Nghiên cứu một số phản ứng trên nguyên tử nitơ của nuciferin và khảo sát độc tính tế bào của sản phẩm tạo thành

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




ĐOÀN QUỐC PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ PHẢN ỨNG
TRÊN NGUYÊN TỬ NITƠ CỦA
NUCIFERIN VÀ KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH
TẾ BÀO CỦA SẢN PHẨM TẠO THÀNH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ




HÀ NỘI - 2015
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




ĐOÀN QUỐC PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ PHẢN ỨNG
TRÊN NGUYÊN TỬ NITƠ CỦA
NUCIFERIN VÀ KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH
TẾ BÀO CỦA SẢN PHẨM TẠO THÀNH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện
DS. Đặng Vũ Thanh Tùng
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp Dược
Trường Đại học Dược Hà Nội.

HÀ NỘI – 2015
LỜI CẢM ƠN
Trước hết cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn
chân thành nhất đến PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện, DS. Đặng Vũ Thanh
Tùng những thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi, truyền đạt cho tôi những kiến
thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình làm khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Văn Hải, ThS. Nguyễn Văn
Giang, ThS. Đào Nguyệt Sương Huyền, ThS. Phạm Thị Hiền cùng các thầy
giáo, cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên của Bộ môn Công nghiệp Dược –
Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo
Trường đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt
quá trình học tập ở trường.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè, đặc biệt là các
bạn cùng làm đề tài tốt nghiệp tại phòng Tổng hợp hóa dược - Bộ môn Công
nghiệp Dược đã luôn là chỗ dựa vững chắc, là những nguồn động viên to lớn
đối với tôi trong cuộc sống, trong học tập và trong công việc.

Xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên

Đoàn Quốc Phương
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Cây Sen 2
1.1.1. Cây sen 2
1.1.2. Chiết xuất alkaloid trong lá sen 3
1.1.3. Phương pháp tách alkaloid dưới dạng tinh khiết 4
1.2. Hợp chất nuciferin. 4
1.2.1. Công thức, tính chất 4
1.2.2. Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế nuciferin từ dược liệu 5
1.2.3. Tác dụng dược lý. 5
1.3. Tổng quan về các phương pháp tạo N-oxid 7
1.3.1. Sử dụng tác nhân oxy hóa. 7
1.3.2. Sử dụng tác nhân alkyl halogenid tác dụng với hydroxylamine. 10
1.3.3. Sử dụng phản ứng loại Cope. 10
1.3.4. Phân tích lựa chọn phương pháp tạo N-oxid của nuciferin. 10
1.4. Các phương pháp N-demethyl hóa. 11
1.4.1. Khử hóa N-oxid 11
1.4.2. Sử dụng K
3
Fe(CN)
6
. 12
1.4.3. Sử dụng gốc phthalimide-N-oxyl 12

1.4.4. Sử dụng este cloroformat 13
1.5. Lựa chọn hướng nghiên cứu. 13
CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU 14
2.1. Nguyên vật liệu 14
2.2. Thiết bị và dụng cụ 15
2.3. Nội dung nghiên cứu 16
2.3.1. Chiết nuciferin từ lá sen 16
2.3.2. Thực hiện oxy hóa nuciferin tạo nuciferin N-oxid. 16
2.3.3. Khử hóa nuciferin N-oxid bằng kẽm trong HCl. 16
2.3.4. Khử nuciferin N-oxide bằng FeSO
4
.7H
2
O 16
2.3.5. Thử tác dụng sinh học 17
2.4. Phương pháp nghiên cứu 17
2.4.1. Bán tổng hợp dẫn chất của nuciferin 17
2.4.2. Xác định cấu trúc sản phẩm 17
2.4.3. Thử tác dụng sinh học 18
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 20
3.1. Chiết, phân lập và tinh chế nuciferin từ lá sen 20
3.1.1. Quy trình chiết nuciferin 20
3.1.2. Tinh chế nuciferin 20
3.2. Kết quả nghiên cứu các phản ứng trên nguyên tử N của nuciferin 21
3.2.1. Phản ứng tổng hợp nuciferin N-oxid 21
3.2.2. Khử hóa nuciferin N-oxid bằng kẽm trong HCl. 24
3.2.3. Khử nuciferin N-oxide bằng FeSO
4
.7H

2
O 25
3.3. Kết quả xác định cấu trúc 26
3.3.1. Xác định cấu trúc sản phẩm phản ứng oxy hóa (nuciferin N-oxid) 26
3.3.2. Xác định cấu trúc sản phẩm phản ứng khử hóa (nuciferin) 28
3.3.3. Xác định cấu trúc sản phẩm phản ứng demethyl hóa (nornuciferin) 29
3.4. Thử tác dụng sinh học 31
3.5. BÀN LUẬN 32
3.5.1. Về quá trình chiết xuất, phân lập và tinh chế nuciferin 32
3.5.2. Về các phản ứng bán tổng hợp. 33
3.6.3. Về phần xác định cấu trúc 35
3.6.4. Về phần thử hoạt tính sinh học 36
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
1
H-NMR
Phổ cộng hưng từ hạt nhân proton
(Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)
AcOEt
Ethyl acetat
AcOH
Acid acetic
ATCC

