Bước đầu khảo sát khả năng tạo mk 7 từ môi trường nuôi cấy bacillus subtilis natto

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI







LÊ XUÂN CƯỜNG


BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO MK-7
TỪ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
Bacillus subtilis natto




KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ





HÀ NỘI - 2015


BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI







LÊ XUÂN CƯỜNG


BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO MK-7
TỪ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
Bacillus subtilis natto

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


Người hướng dẫn:
DS. Lê Ngọc Khánh
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp Dược
Trường Đại học Dược Hà Nội.





HÀ NỘI – 2015

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn
chân thành tới thầy giáo DS. Lê Ngọc Khánh – Giảng viên bộ môn Công
nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn quan tâm, tận tình
hướng dẫn và giúp đỡ tôi trên con đường học tập, nghiên cứu khoa học.
Đồng thời, tôi cũng xin cảm ơn cô giáo TS. Đàm Thanh Xuân cùng toàn
thể các thầy, cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Công nghiệp Dược –
Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận này.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể gia đình, các
thầy cô giáo trong trường và tất cả bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình học tập.


Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên
Lê Xuân Cường

MỤC LỤC Trang
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis natto 3
1.1.1. Giới thiệu 3
1.1.2. Phân loại khoa học 3
1.1.3. Nguồn gốc 3
1.1.4. Đặc điểm hình thái 4
1.1.5. Đặc điểm sinh lý 4
1.1.6. Đặc điểm sinh dưỡng 4
1.2. MK-7 - sản phẩm trao đổi chất của B. subtilis natto 5
1.2.1. Nguồn gốc 5
1.2.2. Cấu trúc 6
1.2.3. Tính chất 6
1.3. Cơ chế tác dụng của MK-7. 7
1.3.1. MK-7 với sức khỏe của xương. 7
1.3.2. MK-7 với sức khỏe tim mạch. 8
1.4. Công dụng 9
1.5. Lên men tạo MK-7 từ Bacillus subtilis natto 10
1.5.1. Nuôi cấy vi sinh vật sản xuất MK – 7. 10


1.5.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp, chiết tách các chất từ
dịch lên men của Bacillus subtilis natto. 11
1.6. Một số nghiên cứu về B. subtilis natto và MK-7 13
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 15

2.1.1. Vi sinh vật sử dụng 15
2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất sử dụng 15
2.1.3. Môi trường 15
2.1.4. Máy móc, thiết bị và dụng cụ 16
2.2. Nội dung nghiên cứu 16
2.2.1. Khảo sát sự có mặt của MK-7 trong môi trường nuôi cấy B. subtilis
natto. 16
2.2.2. Lựa chọn hệ dung môi chiết MK-7 từ môi trường nuôi cấy B.
subtilis natto. 17
2.3. Phương pháp nghiên cứu 17
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy B. subtilis natto. 17
2.3.2. Phương pháp chiết MK-7 từ môi trường nuôi cấy 18
2.3.3. Phương pháp định tính MK-7 bằng sắc kí lớp mỏng 19
CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 22
3.1. Khảo sát có mặt của MK-7 trong môi trường nuôi cấy B. subtilis natto.22
3.1.1. Khảo sát sự có mặt của MK-7 trong phần sinh khối B. subtilis natto22
3.1.2. Khảo sát sự có mặt của MK-7 trong dịch lọc môi trường nuôi cấy B.
subtilis natto 24


3.2. Lựa chọn hệ dung môi chiết MK-7 từ môi trường nuôi cấy B. subtilis
natto 28
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid Deoxyribo nucleic
B. subtilis natto Bacillus subtilis natto
GGCX γ-glutamate carboxylase
Gla Axit γ-carboxyglutamic
HPLC High-performance liquid chromatography
MK-7 Menaquinone 7
mmHg Milimet thủy ngân
NF-κB Nuclear Factor-kappa B
PGE2 Prostaglandin E2

rARN ribosomal Acid Ribonucleic
VSV Vi sinh vật
γ-PGA Gama polyglutamic acid
v/v Thể tích/Thể tích
w/v Khối lượng/Thể tích
mARN messenger Acid ribonucleic
TLC Thin layer chromatography
















DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng
Tên bảng
Trang
2.1
Nguyên liệu và hóa chất

15
2.2
Thiết bị sử dụng
16
3.1
Kết quả sắc kí lớp mỏng của dịch chiết sinh khối với
pha động sắc kí là n-hexan:CH
2
Cl
2
(1:1, v/v)
23
3.2
Kết quả sắc kí lớp mỏng của dịch lọc với pha động sắc
kí là n-hexan:CH
2
Cl
2
(1:1, v/v)
25
3.3
Kết quả sắc kí lớp mỏng của dịch lọc với pha động sắc
kí là CHCl
3
:CH
3
OH (9:1, v/v)
25
3.4
Kết quả sắc kí lớp mỏng của dịch lọc với pha động sắc

kí là CHCl
3
:CH
3
OH (20:1, v/v)
26
3.5
Kết quả sắc kí lớp mỏng của dịch lọc với pha động sắc
kí là Etylacetat:n-hexan (7:3, v/v)
27
3.6
Kết quả sắc kí lớp mỏng của dịch lọc với hệ dung môi
chiết là n-hexan:2-propanol (2:1, v/v)
31





DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình
Tên hình
Trang
1.1
Hình thái vi khuẩn B. subtilis natto
4
1.2
Công thức cấu tạo của MK-7
6

1.3
MK-7 ngăn chặn con đường của NF-κB truyền tín hiệu
8
1.4
Quá trình loại bỏ Calci ra khỏi động mạch
9
1.5
Các sản phẩm có chứa MK-7
11
2.1
Dụng cụ bình sắc kí
19
2.2
Bản mỏng sắc kí
21
3.1
Bản mỏng chạy sắc kí phần sinh khối với pha động sắc kí là
n-hexan:CH
2
Cl
2
(1:1, v/v).
23
3.2
Bản mỏng tiến hành sắc kí với các hệ dung môi
25
3.3
Bản mỏng tiến hành sắc kí lớp mỏng với pha động
n-hexan:CH
2

Cl
2
(1:1, v/v)
30
1


ĐẶT VẤN ĐỀ

Trên thế giới, các bệnh loãng xương, gãy xương là những vấn đề về sức
khỏe nghiêm trọng và chi phí chăm sóc y tế và quản lý là rất lớn. Ở Mỹ năm
1995, chi phí chăm sóc sức khỏe liên quan đến gãy xương do loãng xương là
khoảng 13,8 tỷ USD [34]. Theo một nghiên cứu về tỉ lệ loãng xương ở bệnh
nhân trên 50 tuổi ở bệnh viện đa khoa huyện Cái Nước tỉnh Cà Mau, kết quả
cho thấy tỷ lệ loãng xương chiếm 21,53 % [11]. Ngoài ra các vấn đề về còi
xương ở trẻ nhỏ cũng đang là một vấn đề cần được quan tâm. Một nghiên cứu
cho thấy tỷ lệ còi xương ở trẻ em 1-36 tháng tuổi ở vùng miền núi phía Bắc là
14,4% [1].
Trước đây, con người thường ít quan tâm đến vấn đề chăm sóc sức khỏe
của xương từ lúc ban đầu và thường chỉ phát hiện ở giai đoạn sau của bệnh và
thường phải dùng thuốc điều trị triệu chứng. Các thuốc điều trị loãng xương
như Calci, vitamin D, Calcitonin. Tuy nhiên các thuốc này thường gây ra các
tác dụng không mong muốn. Hiện nay, một số loại thực phẩm giúp phòng và
điều trị loãng xương, giúp xương chắc khỏe có tác dụng rất tốt.
Năm 2004, Tsukamoto nghiên cứu tác động trong quá trình chuyển hóa
xương và vai trò ngăn ngừa loãng xương của MK-7 [46]. Ngoài tác dụng trên
xương MK-7 cũng đã được chứng minh ngăn ngừa quá trình vôi hóa thành
mạch, cải thiện sức khỏe tim mạch [22]. Từ đây con người mới bắt đầu chú ý
và nghiên cứu MK-7. MK-7 là một loại vitamin K2 có nguồn gốc tự nhiên, có
trong các thực phẩm lên men đặc biệt có nhiều trong Natto - một loại thực

