
thử nghiệm lâm sàng pha III trên bệnh nhân ung thƣ gan và pha II trên bệnh ung thƣ
vú [7].
Liposome nhạy cảm ánh sáng (light-sensitive liposome)
Liposome có thể đƣợc tạo thành với các lipid nhạy cảm với ánh sáng. Các tác nhân
nhạy cảm ánh sáng nhƣ dẫn chất porphyrin, chlorins, phthalocyanines tạo ra oxy
nguyên tử sau khi phơi nhiễm ánh sáng và đƣợc sử dụng để kích thích tiêu diệt các
tế bào ung thƣ. Liposome nhạy cảm ánh sáng đƣợc ứng dụng nhiều trong điều trị
những khối u nông [14].
Liposome nhạy cảm pH [pH-sensitive (acidic-triggered) liposomes – pHSLs]
Đƣợc bào chế từ các phospholipid nhạy cảm với pH thấp (< 7), dƣới tác động của
pH acid trong nội bào hoặc ở khối u, lớp vỏ liposome sẽ bị phá vỡ và giải phóng
dƣợc chất ra khỏi liposome. Hệ phân phối thuốc chỉ có thể bị phá vỡ trong
endosomes/lysosomes, giải phóng dƣợc chất theo cơ chế dung hợp với màng tế bào.
Ví dụ điển hình cho liposome loại này là các liposome có thành phần lớp vỏ gồm
dioleylphosphoethanolamine (DOPE) và cholesterylhemisuccinate (CHEMS).
Những thành phần này gây ra sự mất ổn định màng liposome ở pH acid yếu, cho
phép hợp nhất với màng endosome/lysosome và giải phóng thuốc vào trong tế bào
chất [14].
Liposome có từ tính (Magnetic liposomes –MLs)
Các phân tử sắt oxid Fe

3
O
4
hoặc γ-Fe
2
O
3
đƣợc gắn vào bên trong liposome, tạo nên
các liposome có tính từ. MLs cho phép phân phối thuốc có kiểm soát nhờ tác dụng
của một từ trƣờng bên ngoài. Các MLs có thể đƣợc dùng cho mục đích chẩn đoán
bệnh, để chữa trị ung thƣ và kết hợp với các thuốc khác để giải phóng có kiểm soát
cho các liệu pháp chữa trị hiệu quả và an toàn hơn. MLs chia làm hai loại là MLs cổ
điển (classical ML) bao gồm một tiểu phân oxid sắt ~ 15 nm đƣợc bao quanh bởi
7

một lớp màng kép lipid. Khi bên trong chứa đầy các tiểu phân nano oxid sắt thì sẽ
không còn cấu trúc nhân nƣớc. Loại này không cho phép gắn các thuốc thân nƣớc.
Loại thứ hai bao gồm các liposome kích thƣớc khoảng 100 - 500 nm bao quanh một
vài tiểu phân nano oxid sắt kích thƣớc 1 - 10 nm phân tán trong một nhân nƣớc, cho
phép gắn đồng thời nhiều thuốc thân nƣớc [14].
Liposome giải phóng nhờ siêu âm [Echogenic (ultrasound-triggered) liposomes –
ELs]
Giải phóng thuốc có kiểm soát nhờ sóng siêu âm đã đƣợc nghiên cứu do đặc tính
không xâm nhập và có khả năng xuyên qua cơ thể và tăng tính thấm ở hàng rào máu
- mô và màng tế bào. Không khí đƣợc gắn trong ELs cho phép ELs phản ứng khi
kích hoạt sóng siêu âm và nhờ đó mà thuốc đƣợc giải phóng khỏi liposome. Giải
phóng thuốc có thể đƣợc điều chỉnh theo các thông số của sóng siêu âm [14].