American Type Culture Collection
CTCT
Công thức cấu tạo
ESI-MS

Phổ khối lượng phun m điện tử
(Electrospray Ionization Mass Spectrometry)
Et
2
O
Diethyl ether
EtOH
Ethanol
Fe(II)TPPS
Tetrasodium 5,10,15,20-tetra(4-sulfophenyl) porphyrinatoiron(II)
g
Gam
h
Giờ
HIV
Virus gây suy giảm miễn dịch  người
(Human immunodeficiency virus)
IC
50
Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử
(Inhibition concentration at 50%)
i-PrOH
Isopropanol
IR
Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)
IUPAC
Hiệp hội Hóa học Quốc tế thuần túy và ứng dụng
(International Union of Pure and Applied Chemistry)
m-CPBA
acid m-cloroperbenzoic (m-chloroperbenzoic acid)

MeCN
Acetonitril
MeOH
Methanol
MTO
Methyltrioxorheni
MTT
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid
NaOMe
Natri methanolat
NPB
Natri perborate tetrahydrat
NPC
Natri percarbonat
RANKL
Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand
R
f

Hệ số lưu giữ (retension factor)
SKLM
Sắc ký lớp mỏng
TBHP
tert-butyl hydroperoxid
t-BuOH
tert-butanol
t
o
nc

Nhiệt độ nóng chảy
UHP
Ure hydroperoxid

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1.
Một số alkaloid trong lá sen…………………………………………
3
Bảng 2.1.
Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm
14
Bảng 2.2.
Các máy móc, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm…………
15
Bảng 3.1.
Khảo sát nhiệt độ ảnh hưng đến thời gian phản ứng phản ứng bán
tổng hợp nuciferin N-oxid …………………………
21
Bảng 3.2.
Khảo sát dung môi ảnh hưng đến thời gian phản ứng phản ứng bán
tổng hợp nuciferin N-oxid……………………………………………
22
Bảng 3.3.
Khảo sát tỉ lệ mol H
2
O
2
:nuciferin ảnh hưng đến thời gian phản ứng
bán tổng hợp nuciferin N-oxid ……………………………
22

Bảng 3.4.
Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của nuciferin N-oxid ….…………
26
Bảng 3.5.
Kết quả phân tích phổ khối lượng (ESI-MS, MeOH) của nuciferin N-
oxid …………………………………………………………………
27
Bảng 3.6.
Kết quả phân tích phổ cộng hưng từ hạt nhân proton của nuciferin
N-oxid (
1
H-NMR, 500MHz, CDCl
3
)…………………………………
27
Bảng 3.7.
Kết quả phân tích phổ khối lượng (ESI-MS, MeOH) của nuciferin
28
Bảng 3.8.
Kết quả phân tích phổ cộng hưng từ hạt nhân proton của nuciferin
(
1
H-NMR, 500MHz CDCl
3
)………… ……………………………
28
Bảng 3.9.
Kết quả phân tích phổ cộng hưng từ hạt nhân carbon 13 của
nuciferin (
13

C-NMR, 125MHz, CDCl
3
)……………………………….
29
Bảng 3.10.
Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR, KBr) của nornuciferin………
30
Bảng 3.11.
Kết quả phân tích phổ khối lượng (ESI-MS, MeOH) của nuciferin…
30
Bảng 3.12.
Kết quả phân tích phổ cộng hưng từ hạt nhân proton của
nornuciferin (
1
H-NMR, 500MHz, CDCl
3
)…………………………….
31
Bảng 3.13
Kết quả thử gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư MCF7 và
LU.…
31

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cây sen (Nelumbo nucifera Gaertn.)……………………………………
2
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của nuciferin …………… ………………………
4
Hình 1.3. Công thức cấu tạo nhân aporphin ………………………………………
6

Hình 1.4. Sơ đồ phản ứng tạo codein N-oxid bằng cách sử dụng H
2
O
2
30%
8
Hình 1.5. Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng m-CPBA………………
8
Hình 1.6: Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng NPB…………………
8
Hình 1.7: Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng UHP…………………
9
Hình 1.8. Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng NPC…………………
9
Hình 1.9. Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng ozon…………………
9
Hình 1.10. Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng alkyl halogenid………
10
Hình 1.11. Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng phản ứng loại Cope………………
10
Hình 1.12. Sơ đồ phản ứng tạo nuciferin N-oxid bằng H
2
O
2…………………………………
11
Hình 1.13. Sơ đồ khử hóa N-oxid bằng FeSO
4
.7H
2
O

