Nghiên cứu đánh giá khả năng bảo vệ lactobacillus acidophilus của một số tá dược trong nang cứng probiotics

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI









TRẦN NGỌC PHƯƠNG


NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG
BẢO VỆ Lactobacillus acidophilus
CỦA MỘT SỐ TÁ DƯỢC
TRONG NANG CỨNG PROBIOTICS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ






HÀ NỘI – 2015

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN NGỌC PHƯƠNG


NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG
BẢO VỆ Lactobacillus acidophilus
CỦA MỘT SỐ TÁ DƯỢC
TRONG NANG CỨNG PROBIOTICS


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


Người hướng dẫn:
ThS. Nguyễn Khắc Tiệp
Nơi thực hiện:
BM Công nghiệp Dược







HÀ NỘI- 2015

LỜI CẢM ƠN

Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành
đến thầy giáo, ThS. Nguyễn Khắc Tiệp, người thầy đã tận tình hướng dẫn em trong
suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Em cũng xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới TS. Đàm Thanh Xuân, người thầy
đã tận tình hướng dẫn em, đã giúp đỡ và truyền cho em nhiều kinh nghiệm, ý kiến
quý báu, tạo mọi điều kiện thuận lợi để em có thể hoàn thành khóa luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến DS. Lê Ngọc Khánh, cùng các thầy cô
giáo trong Bộ môn Công nghiệp Dược, những người đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến
quý báu và hỗ trợ tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của chị Phạm Thị Thanh
Huyền, cùng các anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn Công nghiệp Dược.
Em cũng xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường và các thầy cô
giáo trong trường đã dạy dỗ và dìu dắt em trong năm năm học tại trường.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ, khích lệ và hết
lòng giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn !!!

Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên


Trần Ngọc Phương


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Đại cương về probiotic 2
1.1.1 Khái niệm probiotic 2
1.1.2 Các thế hệ bào chế của chế phẩm probiotics 2
1.1.3 Các nhóm vi sinh vật thường dùng trong chế phẩm probiotics 3
1.2. Sơ lược về viên nang cứng 4
1.2.1. Đặc điểm của nang cứng 4
1.2.2. Thành phần của nang cứng 5
1.3. Một số tá dược thường sử dụng trong nang cứng probiotics 6
3.2.1. Lactose 7
3.2.2. Tinh bột 8
3.2.3. Glucose 9
3.2.4. Agar 10
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12
2.1. Nguyên liệu và thiết bị 12
2.1.1. Nguyên vật liệu 12
2.1.2. Thiết bị 13
2.1.3. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu 13
2.2. Nội dung nghiên cứu 14
2.2.1. Thiết kế công thức nang probiotics chứa Lactobacillus acidophilus 14
2.2.2. Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của nang cứng probiotics 14
2.2.3. Khảo sát khả năng bảo vệ Lactobacillus acidophilus trong dịch mô
phỏng dạ dày của nang probiotics tạo thành với các loại tá dược sử dụng 14
2.3. Phương pháp nghiên cứu 14
2.3.1. Phương pháp tiệt khuẩn tá dược 14
2.3.2. Phương pháp xác định tỷ trọng biểu kiến của bột 14

2.3.3. Phương pháp xác định hàm ẩm thuốc trong nang 15
2.3.4. Phương pháp bào chế nang cứng probiotics 15

2.3.5. Phương pháp xác định độ đồng đều khối lượng của nang cứng 16
2.3.6. Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật theo nguyên tắc pha loãng
liên tục……. 16
2.3.7. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của pH môi trường lên khả năng
sống sót Lactobacillus acidophilus trong nang probiotics 17
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18
3.1. Thiết kế công thức nang probiotics chứa Lactobacillus acidophilus 18
3.1.1. Lựa chọn tá dược và phương pháp tiệt khuẩn tá dược 18
3.1.2. Thiết kế công thức nang cứng số 1 probiotics 21
3.2. Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của nang cứng probiotics 23
3.2.1. Đánh giá độ đồng đều khối lượng của nang 24
3.2.2. Theo dõi hàm ẩm của bột trong nang 25
3.3. Khảo sát khả năng bảo vệ Lactobacillus acidophilus trong dịch mô phỏng
dạ dày của nang probiotics tạo thành với các loại tá dược sử dụng 28
3.3.1. Lựa chọn môi trường để xác định khả năng sống sót của Lactobacillus
acidophilus trong nang ở điều kiện pH acid 28
3.3.2. Khảo sát khả năng bảo vệ vi sinh vật trong dịch mô phỏng dạ dày của
nang tạo thành với các loại tá dược sử dụng 32
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 36

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

WHO (World Health Organization)
Tổ chức Y tế thế giới
ATCC (American Type Culture
Collection)
Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ
cfu (Colony – Forming Units)
Số đơn vị khuẩn lạc
FAO (Food and Agriculture

Organization)
Tổ chức Nông lương thế giới
MT
Môi trường
MRS (de Man, Rogosa, Sharpe)
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
VSV
Vi sinh vật
NL
Nguyên liệu
RS (resistant starch)
Tinh bột kháng tiêu hóa


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng
Tên bảng
Trang
1.1
Các cỡ nang và dung tích của nang cứng
5
1.2
Tỷ lệ nguyên liệu chứa L. acidophilus trong chế phẩm của một số
probiotics trên thị trường
6
1.3
Tổng hợp một số loại chế phẩm có chứa tá dược cần ngiên cứu
7
2.1