B. Liposome bii b mt
Liposome tuần hoàn dài (long-circulating liposome): Đƣợc bào chế từ

phospholipid trung hòa có nhiệt độ chảy cao, đƣợc bao bề mặt bằng các phân tử
polyme thân nƣớc nhƣ PEG, vì vậy liposome có cấu trúc không gian cồng kềnh nên
tránh đƣợc sự nhận diện của quá trình opsonin hóa làm tăng thời gian lƣu trú trong
hệ tuần hoàn. Với kích thƣớc nhỏ (100 – 200 nm) liposome dễ dàng xâm nhập vào
mô ung thƣ mà không qua đƣợc thành mạch của mô lành. Đây đƣợc gọi là hiệu ứng
tăng tính thấm và thời gian lƣu (EPR). Liposome tuần hoàn dài vận chuyển thuốc
theo cơ chế thụ động dựa trên thời gian lƣu trú lâu trong hệ tuần hoàn của liposome
và tính thấm cao của thành mạch mô ung thƣ [7].
Liposome vận chuyển chủ động (active targeted liposome): Đƣợc chức năng hóa
bề mặt bằng các phối tử (ligand) đƣợc nhận biết bởi các thụ cảm (receptor) trên bề
mặt tế bào mô đích. Những liposome này đƣợc nghiên cứu để vận chuyển chủ động
đến mô ung thƣ. Tế bào ung thƣ sản sinh ra rất nhiều các protein, hormon, enzym có
tính kháng nguyên và những kháng nguyên này sẽ đƣợc nhận biết bởi các kháng thể
tƣơng ứng. Trên bề mặt tế bào ung thƣ có chứa gấp nhiều lần kháng nguyên cũng
8

nhƣ thụ cảm so với các mô lành. Ví dụ nhƣ thụ cảm của các yếu tố tăng trƣởng
(folat receptor, transferrin receptor), protein trên bề mặt tế bào nội mô ung thƣ [7].
1.2.3. 
, ThS. Nguyễn Văn Lâm đã nghiên cứu và đƣa ra đƣợc công
thức và quy trình bào chế cho thuốc tiêm liposome DOX 2 mg/ml. Liposome đƣợc
bào chế bằng phƣơng pháp hydrat hóa film với thành phần màng lipid gồm SPC và
Chol (7 : 3, tỉ lệ mol), giảm kích thƣớc tiếu phân bằng siêu âm, đổi môi trƣờng
ngoài liposome là amoni sulfat bằng hệ thống lọc tiếp tuyến tự động, tạo ra các
liposome có sự chênh lệch pH hai bên màng. Sau đó bơm hỗn dịch này vào các lọ
thủy tinh có chứa bột đông khô của DOX và ủ ở 50
o
C trong 15 phút. Kết quả tạo ra
liposome DOX có kích thƣớc dƣới 200 nm, hiệu suất liposome hóa trên 80%. Đánh
giá tác dụng của liposome DOX trên khối u động vật cho thấy ƣu thế vƣợt trội của

thuốc tiêm dạng liposome so với dạng dung dịch, đặc biệt là trên khối u dƣới da [5].
 Nguyễn Thu Trang đã nghiên cứu và xây dựng đƣợc quy trình bào chế
liposome DOX 2 mg/ml bằng phƣơng pháp pha loãng ethanol. Công thức bào chế
gồm HSPC và Chol (10:3, kl/kl). Quá trình bào chế trải qua các bƣớc: Hòa tan
HSPC, Chol trong ethanol và đệm citrat trong nƣớc, tiêm nhanh pha ethanol vào
dung dịch đệm kết hợp khuấy trộn bằng máy đồng nhất hóa, cô đặc mẫu bằng hệ
thống lọc tiếp tuyến tự động, đổi đệm bên ngoài liposome bằng HEPES pH 7,4 và
gắn dƣợc chất. Liposome thu đƣợc có KTTP < 0,2 µm, PDI ~ 0,2 và hiệu suất
liposome hóa đạt 90%. Nghiên cứu đã xây dựng đƣợc quy trình bào chế và đánh giá
đƣợc sự ảnh hƣởng của tỉ lệ dung môi, nhiệt độ, ảnh hƣởng của quá trình làm giảm
KTTP tới KTTP và hiệu suất liposome hóa. Nghiên cứu cho thấy bào chế liposome
bằng phƣơng pháp pha loãng ethanol đã khắc phục đƣợc một số nhƣợc điểm của
phƣơng pháp hydrat hóa film nhƣ thời gian bào chế dài, phải sử dụng phƣơng pháp
làm giảm kích thƣớc tiểu phân, tuy nhiên phƣơng pháp này cũng còn tồn tại những
hạn chế nhất định nhƣ tỉ lệ pha loãng ethanol quá lớn nên phải trải qua giai đoạn cô
đặc để giảm thể tích đồng thời chƣa kiểm soát đƣợc lƣợng ethanol tồn dƣ trong chế
phẩm thuốc tiêm [9].
9