11
Hình 1.14. Sơ đồ khử hóa N-oxid bằng Fe(II)TPPS)……………………………
12
Hình 1.15. Sơ đồ phản ứng N-demethyl hóa bằng CuCl… …………………….
12
Hình 1.16. Sơ đồ phản ứng N-demethyl hóa bằng K
3
Fe(CN)
6
………………
12
Hình 1.17. Sơ đồ phản ứng N-demethyl hóa bằng gốc phthalimide-N-oxyl……
13
Hình 1.18. Sơ đồ phản ứng N-demethyl hóa bằng ester cloroformat…………
13
Hình 1.19. Sơ đồ định hướng tổng hợp dẫn chất N-demethyl hóa của nuciferin
hướng chống ung thư………………………………………………………………
13
Hình 3.1. Sơ đồ phản ứng tạo nuciferin N-oxid sử dụng H
2
O
2
30%
21
Hình 3.2. Sơ đồ đề xuất phản ứng oxy hóa nuciferin bằng H
2
O
2
30%
23

Hình 3.3. Sơ đồ khử hóa nuciferin N-oxid bằng kẽm trong HCl.
Hình 3.4. Sơ đồ khử nuciferin N-oxid bằng FeSO
4
.7H
2
O.
24
25
Hình 3.5. Cơ chế phản ứng oxy hóa tạo N-oxid
33
Hình 3.6. Cơ chế phản ứng khử N-oxid bằng FeSO
4
.7H
2
O
34
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam có một hệ sinh thái đa dạng và phong phú một tiềm năng lớn về tài
nguyên dược liệu (thực vật, động vật, khoáng vật) nói chung và tài nguyên cây dược
liệu nói riêng. Nước ta đã biết có 12000 loài thực vật có mạch. Trong đó có trên 4000
loài cây thuốc, vùng phân bố rộng khắp cả nước [7].
Trong rất nhiều loại dược liệu được sử dụng để chữa bệnh, Sen là một loài rất
phổ biến  Việt Nam. Sen tên khoa học là Nelumbo nucifera Gaertn., họ Sen –
Nelumbonaceae. Ngó sen có tác dụng cầm máu, hạt sen là thuốc bổ, chữa di tinh, mất
ngủ, suy nhược thần kinh. Gương sen, lá sen có tác dụng chữa huyết ứ, băng huyết,
tiểu tiện ra máu [4].
Trong cây sen, các alkaloid chiếm tới 0,7-0,8%, với nuciferin là alkaloid chính.

Nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra được rất nhiều tác dụng mới của dịch chiết các
bộ phận cây sen cũng như của nuciferin, đó là tác dụng chống ung thư [19,22], chống
HIV [38] hay có tác dụng chống oxy hóa mạnh [22]. Mặt khác, gần đây người ta đã
chiết tách ra được nuciferin tinh khiết để bào chế thực phẩm chức năng, m ra tiềm
năng về nguyên liệu tổng hợp thuốc mới.
Bán tổng hợp dẫn chất của nuciferin có triển vọng trong ngành tổng hợp thuốc
mới. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra các dẫn chất của nuciferin có tác dụng đa dạng và
phong phú như: tác dụng chống ung thư [15], ức chế acetylcholinesterase [16,37].
Nhờ có ưu thế về nguồn nguyên liệu cây sen cũng như là tiềm năng của nó trong
y dược học, cây sen trong những năm gần đây được đưa vào nghiên cứu rất nhiều 
Việt nam. Với nguồn nguyên liệu nuciferin sẵn có và dễ tách chiết với hiệu suất cao,
việc bán tổng hợp các dẫn chất của nuciferin đang là một hướng phát triển để tìm ra
các hoạt chất mới có tác dụng chữa bệnh, đặc biệt là bệnh ung thư. Đề tài “Nghiên
cứu một số phản ứng trên nguyên tử nitơ của nuciferin và khảo sát độc tính tế bào
của sản phẩm tạo thành” được thực hiện với các mục tiêu sau:
1. Tạo dẫn chất N-oxid, khử hóa N-oxid tạo N-demethyl nuciferin (nornuciferin).
2. Thử tác dụng chống ung thư của các dẫn chất bán tổng hợp được.
2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Cây Sen
1.1.1. Cây sen
Tên khoa học: Nelumbo
nucifera Gaertn., họ Sen –
Nelumbonaceae.
Phân bố: Vùng nhiệt đới châu
Á, Châu Mĩ và  Việt Nam.
Đặc điểm thực vật: Sen là một
loài cây  dưới nước, thân rễ hình
trụ mọc  trong bn thường gọi là