Các hóa chất dùng trong nghiên cứu
12
2.2
Các tá dược sử dụng trong nghiên cứu
12
2.3
Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
13
3.1
Hàm ẩm của tá dược trước và sau tiệt khuẩn khi sử dụng các
phương pháp tiệt khuẩn khác nhau
20
3.2
Tỷ trọng biểu kiến của các tá dược và sơ bộ khối lượng bột khi
đóng nang
23
3.3
Công thức bào chế bột đóng nang cứng probiotics (mẻ 40 viên)
24
3.4
Khối lượng của các loại nang probiotics
26
3.5
Hàm ẩm của các bột đóng nang trong quá trình bảo quản
27
3.6
Số lượng vi sinh vật sống sót trong các môi trường thử nghiệm có
pH 4,0 tại các thời điểm 1 giờ, 2 giờ
31
3.7

Số lượng vi sinh vật sống sót trong môi trường thử nghiệm MRS
có pH từ 4,0 tại các thời điểm 1 giờ, 2 giờ
33
3.8
Số lượng vi sinh vật sống sót trong các loại nang probiotics sau
khi tiếp xúc với dịch mô phỏng dạ dày MRS pH 4,0 trong 1 giờ
35


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình
Tên hình
Trang
1.1
Các thế hệ bào chế của chế phẩm chứa probiotics
3
3.1
Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm ẩm của tá dược khi sử dụng các
phương pháp tiệt khuẩn khác nhau
20
3.2
Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm ẩm của các bột đóng nang trong
quá trình bảo quản
27
3.3
Đồ thị biểu diễn số lượng vi sinh vật sống sót trong các môi trường
thử nghiệm có pH 4,0 tại các thời điểm 1 giờ, 2 giờ
31
3.4

Đồ thị biểu diễn số lượng sống sót và tỷ lệ chết của vi sinh vật trong
các loại nang probiotics khi tiếp xúc với dịch mô phỏng dạ dày
MRS pH 4,0 trong 1 giờ
35
1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong thời gian gần đây, các sản phẩm chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc từ
probiotics đã có sự gia tăng mạnh mẽ về số lượng. Probiotics ngày càng được bào
chế dưới nhiều dạng chế phẩm khác nhau như bột, cốm, viên nang Tuy nhiên,
nhiều báo cáo chỉ ra rằng số lượng các vi khuẩn probiotics trong các chế phẩm này
khá ít [50], [60]. Nguyên nhân là do các vi sinh vật này rất nhạy cảm với điều kiện
môi trường bảo quản và hàng rào sinh học của hệ tiêu hóa. Do đó, trong quá trình
bảo quản và sau khi vi khuẩn được đưa vào hệ tiêu hóa, số lượng vi khuẩn bị giảm
đáng kể làm hạn chế tác dụng của chế phẩm [36], [38].
Để giải quyết vấn đề này, cần phải tìm ra những phương pháp gia tăng tỉ lệ
sống sót và khả năng chống chịu của vi khuẩn probiotics trước các điều kiện bất lợi
trong bảo quản và sử dụng. Ở Việt Nam, việc phát triển các sản phẩm probiotics
đang trong giai đoạn đầu, dạng bào chế thông dụng hiện nay là viên nang. Một
trong các hướng nghiên cứu gần đây là sử dụng một số tá dược bảo vệ để gia tăng tỉ
lệ sống sót của các vi khuẩn trong nang cứng probiotics.
Xuất phát từ các lí do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu đánh giá
khả năng bảo vệ Lactobacillus acidophilus của một số tá dược trong nang cứng
probiotics” nhằm ba mục tiêu sau:
1. Thiết kế công thức nang probiotics chứa Lactobacillus acidophilus.
2. Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của nang cứng probiotics.
3. Khảo sát khả năng bảo vệ Lactobacillus acidophilus trong dịch mô phỏng dạ
dày của nang probiotics tạo thành với các loại tá dược sử dụng.
2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về probiotics
1.1.1 Khái niệm probiotics
Probiotics là thuật ngữ bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là “dành cho sự
sống”, dùng để chỉ những vi khuẩn mang lại những tác động có lợi cho con người
và cho vật chủ [61].
Từ hàng nghìn năm trước đây, con người đã biết sử dụng các chế phẩm sữa
lên men với mục đích tăng cường sức khỏe. Tuy nhiên, phải đến đầu thế kỉ XIX,
nhà khoa học người Nga Elie Metchnikoff mới thực sự nghiên cứu vấn đề này trên
cơ sở khoa học. Thuật ngữ “Probiotics” được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1953
bởi Kollath. Theo ông, Probiotics là “các yếu tố có nguồn gốc từ vi khuẩn, kích
thích sự phát triển của các vi khuẩn khác” [19]. Năm 1989, Fuller đã đưa ra một
định nghĩa khác về probiotic: “Probiotics là thực phẩm bổ sung các VSV sống đem
lại các tác động có lợi cho vật chủ bằng cách cải thiện cân bằng hệ vi sinh đường
ruột” [47].
Năm 2002, WHO và FAO đã đưa ra định nghĩa ngắn gọn và hoàn chỉnh nhất
về probiotics ở thời điểm hiện tại như sau: “Probiotics là những vi sinh vật sống mà
khi đưa vào cơ thể với một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật
chủ” [58], [61]. Theo FAO, để có được hiệu quả thực sự thì vi sinh vật trong các
chế phẩm probiotics cần phải đến được vị trí tác dụng trong đường tiêu hóa. Do
trong quá trình sử dụng vi khuẩn probiotics phải đối mặt với các điều kiện bất lợi
của đường tiêu hóa nên để đem lại tác dụng, các chế phẩm probiotics phải chứa ít
nhất 10
6
– 10
7
cfu/ml tế bào vi sinh vật sống cho đến ngày hết hạn sử dụng để đảm
bảo tác dụng điều trị (FAO/WHO) [32], [53].
1.1.2 Các thế hệ bào chế của chế phẩm probiotics

