Nghiên cứu bào chế liposome mang phức amphotericin b với cyclodextrin

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ THUỶ
NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME
MANG PHỨC AMPHOTERICIN B
VỚI CYCLODEXTRIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


HÀ NỘI - 2015




BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ THUỶ

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME
MANG PHỨC AMPHOTERICIN B
VỚI CYCLODEXTRIN

Người hướng dẫn:
TS. Trần Thị Hải Yến
Nơi thực hiện:
Bộ môn bào chế

Trường Đại học Dược Hà Nội






HÀ NỘI - 2015



LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới:
TS. Trần Thị Hải Yến
Là người thầy đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể các thầy cô, các kỹ thuật viên
bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện để em
hoàn thành khóa luận này.
Nhân đây, em cũng gửi lời cảm ơn các thầy cô trong ban giám hiệu, các phòng
ban và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy bảo em
suốt 5 năm học tập tại trường.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè những người đã giúp đỡ,
động viên em trong quá trình học tập và làm khóa luận.
Hà Nội, tháng 5 năm 2015.
Sinh viên
Phạm Thị Thuỷ

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 2
1.1. Amphotericin B 2
1.1.1. Nguồn gốc 2
1.1.2. Công thức hóa học 2
1.1.3. Đặc tính hoá lý 2
1.1.4. Tác dụng dược lý 3
1.1.5. Dược động học 4
1.1.6. Chỉ định 4
1.1.7. Tác dụng không mong muốn 5
1.1.8. Liều dùng 5
1.1.9. Một số chế phẩm tiêm của amphotericin B trên thị trường 5
1.2. Liposome chứa phức hợp cyclodextrin 6
1.2.1. Phức hợp cyclodextrin- amphotericin B 6
1.2.2. Liposome chứa phức hợp cyclodextrin- amphotericin B 8
1.3. Bào chế liposome chứa phức hợp amphotericin B- cyclodextrin 12
1.3.1. Bào chế phức hợp amphotericin B-cyclodextrin 12
1.3.2. Bào chế liposome thô chứa phức hợp amphotericin B- cyclodextrin 12
1.3.3. Đồng nhất và giảm kích thước tiểu phân liposome 13
1.4. Một số nghiên cứu về liposome chứa phức hợp amphotericin B-
cyclodextrin 14
CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phương tiện nghiên cứu 15

2.2. Nội dung nghiên cứu 16
2.3. Phương pháp nghiên cứu 16
2.3.1. Qui trình bào chế phức hợp amphotericin B- cyclodextrin 16
2.3.2. Qui trình bào chế liposome chứa phức hợp amphotericin B-
cyclodextrin 18
2.3.3. Phương pháp làm giảm và đồng nhất kích thước tiểu phân 20
2.3.4. Phương pháp đánh giá một số đặc tính của phức hợp amphotericin B-
cyclodextrin 20
2.3.5. Phương pháp đánh giá một số đặc tính của liposome chứa phức hợp
amphotericin B- cyclodextrin 22
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26
3.1 Xây dựng phương pháp định lượng amphotericin B trong phức hợp và trong
hỗn dịch liposome 26
3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của tá dược HPβCD và tá dược lipid đến phương
pháp đo quang phổ UV – VIS 26
3.1.2. Đường chuẩn biểu thị sự tương quan giữa nồng độ amphotericin B trong
methanol và mật độ quang 27
3.2 Khảo sát một số yếu tố thuộc về qui trình và công thức bào chế ảnh hưởng
đến đặc tính của phức hợp amphotericin B- cyclodextrin 29
3.2.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của loại cyclodextrin trong công thức bào chế
phức hợp amphotericin B- cyclodextrin 29
3.2.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian ủ để hình thành phức hợp tới đặc
tính của phức hợp 30
3.2.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của lượng dược chất ban đầu tới đặc tính của
phức hợp 31
3.3. Đánh giá một số đặc tính của phức hợp amphotericin B- cyclodextrin 33


3.3.1. Đánh giá hình thức, hình thái của phức hợp amphotericin B-
cyclodextrin 33

3.3.2. Phân tích nhiệt vi sai phức hợp amphotericin B- cyclodextrin 33
3.4. Nghiên cứu bào chế liposome chứa phức hợp amphotericin B- cyclodextrin . 35
3.4.1. Đánh giá hình thức, hình thái, kích thước tiểu phân, thế zeta của mẫu
liposome chứa phức hợp 35
3.4.2. Đánh giá hiệu suất liposome hoá và hàm lượng dược chất trong liposome 36
3.4.3. Đánh giá giải phóng in vitro 38
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41



DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
TT
Viết tắt
Từ/cụm từ đầy đủ
1
α-CD
Anphacyclodextrin
2
β-CD
Beta cyclodextrin
3
HPβCD
Hydroxyl propyl beta cyclodextrin
4
AMB
Amphotericin B
5
CD
Cyclodextrin
6

Chol
Cholesterol
7
DĐVN
Dược điển Việt Nam
8
DMPC
α – Dimyristoylphosphatidylcholin
9
DMPG
1- α-Dimyristoylphosphatidylglycerol
10
DSPG
Distearoylphosphatidylglycerol
11
HSPC
Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (Hydrogennated
soy phosphatidylcholine)
12
KTTP
Kích thước tiểu phân
13
LTT
Lọc tiếp tuyến
14
NSX
Nhà sản xuất
15
PDI
Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index)