ngó sen hay ngẫu tiết, ăn được. Lá
(liên diệp) mọc lên khỏi mặt nước, có cuống lá dài, có gai nhỏ, phiến lá hình khiên,
to, đường kính 60-70 cm có gân tỏa tròn. Hoa to màu trắng hay đỏ hồng, đều lưỡng
tính. Quả (thường gọi là hạt sen) chứa một hạt (liên nhục) không có nội nhũ. Hai lá
mầm dày. Chồi mầm (liên tâm) gồm 4 lá non gập vào phía trong. Sen được trông
nhiều  nhiều nơi nước ta để ăn và làm thuốc. Mùa thu hái vào các tháng 7-9 [4].
Thành phần hóa học: Lá sen có chứa alcaloid (0,77 – 0,84%), trong đó có
nuciferin, nor-nuciferin, roemerin, anonain, liriodenin, pronuciferin, O-norciferin,
armepavin, N-nor-armepavin, methyl-corlaurin, nepherin, dehydroemerin,
dehydronuciferin, dehydroanonain, N-methylisocorlaurin. Trong đó nuciferin là
alcaloid chính. Ngoài ra trong lá sen còn có flavonoid, tanin, acid hữu cơ. Trong tâm
sen có nhiều alcaloid (0,85 – 0,96%), trong đó có liensinin, isoliensinin, neferin,
lotusin, nuciferin, pronuciferin, methylcorypallin, demetylcorlaurin (xem Bảng 1.1)
[3,9].
Công dụng: Alcaloid toàn phần trong lá sen có tác dụng an thần, hạ huyết áp
nhẹ. Lá sen được dng để sắc uống chữa mất ngủ với liều 15 – 20 g/ngày. Lá sen kết
hợp với một số dược liệu khác làm thuốc an thần. Tâm sen chữa mất ngủ, an thần, di
mộng tinh. Ngày dùng 4 – 10 g dưới dạng thuốc hãm hay sắc uống [3,9].
Hình 1.1. Cây sen (Nelumbo nucifera Gaertn.)
3


1.1.2. Chiết xuất alkaloid trong lá sen
1.1.2.1. Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng muối bằng dung môi nước, nước
acid hoặc cồn (EtOH, MeOH).
 Tiến hành
Bột dược liệu được làm ẩm bằng NH
4
OH 10% sau đó chiết bằng cồn 70
o

. Dịch
chiết cồn được cất dưới áp suất giảm để thu hồi cồn. Hòa tan cắn vào nước, acid hóa
bằng HCl 5% đến pH = 2. Lọc loại bỏ cặn. Dịch lọc acid được chiết bằng ether dầu
hỏa để loại tạp. Dich chiết acid được thêm NH
4
OH 10% đến pH = 10 – 11 rồi chiết
bằng CHCl
3
. Dịch chiết CHCl
3
được cất thu hồi dung môi, còn lại cắn alcaloid toàn
phần [5].
1.1.2.2. Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ không phân cực:
 Tiến hành:
Bột lá sen được làm ẩm bằng nước vôi trong trong 24h. Cho bột dược liệu đã kiềm
hóa vào bình chiết, chiết bằng dung môi dầu hỏa bằng phương pháp chiết nóng. Thời
gian chiết 4h, chiết 3 lần cho dung môi ngập dược liệu. Thu dịch chiết đem lắc với
H
2
SO
4
0,5% đến pH=2. Lấy lớp acid thêm Na
2
CO
3
bão hòa đến pH=10-11, để yên
cho tủa. Lọc tủa, rửa tủa bằng nước cất đến pH=7. Thu lấy tủa đem sấy được alkaloid
toàn phần [1].
Bảng 1.1. Một số alkaloid trong lá sen
Tên Alkaloid

R1
R2
R3

Nuciferin
CH
3

CH
3

CH
3

N – nor – Nuciferin
CH
3

CH
3

H
O – nor – Nuciferin
H
CH
3

CH
3

Roemetine
- CH
2
-
CH
3

Anonaine
- CH
2
-
H
4

1.1.3. Phương pháp tách alkaloid dưới dạng tinh khiết
1.1.3.1. Giải phóng phân đoạn
Một số nhóm các hợp chất tự nhiên có thể giải phóng phân đoạn từ một hỗn
hợp. Có thể lấy ví dụ một hỗn hợp alkaloid trong dung dịch nước nếu thêm từ từ vừa
đủ từng phần kiềm lúc đầu các base yếu nhất sẽ được giải phóng ra dưới dạng tự do.
Tăng dần độ kiềm lên sẽ lần lượt giải phóng các base có tính kiềm mạnh dần, Mối lần
thêm kiềm ta lắc hỗn hợp với dung môi hữu cơ ta sẽ thu được một loạt các phân đoạn
base [2].
1.1.3.2. Sắc kí hấp phụ
Trong các trường hợp khác nhau tách và phân lập các hợp chất từ thực vật, kỹ
thuật sắc kí là một trong những kỹ thuật được sử dụng nhiều nhất. Kỹ thuật này dựa
trên sự hấp phụ khác nhau của các chất lên bề mặt chất rắn. Các chất rắn này được
nhồi qua một cột thích hợp, sau đó cho dung dịch cần tách qua. Các chất này sẽ lần
lượt hấp phụ lên cột tạo thành các dải hấp phụ. Sau đó dng dung môi khác để rửa
giải chất đó ra khỏi cột (gọi là phản hấp phụ). Các chất sẽ lần lượt tách ra khỏi cột,
nhờ đó mà ta tách riêng được từng chất [2].