phẩm truyền thống của người Nhật được lên men bằng cách ủ đậu tương nấu
chín với Bacillus subtilis natto [9]. B. subtilis natto có khả năng sinh tổng hợp
MK-7 và khi thay đổi các điều kiện môi trường như nhiệt độ, cấp khí, dinh
2

dưỡng, thời gian lên men có thể ảnh hưởng tới khả năng sinh tổng hợp MK-
7 của vi khuẩn. Các nghiên cứu về MK-7 phần lớn là ở nước ngoài còn trong
nước vẫn chưa nghiên cứu được nhiều. Dó đó, khóa luận “Bước đầu khảo sát
khả năng tạo MK-7 từ môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis natto” được thực
hiện với hai mục tiêu:
1. Khảo sát sự có mặt của MK-7 trong môi trường nuôi cấy B. subtilis
natto.
2. Lựa chọn dung môi chiết MK-7 từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto.

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Vi khuẩn Bacillus subtillis natto
1.1.1. Giới thiệu
Bacillus subtilis natto là vi sinh vật thuộc chi Bacilus, loài Bacillus subtilis
được giáo sư S. Sawamura phân lập lần đầu tiên từ quá trình lên men natto
năm 1905 [36].
Tên khác: Bacillus subtilis subsp. natto; Bacillus subtilis var. natto,
Bacillus natto [36], B. subtilis (natto) [24].
1.1.2. Phân loại khoa học
Bacillus subtilis natto là một vi khuẩn thật (Eurobacteria) thuộc:
Giới: Bacteria; Ngành: Firmicutes; Lớp: Bacilli; Bộ: Bacillales; Họ:
Bacillaceae; Chi: Bacillus; Loài: Bacillus subtilis [48]. Phân loại dưới loài:
Bacillus subtilis natto [36].
Từ kết quả phân tích ADN nhiễm sắc thể Bacillus subtilis natto và Bacillus

subtilis của Seki năm 1975 [36] và kết quả phân tích gen 16S rARN của
Tamang năm 2002 [43] cho thấy B. subtilis natto thuộc loài B. subtilis, các
khóa phân loại đã xếp B. subtilis natto là một dòng thuộc loài B. subtilis
nhưng phân biệt với các dòng khác là khả năng lên men tạo natto [44], [38].
Dòng B. subtilis natto có nhiều loại như B. subtilis natto N441 [1], B.
subtilis N18 [5], B. subtilis natto B-12 [55], B. subtilis natto N-77 [39]
1.1.3. Nguồn gốc
B. subtilis natto được giáo sư Shin Sawamura phân lập từ Natto, một loại
thực phẩm lên men từ đậu tương là món ăn truyền thống của người nhật Bản
[24]. Vi khuẩn này có nhiều trong rơm rạ, cỏ khô, phát triển trên các loại ngũ
cốc, các loại thực phẩm có nguồn gốc động vật như thịt, cá đặc biệt phát triển
tốt trên đậu tương đã nấu chín [47], [42].
4

1.1.4. Đặc điểm hình thái
B. subtilis natto là trực khuẩn hình que, Gram (+). Nội bào tử hình que có
kích thước dưới 1μm. Các tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hay nối với nhau
thành chuỗi (Hình 1.1). Khuẩn lạc khô, không màu, có kích thước lớn hơn
hay hình dạng bất định. Bề mặt hơi nhăn tạo thành lớp mịn, lan rộng trên bề
mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch [38].