Nhìn chung các nghiên cứu trong nƣớc chủ yếu tập trung vào bào chế và đánh giá
tác dụng sinh học của liposome DOX quy ƣớc, chƣa có nghiên cứu nào về các
liposome sử dụng dẫn chất polyme nhƣ PEG để làm tăng thời gian tuần hoàn và
giảm tốc độ thanh thải trong huyết tƣơng.
1.3. Lipo
1.3.1. 
Liposome PEG hóa còn đƣợc gọi là liposome ngụy trang. Để tồn tại lâu trong hệ
thống tuần hoàn bề mặt vỏ các liposome đƣợc đƣa thêm nhóm thân nƣớc có kích
thƣớc lớn, tƣơng hợp sinh học là PEG nhằm tạo ra một lớp áo bảo vệ cho liposome
để thoát khỏi quá trình opsonin hóa, sự tấn công của đại thực bào và hệ thống lƣới
nội mô tại gan. Các liposome PEG hóa hƣớng đích theo cơ chế thụ động, do thời

gian lƣu hành trong tuần hoàn tăng nên thời gian tập trung ở mô đích tăng nhờ hiệu
ứng EPR [23], [24], [27], [28].
1.3.2.  
m c
- Ƣu điểm nổi bật nhất là giảm mạnh hấp thu vào MPS (hệ đại thực bào đơn nhân)
và kéo dài thời gian tuần hoàn do đó cải thiện đƣợc sự phân bố vào các mô đƣợc
tƣới máu [16], [19]. Blume và các cộng sự đã làm sáng tỏ đƣợc thời gian tuần hoàn
trong máu tăng là do giảm tƣơng tác giữa các liposome với các protein trong huyết
tƣơng và các protein trên bề mặt tế bào [19]. Liposome biến đổi bề mặt bằng cách
PEG hóa sẽ hình thành một lớp nƣớc bao quanh liposome do tƣơng tác giữa polyme
– PEG và phân tử nƣớc, nhờ đó mà ngăn cản đƣợc hiện tƣợng opsonin hóa [26],
[29].
- Chuỗi PEG trên bề mặt liposome cũng giúp tránh đƣợc hiện tƣợng kết tụ các
liposome nên cải thiện đƣợc độ ổn định công thức. Needham và các cộng sự (1992)
đã chứng minh rằng sự có mặt của PEG trên bề mặt liposome tạo ra lực đẩy lớn
giữa các lớp màng kép, lực này thắng đƣợc lực hút Van der Waals do đó liposome
sẽ ổn định hơn nhờ tránh đƣợc lực gây kết tụ [17], [19].
10

- Khác với liposome quy ƣớc, dƣợc động học của liposome PEG hóa không phụ
thuộc vào liều. Việc tăng liều sử dụng ít làm tăng tốc độ thanh thải của thuốc, tốc độ
thanh thải chỉ tăng nhanh trong trƣờng hợp liều rất thấp [13].
- Độc tính trên tim, suy tủy, rụng tóc và nôn giảm đáng kể so với doxorubicin
truyền thống khi dùng với liều đạt hiệu quả tƣơng đƣơng [19].

- Việc PEG hóa không giúp liposome hoàn toàn tránh khỏi sự hấp thu của các tế bào
thuộc hệ thống lƣới nội mô. Moghimi và Szebeni (2003) đã kiểm tra một cách chính
xác những cơ chế để đạt đƣợc thời gian tuần hoàn kéo dài của các liposome “ngụy
trang”. Nghiên cứu cho thấy liposome PEG hóa không hoàn toàn trơ về mặt sinh
học và đã có một số bằng chứng cho thấy rằng polyme có thể gây ra hoạt hóa hệ