Nhiều báo cáo chỉ ra rằng số lượng các vi khuẩn probiotics trong các chế
phẩm thị trường rất nghèo nàn. Để cải thiện số lượng vi khuẩn sống sót trong suốt
quá trình bảo quản và trong môi trường pH thấp của hệ tiêu hóa, trên thị trường Việt
Nam đã có các sản phẩm probiotics của bốn thế hệ bào chế như sau [4]:
3

Hình 1.1. Các thế hệ bào chế của chế phẩm chứa probiotics

Đa phần các sản phẩm probiotics sử dụng theo đường uống, vi sinh vật bị
chết rất nhiều vì phải chịu tác dụng của dịch vị, cũng như của acid mật. Việc đảm
bảo khả năng sống sót của vi sinh vật probiotics trong sản xuất, bảo quản, lưu hành,
và tỉ lệ sống sót cao khi đến ruột không đơn giản. Cung cấp cho các tế bào sống một
rào cản vật lý để chống lại các điều kiện bất lợi từ môi trường là một hướng tiếp cận
được quan tâm hiện nay, phổ biến nhất là bào chế probiotics dạng nang cứng.
1.1.3 Các nhóm vi sinh vật thường dùng trong chế phẩm probiotics
Bốn nhóm vi sinh vật thường được sử dụng trong các chế phẩm probiotics là:
Lactobacillus, Bifidobacterium, Saccharomyces, Enterococcus. Trong đó,
Lactobacillus và Bifidobacterium là hai loại vi khuẩn được sử dụng nhiều nhất [53].
Lactobacillus acidophilus thuộc họ Lactobacillaceae, chi Lactobacillus,
thuộc nhóm vi khuẩn lactic. L. acidophilus là trực khuẩn Gram (+), kích thước từ
0,6 – 0,9 × 1,5 – 6,0µm, mọc đơn hoặc mọc đôi tạo thành chuỗi ngắn không sinh
bào tử, không di động, kị khí không bắt buộc, phản ứng catalase âm tính. Phát triển
tối ưu ở nhiệt độ 37
o
C, không phát triển trong khoảng 20
o
C – 22
o
C, tối đa trong
khoảng 43

o
C – 48
o
C. Vì thuộc nhóm vi khuẩn sinh acid lactic, nên có khả năng chịu
được điều kiện pH acid khoảng 5,0 – 6,0 trong 24 – 36 giờ [3].
4

L. acidophilus chiếm tỉ lệ chủ yếu trong số các vi sinh vật có ích cư trú ở
đoạn trên của ống tiêu hóa [26]. Chúng có khả năng làm giảm số lượng các vi sinh
vật hoặc nấm có hại ở ruột non; có khả năng sinh lactase – một enzym quan trọng
trong quá trình chuyển hóa sữa. Trong quá trình tiêu hóa, L. acidophilus còn tham
gia sản sinh niacin, acid folic, pyridoxin. Một vài nghiên cứu đã chứng minh L.
acidophilus làm tăng cường chức năng của hệ tiêu hóa, tăng khả năng miễn dịch cơ
thể, ngăn chặn bệnh tiêu chảy và làm giảm triệu chứng khó tiêu [26].
Với những đặc điểm trên, L. acidophilus là lựa chọn hàng đầu để sản xuất
các chế phẩm probiotics.
Tuy nhiên L. acidophilus vẫn còn những điểm hạn chế. Khả năng sống sót
của L. acidophilus phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: pH, sự acid hóa trong sản phẩm
lên men, nồng độ oxy hòa tan (khuếch tán từ bao bì, trong môi trường nuôi cấy, bảo
quản), nhiệt độ bảo quản [41], [50]. Trong đó, nồng độ oxy hòa tan là nguyên
nhân chính trong việc hạn chế khả năng sống sót của L. acidophilus. Do đó, sau một
thời gian bảo quản, số lượng L. acidophilus sống sót sẽ bị giảm đáng kể [22].
1.2. Sơ lược về viên nang cứng
Từ thế kỷ XIX nang gelatin đã được phát minh để che giấu mùi vị khó chịu
của nhiều dược liệu như nhựa dầu gây cảm giác buồn nôn khi uống. Từ “capsule”
được bắt nguồn từ chữ “capsula” trong tiếng Latin có nghĩa là chiếc hộp nhỏ. Dược
điển Việt Nam IV định nghĩa thuốc nang là dạng thuốc uống chứa một hoặc nhiều
hoạt chất trong vỏ nang cứng hay mềm theo kiểu dáng và kích thước khác nhau [1],
[2], [5].
1.2.1. Đặc điểm của nang cứng

Nang cứng là dạng thuốc phân liều gồm: dược chất được bào chế ở dạng
thích hợp và vỏ gồm hai nửa trụ lồng khít vào nhau [5]. Sau khi tan rã giải phóng
thuốc, vỏ đựng được tiêu hóa trong cơ thể [2]. Chế phẩm probiotics dạng nang cứng
là dạng bào chế phổ biến nhất sau dạng thuốc bột.
Nang cứng probiotics giúp hệ vi sinh vật trong nang tránh một phần tác động
bất lợi của môi trường bên ngoài như độ ẩm, ánh sáng do vậy làm tăng tỷ lệ sống
5

sót của vi sinh vật. Tá dược chủ yếu trong nang là tá dược độn như tinh bột, lactose,
glucose… Ngoài ra còn thêm một thành phần khác như tá dược trơn, tá dược điều
hương vị… [57].
Thành phần nang cứng probiotics có thể có thêm một số tá dược giúp bảo vệ
vi sinh vật trong điều kiện bảo quản, điều kiện môi trường bên ngoài hay bảo vệ vi
sinh vật bền vững qua acid dạ dày. Điển hình là nhóm chất xơ như inulin,
fructooligosaccharid… [1], [5], [57].
1.2.2. Thành phần của nang cứng
 Vỏ nang
Thành phần chính của vỏ nang là gelatin, ngoài ra còn các thành phần khác
như: chất màu, cản quang, chất bảo quản… Vỏ có nhiều cỡ, thể tích khác nhau và
được đánh số từ 000 đến 5. Nang probiotics thường dùng là cỡ 0 và cỡ 1 [5]. Các cỡ
và dung tích của nang được trình bày trong bảng 1.1 dưới đây [1]:
Bảng 1.1. Các cỡ nang và dung tích của nang cứng
Cỡ nang
5
4
3
2
1
0
00

000
Dung tích nang (ml)
0,13
0,20
0,27
0,37
0,48
0,67
0,95
1,36

Vỏ nang cứng phải được bảo quản trong điều kiện nhiệt độ khoảng 20-30
o
C,
độ ẩm tương đối của môi trường khoảng 35-50%. Điều kiện bảo quản ảnh hưởng
đến hàm ẩm của vỏ nang (hàm ẩm của vỏ nang gelatin là 13-16%). Hàm lượng
nước trong vỏ nang có liên quan đến kích thước và thể chất của nó (nước trong vỏ
nang đóng vai trò như một chất hóa dẻo, giữ cho vỏ nang không bị giòn) [5].
 Hỗn hợp trong nang
Hỗn hợp nạp nang gồm dược chất và tá dược thích hợp như: tá dược độn, tá
dược trơn, tá dược rã… Dược chất có thể được bào chế dưới nhiều dạng khác nhau
để đóng nang như: dạng hạt qui ước, dạng hạt pellet, bột thuốc… [5]. Nang
probiotics thường ở dạng hỗn hợp bột đóng nang. Tham khảo một số chế phẩm
probiotics trên thị trường có công bố khối lượng dược chất, bảng 1.2 chỉ ra tỷ lệ
nguyên liệu chứa L. acidophilus trên khối lượng chế phẩm:
6

Bảng 1.2. Tỷ lệ nguyên liệu chứa L. acidophilus trong chế phẩm của một số
probiotics trên thị trường
Chế phẩm

Nhà sản xuất
Tỷ lệ dược chất
trong chế phẩm (%)
Ther-Biotic Complete Probiotic Powder
Klaire Labs®
53
NOW Foods Acidophilus
My nutra mart
50
Quantum probiotic support
Quantum Nutrition
57
Primal Defense® ULTRA Ultimate
Probiotic Formula
Garden of Life
59

1.3. Một số tá dược thường sử dụng trong nang cứng probiotics
Một số tá dược phổ biến được sử dụng cho việc xây dựng công thức nang
cứng gelatin là: lactose, tinh bột, aerosol, magnesi stearat… [57]. Một số bằng sáng
chế về sản phẩm probiotics trên thị trường thường sử dụng tá dược: lactose, tinh
bột, glucose Ngoài ra agar cũng là một thành phần thường được sử dụng bởi khả
năng làm tăng độ nhớt, tăng pH dịch dạ dày và bảo vệ chế phẩm probiotics [29],
[37]. Thành phần một số công thức của các chế phẩm trên thị trường được trình bày
trong bảng 1.3:
7

Bảng 1.3. Tổng hợp một số loại chế phẩm có chứa tá dược cần nghiên cứu
Tá
dược

Chế phẩm có thành phần tá
dược trong công thức
Nhà sản xuất
Lactose
Fivelac probiotic
Global Health Trax – A GHT
Company
Tinh
bột
NOW Foods Acidophilus
My nutra mart
Fivelac probiotic
Global Health Trax - A GHT
Company
Nexabiotic
Bioprosper Labs
Glucose
Myofusion Probiotic Series
Gaspari Nutrition
Agar
Professional Strength Probiotic
HD Brand Supplements
pHion Probiotic Blend
Phionbalance
Digestive Bliss Probiotic
Nature's Secret
Myofusion Probiotic Series
Gaspari Nutrition

3.2.1. Lactose

 Nguồn gốc
Lactose là một disaccharid bao gồm β-D-galactose và β-D-glucose được liên
kết với nhau qua liên kết β 1-4 glycosid [51]. Lactose được tìm thấy trong sữa người
và động vật, chiếm khoảng 2-8% sữa (theo trọng lượng) [20]. Cơ thể hấp thu lactose
nhờ enzym lactase (β-D-galactosidase), cơ thể không có enzym này thì không thể
hấp thu được lactose, gọi là bệnh không dung nạp lactose.
 Tính chất
Lactose là một tá dược hút ẩm, nên bảo quản ở nơi khô ráo, thoáng mát.
Trong điều kiện ẩm, lactose có thể là môi trường cho nấm mốc và các vi sinh vật
phát triển [51]. Lactose là đường khử nên tương kỵ với dược chất nhóm amin làm
cho tá dược bị sẫm màu.
8

Lactose có khả năng thủy phân để tạo glucose và galactose trong enzym
lactase, đồng phân hóa trong dung dịch kiềm hoặc xử lý với nhiệt độ cao để tạo
lactulose, hydro hóa để tạo polyhydric và lactitol [39].
 Ứng dụng
Lactose được sử dụng rộng rãi làm tá dược độn trong viên nén và viên nang
vì vị dễ chịu, trung tính, ít ảnh hưởng bởi lực nén và có khả năng phối hợp với
nhiều loại tá dược khác [1]. Trong nang cứng, lactose làm tăng khả năng sống sót
của vi sinh vật trong điều kiện acid dạ dày, bảo vệ chế phẩm probiotics [11].
Lactose là cơ chất cho vi khuẩn lactic, tạo điều kiện cho chúng phát triển và
loại trừ vi khuẩn có khả năng gây bệnh. Điều này giúp duy trì môi trường dạ dày và
ruột khỏe mạnh. Sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hóa lactose là acid lactic,
giúp acid hóa ruột và hỗ trợ tiêu hóa protein. Việc acid hóa này tạo môi trường bất
lợi cho vi khuẩn gây bệnh và làm giảm sự phát triển của chúng.
3.2.2. Tinh bột
 Nguồn gốc
Tinh bột có trong các loại hạt, quả, củ như ngô, lúa mì, sắn, khoai tây, dong.
Tinh bột có công thức hóa học là ((C

6
H
10
O
5
)
n
), là một polysaccharid gồm các đơn vị
α-D-glucopyranosyl liên kết với nhau kiểu α-D-(1-4) hoặc α-D-(1-6). Tinh bột chứa
hỗn hợp amylose và amylopectin, tỷ lệ phần trăm amilose và amilopectin thay đổi
tùy thuộc vào từng loại tinh bột, tỷ lệ này thường từ 20:80 đến 30:70 [18], [33],
[35].
 Tính chất
Trong môi trường acid mạnh tinh bột bị thủy phân hoàn toàn thành glucose.
Tinh bột bị trương nở khi hòa tan vào nước. Với nhiệt độ 55 – 70
o
C trong
thời gian kéo dài, các hạt tinh bột bị mất cấu trúc cũ trở thành dung dịch keo. Nhiệt
độ để phá vỡ cấu trúc hạt tạo dung dịch keo gọi là nhiệt độ hồ hóa [6], [34].
Tinh bột là một tá dược hút ẩm nên bảo quản ở nơi khô ráo, thoáng mát.
Trong điều kiện bảo quản thông thường, tinh bột khá trơ về mặt hóa học và vi sinh
[51].
9

 Ứng dụng
Tinh bột là tá dược phổ biến do tính trơ, rẻ tiền, dễ kiếm, được sử dụng làm
tá dược độn, tá dược dính, tá dược rã [9], [31], [44], [45], [62].
Tinh bột là một phần trong chế độ ăn uống, có vai trò quan trọng trong sinh
lý học và chức năng của đại tràng. Phần tinh bột thoát khỏi dạ dày, xuống ruột được
gọi là tinh bột kháng tiêu hóa (resistant starch - RS), một dạng chất xơ, là tổng hợp

của tinh bột và các sản phẩm thoái hóa của tinh bột không được hấp thu ở ruột non
của người khỏe mạnh [10]. Khoảng 30-70% lượng tinh bột kháng tiêu hóa được
thủy phân thành các acid béo mạch ngắn như acetat, butyrat, propionat do vi khuẩn
amylase ở đại tràng [12], [13], [24], [48], [49]. Các acid này là nhiên liệu hô hấp
của tế bào ruột, có tác dụng làm tăng lưu lượng máu đại tràng, giảm pH, ức chế sự
phát triển của tế bào ruột bất thường, giúp ngăn ngừa bệnh ung thư đại tràng [21],
[56], [59]. Quá trình lên men này cũng tạo pH acid thủy phân các chất độc tính kiềm
[15].
Số lượng vi sinh vật nhóm bifidobacteria, lactobacilli, streptococci và
enterobacteria tăng đáng kể ở ruột của chuột được ăn tinh bột khoai tây [30] là một
bằng chứng cho thấy tác dụng kích thích sự phát triển probiotics của tinh bột.
3.2.3. Glucose
 Nguồn gốc
Glucose là một monosaccarid tiêu biểu có công thức phân tử là C
6
H
12
O
6
.
Glucose là sản phẩm thủy phân tinh bột bằng acid hoặc enzym. Glucose thường ở
dạng polyme trong tinh bột ở thực vật (tinh bột bắp, tinh bột khoai tây) hoặc
glycogen ở động vật [16].
 Tính chất
Glucose là một tá dược dễ hút ẩm, dễ tan trong nước, có tính tạo khối, tạo
viên, đảm bảo độ bền cơ học cho viên nang, viên nén [1]. Giống như các đường đơn
khác, glucose bị lên men bởi nấm men và vi sinh vật. Khi phản ứng với các hợp
chất chứa nitơ, glucose tạo ra các chất màu tùy vào điều kiện phản ứng như pH,
nhiệt độ, nồng độ…
10