1.2. Hợp chất nuciferin.
1.2.1. Công thức, tính chất
- Công thức phân tử: C
19
H
21
NO
2
.
- Khối lượng phân tử: 295,2.
- Danh pháp: 5,5a,7,8-tetrahydro-1,2-dimethoxy-6-
methyldiabenzoquinolin (IUPAC) [4,5]; hoặc 1,2-
dimethoxy-6-methyl-5,6,6a,7-tetrahydro-4H-
dibenzo[de,g]quinolin; 1,2-dimethoxy-6-methyl-5,6,6a,7-
tetrahydro-4H-dibenzo[de,g]quinolin; (+-)-1,2-dimethoxy-6-
methyl-aporphin; 1,2-dimethoxy-6-methyl-aporphin [13].
- Tính chất lí – hóa: Nuciferin là chất kết tinh, tinh thể hình
khối, màu vàng nhạt, không mùi, không vị, tan tốt trong CHCl
3
, MeOH, EtOH nóng,
Hình 1.2. Công thức
cấu tạo của nuciferin
5

hầu như không tan trong nước, nhiệt độ nóng chảy 164 - 165
o
C, phổ UV (đo trong
MeOH) cho λ
max
tại bước sóng 210 nm, 228 nm, 270 nm [4,5].

- Phổ
1
H-NMR (CDCl
3
): δ (ppm) 7,48 (3H, s, N-CH
3
), 6,40 (3H, s, C
1
-OCH
3
),
6,16 (3H, s, C
2
-OCH
3
), 3,38 (1H, s, C
3
-H). 2,74 (3H, m, C
8
-H + C
9
-H + C
10
-H).
1,60 (1H, d, C
11
-H) [6].
1.2.2. Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế nuciferin từ dược liệu
- Chiết xuất: Sử dụng phương pháp chiết như phần 1.1.2 thu được alkaloid toàn
phần.

- Phân lập và tinh chế: Sử dụng phương pháp kết tinh lại trong cồn nóng thu được
tinh thể màu trắng ánh xanh nhạt [1].
1.2.3. Tác dụng dược lý.
Tác dụng dược lý của dịch chiết sen và của nuciferin
Với y học cổ truyền, người ta sử dụng các bộ phận của cây sen trong những
bài thuốc khác nhau dùng để chữa nhiều chứng bệnh khác nhau, ngày nay khoa học
đã chứng minh được nhiều tác dụng của những bài thuốc cổ truyền có nguồn gốc từ
các alkaloid có trong sen (nuciferin là alkaloid chính) cũng như tìm ra nhiều tác dụng
mới của sen.
- Tác dụng chống ung thư:
 Nghiên cứu thấy rằng nuciferin ức chế sự hoạt hóa thụ thể của yếu tố nhân
ligand kappa-B (RANKL) – yếu tố này hình thành tế bào hủy xương trong các tế bào
đại thực bào tủy xương chuột. Ngoài ra, nuciferin tăng sinh tế bào ức chế và apoptosis
cảm ứng trong tế bào MDA-MB-231 ung thư vú  người. Hơn nữa, nuciferin có thể
điều chỉnh phân phối chu kỳ tế bào và biểu hiện của các protein liên quan đến quá
trình apoptosis trong tế bào MDA-MB-231 và ức chế ung thư vú từ đó ức chế sự tiêu
xương trong cơ thể. Vì vậy, nuciferin có thể có tiềm năng để ngăn chặn ung thư vú
[19].
 Nghiên cứu đã xem xét các hoạt động gia tăng của hợp chất cô lập, chất này
có tác dụng chống lại khối u ác tính của con người, tuyến tiền liệt và các tế bào ung
6

thư dạ dày. Kết quả chỉ ra rằng 7- hydroxydehydronuciferine ức chế đáng kể sự phát
triển của khối u ác tính, tuyến tiền liệt và các tế bào ung thư dạ dày [22].
- Tác dụng chống oxy hóa: 15 hợp chất được chiết xuất và tinh chế từ lá của Nelumbo
nucifera Gaertn. Các hoạt động chống oxy hóa của các hợp chất đã được xem xét
bằng cách dọn dẹp gốc tự do, phức kim loại và khử sắt III. Các kết quả đã cho thấy
các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa. Phát hiện này cho thấy rằng lá của Nelumbo
nucifera Gaertn. cv. Rosa-Plena là một tiềm năng để đạt được các hoạt chất sinh học
có đặc tính chống oxy hóa [22].