thống bổ thể [19].
- Liposome DOX PEG hóa làm tăng thời gian tuần hoàn trong máu đồng thời cũng
làm tăng cả thời gian tiếp cận với các mô lành trong cơ thể, do vậy có khả năng gây
ra một số tác dụng không mong muốn khác [18].
1.3.3
PEG là một polyether diol thẳng có nhiều đặc tính hữu ích
 Tƣơng thích sinh học với cơ thể,
 Hòa tan trong nƣớc và nhiều dung môi hữu cơ,
 Độc tính thấp,
 Tính kháng nguyên và khả năng tạo miễn dịch thấp,
 Thải trừ tốt,
 Dễ dàng hợp nhất polyme với lipid [19].
Những đặc tính này cho phép PEG đƣợc ứng dụng nhiều trong lâm sàng bao gồm cả
lĩnh vực y sinh hóa [19]. PEG và dẫn chất của nó đƣợc sử dụng rộng rãi để cải thiện
dƣợc động học và độ ổn định của các hệ mang thuốc [22]. Khối lƣợng phân tử và
cấu trúc của phân tử PEG có thể đƣợc điều chỉnh cho từng mục đích cụ thể [19].
11

1.3.4. 
Ảnh hưởng của tính linh động chuỗi PEG
- Độ linh động của chuỗi PEG ảnh hƣởng tới thời gian tuần hoàn của liposome. Độ
linh động càng cao thì khả năng ức chế hiện tƣợng opsonin hóa và sự phát hiện của
các protein và kháng thể càng cao. Tuy nhiên độ linh động của PEG trên bề mặt
liposome rất khó đƣợc đánh giá bằng các phân tích thí nghiệm, tác dụng của độ linh
động PEG trên độ ổn định liposome chủ yếu đƣợc thảo luận trên cơ sở mô phỏng
tính toán [10].
- Abe.K và các cộng sự (2015) tiến hành nghiên cứu đánh giá sự ảnh hƣởng của
cholesterol tới độ linh động của chuỗi PEG với nồng độ cholesterol khảo sát từ 0-30
%mol. Kết quả phổ cộng hƣởng từ hạt nhân cho thấy sự hợp nhất cholesterol vào
trong lớp màng kép lipid làm tăng độ linh động của chuỗi PEG. Ngoài ra độ linh

động chuỗi PEG cũng tăng đáng kể khi cholesterol bị loại bỏ khỏi lớp màng kép ở
nồng độ trên 20 %mol [10].
Ảnh hưởng của khối lượng phân tử PEG
- Việc sử dụng phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân
1
H NMR đã chứng minh
`phân tử lƣợng của PEG trong PEG-lipids đƣợc gắn lên bề mặt liposome có ảnh
hƣởng đến độ linh động của chuỗi PEG tại bề mặt liposome. Khối lƣợng phân tử
PEG tăng sẽ làm tăng độ linh động trên bề mặt liposome [10].
- Trong hầu hết các trƣờng hợp, chuỗi PEG dài hơn sẽ làm tăng thời gian tuần hoàn
trong máu tốt hơn. Allen và cộng sự (1991) đã báo cáo rằng nồng độ liposome trong
máu cao hơn khi sử dụng liposome SM/PC/Chol/DSPE-PEG với khối lƣợng phân
tử PEG lớn hơn (PEG
1900
, PEG
5000
) so với liposome chứa PEG-lipid với PEG chuỗi
ngắn hơn (ví dụ PEG
750,
PEG
120).
Sử dụng PEG
2000
thu đƣợc gấp đôi lƣợng lipid còn
lại trong huyết tƣơng so với công thức có PEG phân tử lƣợng 350 tới 750 [19].
- Một số nghiên cứu gần đây đã đánh giá đƣợc ảnh hƣởng độ dài chuỗi PEG của các
liposome đƣợc PEG hóa lên thời gian bán thải ở invivo. Dos Santos và các cộng sự
đã thấy rằng các liposome đƣợc PEG hóa với 5 %mol PEG
350
, PEG

550
, PEG
750
thu
12

đƣợc sinh khả dụng và thời gian tuần hoàn trong máu tƣơng tự nhƣ liposome đƣợc
PEG hóa 2 %mol hoặc 5 %mol PEG
2000
[23].
- Với các PEG chuỗi dài hơn, Maldiney và cộng sự đã chứng minh đƣợc rằng khi
che phủ hoàn toàn các liposome với PEG
5000
, PEG
10000
hoặc PEG
20000
không làm
ảnh hƣởng đến sự phân bố sinh học so với PEG
2000
[23]. Fang và cộng sự lại thấy
rằng các liposome đƣợc PEG hóa với PEG
5000
làm giảm sự hấp thu protein và tăng
cƣờng tác dụng tới đích khối u hơn so với các liposome đƣợc PEG hóa PEG
2000
và
PEG
1000
[23].

Ảnh hưởng của mật độ PEG.
- Mật độ phân tử PEG xác định mức độ che phủ và khoảng cách giữa các phân tử
đƣợc gắn vào liposome và xác định hình dạng PEG trên bề mặt liposome
- Walkey và cộng sự đã đánh giá tác dụng của mật độ PEG lên tốc độ thanh thải và
hiện tƣợng opsonin hóa liposome. Kết quả cho thấy mức độ opsonin hóa có tỉ lệ với
kích thƣớc liposome và mật độ phân tử PEG trên bề mặt, với mật độ PEG cao (>
0,75 PEG/nm
2
) khả năng ức chế quá trình opsonin hóa lên tới 99% so với các
liposome không PEG hóa. Các liposome với mật độ PEG hóa thấp (< 0,16
PEG/nm
2
) đƣợc hấp thu thông qua cơ chế phụ thuộc vào huyết tƣơng còn các
liposome với mật độ PEG hóa cao (> 0,64 PEG/nm
2
) lại độc lập với huyết tƣơng,
tức là bất cứ protein huyết tƣơng nào hấp phụ lên liposome cũng không ảnh hƣởng
đến quá trình hấp thu liposome [10].
- Phân tử PEG đƣợc gắn trên bề mặt của liposome làm giảm mạnh lực hút Van der
Waals và tăng lực đẩy giữa các liposome. Việc tăng nồng độ PEG làm giảm kết tụ,
giảm dần kích thƣớc liposome và cuối cùng hòa tan hoàn toàn LUV vào trong các
micell ở 30 %mol DSPE-PEG. Kích thƣớc của liposome giảm dần khi tăng nồng
độ DSPE-PEG %mol ngoại trừ 7 ± 2 %mol [15].
- Đối với liposome lƣợng PEG tối ƣu bao phủ lên bề mặt liposome nằm trong
khoảng 5 %mol và 9 %mol của PEG
2000
. Ở nồng độ đó mỗi chuỗi polyme ở dạng
cấu trúc hình nấm (mushroom) liên kết yếu với nhau tạo nên sự che phủ toàn bộ bề
mặt liposome để ngăn cản hiện tƣợng opsonin hóa. Dƣới khoảng này, độ che phủ bề
13

mặt PEG là chƣa hoàn toàn, điều này tạo điều kiện để quá trình opsonin hóa diễn ra
nhanh chóng. Ở nồng độ trên 9 %mol mặc dù mức độ che phủ là hoàn toàn nhƣng
mật độ cao PEG che phủ trên bề mặt khiến PEG có hình dáng giống bàn chải
(brush), điều này làm mất ổn định màng lipid kép do lực đẩy ngang của chuỗi PEG
gây ra [23].
- Markus Johnsson và cộng sự đã nghiên cứu các cấu trúc khác ngoài liposome có
trong hỗn dịch liposome tạo thành với các nồng độ PEG
2000
hoặc PEG
5000
khác
nhau. Các hình ảnh chụp TEM đã cho thấy có sự chuyển dạng từ liposome sang
micell cầu thông qua sự hình thành các micell dạng đĩa. Cấu trúc micell dạng đĩa
xuất hiện ngay ở nồng độ PEG thấp (< 5%), càng tăng nồng độ PEG thì càng hình
thành nhiều cấu trúc micell đĩa nhỏ hơn và cho tới nồng độ 19,5 %mol thì chỉ còn
một vài liposome, phần còn lại là các micell dạng đĩa có kích thƣớc rất nhỏ. Tiếp
tục tăng nồng độ PEG-DSPE cấu trúc liposome biến mất hoàn toàn, các micell đĩa
có kích thƣớc giảm dần và tiến lại gần nhau hình thành nên các micelle cầu. Xảy ra
sự chuyển đổi tất cả liposome thành các micell dạng đĩa ở nồng độ gần 20 %mol
của DPPE-PEG
2000
. Sự biến đổi cấu trúc này cũng xảy ra tƣơng tự với DSPC và
PEG
5000.
Tuy nhiên, có một vài khác biệt về nồng độ chính xác của PEG-lipid cần
thiết cho việc chuyển đổi hoàn toàn liposome vào micell đĩa. Sử dụng PEG
5000
cần
nồng độ 30 - 40 %mol, cao hơn so với PEG