Hình 1.1. Hình thái vi khuẩn B. subtilis natto [60].
1.1.5. Đặc điểm sinh lý
B. subtilis natto là sinh vật hiếu khí bắt buộc, có thể phát triển ở nồng độ
oxy lớn hơn 3%. Vi khuẩn phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng (30
o
C –
50
o
C); pH trung tính hoặc hơi kiềm, khoảng pH tối ưu cho sự sinh trưởng là

7,2 – 7,6. Sự phát triển của B. subtilis natto bị ức chế bởi nhiệt độ lớn hơn
55
o
C và pH ≤ 4,5. Vi sinh vật có khả năng sinh bào tử, nhiệt độ thích hợp cho
sự nảy mầm của bào tử là 40
o
C, bào tử vẫn có thể nảy mầm sau khi bảo quản
ở 0
o
C [38], [23].
1.1.6. Đặc điểm sinh dưỡng
B. subtilis natto là sinh vật dị dưỡng, nguồn hydrocarbon có thể sử dụng từ
nhiều nguồn khác nhau như: đường đơn (glucose, fructose); đường đôi
(saccarose, maltose); polysaccharid (tinh bột, dextrin). Nguồn nitơ cần thiết
5

cho sự phát triển của B. subtilis là các acid amin, protein được cung cấp từ các
nguồn như cao ngô, cao nấm men, cao thịt VSV có thể sử dụng dễ dàng
acid glutamic, arginine, asparagine nhưng không sử dụng được threonin,
methinonin, phenylalamin [38], [23].
1.2. MK-7 - sản phẩm trao đổi chất của B. subtilis natto
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển B. subtilis natto có khả năng sinh
ra nhiều sản phẩm trao đổi chất như các enzym: phytase theo M. Shimizu năm
1992 [39]; amylase theo Elif Demirkan năm 2011 [19]; cellulase theo Sun
Yan năm 2011 [40]; protease theo M. Fujita năm 1993 [20]; nhóm enzym γ–
transpeptidase theo Noda năm 1989 [29]. Ngoài ra còn có các sản phẩm khác:
γ-PGA theo Bhat năm 2013 [12]; levan (fructan) theo Santos năm 2013 [21],
trong đó có các ứng dụng được quan tâm đó là:
Natto là thực phẩm lên men truyền thống của Nhật Bản được cho là có lịch
sử trên 1.000 năm. Natto được sản xuất trên nguyên liệu đậu nành với vi

khuẩn Bacillus subtilis natto. Hiện nay, Nhật Bản sản xuất trên 300.000
tấn/năm [5]. Hai chất được tìm thấy trong natto là nattokinase và
menaquinone 7. Nattokinase tiêu fibrin là enzyme làm tan huyết khối, được
phát hiện trong Natto vào năm 1980 [43] và menaquinone 7 một sản phẩm
cũng đang được nghiên cứu rất nhiều hiện nay [41], [45], [50], [13], [26].
1.2.1. Nguồn gốc
Menaquinone 7 có tên khác là: Vitamin K2 (menaquinone – 7), Vitamin
K2 (35), Menaquinone K7, Vitamin MK 7, MK-7.
Vitamin K lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1929 bởi Henrik Dam [9].
Vitamin K gồm có vitamim K tự nhiên và vitamin K tổng hợp. Vitamin K
tự nhiên gồm có vitamin K1 (phylloquinone hoặc 2-methyl-3eicosa-2
’
-ene-
1,4-naphthoquinone) và vitamin K2 (menaquinone hoặc 2-methyl-3-
6

multiprenyl-1,4-naphthoquinone) [15]. Vitamin K tổng hợp gồm 3 loại là
vitamin K3, vitamin K4, vitamin K5 [21].
Vitamin K2 (MK-n) gồm có các chất được phân biệt với nhau dựa vào số
lượng isoprene-5-carbon ở mạch nhánh, chiều dài chuỗi khác nhau từ 2 đến
15 đơn vị isoprene [42] (n từ 2 đến 15). Trong đó MK-4, MK-7 là được
nghiên cứu nhiều nhất.
MK-7 là vitamin K2 có nguồn gốc từ thiên nhiên, có nhiều trong những
thực phẩm lên men như phomat, miso, và đặc biệt là ở natto. Cứ 100 g natto
cung cấp 870 µg vitamin K2 chủ yếu dưới dạng MK-7 [9].
1.2.2. Cấu trúc
Công thức cấu tạo

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của MK-7 [56].
Công thức phân tử C