Glucose có khả năng isome hóa trong môi trường kiềm để tạo fructose và
mannos, thủy phân trong dung dịch kiềm tạo thành acid carboxylic, oxy hóa để tạo
acid gluconic và acid glucaric, hydro hóa để tạo 1,2-propanediol, glycol, glycerol
[6].
 Ứng dụng
Các tính chất vật lý, hóa học và dinh dưỡng của glucose được ứng dụng
trong nhiều lĩnh vực công nghệ dược phẩm cũng như công nghệ thực phẩm, lên
men và hóa chất.
Glucose là tá dược độn, tá dược dính… Ngoài ra, glucose còn là nguồn
nguyên liệu phổ biến cho hầu hết các sinh vật từ vi khuẩn đến con người. Nó là
nguyên liệu của các quá trình lên men sản xuất các acid hữu cơ, vitamin, kháng
sinh, enzym… Glucose là năng lượng chính cho não, thiếu hụt glucose dễ dẫn đến
các ảnh hưởng tâm lý.
Trong hệ tiêu hóa, glucose được vận chuyển tích cực ở phần đầu của ruột
non [7]. Glucose có thể làm tăng khả năng sống của Lactobacilli trong môi trường
acid sau bốn giờ tiếp xúc. Shabala đã chỉ ra glucose đóng một vai trò quan trọng
trong việc cân bằng nội môi, từ đó làm tăng pH dạ dày, nhưng cơ chế vẫn chưa
được giải thích rõ ràng [23], [55].
3.2.4. Agar
 Nguồn gốc
Agar là phức hợp polysaccharid của agarose và agaropectin, tìm thấy trong
thành tế bào một số loại tảo agarophytes, thuộc nhóm Rhodophyta (tảo đỏ) [8],
[27]. Mạch gồm β-D-galactopyranose và 3,6-anhydro-α-L-galactopyranose liên kết
với nhau bởi liên kết β-1,4 và α-1,3 [63].
 Tính chất
Agar có tính tạo gel rất tốt, nó có thể hấp thu rất nhiều nước và tạo gel nhờ
các liên kết hydro ở nồng độ rất thấp (khoảng 0,04%). Agar tạo gel sau khi được
11

đun nóng và làm lạnh. Khả năng tạo gel và độ bền gel phụ thuộc vào nồng độ và
phân tử lượng trung bình của nó (phân tử lượng trung bình càng lớn thì gel tạo
thành càng bền). Sự khác biệt giữa nhiệt độ nóng chảy (80°C) và tạo gel (40°C) làm
cho agar rất dễ sử dụng trong công nghiệp dược phẩm và thực phẩm.
 Ứng dụng
Agar là tá dược dính, chất nhũ hóa, chất giải phóng ổn định trong gel, chất
làm tăng độ nhớt… trong dạng viên nén, viên nang [14], [17], [43], [51], [54].
Agar được sử dụng chủ yếu trong công nghệ thực phẩm và cũng là một chất
rắn tạo nền chứa môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Nó cũng được sử dụng như một
thuốc nhuận tràng, thay thế gelatin cho người ăn chay, một chất làm đặc cho các
món súp, kem và các món tráng miệng khác và là một chất quan trọng trong công
nghiệp sản xuất bia, giấy và vải [28].
Trong hệ tiêu hóa, agar ngậm nước trương nở thể tích gấp ba lần, điều này
đem lại cảm giác no, có khả năng điều trị béo phì [40].
Agar thuộc nhóm mucopolysaccharid, là một lớp nhỏ của nhóm
polysaccharid, còn được gọi là glycosaminoglycan. Phối hợp nhóm này trong các
chế phẩm probiotics có ba ưu điểm: không bị tiêu hóa bởi acid dạ dày, có xu hướng
tích tụ khi ướt tạo thành các giọt bọc bên trong là probiotics khô giúp chế phẩm sinh
học được bảo vệ khỏi acid dạ dày, khi xuống tới ruột chúng phân hủy để cung cấp
carbohydrat và acid amin cho probiotics phát triển [42]. Đây là một trong những tác
dụng quan trọng trong việc bảo vệ chế phẩm probiotics của agar.
12

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1. Nguyên liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
 Nguyên liệu
Bột nguyên liệu chứa L. acidophilus: của hãng Unique Biotech Limited, Ấn
Độ.

 Nguyên liệu pha môi trường
Bảng 2.1. Các hóa chất dùng trong nghiên cứu
Tên hóa chất
Nguồn gốc
Tên hóa chất
Nguồn gốc
Glucose
Trung Quốc
Acid clohydric
Trung Quốc
Pepton
Ấn Độ
MnSO
4
.4H
2
O
Trung Quốc
Cao thịt
Merck- Đức
Triamoni citrat
Trung Quốc
Cao nấm men
Merck- Đức
Acetat natri
Trung Quốc
K
2
HPO
4

Trung Quốc
Natri clorid
Trung Quốc
MgSO
4
.7H
2
O
Trung Quốc
Thạch agar
Việt Nam

 Tá dược sử dụng
Bảng 2.2. Các tá dược sử dụng trong nghiên cứu
Tên tá dược
Nguồn gốc
Tinh bột
Trung Quốc
Lactose
Trung Quốc
Glucose
Trung Quốc
Thạch agar
Việt Nam
13