2000
(20 %mol) [20].
Hiện nay việc sử dụng PEG
2000
nồng độ 5 %mol đƣợc chấp nhận để đạt đƣợc
thời gian tuần hoàn trong máu tối ƣu. Đây cũng là loại PEG đƣợc sử dụng nhiều
nhất trong các chế phẩm liposome PEG hóa lƣu hành trên thị trƣờng. Tuy nhiên
việc sử dụng PEG
2000
chủ yếu dựa trên sự lựa chọn ngẫu nhiên chứ không phải dựa
trên các lý luận khoa học.
1.3.5. 
Có nhiều cách để gắn PEG vào liposome, trong đó có ba cách điển hình sau:
- Dùng phƣơng pháp vật lý để hấp thụ polyme vào bề mặt của liposome.
- Hợp nhất các PEG-lipid trong quá trình bào chế liposome.
14

- Gắn các nhóm phản ứng tạo liên kết đồng hóa trị lên bề mặt của các liposome đã
tạo thành trƣớc [19].
1.3.6. u  

Neus Lozano và cộng sự đã công bố nghiên cứu về liposome-ICG DOX PEG hóa
gắn kháng thể hƣớng đích đơn dòng (Indocyanine green – ICG). Liposome đƣợc
bào chế bằng phƣơng pháp hydrat hóa film. HSPC/Chol/DSPE-PEG
2000

(56,3:38,2:5,5; tỉ lệ phần trăm mol) đƣợc hòa tan trong chloroform/methanol (4:1,
tt/tt), dung môi đƣợc bốc hơi dƣới áp suất giảm bằng thiết bị cất quay. Lớp film
mỏng đƣợc hydrat hóa với dung dịch dextrose có chứa ICG (có thêm DOX nếu cần
tạo liposome-ICG DOX PEG hóa). Giảm kích thƣớc tiểu phân bằng cách đông chảy

qua 6 chu kỳ và nén qua màng polycarbonat với kích thƣớc lỗ màng khác nhau. Sau
đó tiến hành hợp nhất kháng thể hCTM01 vào liposome vừa tạo thành. Nghiên cứu
đã đánh giá đƣợc sự tích lũy thuốc trong khối u bằng kĩ thuật MSOT (multispectral
optoacoustic tomography). Khả năng tích lũy vƣợt trội của liposome-ICG PEG hóa
gắn kháng thể đơn dòng sau khi truyền tĩnh mạch đã đƣợc nghiên cứu so với
liposome-ICG PEG hóa không gắn kháng thể đơn dòng sử dụng cả mô hình khối u
dƣơng tính phát triển nhanh (4T1) và mô hình khối u phát triển chậm (HT-29). Kết
quả cho thấy cả hai công thức đều có tích lũy vƣợt trội trong các khối u đƣợc nghiên
cứu. Đã quan sát đƣợc sự tích lũy nhanh với liposome gắn kháng thể đơn dòng vào
thời điểm ngay sau khi truyền, phần lớn ở vị trí rìa khối cho thấy sự liên kết với các
thụ thể MUC-1. Ngƣợc lại, các liposome không gắn kháng thể đơn dòng cho thấy
sự tích lũy tại trung tâm của khối u vào thời điểm muộn hơn. Nghiên cứu đã thành
công trong việc gắn DOX vào trong cả liposome-ICG PEG hóa có hƣớng đích và
không hƣớng đích. Với việc hợp nhất Indocyanine green (ICG) với khả năng hấp
thu hình ảnh và phát huỳnh quang nhằm mục đích xác định vị trí khối u, DOX có
tác dụng chống ung thƣ vào liposome PEG hóa, nghiên cứu đã thiết kế đƣợc công
thức mới có nhiều triển vọng trong tƣơng lai [21].
15