46
H
64
O
2
[56].
Trọng lượng phân tử: 648,99916 g/mol [56].
Tên IUPAC:
2-[(2E,6E,10E,14E,18E,22E)-3,7,11,15,19,23,27-heptamethyloctacosa-
2,6,10,14,18,22,26-heptaenyl]-3-methylnaphthalene -1,4-dione [41].
1.2.3. Tính chất
Màu sắc: tinh thể, màu vàng [31].
Điểm sôi: 200
o
C tại 0,0002 mmHg [31].
Điểm nóng chảy: 54
o
C [25].
Độ hòa tan: ít tan hơn so với vitamin K1 trong cùng một dung môi hữu cơ
[45], không tan trong nước, tan được trong dầu, mỡ [30], [35].
7

1.3. Cơ chế tác dụng của MK-7
1.3.1. MK-7 với sức khỏe của xương
MK-7 đã được chứng minh tác dụng kích thích vôi hóa xương trong các
mô xương đùi chuột [18]. Ở nồng độ MK-7 (10
-6
hoặc 10
-5
M), MK-7 làm

tăng đáng kể các thành phần sinh hóa (phosphatase kiềm, ADN và canxi) ở
các mô xương đùi chuột trong ống nghiệm [52]. Hơn nữa, MK-7 làm tăng
đáng kể phosphatase kiềm, protein (osteocalcin) và ADN trong các tế bào
sinh xương MC3T3-E1 trong ống nghiệm [53]. Hiệu quả của MK-7 trong các
tế bào sinh xương bị ức chế bởi cycloheximide [52], [18], [16]. Như vậy,
MK-7 đã được chứng minh kích thích sự hình thành tế bào sinh xương do
tăng tổng hợp protein [51]. Mặt khác, trong tế bào sinh xương có chứa một
protein là osteocalcin. Osteocalcin là một protein không thuộc dạng collagen,
quan trọng nhất trong cấu trúc xương, là protein gắn kết calci chuyên biệt cho
xương phụ thuộc vào vitamin K [4]. Osteocalcin tạo ra từ tế bào sinh xương
nhờ được cảm ứng bởi vitamin D3 nhưng ở dạng chưa hoạt hóa. Khi đó, MK-
7 sẽ hoạt hóa osteocalcin giúp protein này có thể gắn và vận chuyển calci vào
xương, hình thành xương và giúp xương vững chắc [33].
MK-7 cũng đã được chứng minh có tác dụng ức chế tái hấp thu tế bào hủy
xương [16]. MK-7 ức chế các yếu tố bao gồm hormone tuyến cận giáp (PTH)
và prostaglandin E2 (PGE2). Tế bào hủy xương được hình thành khi có mặt
của các yếu tố như PTH, PGE2 và các yếu tố khác [16]. Ở nồng độ từ (10
-8
-
10
-5
M), MK-7 giúp ngăn chặn PTH- hoặc PGE2 là các chất hình thành tế
bào hủy xương.
Hiệu quả của MK-7 trên tế bào hủy xương trưởng thành được phân lập từ
mô xương đùi chuột cũng đã được kiểm tra. MK-7 làm giảm số lượng các tế
bào hủy xương trưởng thành trong ống nghiệm [16].
8


Hình 1.3. MK-7 ngăn chặn con đường của NF-κB truyền tín hiệu [49].

MK-7 kích thích sự hình thành tế bào sinh xương và ức chế tái hấp thu tế
bào hủy xương. MK-7 tăng tổng hợp protein bao gồm osteocalcin và kích
hoạt γ-carboxylase trong tế bào sinh xương. Hơn nữa, MK-7 cũng đã được
biết đến trong việc ngăn chặn sự hoạt hóa của tín hiệu NF-κB trong cả
osteoblastogenesis và osteoclastogenesis. Hoạt hóa NF- κB là con đường
truyền tín hiệu cần thiết cho sự hình thành tế bào hủy xương [49]. NF-κB hoạt
hóa cytokin gây ra ức chế các tế bào tiền sinh xương và kích thích sự hình
thành của các tế bào hủy xương [49]. MK-7 đối kháng thụ thể của NF-κB
(RANK) ligand (RANKL) –induced là những tiền chất của tế bào hủy
xương. MK-7 kích thích IκB mRNA biểu hiện [49]. Những phát hiện này
cung cấp một cơ chế mới của vitamin K2, kích thích sự hình thành xương và
ức chế các tế bào hủy xương.
1.3.2. MK-7 với sức khỏe tim mạch
MK-7 kiểm soát các protein điều hòa calci trong mô mạch máu đó là matrix
GLA protein và osteocalcin. Bằng cách loại bỏ calci ra khỏi động mạch giúp
9

ngăn quá trình vôi hóa thành mạch máu. Điều này giúp làm giảm nguy cơ
calci tích tụ tạo thành các mảng xơ vữa động mạch [54].