2.1.2. Thiết bị
Bảng 2.3. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
Tên thiết bị
Nguồn gốc

Máy đóng nang thủ công
Trung Quốc
Tủ cấy vô trùng
Nhật (Sanyo)
Tủ ấm CO
2
Nhật (Sanyo)
Tủ lạnh LG
Hàn Quốc
Nồi hấp tiệt khuẩn
ALP - Nhật
Cân phân tích
Đức (Satorious)
Cân kĩ thuật
Đức (Satorious)
Máy đo hàm ẩm
Mỹ (Ohaus)
Máy khuấy từ
Hàn Quốc (Wisd)
Máy lắc (Vortex)
Đức
Máy đo pH
Đức (Mettler toledo)
Đĩa petri, ống nghiệm, đầu côn, …


2.1.3. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu
 Môi trường MRS lỏng (MT1)
Glucose 20g Acetat natri 5g
Pepton 10g K

2
HPO
4
2g
Cao thịt 10g MgSO
4
.7H
2
O 0,2g
Cao nấm men 5g MnSO
4
.4H
2
O 0,05g
Triamoni citrat 2g Nước máy vừa đủ 1000ml
pH 6,8 - 7,0
 Môi trường MRS thạch (MT2)
MT2 = MT1 + Thạch agar (20g/1000ml môi trường).
14

2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Thiết kế công thức nang probiotics chứa Lactobacillus acidophilus
 Lựa chọn tá dược và phương pháp tiệt khuẩn tá dược.
 Thiết kế công thức nang cứng số 1 probiotics.
2.2.2. Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của nang cứng probiotics
 Đánh giá độ đồng đều khối lượng của nang.
 Theo dõi hàm ẩm của bột trong nang.
2.2.3. Khảo sát khả năng bảo vệ Lactobacillus acidophilus trong dịch mô
phỏng dạ dày của nang probiotics tạo thành với các loại tá dược sử dụng
 Lựa chọn môi trường để xác định khả năng sống sót của Lactobacillus

acidophilus trong nang ở điều kiện pH acid.
 Khảo sát khả năng bảo vệ vi sinh vật trong dịch mô phỏng dạ dày của nang
tạo thành với các loại tá dược sử dụng.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tiệt khuẩn tá dược
 Phương pháp tiệt khuẩn nhiệt ẩm
Nguyên liệu cần tiệt khuẩn được đựng trong bình nón và đậy kín bằng nút
bông. Sau đó được tiệt khuẩn trong nồi hấp (Auto clave), ở 115
o
C; 0,6atm trong 20
phút.
 Phương pháp tiệt khuẩn Tyndall
Nguyên liệu cần tiệt khuẩn được đựng trong bình nón và đậy kín bằng nút
bông. Để bình nón ở 70-80
o
C trong 1 giờ. Lấy ra, ủ bình trong tủ 37
o
C trong 24 giờ.
Sau 24 giờ, lấy bình đựng nguyên liệu ra, lặp lại như trên ba lần, thu được nguyên
liệu cần tiệt khuẩn.
2.3.2. Phương pháp xác định tỷ trọng biểu kiến của bột
Cân chính xác một lượng bột nhất định (m) khoảng 10 g đã rây qua rây 250,
chuyển vào ống đong 10ml có độ chia nhỏ nhất là 0,1 ml, gõ nhẹ nhàng khoảng 30
15

lần cho đến khi thể tích khối bột không thay đổi. Đọc thể tích V
bk
trên ống đong
chia vạch. Tính tỷ trọng biểu kiến d
bk

theo công thức: m/V
bk
[1]. Tiến hành đo ba
lần, lấy kết quả trung bình.
2.3.3. Phương pháp xác định hàm ẩm thuốc trong nang
Tiến hành trên máy đo hàm ẩm Ohaus của Mỹ.
Với mẫu là bột tá dược, làm nhỏ mẫu cần đo hàm ẩm. Với mẫu là nang cứng
probiotics, tháo vỏ nang, đổ bột thuốc trong nang ra khỏi vỏ nang, làm nhỏ bột nếu
cần. Cho lên mặt đĩa của thiết bị khoảng 0,6 - 1,2 g mẫu, dàn đều mẫu ra mặt đĩa,
đậy nắp, chạy máy. Chờ máy gia nhiệt trong khoảng 5 phút hoặc đến khi máy hiện
kết quả. Đọc, ghi lại số liệu kết quả đo hàm ẩm hiện trên màn hình.
2.3.4. Phương pháp bào chế nang cứng probiotics
 Chuẩn bị nguyên liệu
- Dược chất: Bột nguyên liệu chứa L. acidophilus có sẵn của nhà sản xuất Ấn
Độ.
- Tá dược: Chuẩn bị các tá dược cho một mẻ như trong công thức, tiệt khuẩn
theo phương pháp đã trình bày ở mục 2.3.1.
 Bào chế nang
Quá trình tạo bột kép đóng nang được tiến hành trong tủ cấy vô khuẩn. Tiệt
khuẩn mặt cân, chày cối sứ, rây 250, các bề mặt các dụng cụ tiếp xúc trực tiếp với
bột, cho vào tủ cấy vô khuẩn. Nghiền mịn các nguyên liệu bao gồm dược chất và
các loại tá dược bằng chày cối. Cân nguyên liệu theo công thức mẻ. Trộn bột kép
theo nguyên tắc đồng lượng và rây hỗn hợp bột qua rây 250 thành bốn nhóm: dược
chất – tinh bột, dược chất – glucose, dược chất – lactose, dược chất – agar. Đóng
thuốc vào nang trên thiết bị đóng nang thủ công (200 viên) theo 3 bước: mở nắp,
đóng thuốc, đậy nắp nang. Lau nang và đóng gói vào túi PE.
16

2.3.5. Phương pháp xác định độ đồng đều khối lượng của nang cứng
Thử với 20 nang. Cân từng nang, tháo nắp, đổ hết thuốc ra, lau sạch vỏ nang.