16
TKHH
Tinh khiết hoá học
17
USP
United State Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ)
18
Z
average
Kích thước tiểu phân trung bình




DANH MỤC BẢNG BIỂU
Số hiệu
Tên bảng biểu
Trang
Bảng 1.1.
Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường
6
Bảng 2.1.
Nguyên liệu
15
Bảng 3.1
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tá dược HPβCD tới phương
pháp đo quang UV-VIS
25
Bảng 3.2
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tá dược lipid tới phương

pháp đo quang UV-VIS
26
Bảng 3.3
Mật độ quang của các dung dịch chuẩn trong methanol
27
Bảng 3.4
Thành phần công thức bào chế phức hợp thay đổi loại CD
28
Bảng 3.5
Kết quả ảnh hưởng của loại cyclodextrin đến hàm lượng
AMB trong phức hợp.
28
Bảng 3.6
Kết quả ảnh hưởng của thời gian hình thành phức hợp tới
hàm lượng AMB trong phức hợp
30
Bảng 3.7
Thành phần công thức bào chế phức hợp thay đổi khối lượng
dược chất ban đầu.
31
Bảng 3.8
Kết quả ảnh hưởng của khối lượng AMB ban đầu tới hàm
lượng AMB trong phức hợp
31
Bảng 3.9
Kết quả KTTP, phân bố KTTP và thế zeta của liposome
chứa phức hợp AMB-CD.
35
Bảng 3.10
Thành phần công thức bào chế liposome thường và lipsome

chứa phức hợp.
35
Bảng 3.11
Kết quả sự khác biệt về hiệu suất liposome hoá giữa mẫu
liposome thường và liposome chứa phức hợp.
36
Bảng 3.12
Kết quả sự khác biệt về hàm lượng AMB giữa các mẫu
liposome AMB thường và liposome chứa phức hợp AMB-
CD.
37
Bảng 3.13
Kết quả đánh giá giải phóng invitro của liposome AMB
thường và liposome chứa phức hợp AMB-CD.
38




DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Số hiệu
Tên hình vẽ, đồ thị
Trang
Hình 1.1.
Công thức hoá học của AMB.
2
Hình 1.2.
Cấu trúc liposome.
8
Hình 1.3.

Phân tử HSPC và DSPG.
9
Hình 1.4.
Thiết bị đùn ép mini extruder.
14
Hình 2.1.
Sơ đồ quy trình bào chế phức hợp AMB-CD.
17
Hình 2.2
Sơ đồ qui trình bào chế liposome chứa phức hợp AMB-CD
bằng phương pháp hydrat hoá màng phim.
19
Hình 2.3
Cơ chế của phương pháp sử dụng máy lọc tiếp tuyến loại bỏ
phần AMB ở dạng phức hợp AMB-CD không nằm trong
liposome.
23
Hình 3.1
Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ AMB và độ
hấp thụ quang.
27
Hình 3.2
Kết quả chụp SEM của mẫu nguyên liệu AMB (a) và phức
hợp AMB-HPβCD (b).
32
Hình 3.3
Kết quả phân tích DSC của mẫu AMB (a), mẫu HPβCD (b)
và mẫu phức hợp AMB-HPβCD (c).
34
Hình 3.4

Đồ thị đánh giá giải phóng in vitro liposome chứa phức
AMB-CD và liposome AMB thường.
39
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Amphotericin B là một trong những kháng sinh chống nấm thế hệ đầu tiên, nó
bắt đầu được đưa vào sử dụng năm 1957. Trong nhiều năm, amphotericin B vẫn là một
thuốc chống nấm hiệu quả nhất để điều trị nấm toàn thân. Tuy nhiên, do có nhiều hạn
chế như là dược chất thân dầu, không tan trong nước, có nhiều tác dụng phụ nghiêm
trọng, đặc biệt là tác dụng phụ trên thận gây khó khăn trong việc ứng dụng trong lâm
sàng.
Để tăng hiệu quả điều trị cũng như hạn chế các tác dụng phụ nghiêm trọng của
thuốc, hàng loạt nghiên cứu về các hệ mang thuốc mới ra đời. Dạng chế phẩm tiêm ban
đầu của aqmphotericin B là dạng micell (chế phẩm Fungizone). Tuy nhiên ở dạng bào
chế này, amphotericin B không bền trong hệ tuần hoàn và nhanh chóng chuyển từ dạng
miccell sang dạng lipoprotein gây độc cho tế bào vật chủ, đặc biệt là độc tính trên thận.
Tiếp đến, dạng bào chế liposome của amphotericin B thể hiện nhiều ưu điểm song hàm
lượng amphotericin B sử dụng thấp, chỉ khoảng 9 mol % so với tổng lipid. Sự kết hợp
amphotericin B với cyclodextrin tạo thành phức hợp, đưa phức hợp vào khoang nước
của liposome là một hướng nghiên cứu mới đầy triển vọng. Dạng bào chế này có thể
tận dụng những ưu điểm đồng thời khắc phục được yếu điểm hàm lượng dược chất
thấp của liposome nhằm nâng cao hiệu quả điều trị, giảm độc tính, tăng liều sử dụng
của amphotericin B.
Để ứng dụng cyclodextrin làm chất mang thuốc và cải thiện độ tan của thuốc
trong nước, triển khai đề tài “ Nghiên cứu bào chế liposome mang phức aphotericin B
với cyclodextrin “ nhằm mục tiêu :
1. Xây dựng được qui trình bào chế phức hợp cyclodextrin- amphotericin B.
2. Bào chế được liposome mang phức hợp cyclodextrin- amphotericin B.
3. Đánh giá được một số đặc tính: kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu

phân và hiệu suất tạo liposome, giải phóng in vitro.
2

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN
1.1. Amphotericin B
1.1.1. Nguồn gốc
Amphotericin B là một hỗn hợp các polyen chống nấm được sản xuất bằng
cách nuôi cấy một số giống Streptomyces nodosus hoặc bằng các phương pháp, chứa
chủ yếu là amphotericin B .
Amphotericin B là acid (1R, 3S, 5R, 6R, 9R, 11R, 15S, 16R, 17R, 18S, 19E,
21E, 23E, 25E, 27E, 29E, 31E, 33R, 35S, 36R, 37S) -33- [(3-amino-3,6-dideoxy-  - D
- mannopyranosyl) oxy ]-1, 3, 5, 6, 9, 11, 17, 37 - octahydroxy -15, 16, 18 trimethyl -
13 - oxo - 14, 39 - dioxabicyclo - [33.3.1] nonatriaconta -19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 -
heptaen - 36 carboxylic.
Hoạt lực của chế phẩm không được nhỏ hơn 750 IU/mg tính theo chế phẩm đã làm
khô [3].
1.1.2. Công thức hóa học

Hình 1.1: Công thức hoá học của AMB.
Công thức phân tử: C
47
H
73
NO
17

Khối lượng phân tử: 924 [3].
1.1.3. Đặc tính hoá lý
3

Lý tính
- Bột kết tinh màu vàng hoặc da cam [3].
- Độ tan: AMB hầu như không tan trong nước (<0,1mg/ml ở 21
0
C), không tan
trong chloroform hay ethanol. Nó hòa tan trong dimethyl sulphoxide (DMSO) (30-40
mg/ml) và dimethylformamide (DMF) (2-4 mg/ml), tan được trong methanol [2].
Hoá tính
Hóa tính chính của AMB là của hệ dây nối đôi luân phiên, nhóm amin và nhóm
carboxylic tự do, do đó AMB có tính chất sau:
- Tính lưỡng tínhvà lưỡng thân.
- Tạo muối hơi tan trong nước khi tác dụng với acid hydrocloric hoặc các dung
dịch kiềm.
- Dung dịch AMB trong methanol có 3 cực đại hấp thụ ở 362, 381 và 405 nm. Tỷ
lệ độ hấp thụ ở 362 nm so với 381 nm là 0,57- 0,61, tỷ lệ độ hấp thụ ở 381 nm so với
405 nm là 0,87-0,93 [2].
1.1.4. Tác dụng dược lý
Cơ chế tác dụng: Cơ chế tác dụng của AMB, cũng như của các polyen khác, dựa
trên sự liên kết giữa đuôi kỵ nước của AMB với đuôi ergosterol trên màng tế bào nấm,
tạo các kênh trên màng tế bào, làm thay đổi tính thấm và tính khử cực của màng tế bào,
làm rò gỉ các chất bên trong tế bào ra ngoài và cuối cùng làm chết tế bào nấm. AMB
cũng có thể liên kết với các cholesterol trên màng tế bào người, điều này là nguyên
nhân chính gây tác dụng phụ nghiêm trọng của AMB. Ái lực của AMB với ergosterol
màng lớn hơn với cholesterol màng nên AMB thể hiện tác dụng chống nấm chủ yếu
nhưng vẫn tiềm tàng tác dụng phụ nghiêm trọng, đặc biệt là tổn thương thận với các
biểu hiện: suy thận, tăng creatinin và ure huyết, rối loạn chuyển hoá, tăng kali máu…
AMB có tác dụng kìm nấm đối với một số loại nấm như: Absidia, Aspergillus,
Basidiobolus, Blastomyces dermatitidis, Candida… Nồng độ ức chế tối thiểu đối với
các loại nấm này là 0,03- 1 mcg/ml.
4