Hình 1.4. Quá trình loại bỏ Calci ra khỏi động mạch [57].
1.4. Công dụng
Dự phòng và giúp điều trị loãng xương, còi xương, gãy xương, giúp xây
dựng và bảo vệ xương khỏe mạnh, làm chậm quá trình mất xương do tuổi, cải
thiện chất lượng xương trong nhiều nguyên nhân bệnh lý như mãn kinh, do
dùng thuốc (như corticoid), bệnh Parkinson, xơ gan, đột qụy, đái tháo đường,
bệnh tiêu hóa [57].
Bảo vệ sức khỏe hệ tim mạch, chống xơ vữa động mạch, chống tắc nghẽn
mạch, tránh nhồi máu cơ tim, đau thắt ngực. Nghiên cứu chỉ ra rằng, nếu cung
cấp đủ MK7 thì có thể giảm nguy cơ tử vong vì vôi hóa động mạch và các

bệnh tim mạch lên đến 50%, mà không gây ra tác dụng phụ nào [57].
MK7 làm tăng lượng Collagen ở lớp thượng bì trên da. Đồng thời, giúp
giảm lượng Canxi tích tụ trên da, nhờ đó, giúp da khỏe mạnh và giảm nếp
nhăn [57].
Các sản phẩm có chứa MK-7:
Natto: là nguồn thực phẩm từ đậu nành lên men có nguồn gốc từ Nhật Bản
[44].
10

Một số loại thực phẩm lên cũng có chứa MK-7 như phô mai, sữa đông
[9].
Một số loại thực phẩm chức năng có chứa MK-7 như: MenaQ7, Vững cốt,
Vipteen


Hình 1.5. Các sản phẩm có chứa MK-7
1.5. Lên men tạo MK-7 từ Bacillus subtilis natto
1.5.1. Nuôi cấy vi sinh vật sản xuất MK – 7
Phương pháp lên men bề mặt:
Vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường dinh dưỡng ở thể rắn đã được
làm ẩm và vô trùng. Môi trường này thường gồm các nguyên liệu tự nhiên
như cám gạo, khô cám, cám mỳ, ngô (chiếm 90 - 95%) có bổ sung trấu nhỏ
hoặc mùn cưa (khoảng 5 - 10%) để làm xốp canh trường khiến oxy dễ thâm
nhập. Các nguyên liệu trên cung cấp các chất dinh dưỡng như: nitơ, carbon,
vitamin, muối khoáng cho VSV phát triển. Môi trường được làm ẩm (50 -
60%) và tiệt khuẩn (1atm, 120
o
C) sau đó hạ nhiệt độ xuống 30 – 40
o
C để

gieo vi sinh vật [10], [2].
Phương pháp lên men chìm:
Người ta cho vi sinh vật phát triển trong môi trường dinh dưỡng lỏng, có
sục khí liên tục. Thành phần dinh dưỡng gồm: nguồn carbon (các loại đường
dễ đồng hóa: glucose, maltose, hoặc tinh bột đã thủy phân sơ bộ…); nguồn
11