Cân từng vỏ nang. Khối lượng thuốc trong nang là hiệu số giữa khối lượng nang
thuốc và vỏ nang. Tính khối lượng trung bình của thuốc trong nang. Không được
quá hai nang vượt quá giới hạn sau [2].
- Với viên có khối lượng trung bình viên nhỏ hơn 300 mg, giới hạn là ± 10%.
- Với viên có khối lượng trung bình viên lớn hơn 300 mg, giới hạn là ± 7,5%.
2.3.6. Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật theo nguyên tắc pha loãng
liên tục
Cân, đong chính xác các thành phần theo công thức môi trường MRS thạch
(nêu trong mục 2.1.2). Hòa tan các thành phần tan trong nước, phân tán thạch vào
dung dịch đựng trong bình nón thích hợp. Đậy kín bằng nút bông. Hấp tiệt khuẩn ở
115
o
C /20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn. Lấy bình đựng môi trường ra khỏi nồi hấp,
phân phối môi trường lên các đĩa petri đã được rửa sạch, hấp tiệt khuẩn và sấy khô
(bề dày lớp thạch trên các đĩa khoảng 2 mm) sao cho mặt thạch nhẵn, phẳng. Chờ
cho thạch nguội và đông rắn lại, đậy kín.
Chuẩn bị các ống nghiệm sạch mỗi ống chứa 9 ml nước muối sinh lí, đậy
kín, hấp tiệt khuẩn ở 115
o
C/20 phút, để nguội xuống nhiệt độ khoảng 37 – 40
o
C.
 Mẫu xác định số lượng VSV sống sót trong dịch mô phỏng dạ dày
Chuẩn bị bình nón đựng 100 ml dung dịch nước muối sinh lý có pH 1,2
(chỉnh pH môi trường bằng dung dịch acid clohydric 3N) đã hấp tiệt trùng và để
nguội. Cân chính xác 1 g mẫu (nang probiotics hoặc bột probiotics cần thử) cho vào
bình nón. Lắc nhẹ rồi ủ trong tủ nhiệt độ 37
o
C. Sau 1 giờ ủ, hút chính xác 1 ml hỗn
dịch trên vào ống nghiệm đựng nước muối sinh lí thứ nhất, lắc đều. Hút chính xác 1

ml dịch đã được đồng nhất trong ống nghiệm thứ nhất pha loãng sang ống nghiệm
thứ hai, lắc đều. Cứ tiếp tục pha loãng như vậy tới nồng độ cần pha loãng. Cấy trải
lên mỗi đĩa petri 0,5 ml dịch trong các ống pha loãng ở trên (làm trên 3 nồng độ
cuối, mỗi nồng độ cấy trên 2 đĩa).
17

 Mẫu xác định số lượng VSV trong chế phẩm
Chuẩn bị bình nón đựng 100 ml dung dịch nước muối sinh lí đã hấp tiệt
trùng và để nguội. Cân chính xác 1 g mẫu cho vào bình nón. Phân tán đều mẫu
trong dung dịch, hút chính xác 1 ml hỗn dịch trên vào ống nghiệm đựng nước muối
sinh lí thứ nhất, lắc đều. Hút chính xác 1 ml dịch đã được đồng nhất trong ống
nghiệm thứ nhất pha loãng sang ống nghiệm thứ hai, lắc đều. Cứ tiếp tục pha loãng
như vậy tới nồng độ cần pha loãng. Cấy trải lên mỗi đĩa petri 0,5 ml dịch trong các
ống pha loãng ở trên (làm trên 3 nồng độ cuối, mỗi nồng độ cấy trên 2 đĩa).
Ủ các đĩa này trong tủ ấm CO
2
5%, ở nhiệt độ 37
o
C. Sau 48 giờ đọc kết quả.
Số lượng VSV có trong 1 g mẫu được tính theo công thức:

Trong đó:
X là số VSV có trong 1 g mẫu.
M là khối lượng mẫu đem tiến hành xác định số lượng VSV.
A
n
là số khuẩn lạc mọc trên các đĩa petri có cấy các nồng độ
pha loãng n.
2.3.7. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của pH môi trường lên khả năng sống
sót Lactobacillus acidophilus trong nang probiotics

Chuẩn bị các bình nón đựng 100ml dung dịch thử có pH từ 1,2 tới 4,0 (chỉnh
pH môi trường bằng dung dịch acid clohydric 3N) đã hấp tiệt trùng và để nguội.
Cân chính xác 1 g mẫu cho vào bình nón. Lắc nhẹ rồi ủ trong tủ nhiệt độ 37
o
C. Lấy
mẫu ở các thời điểm 1 giờ, 2 giờ, tiến hành xác định số lượng vi sinh vật theo
nguyên tắc pha loãng liên tục ở mục 2.3.6.