Thuốc không có tác dụng với virus, vi khuẩn và ricketsia [4].
1.1.5. Dược động học
AMB hấp thu rất kém qua đường tiêu hóa, do vậy thuốc chủ yếu được tiêm
truyền tĩnh mạch để điều trị các trường hợp nhiễm nấm nặng toàn thân và chỉ dùng
đường uống để điều trị tại chỗ (nhiễm nấm đường tiêu hóa và niêm mạc miệng).
Khi tiêm tĩnh mạch dưới dạng dung dịch keo với liều thông thường tăng dần,
nồng độ đỉnh trong huyết tương là 0,5 tới 4 microgam/ml. Nồng độ thuốc trong huyết
tương trung bình là 0,5 microgam/ml với liều duy trì 400 - 600 microgam/kg thể
trọng/ngày.
AMB liên kết với protein ở mức cao. Thuốc phân bố rộng rãi trong cơ thể nhưng
chỉ một lượng nhỏ vào trong dịch não tủy. Nửa đời của thuốc trong huyết tương
khoảng 24 giờ, khi dùng thời gian dài, nửa đời cuối cùng có thể tới 15 ngày. AMB bài
tiết rất chậm qua thận, với 2 - 5% liều đã dùng bài tiết dưới dạng hoạt tính sinh học. Sau
khi ngừng điều trị, vẫn có thể tìm thấy thuốc trong nước tiểu ít nhất sau 7 tuần. Lượng
thuốc tích lũy trong nước tiểu sau 7 ngày xấp xỉ 40% lượng thuốc đã truyền. Có thể do
vậy mà AMB có nguy cơ gây độc cao với thận. Không loại được AMB ra khỏi cơ thể
bằng thẩm tách máu.
AMB dưới dạng liposom hoặc phức hợp với lipid làm tăng hoạt tính chống nấm
và làm giảm độc tính của thuốc [4].
1.1.6. Chỉ định
- Thuốc uống (viên, hỗn dịch) dùng tại chỗ để điều trị nhiễm nấm Candida
albicans ở miệng và ở đường tiêu hóa.
- Tiêm tĩnh mạch AMB dùng để điều trị nhiễm nấm toàn thân nặng do nhiễm
Aspergillus, Blastomyces, Candida, Coccidiodesimmitis, Cryptococus, Hitstoplasma,
Mucor, Paracoccidioides và Sporotrichum.
- Phòng nhiễm nấm cho bệnh nhân sốt kéo dài và giảm bạch cầu trung tính đã
điều trị lâu bằng kháng sinh phổ rộng hoặc điều trị ung thư bằng hóa chất.
5

- Dạng liposome hoặc phức hợp lipid: chỉ định cho trường hợp điều trị thất bại
bằng AMB thông thường hoặc trong trường hợp AMB có thể gây độc cho thân hoặc
gây suy thận[4].
1.1.7. Tác dụng không mong muốn
- Phản ứng chung: sốt, rét run, nôn, đau đầu, đau cơ khi mới tiêm truyền.
- Độc với thận: giảm sức lọc cầu thận, hoại tử thận.
- Tác dụng không mong muốn khác: thiếu máu, độc với gan tim, giảm K
+
và
Mg
2+
huyết… [4].
1.1.8. Liều dùng
Đường tiêm tĩnh mạch:
- AMB quy ước (Fungizone): bắt đầu với liều 0,25 mg/kg/ngày, tăng dần tới tối
đa 1mg/kg/ngày, trường hợp nặng, liều có thể cần tới 1,5 mg/kg/ngày hoặc cho cách 1
ngày.
- AMB dạng liposome: bắt đầu với liều 1 mg/kg/ngày, tăng dần tới 3- 4
mg/kg/ngày.
- Dạng phức hợp phospholipid: thường dùng với liều 5 mg/kg/ngày.
Đường uống:
- Viên 10 mg hoặc hỗn dịch chứa 100mg/ml.
- Nhiễm nấm Candida ở miệng: hỗn dịch dùng 1 ml/lần × 4 lần/ngày, giữ thuốc
trong miệng ít nhất 1 phút trước khi nuốt, viên tan trong miệng dùng 4 lần/ngày.
- Nhiễm nấm Candida ở ruột: 100- 200 mg/ngày, 4 lần/ngày [4].
1.1.9. Một số chế phẩm tiêm của amphotericin B trên thị trường

6

Bảng 1.1: Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường
TT
Tên chế
phẩm
Hàm
lượng
Thành phần
Dạng cấu
trúc
%
mol
AM
B
Dạng
bào
chế
Liều dùng
1
Fungizone
50 mg
AMB và natri
deoxycholat
Micell
34
Bột
đông
khô
1

mg/kg/ngày
2
Abelcet
100
mg/20
ml
DMPC:
DMPG :AMB
(tỷ lệ mol 2
lipid là 7:3)
Phức hợp
lipid
35 –
50
Hỗn
dịch
5
mg/kg/ngày
3
Amphotec
50 mg,
100
mg
Phức hợp
AMB với
cholesteryl
sulfate
Phức hợp
lipid
50

Bột
đông
khô
3 -4
mg/kg/ngày
4
Ambisome
50 mg
HSPC:DSPG:
Chol:AMB
(tỷ lệ mol
2:0,8:1:0,4)
Liposome
10
Bột
đông
khô
3 – 5
mg/kg/ngày
1.2. Liposome chứa phức hợp cyclodextrin
1.2.1. Phức hợp cyclodextrin- amphotericin B
Cyclodextrin là vòng oligosaccarid có 6, 7 hay 8 các đơn vị đường
glucopyranose liên kết với nhau theo liên kết 1-4, với một nhóm hydroxyl thân nước ở
bề mặt bên ngoài và một khoang kị nước ở trung tâm. Các cyclodextrin có khả năng
tạo phức với nhiều loại dược chất do khả năng nhốt toàn bộ phân tử hay một phần của
nó vào trong khoang. Qúa trình tạo phức với cyclodextrin sẽ ảnh hưởng đến đặc tính
của dược chất như khả năng hoà tan và tỷ lệ hoà tan của thuốc [17].
7