- Tác dụng chống HIV: Người ta chứng minh tác dụng chống HIV của một số
alkaloid phân lập từ cây Nelumbo nucifera: coclaurin, norcoclaurin, nuciferin,
liensinin, negferin và isoliensinin… thông qua các đánh giá các giá trị EC
50
và TI (chỉ
số điều trị). Nuciferin là alkaloid chính trong lá và phôi của Nelumbo nucifera, tác
dụng chống HIV  EC
50
là 0,8 µg/ml và TI là 36 [38].
- Tác dụng chống béo phì: người ta đã khảo sát ảnh hưng của dịch chiết của lá cây
Nelumbo nucifera về hoạt động của enzym tiêu hóa, chuyển hóa lipid và đánh giá khả
năng chống béo phì bằng cách cho chế độ ăn gây ra béo phì  chuột và sử dụng dịch
chiết Nelumbo nucifera trong 5 tuần. Dịch chiết Nelumbo nucifera gây ra sự ức chế
phụ thuộc nồng độ của các hoạt động của α-amylase và
lipase, làm tăng chuyển hóa lipid và biểu hiện của mRNA
UCP3. Dịch chiết ngăn chặn sự gia tăng trọng lượng cơ
thể, cân nặng và mô mỡ gan triacylglycerol  chuột mắc
bệnh béo phì gây ra bi một chế độ ăn giàu chất béo. Vì
vậy làm giảm tiêu hóa, hấp thụ của chất béo và ức chế
carbohydrat, tăng tốc quá trình chuyển hóa lipid và điều
chỉnh tăng tiêu hao năng lượng. Do đó, dịch chiết lá
Nelumbo nucifera có lợi về ngăn chặn bệnh béo phì [29].
- Tác dụng chống giun sán: người ta tách các alkaloid từ
lá sen trong đó liriodenin, lysicamin, anonain, asimilobin, caaverin, N-
methylasimilobin, nuciferin, nornuciferin, roemerin, 7-hydroxydehydronuciferin và
Hình 1.3. Công thức cấu
tạo nhân aporphin
7

cepharadion B và thử tác dụng đối với Anisakis simplex và Hymenolepis nana. Nghiên

cứu này cho thấy rằng các thành phần trên giết hoặc giảm sự chuyển động chủ động
của H. nana [21].
- Tác dụng chống sốt rét và kháng nấm của một số alkaloid được chiết được từ lá
sen đã được thử nghiệm. Kết quả cho thấy trong số các alkaloid đã được thử nghiệm
thì một vài alkaloid có tác dụng chống sốt rét hoặc chống nấm. Tuy nuciferin không
có tác dụng này, nhưng người ta phát hiện ra một mối liên hệ cấu trúc và tác dụng có
liên quan mật thiết với nhóm thế  vị trí C1 và C2 trên vòng aporphin (xem Hình 1.3)
. Đây được coi là một hướng nghiên cứu mới với việc gắn nhóm thế vào 2 vị trí này
 nuciferin [11].
- Kích thích tiết insulin: Nuciferin chiết từ lá sen có tác dụng kích thích tiết insulin
in vitro tốt hơn Glyburid. Cơ chế kích thích tiết insulin bằng cách đóng các kênh K
+
- ATPase , giải thích tác dụng chống bệnh tiểu đường của Nelumbo nucifera [25, 26].
Có thể kết luận sen và các hoạt chất có trong sen, đặc biệt là các alkaloid với
nuciferin là thành phần chính có thể có rất nhiều tác dụng sinh học, tác dụng tốt với
nhiều bệnh mà hiện con người vẫn còn đang trong quá trình nghiên cứu và chưa tìm
ra phương pháp chữa hiệu quả, sen và các alkaloid trong sen có một giá trị tiềm năng
lớn về mặt khoa học trong tương lai.
1.3. Tổng quan về các phương pháp tạo N-oxid
1.3.1. Sử dụng tác nhân oxy hóa.
1.3.1.1. Sử dụng tác nhân H
2
O
2
.
Điều kiện phản ứng: codein được hòa tan trong MeOH, làm lạnh về 0
o
C thêm
H
2

O
2
(dư 11 lần). Khuấy hỗn hợp phản ứng  nhiệt độ phòng trong 18h. Hỗn hợp
thêm MnO
2
để loại H
2
O
2
. Xử lý hỗn hợp thu được codein N-oxid với hiệu suất 100%
(xem Hình 1.4) [23].
8


1.3.1.2. Sử dụng acid m-cloroperbenzoic (m-CPBA).
Điều kiện phản ứng: codein được hòa tan trong i-PrOH/CHCl
3
(1:3) làm lạnh
đưa về -5
o
C. Thêm m-CPBA, khuấy trong 10 phút thu được codein N- oxid với hiệu
suất 100% (Xem Hình 1.5) [20].


1.3.1.3. Sử dụng natri perborate tetrahydrat (NPB)
Điều kiện phản ứng: isonicotinonitril được hòa tan trong AcOH băng thêm
NPB đưa nhiệt độ phản ứng lên 40
o
C. Khuấy tiếp theo dõi bằng sắc kí lớp mỏng
(SKLM) đến khi phản ứng kết thúc. Xử lý hỗn hợp phản ứng thu được

isonicotinonitril N-oxid với hiệu suất 81% (Xem Hình 1.6) [24].

Hình 1.5. Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng m-CPBA

Hình 1.4. Sơ đồ phản ứng tạo codein N-oxid bằng cách sử dụng H
2
O
2
30%
Hình 1.6. Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng NPB


9

1.3.1.4. Sử dụng Urea−Hydrogen Peroxid.
Điều kiện phản ứng: pyridin được thêm UHP, đưa nhiệt độ hỗn hợp phản ứng
lên 85
o
C trong 45 phút. Xử lý hỗn hợp phản ứng thu được pyridin N-oxid với hiệu
suất 85% (xem Hình 1.7) [36].

1.3.1.5. Sử dụng natri percarbonat.
Điều kiện phản ứng: thêm N-ethyl-N-methylanilin thêm xúc tác MTO, NPB,
AcOH, MeCN, sục khí N
2
, đưa nhiệt độ phản ứng lên 50
o
C trong 1h. Xử lý hỗn hợp
phản ứng thu được N-ethyl-N-methylanilin N-oxid với hiệu suất 94% (xem Hình
1.8) [18].

1.3.1.6. Sử dụng ozon.
Điều kiện phản ứng: hòa tan quinuclidin trong Et
2
O, làm lạnh xuống -78
o
C.
Sục khí ozon trong 3h. Xử lý hỗn hợp phản ứng thu được quinuclidin N-oxid với hiệu
suất 95% (xem Hình 1.9) [28].

Hình 1.7. Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng UHP

Hình 1.8. Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng NPC


Hình 1.9. Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng ozon



10

1.3.2. Sử dụng tác nhân alkyl halogenid tác dụng với hydroxylamine.
Điều kiện phản ứng: hòa tan 4- tert-butyl-1-hydroxypiperidin và methyl
iodid trong EtOH có chứa NaHCO
3
. Phản ứng được đưa lên nhiệt độ 50
o
C trong 5
ngày. Xử lý hỗn hợp phản ứng thu được sản phẩm N-oxid với hiệu suất 15% (xem
Hình 1.10) [33].

1.3.3. Sử dụng phản ứng loại Cope.

Điều kiện phản ứng: Hòa tan 1,(2S)-oxiranyl-prop-2-en-(1R)-ol trong MeOH,
thêm N-benzylhydroxylamin.HCl và NaOMe. Xử lý hỗn hợp phản ứng thu được 1-
benzyl-(2S)methyl-(1S)-N-oxy-pyrrolidin-(3R),(4S)-diol với hiệu suất 72% (xem
Hình 1.11) [27] .
1.3.4. Phân tích lựa chọn phương pháp tạo N-oxid của nuciferin.
Ở khóa luận này chúng tôi sử dụng tác nhân H
2
O
2
để oxy hóa nuciferin tạo sản
phẩm nuciferin N-oxid bi vì tác nhân H
2
O
2
rẻ tiền và dễ kiếm, thường có hầu hết 
các phòng tổng hợp hóa dược.
Hình 1.10. Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng alkyl halogenid




Hình 1.11. Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng phản ứng loại Cope
11

Điều kiện phản ứng: nuciferin được hòa tan trong MeOH thêm H
2
O

2
khuấy 
nhiệt độ phòng, theo dõi bằng SKLM. Xử lý hỗn hợp thu được nuciferin N-oxid với
hiệu suất 90% (xem Hình 1.12) [37].

1.4. Các phương pháp N-demethyl hóa.
1.4.1. Khử hóa N-oxid
1.4.1.1 Sử dụng FeSO
4
.7H
2
O.
Điều kiện phản ứng:Hòa tan Codein N-oxid trong MeOH điều chỉnh pH đến
1 bi HCl 6M, cất quay đến cắn được codein N-oxid.HCl. Sau đó chất rắn được hòa
tan trong MeOH thêm FeSO
4
.7H
2
O  0
o
C. Khuấy  nhiệt độ phòng trong 1h. Xử lý
hỗn hợp phản ứng thu được nor-cordein với hiệu suất 49% (xem Hình 1.13) [23].
1.4.1.2 Dùng tetranatri 5,10,15,20-Tetra(4-sulfophenyl)porphyrinatoiron(II)
(Fe(II)TPPS).
Điều kiện phản ứng: codein methyl ether N-oxide.HCl hòa tan trong MeOH
thêm Fe(II)TPPS. Khuấy  nhiệt độ phòng trong 72h. Xử lý hỗn hợp phản ứng thu
được norcodein methyl ether với hiệu suất 91% (xem Hình 1.14) [14].
Hình 1.12. Sơ đồ phản ứng tạo nuciferin N-oxid bằng H
2
O