  Ikumi Sugiyama, Yasuyuki Sadzuka đã nghiên cứu về sự tăng
cƣờng tác dụng chống ung thƣ của liposome DOX PEG hóa có gắn 2 PEG có phân
tử lƣợng khác nhau. Nghiên cứu đã thiết kế và tổng hợp đƣợc PEG-lipid mới: 1,2-
distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-PEG (different double arms PEG,
DDA-PEG) bao gồm 2 chuỗi PEG có phân tử lƣợng 500, 2000 trong một phân tử để
tạo liposome biến đổi bề mặt hữu ích hơn trong sử dụng. Phƣơng pháp Bangham
đƣợc sử dụng để bào chế liposome. DAA-PEG-modified liposomal doxorubicin
(DDA-LDOX) tạo một lớp nƣớc bao quanh liposome ổn định và lớn nhất so với các
liposome gắn PEG khác ngay cả khi chỉ thêm một lƣợng nhỏ. Nghiên cứu về sự hấp
thu thuốc vào tế bào ung thƣ thu đƣợc kết quả nhóm DDA-LDOX làm tăng nồng độ
thuốc trong tế bào ung thƣ vì nó có khả năng hƣớng tới đích tác dụng là các tế bào

ung thƣ. DDA-LDOX có thời gian tuần hoàn dài trong dòng máu và có mối liên hệ
đặc biệt với tế bào ung thƣ. Nó cũng có tác dụng chống ung thƣ rất mạnh trên chuột
đƣợc cấy M5076 ovarian sarcoma, điều này xảy ra cả với tế bào đã kháng với DOX.
Hơn nữa các liposome này có khả năng duy trì nồng độ DOX trong tế bào ung thƣ
trong một thời gian dài. Những kết quả này đã cho thấy những lợi ích về tác dụng
chống ung thƣ của DDA-liposome trên tế bào M5076 ovarian sarcoma. Nghiên cứu
đã mở ra một hƣớng mới trong việc sử dụng dẫn chất polyme cho việc chữa trị
chống lại những tế bào ung thƣ đã kháng thuốc [29].
Qua một số nghiên cứu trên ta thấy rằng xu hƣớng hiện nay trên thế giới là
tập trung phát triển các liposome biến đổi bề mặt hoặc biến đổi thành phần cấu tạo
vỏ. Bào chế các dạng liposome biến đổi nhằm tăng tính hƣớng đích, giải phóng
thuốc có kiểm soát góp phần tăng tác dụng điều trị, giảm kháng thuốc và tác dụng
phụ.

16

 U


- Liposome PEG hóa.
- Liposome DOX PEG hóa.

Bng 2.1. t lic s dng
STT
Tên nguyên liệu
Nguồn gốc
Tiêu chuẩn
1
Doxorubicin hydroclorid
Ấn Độ

USP
2
Cholesterol
Sigma Aldrich
TCCS
3
Phosphatidylcholin dầu đậu nành đã
hydrogen hóa (HSPC)
Lipoid
TCCS
4
DSPE-PEG
2000
Lipoid
TCCS
5
Cloroform
Trung Quốc
TCCS
6
Ethanol tuyệt đối
Trung Quốc
TKHH
7
Amoni sulfat
Trung Quốc
TKHH
8
HEPES
Mỹ

USP
9
Kali dihydrophosphat
Trung Quốc
TKHH
10
Dinatri hydrophosphat
Trung Quốc
TKHH
11
Triton X100 (Octylphenolpoly –
(ethylen glycolether)
Amresco Ohio-Mỹ
TKHH
12
Túi thẩm tích
Spectrum laboratory-Mỹ
TCCS
13
Natri hydroxid
Trung Quốc
TKHH
14
Acid hydroclorid
Trung Quốc
TKHH
15
Natri clorid
Trung Quốc
TKHH

16
Dung dịch tiêm truyền glucose 5%
Việt Nam
DĐVN
17
Dung dịch tiêm truyền NaCl 0,9%
Việt Nam
DĐVN