Độ hoà tan của AMB trong nước rất thấp (2-4 µg/ml) đặt ra các vấn đề trong

việc phát triển các công thức thuốc lỏng, ứng dụng đặc tính quan trọng của
cyclodextrin là khả năng bao lấy các phân tử khách có kích thước và hình dạng phù
hợp với khoang kị nước làm tăng độ tan của các phân tử khách, tạo ra phức hợp
cyclodextrin- amphotericin B [23].
Cơ chế tạo thành phức hợp: động lực của sự hình thành phức hợp là sự giải
phóng ra các phân tử nước giàu enthalpy từ khoang. Các phân tử nước sẽ được thay thế
bởi các phân tử thuốc kị nước có mặt trong dung dịch để hình thành liên kết không
phân cực và giảm sức căng của vòng cyclodextrin dẫn đến một trạng thái năng lượng
thấp hơn, ổn định hơn [11].
Khả năng hình thành phức hợp phụ thuộc vào 2 yếu tố chính: sự phù hợp về
kích thước và hình dạng không gian giữa phân tử cyclodextrin với phân tử dược chất
hoặc một số nhóm chức quan trọng của phân tử dược chất; sự tương tác nhiệt động lực
học giữa các thành phần của hệ thống (phân tử cyclodextrin, phân tử dược chất, dung
môi).
Các hoạt động có tác động thúc đẩy sự thay đổi trạng thái cân bằng để hình
thành phức hợp:
- Sự dịch chuyển các phân tử nước phân cực từ khoang không phân cực của phân
tử cyclodextrin.
- Việc tăng số lượng các liên kết hydro do việc giải phóng các phân tử nước từ
khoang không phân cực ra môi trường dung môi.
- Giảm tương tác đẩy giữa các phân tử thuốc kị nước với môi trường nước.
- Sự gia tăng tương tác kị nước khi mà phân tử thuốc kị nước được chèn vào
khoang kị nước của phân tử cyclodextrin.
Thời gian cần thiết để đạt được đến trạng thái cân bằng cuối cùng của quá trình
hình thành phức hợp thường khá dài [11].
8

1.2.2. Liposome chứa phức hợp cyclodextrin- amphotericin B
1.2.2.1. Khái niệm về liposome
Liposome là dạng đặc biệt của vi nang và siêu vi nang, gồm một nhân nước ở

giữa được bao bọc bởi một vỏ phospholipid gồm một hay nhiều lớp đồng tâm, có kích
thước thay đổi từ hàng chục nanomet đến hàng chục micromet[1].
Liposome là một nhóm của hệ đưa thuốc tới đích, là hệ điều trị phát triển ở mức
cao hơn thuốc tác dụng kéo dài.






Liposome chứa phức hợp AMB-CD có độ ổn định cao hơn so với liposome AMB
thông thường (đánh giá dựa trên khả năng giải phóng AMB tự do ở 37
o
C trong thời
gian 60 phút : 87,8% so với 34,9%), độc tính thấp hơn (đánh giá dựa trên khả năng làm
tan hồng cầu ở nồng độ 38µg/ ml thì tương ứng là 22% và 27%), và có hiệu quả điều trị
cao hơn (chuột nhiễm A. fumigates được điều trị với liposome thường và liposome
chứa phức thì có tỉ lệ sống sót là 50% và 70%) [9].
1.2.2.2. Thành phần của liposome Amphotericin B
Vỏ liposome
Vỏ liposome gồm 2 thành phần chính là phospholipid và cholesterol.
Phospholipid
Phospholipid sử dụng trong liposome AMB bao gồm phosphatidylcholin đậu
nành hydrogen hóa (HSPC) và distearoylphosphatidylglycerol (DSPG).
A: Bề mặt ưa nước của lớp vỏ lipid kép
B: Lớp kỵ nước của lớp vỏ lipid kép
C: Nhân nước bên trong có thể chứa dược
chất tan trong nước
D: Các dược chất kết tinh bên trong nhân
E: Các dược chất thân dầu trong lớp vỏ

lipid

Hình 1.2: Cấu trúc của liposome[5]
9


Hình 1.3: Phân tử HSPC và DSPG[5].
HSPC và DSPG tham gia quá trình tạo thành lớp lipid kép. Ngoài ra, HSPC có
khả năng ức chế các quá trình peroxyd hóa lipid giúp màng lipid bền vững hơn, hạn
chế thủng màng gây rò rỉ dược chất, DSPG đóng vai trò quan trọng trong cơ chế hình
thành của liposome AMB bằng cách tạo phức với AMB bởi lực hút tĩnh điện ở pH 1-3
trong 1 dung môi không proton [15], [25].
Cholesterol
Cholesterol không tạo lớp kép mà tác dụng như một hệ đệm lỏng để điều chỉnh
thể chất của lớp lipid kép làm giảm tính thấm nước của liposome. Do đặc tính về cấu
trúc phân tử và độ tan, cholesterol lấp vào các khoang của phospholipid kép làm tăng
độ vững chắc cho màng liposome [6].
Ngoài ra, trong liposome AMB, cholesterol có ái lực tốt với AMB nên tạo liên
kết với AMB góp phần đưa dược chất vào pha dầu của cấu trúc liposome, giúp ổn định
cấu trúc này, hạn chế rò rỉ dược chất và giúp liposome vận chuyển AMB tới đích tác
dụng [16], [25].
Dược chất
AMB được phân bố trong cả 2 khoang thân dầu và thân nước của liposome
Trong khoang thân dầu, AMB được gắn chủ động vào liposome trong quá trình
tạo thành liposome bởi sự hình thành các liên kết tĩnh điện với DSPG và liên kết với
cholesterol trong thành phần vỏ phospholipid.
10

Trong khoang thân nước, AMB nằm trong phức hợp AMB- CD được gắn chủ
động vào liposome trong quá trình hydrat hoá màng film.

1.2.2.3 . Ưu nhược điểm
Ưu điểm
- Liposome có thành phần cấu tạo và tính chất lí hóa tương tự màng sinh học như
tính thấm, tính đẳng trương, đặc tính bề mặt, khả năng tương tác với các chất tan. Do
đó đây được coi là hệ vận chuyển thuốc có tính tương hợp sinh học cao [28].
- Liposome có thể thay đổi hoàn toàn các đặc điểm dược động học của hoạt chất,
cải thiện sinh khả dụng của dược chất hơn hẳn so với việc dùng thuốc dạng tự do phải
qua các quá trình dược động học thông thường [1],[7].
- Cải thiện độ tan của thuốc: dựa vào đặc tính hai pha của liposome và sự đa
dạng trong thiết kế công thức, thành phần tá dược [22].
- Liposome có tác dụng bảo vệ và giải phóng một cách có kiểm soát các dược
chất: Khi dược chất được nang hóa trong liposome, cấu trúc đặc biệt của liposome làm
giảm lượng dược chất bị chuyển hóa khi qua gan và lượng lớn dược chất còn lại vượt
qua được các quá trình chuyển hóa này sẽ tạo hiệu quả tác dụng cao hơn [7], [21], [29].
- Giảm độc tính của thuốc, ví dụ như: ở dạng bào chế liposome, AMB liên kết
bền chặt với lớp màng lipid do tạo thành phức hợp AMB – chol, làm giảm khả năng
liên kết với chol trên màng tế bào người làm giảm độc tính của thuốc [16].
- Có thể dễ dàng thiết kế ra nhiều loại liposome có kích thước, thành phần
phospholipid và các đặc tính bề mặt khác nhau, do đó có thể phục vụ cho nhiều mục
đích khác nhau [18].
- Liposome chứa phức hợp dược chất với CD cho hàm lượng dược chất cao hơn.
VD liposome chứa phức hợp curcurmin – HPγCD có nồng độ dược chất là 1,3 mg/ml
trong khi liposome curcurmin thông thường chứa 0,8 mg/ml dược chất [12].
- Liposome chứa phức hợp dược chất kết hợp với CD làm tăng độ ổn định của
liposome so với các liposome thông thường [8].
11

Nhược điểm
Mặc dù có rất nhiều ưu điểm nhưng hiện liposome vẫn chưa được sử dụng rộng
rãi do có một số nhược điểm sau:

- Độ ổn định thấp: liposome kém ổn định cả về mặt vật lí , hóa học và sinh học
[13].
- Nguyên liệu đòi hỏi phải có độ tinh khiết cao, đắt tiền nên giá thành chế phẩm
cao [1],[7].
- Đa số các phương pháp bào chế liposome đều sử dụng dung môi hữu cơ để hòa
tan lipid gây tác động bất lợi đến sức khỏe nguời sử dụng và môi trường [20].
- Đa số các phương pháp bào chế liposome chỉ thích hợp ở quy mô phòng thí
nghiệm, rất khó để sản xuất ở quy mô lớn [13].
1.2.2.4. Độ ổn định
Một trong những lý do làm cho liposome chưa được đưa vào sản xuất hàng loạt
là vấn đề về độ ổn định của chế phẩm. Trong quá trình bảo quản, liposome không bền
cả về mặt vật lý và hóa học [6].
Hóa học:
Sự ổn định hóa học của phospholipid được xem xét trên 2 phương diện là sự
oxy hóa và sự thủy phân. Các quá trình này bị ảnh hưởng bởi pH, nhiệt độ, nồng độ
đệm, ion kim loại, sự tích điện của lớp phospholipid kép…. Bảo quản ở nhiệt độ thấp,
bảo vệ tránh ánh sáng và oxy môi trường được cho là sẽ làm chậm quá trình oxy hóa.
[6],[14].
Vật lý:
Sự ổn định vật lý được đánh giá trên các tiêu chí về KTTP, chỉ số PDI, sự tích
điện bề mặt, tính vững chắc của lớp màng kép, sự thẩm thấu của màng phospholipid
(hay chính là sự rò rỉ của dược chất qua màng) [14].
12

Độ ổn định của liposome là mối quan tâm lớn cho việc lưu trữ lâu dài. Một số
thay đổi như thay đổi KTTP, phân bố KTTP, hàm lượng thuốc và sự kệt tụ có thể xảy
ra khi lưu trữ trong thời gian dài [24].
1.3. Bào chế liposome chứa phức hợp amphotericin B-cyclodextrin
1.3.1. Bào chế phức hợp amphotericin B- cyclodextrin
Phương pháp bào chế phức hợp được sáng chế năm 1989 bởi các nhà khoa học

Wing-Sun Chow , Shirley C. Chen , Peter Timmins và sau đó được sử dụng rộng rãi
trong các nghiên cứu bào chế phức hợp giữa CD và AMB vì tính tiện ích, không đòi
hỏi thiết bị kĩ thuật cao, dễ thực hiện [30].
AMB được hoà tan vào dung dịch nước của CD ở pH=9-12, sau đó dung dịch
thu được sẽ được duy trì ở pH dao động khoảng 6-8 để tách lấy phức hợp. Phức hợp
thu được có thể được đem đông khô để đạt được khả năng hoà tan cao hơn.
Trong phương pháp này, khối lượng CD cần phải nằm trong khoảng 2-3,5 % về
khối lượng, tỉ lệ về khối lượng của AMB/CD nên nằm trong khoảng 1: 60 đến 1: 40.
Việc điều chỉnh pH là rất quan trọng, trong giai đoạn đầu tiên, pH phải nằm trong
khoảng 9-12 để đảm bảo AMB hoà tan hoàn toàn, giai đoạn tiếp theo pH phải nằm
trong khoảng 6-8 nhằm đảm bảo AMB có trong dung dịch hoàn toàn nằm trong khoang
phân tử CD [30].
Tuy nhiên, theo nghiên cứu mới nhất năm 2014 của Helga K. Rui thì giai đoạn
đầu tiên pH cần chỉnh chính xác 12, giai đoạn tách AMB tự do pH cần duy trì ở 5,5 thì
hiệu suất tạo phức là tối ưu [26].
1.3.2. Bào chế liposome thô chứa phức hợp amphotericin B- cyclodextrin
Liposome chứa phức hợp AMB-CD được bào chế theo phương pháp hydrat hoá
màng film trong đó dung dịch hydrat hoá chính là dung dịch phức hợp AMB-CD trong
môi trường đệm photphat pH = 5,5 [12].
13

Liposome được tạo ra bởi phương pháp này có thể có KTTP lớn và không đồng
nhất. Để đạt được mục đích điều trị, việc đồng nhất và giảm KTTP liposome là cần
thiết.
1.3.3. Đồng nhất và giảm kích thước tiểu phân liposome
Mục đích của quá trình này là tạo ra liposome có kích thước nhỏ và phân bố
kích thước hẹp, điều này giúp tăng độ ổn định về mặt vật lý, cải thiện hình thức cho
chế phẩm, đồng thời cho phép lọc loại khuẩn liposome và sử dụng liposome bằng
đường tiêm tĩnh mạch [27].
Đùn ép

Đùn ép là một biện pháp làm giảm KTTP, sử dụng áp lực vừa phải để đẩy các
liposome trong dung dịch qua các màng lọc polycarbonate tiêu chuẩn với kích thước
màng xác định [19].
Đùn tuần tự bằng thiết bị mini – extruder:
Đùn ép có thể được thực hiện bằng cách sử dụng một hệ thống xylanh cầm tay
trang bị bộ giữ màng lọc với kích thước màng lọc phù hợp. Để có thể đùn ép qua lỗ lọc
200 nm, dung dịch liposome loãng phải được tuần tự đùn qua các màng lọc với kích
thước lỗ lọc lớn hơn. Sau đó, quá trình đùn ép dùng áp lực cao có thể được sử dụng để
có thể đẩy dung dịch qua màng lọc có đường kính 100 nm và nhỏ hơn.
Tuy nhiên, phương pháp này bị giới hạn bởi áp lực mà xylanh và bộ lọc có thể
chịu được, như cũng như áp lực có thể đẩy được bằng tay. Cụ thể, với nồng độ
phospholipid dưới 20 mg/ml và kích thước lỗ lọc lớn hơn 200 nm thì có thể đẩy dễ
dàng bằng tay. Nhược điểm khác là khó đẩy qua màng có kích thước lỗ lọc nhỏ do hạn
chế về lực đẩy bằng tay cũng như khả năng chịu áp lực của thiết bị. Ngoài ra, thể tích
mẫu có thể bào chế bằng phương pháp này thường hạn chế do quy mô của bộ dụng cụ
nhỏ[19].
14