nitơ (nitơ vô cơ: amoni sulfat, ure…; nitơ hữu cơ: cao ngô, pepton, cao
thịt,…); muối khoáng và vitamin (biotin, K
2
HPO
4
, MgSO
4
…). Môi trường
dinh dưỡng được tiệt khuẩn trực tiếp trong thiết bị lên men bằng hơi nước
nóng (118 – 125
o
C/45 – 60 phút).
Hạ nhiệt độ và bổ sung VSV, nuôi 2 – 4 ngày. Nuôi cấy chìm thường tạo
nhiều bọt, nên có thể sử dụng một số chất phá bọt như tween 20, acid oleic
[10], [2].
So với lên men bề mặt, phương pháp lên men chìm có ưu điểm: tính liên
tục, dễ cơ giới hóa, tự động hóa, cho năng suất cao, enzym thu được ít lẫn tạp.
Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là: nồng độ enzym thấp, tốn
nhiều điện năng. Với những ưu nhược điểm trên, ngày nay phương pháp lên
men chìm được sử dụng cho việc sản xuất hầu hết các enzym trong công
nghiệp [10].
1.5.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp, chiết tách các chất
từ dịch lên men của Bacillus subtilis natto

a) Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp các chất của B. subtilis
natto
Vi sinh vật là những cơ thể sống, ngoài những nhu cầu về dinh dưỡng
còn chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nhiệt độ, PH, thời gian lên men
Các yếu tố này có thể kích thích vi sinh vật phát triển tạo nhiều sản phẩm
nhưng cũng có thể ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật.
Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ môi trường và vi sinh vật có quan hệ mật thiết với nhau. Nhiệt
độ ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng, phát triển và khả năng sinh tổng hợp
các chất của vi sinh vật. Mỗi vi sinh vật có khoảng nhiệt độ tối thiểu, tối thích,
tối đa mà chúng có thể chịu đựng. Khi nhiệt độ lên quá cao vi sinh vật sẽ bị
12

chết hoặc nhiệt độ xuống quá thấp màng sinh chất bị đông kết lại như vậy đều
ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp các chất của vi sinh vật [2], [7].
Theo Aydin Berenjian và cộng sự khi lên men trong máy lắc nhiệt độ tối
ưu để tạo MK-7 là 37
o
C [13].
Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng
Dinh dưỡng là yếu tố quan trọng có ảnh hưởng tới sự phát triển và tổng
hợp các chất của vi sinh vật [2]. Với cùng một giống vi sinh vật nhưng nếu
nuôi cấy trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau thì sẽ có thu được các
sản phẩm cũng như nồng độ các sản phẩm khác nhau. Tùy vào sản phẩm
muốn thu nhận sẽ có các môi trường dinh dưỡng phù hợp.
Theo nghiên cứu của Aydin Berenjian và cộng sự thì môi trường có
peptone đậu tương, glycerol, cao nấm men, K
2
HPO
4

là môi trường tốt nhất để
tổng hợp MK-7 [13].
Ảnh hưởng của thời gian lên men
Thời gian lên men thích hợp của mỗi loại vi sinh vật được xác định là
khoảng thời gian tạo sản phẩm nhiều nhất có thể. Thời gian đó phụ thuộc và
từng loại vi sinh vật.
Quá trình sinh trưởng của vi sinh vật trải qua bốn pha là pha tiềm phát,
pha lũy thừa, pha cân bằng, pha suy vong. Độ dài pha tiềm phát phụ thuộc
vào ba yếu tố chính là tuổi của giống, lượng giống và thành phần môi trường
[2]. Theo một số nghiên cứu thời gian lên men tạo MK-7 thích hợp là 6 ngày
[41], [45], [13].
b) Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết tách MK-7
Loại dung môi
Dung môi chiết có ảnh hưởng đến độ tinh khiết cũng như nồng độ sản
phẩm. Nếu dung môi không thích hợp thì sẽ không thu được sản phẩm hoặc
sản phẩm thu được không tối đa, có nhiều tạp.
13

Dung môi thường dùng để chiết MK-7 là n-hexan và 2-propanol [41], [45],
[13].
Độ tinh khiết của dung môi
Độ tinh khiết của dung môi dùng chiết ảnh hưởng đến độ tinh khiết của
sản phẩm muốn tách. Nếu dung môi có lẫn nhiều tạp thì sản phẩm thu được
cũng không tinh khiết như vậy sẽ khó tinh chế.
Tỉ lệ dung môi chiết
Tỉ lệ dung môi chiết có ảnh hưởng đến lượng chất thu được. Tỉ lệ các dung
môi thích hợp sẽ thu được nhiều sản phẩm nhất.
Tỉ lệ dung môi chiết thu được lượng MK-7 lớn nhất khi sử dụng hệ dung
môi n-hexan:2-propanol (2:1, v/v), với tỉ lệ dịch lên men:dung môi chiết (1:4,
v/v) [41], [45], [13], [14].