2

Hình 1.13. Sơ đồ khử hóa N-oxid bằng FeSO
4
.7H
2
O

12


1.4.1.3 Sử dụng CuCl

Điều kiện phản ứng: N,N-dimethylanilin hòa tan trong t-BuOH. Thêm vào hỗn
hợp phản ứng CuCl và TBHP. Đưa hỗn hợp phản ứng lên 35
o
C trong 6h. Xử lý hỗn
hợp phản ứng thu được N-methylanilin với hiệu suất 64% (xem Hình 1.15) [32].
1.4.2. Sử dụng K
3
Fe(CN)
6
.
Điều kiện phản ứng: 3-dimethylaminocyclohexanol thêm nước, thêm
K
3
Fe(CN)
6
và KOH trong điều kiện nhiệt độ <5
o

C trong 45 phút. Sau đó hỗn hợp
được đưa đến nhiệt độ phòng và để qua đêm. Xử lý hỗn hợp phản ứng thu được 3-
monomethylaminocyclohexanol với hiệu suất 93% (xem Hình 1.16) [31].

1.4.3. Sử dụng gốc phthalimide-N-oxyl
Điều kiện phản ứng: N,N-dimethylanilin thêm CH
3
CN, thêm chì (IV) acetat
(Pb(OAc)
4
) trong AcOH và MeCN, thêm N-hydroxylphtalimid trong MeCN, sục khí
Argon trong 20 phút. Hỗn hợp được khuấy  25
o
C trong 10 phút. Xử lý hỗn hợp sản
phẩm thu được N-methylanilin với hiệu suất từ 12-20% (xem Hình 1.17) [12].
Hình 1.16. Sơ đồ phản ứng N-demethyl hóa bằng K
3
Fe(CN)
6




Hình 1.14. Sơ đồ khử hóa N-oxid bằng Fe(II)TPPS)

Hình 1.15. Sơ đồ phản ứng N-demethyl hóa bằng CuCl


13

1.4.4. Sử dụng este cloroformat
Điều kiện phản ứng:Khuấy hỗn hợp gồm morphin, KHCO
3
trong CHCl
3
.
Thêm phenyl cloroformat, đun hồi lưu trong 60h. Xử lý hỗn hợp phản ứng thu được
N-Carbophenoxynormorphin với hiệu suất 91%. N-Carbophenoxynormorphin được
hòa tan trong C
2
H
5
OH, KOH sục khí N
2
đun hồi lưu trong 24h. Xử lý hỗn hợp phản
ứng thu được normorphin với hiệu suất 43,5% (xem Hình 1.18) [10].

1.5. Lựa chọn hướng nghiên cứu.
- Với một số hoạt tính đã được nghiên cứu của các amin N-oxid như tác dụng
chống ung thư [17], kháng khuẩn [34], ức chế cytochrome P450 [35]. Vì vậy chúng
tôi oxy hóa nuciferin tạo thành nuciferin N-oxid.
- Tổng hợp các hợp chất tương tự tác nhân alkyl hóa như melphalan, clorambucil,
cyclophosphamid đã sử dụng làm thuốc ung thư. Chúng tôi dự định chọn hướng N-
demethyl hóa nuciferin sau đó đưa nhóm alkyl vào nguyên tử N. Đó là tiềm năng về
tổng hợp thuốc mới có tác dụng chống ung thư.

Hình 1.19. Sơ đồ định hướng tổng hợp dẫn chất N-demethyl hóa của nuciferin
hướng chống ung thư
Hình 1.17. Sơ đồ phản ứng N-demethyl hóa bằng gốc phthalimide-N-oxyl

Hình 1.18. Sơ đồ phản ứng N-demethyl hóa bằng este cloroformat





14

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu
 Nguyên liệu: lá Sen mua tại phố Lãn Ông, Hà Nội đã được phơi khô. Qua quá trình
chiết, phân lập và tinh chế tại phòng Tổng hợp Hóa dược Bộ môn Công nghiệp Dược-
Trường Đại học Dược Hà Nội thu được nuciferin làm nguyên liệu cho các phản ứng
bán tổng hợp.
 Các hóa chất và dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm đã được thống kê
trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm
Stt
Nguyên liệu
Xuất xứ
1
Aceton
Trung Quốc
2
Acid sulfuric

Trung Quốc
3
Bản mỏng Silica gel 60 F254
Merck – Đức
4
Cloroform
Trung Quốc
5
Dầu hỏa
Việt Nam
6
EtOH
Việt Nam
7
FeSO
4
.7H
2
O
Trung Quốc
8
Hydro cloric
Trung Quốc
9
Hydro peroxid
Trung Quốc
10
i-PrOH
Trung Quốc
11

Kẽm
Trung Quốc
12
KMnO
4
Trung Quốc
13
MeOH
Trung Quốc
14
Natri carbonat
Trung Quốc
15
Natri nitrit
Trung Quốc
16
Natri sulfat khan
Trung Quốc
17
Than hoạt tính
Việt Nam