Hình 1.4: Thiết bị đùn ép mini extruder[5].
1.4. Một số nghiên cứu về liposome chứa phức hợp amphotericin B-
cyclodextrin
Chakraborty và cộng sự đã bào chế liposome chứa phức hợp AMB-HPβCD bằng
phương pháp tiêm ethanol. Phức hợp AMB-CD được bào chế bằng phương pháp trộn
khô, HPβCD và AMB được trộn lẫn, sau đó đem đi nghiền bi, hỗn hợp rắn sau đó được
hoà tan trong đệm photphat pH 7,4 để tạo thành hỗn dịch. Hỗn dịch thu được sau đó
đem ly tâm lạnh, để loại bỏ phần dược chất tự do. Dung dịch thu được sau li tâm sẽ
dùng làm dung dịch hydrat hoá cho liposome. EPC và cholesterol được hoà tan trong
ethanol, sau đó dung dịch phức hợp được thêm vào tạo thành hỗn hợp lipid-ethanol-

nước. Hỗn hợp được làm nóng ở 60°C vài phút rồi làm mát ở nhiệt độ phòng, cuối
cùng thêm từng giọt đệm photphat pH 7,4 tới đủ thể tích kết hợp với lắc đều. Liposome
thu được có kích thước trung bình từ 3-5 µm, kết quả đánh giá giải phóng in vitro so
với liposome thường thấp hơn (87,8% so với 34,9% sau 60 phút đầu tiên) độc tính thấp
hơn ( đánh giá dựa trên khả năng làm tan hồng cầu ở nồng độ 38µg/ ml thì tương ứng
là 22% và 27% ), và có hiệu quả điều trị cao hơn ( chuột nhiễm A. fumigates được điều
trị với liposome thường và liposome chứa phức thì có tỉ lệ sống sót là 50% và 70%)
[8]; [9].
15

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phương tiện nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: liposome chứa phức hợp AMB-CD.
- Nguyên liệu
Bảng 2.1: Nguyên liệu.
STT
Tên nguyên liệu
Nguồn gốc
Tiêu chuẩn
1
Amphotericin B
Trung Quốc
USP
2
α-cyclodextrin
Trung Quốc
TKHH
3
Β-cyclodextrin
Trung Quốc

TKHH
4
HP-β-cyclodextrin
Trung Quốc
TKHH
5
Cholesterol
Trung Quốc
TKHH
6
Phosphatidylcholin đậu nành đã
hydrogen hóa (hydrogenated soy
phosphatidylcholin)
Lipoid – Đức
NSX
7
Distearoyl phosphatidylglycerol
Lipoid – Đức
NSX
8
Chloroform
Labscan – Thái Lan
NSX
9
Methanol
Trung Quốc
TKHH
10
Nước cất pha tiêm
Việt Nam

DĐVN
11
Dinatri hydrophosphat
Trung Quốc
TKHH
12
Kalidihydrophosphat
Trung Quốc
TKHH
13
Natriclorid
Trung Quốc
TKHH
14
Acid phosphoric
Merk-Đức
TKHH
15
Natri hydroxyd
Trung Quốc
TKHH
16
Acid hydroclorid đặc
Trung Quốc
TKHH

- Phương tiện nghiên cứu:
 Hệ thống cất quay Rovapor R – 210 (Buchi – Đức), bình cầu NS 29/32, dung
tích 1000 ml (Buchi – Đức).
16

 Hệ thống thiết bị phân tích kích thước Zetasizer nano ZS90 (Malvern – Anh).
 Thiết bị đùn mini extruder (Eastern Scientific – Mỹ).
 Bể siêu âm Ultrasonic LC 60H.
 Máy đo quang Hitachi U – 1800 (Nhật Bản).
 Máy thử hoà tan ERWEKA DT600 (Đức).
 Máy lọc tiếp tuyến tuyến MicroKros® Filter Modules (Spectrumlab- Mỹ).
 Cân phân tích Satorius BP121S, máy đo pH InoLab, tủ sấy, tủ lạnh, cân kỹ
thuật, các dụng cụ thủy tinh, lọ thủy tinh trung tính.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Xây dựng phương pháp định lượng AMB trong phức hợp và hỗn dịch liposome.
- Xây dựng qui trình bào chế phức hợp AMB-CD và khảo sát các yếu tố trong qui
trình và công thức bào chế ảnh hưởng đến đặc tính của phức hợp AMB-CD.
- Bào chế liposome chứa phức hợp AMB-CD và đánh giá các đặc tính của
liposome: KTTP, phân bố KTTP, hiệu suất liposome hoá, giải phóng in vitro.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Qui trình bào chế phức hợp amphotericin B- cyclodextrin
Qui trình bào chế phức hợp AMB-CD như sau:
Cân và hoà tan CD trong khoảng 16,5 ml nước cất, sau đó chỉnh pH dung dịch
đến pH = 12 bằng dung dịch NaOH 1 N (dung dịch 1).
Cân và hoà tan hoàn toàn AMB trong dung dịch 1 (dung dịch 2).
Đưa dung dịch 2 vào ngăn mát tủ lạnh, sau 1 khoảng thời gian ủ thích hợp, đưa
trở về nhiệt độ phòng.
Chỉnh pH dung dịch 2 đến 5,5 bằng dung dịch H
3
PO
4
1N.
Li tâm với tốc độ 6000 vòng/phút, thời gian là 10 phút.
Gạn lấy dịch li tâm, lọc qua màng lọc cenluloacetat 0,2 µm.

Bổ sung thể tích đến 20ml bằng dung dịch đệm photphat pH = 5,5.
Dung dịch phức hợp sau bào chế được bảo quản ở nhiệt độ 5-8
o
C.