1.6. Một số nghiên cứu về B. subtilis natto và MK-7
Các nghiên cứu về tổng hợp, chiết tách MK-7:
Ở trong nước: Chưa có một công trình nghiên cứu nào về quá trình tổng
hợp, tách chiết MK-7.
Ở ngoài nước:
Surya Rosa-Putra và cộng sự đã nghiên cứu sinh tổng hợp MK-7 từ
Sphingobacterium multivorum thông qua con đường methylerythritol
phosphate và tiến hành tinh chế MK-7 bằng TLC (CH
2
Cl
2
:n-hexan, 1:1, R
f
=
0,4) [32].
Các nghiên cứu về tác dụng của MK-7:
Năm 1999, Yamaguchi đã nghiên cứu MK-7 trong việc ngăn ngừa loãng
xương ở chuột, kết quả cho thấy MK-7 có tác dụng ngăn ngừa loãng xương
[50].
Năm 2004, Tsukamoto nghiên cứu tác động trong quá trình chuyển hóa
xương và vai trò ngăn ngừa loãng xương của MK-7. Kết quả cho thấy MK-7
14

tác động đến quá trình hình thành xương và đóng vao trò quan trọng trong
việc ngăn ngừa loãng xương [46].




15

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Vi sinh vật sử dụng
Bacillus subtilis natto - Chủng Nhật Bản được lưu giữ tại phòng Vi
sinh-kháng sinh bộ môn Công nghiệp Dược - Đại học Dược hà Nội.
2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất sử dụng
Nguyên liệu và hóa chất sử dụng được đưa ra trong Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Nguyên liệu và hóa chất
Nguyên liệu sử
dụng
Nguồn gốc

Hóa chất chiết, chạy
sắc kí
Nguồn gốc
Pepton
Ấn Độ
Isopropanol
Trung Quốc
Cao thịt
Ấn Độ
Methanol
Trung Quốc
NaCl
Trung Quốc
n - hexane
Trung Quốc
Thạch thường
Việt Nam

Dicloromethane
Trung Quốc
Vững cốt
Việt Nam
Tricloromethane
Trung Quốc
Nước cất
Việt Nam
Etylacetat
Trung Quốc

2.1.3. Môi trường
a) Công thức môi trường canh thang
Thành phần Lượng
Pepton 1,0g
Cao thịt 0,5g
NaCl 0,5g
Nước máy vđ 100ml
b) Công thức môi trường thạch thường
Thành phần Lượng
16

Pepton 1,0g
Cao thịt 0,5g
NaCl 0,5g
Thạch thường 2,3g
Nước cất vừa đủ 100ml.
2.1.4. Máy móc, thiết bị và dụng cụ
Danh sách các thiết bị sử dụng được đưa ra trong Bảng 2.2
Bảng 2.2. Thiết bị sử dụng

Tên
Nguồn gốc

Tên
Nguồn gốc
Tủ cấy vô trùng
Italia (UV
Bioair)
Máy li tâm
Đức
(Rotofix)
Nồi hấp tiệt trùng
Nhật (ALP)
Máy lắc
Đức
(Bioshaker)
Tủ sấy
Đức (Memmert)
Máy cất quay Buchi
Thụy sĩ
Tủ lạnh
Nhật (Toshiba)
Cân kỹ thuật
Đức
(Satorius)

Các dụng cụ sử dụng: bình định mức, bình nón, bình gạn, bình chạy sắc kí,
kẹp, ống ly tâm, cốc có mỏ, ống nghiệm, bản mỏng silicagel, mao quản
2.2. Nội dung nghiên cứu

2.2.1. Khảo sát sự có mặt của MK-7 trong môi trường nuôi cấy B. subtilis
natto.
Khảo sát sự có mặt của MK-7 bằng sắc ký lớp mỏng trong:
- Phần dịch lọc tách từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto.
- Phần sinh khối tách từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto.