Khảo sát ảnh hưởng của môi trường lên men chứa đậu tương tới khả năng sinh protease của bacillus subtilis natto

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI






LÊ THỊ HỒNG LIÊN


KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI
TRƯỜNG LÊN MEN CHỨA ĐẬU TƯƠNG
TỚI KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CỦA
Bacillus subtilis natto


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ





HÀ NỘI - 2015

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




LÊ THỊ HỒNG LIÊN



KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI
TRƯỜNG LÊN MEN CHỨA ĐẬU TƯƠNG
TỚI KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CỦA
Bacillus subtilis natto


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


Người hướng dẫn:
Ts. Đàm Thanh Xuân
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp Dược





HÀ NỘI - 2015

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến
cô giáo TS. Đàm Thanh Xuân - Giảng viên Bộ môn Công nghiệp Dược, người thầy
đã luôn quan tâm, trực tiếp tận tình hướng dẫn tôi thực hiện khóa luận này.
Đồng thời, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới Ths. Kiều Thị Hồng, Ths.
Nguyễn Khắc Tiệp, DS. Lê Ngọc Khánh đã cho tôi nhiều ý kiến đóng góp quý báu
và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên trong Bộ
môn Công nghiệp Dược đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi thực hiện khóa luận.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo
trường Đại học Dược Hà Nội đã dìu dắt, dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
tôi trong thời gian học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và tất cả những người thân, bạn bè đã động
viên, khích lệ, ủng hộ nhiệt thành và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên
cứu vừa qua.

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Lê Thị Hồng Liên

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis natto 2
1.1.1. Phân loại khoa học 2
1.1.2. Nguồn gốc 2
1.1.3. Đặc điểm hình thái 2
1.1.4. Đặc điểm sinh dưỡng 3
1.1.5. Đặc điểm sinh lý 3
1.1.6. Sản phẩm trao đổi chất của Bacillus subtilis natto 3
1.2. Natto và Nattokinase 4
1.2.1. Natto 4
1.2.2. Nattokinase 5
1.2.3. Đậu nành 8
1.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự tổng hợp protease của Bacillus subtilis natto
9
1.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ 9
1.3.2. Ảnh hưởng của pH môi trường 10
1.3.3. Độ thông khí 10
1.3.4. Ảnh hưởng của thành phần môi trường 10
1.3.5. Ảnh hưởng của thời gian lên men 10

1.3.6. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng
sinh enzym protease của B. subtilis natto 11
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
2.1. Nguyên liệu và thiết bị sử dụng 13
2.1.1. Vi sinh vật sử dụng 13
2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng 13
2.1.3. Môi trường 14
2.1.4. Máy móc và dụng cụ 14
2.2. Nội dung nghiên cứu 15
2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung nguồn dinh dưỡng chứa đậu tương
tới khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto 15
2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung kết hợp đậu tương và casein
tới khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto 15
2.3. Phương pháp nghiên cứu 16
2.3.1. Phương pháp giữ giống và nuôi cấy Bacillus subtilis natto 16
2.3.2. Phương pháp làm sữa đậu nành 16
2.3.3. Phương pháp làm đậu natto 16
2.3.4. Phương pháp thử hoạt tính các nhóm enzym 17
2.3.5. Một số công thức sử dụng trong kết quả thực nghiệm: 18
Chương 3: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ 19
3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn hydratcacbon chứa đậu tương tới khả
năng sinh protease của Bacillus subtilis natto 19
3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung sữa đậu nành và bột đậu tới khả
năng sinh enzym ngoại bào của Bacillus subtilis natto 19


3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men Bacillus subtilis natto trong môi
trường canh thang có bổ sung sữa đậu nành và bột đậu nành đến khả năng sinh
protease của Bacillus subtilis natto 23
3.2. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường tổng hợp chứa đậu tương và casein

đến khả năng sinh enzym protease của Bacillus subtilis natto 27
3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ casein đến khả năng sinh enzym protease của
Bacillus subtilis natto 27
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung kết hợp casein và bột đậu
nành lên khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto 30
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC














DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN
Acid deoxyribo nucleic
Atm
Đơn vị đo áp suất atmosphe
B. subtilis natto
Bacillus subtilis natto

CMC
Carboxy methyl cellulose
CU
Caseinolytic units
Da, kDa
Dalton, kilo Dalton
FU
Fibrinolytic units (Đơn vị đánh giá khả
năng phân giải fibrin của chất nghiên cứu
NCBI
National center for Biotechnology
Information (Trung tâm quốc gia về thông
tin công nghệ sinh học)
pI
Điểm đẳng điện của protein
TLPT
Trọng lượng phân tử
t – PA
Tissue plasminogen activator (các tác nhân
hoạt hóa plasminogen ở mô)
VSV
Vi sinh vật

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT
Tên bảng
Trang
1.1
Thành phần chính trong 100g Natto
5
1.2
Thành phần hóa học trong đậu nành
9
2.1
Nguyên liệu và hóa chất sử dụng
13
2.2
Thiết bị được sử dụng
15
3.1
Đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch lên men các môi
trường canh thang bổ sung sữa đậu nành, bột đậu và của dịch
chiết natto sau 24 giờ
20
3.2
Đường kính vòng phân giải casein 

casein
) của dịch lên men khi
nuôi cấy B. subtilis natto sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ trong các

môi trường bổ sung sữa đậu nành, bột đậu và của dịch chiết natto

24
3.3
Đường kính vòng phân giải casein (

casein
) của dịch lên men khi
nuôi cấy B. subtilis natto sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ trong các
môi trường canh thang có bổ sung casein
28
3.4
Đường kính vòng phân giải casein (

casein
) của dịch lên men khi
nuôi cấy B. subtilis natto sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ trong môi
trường canh thang có bổ sung casein 2% và bột đậu nành
31










DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

STT
Tên hình
Trang
1.1
Hình thái vi khuẩn của Bacillus subtilis natto
3
1.2
Sản phẩm natto
4
1.3
Cấu trúc bậc 3 của nattokinase
6
1.4
Cơ chế tiêu fibrin của nattokinase
7
3.1
Biểu đồ thể hiện đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch lên
men các môi trường canh thang bổ sung sữa đậu nành, bột đậu
và dịch chiết natto sau 24 giờ
21
3.2
Biểu đồ thể hiện đường kính vòng phân giải casein của dịch lên
men sau các khoảng thời gian trong các môi trường bổ sung sữa
đậu nành, bột đậu và dịch chiết natto

25
3.3
Biểu đồ thể hiện đường kính vòng phân giải casein của dịch lên
men sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ trong các môi trường canh thang

bổ sung casein
28
3.4
Biểu đồ thể hiện đường kính vòng phân giải casein của dịch lên
men sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ trong các môi trường bổ sung
casein 2% và bột đậu nành
32
1


ĐẶT VẤN ĐỀ
Các bệnh liên quan đến tim mạch là nguyên nhân lớn nhất gây tử vong trên
toàn thế giới. Trong năm 2012, khoảng 17,5 triệu người chết vì bệnh tim mạch, chiếm
31% tỉ lệ người tử vong trên toàn cầu [47]. Ở Mỹ, mỗi năm có khoảng 900.000 người
mắc bệnh huyết khối tĩnh mạch, trong đó khoảng 300.000 ca tử vong [26]. Tại thành
phố Hồ Chí Minh, theo thống kê, mỗi năm có khoảng 17.500 nguời bị đột quỵ do tai
biến mạch máu não, trong đó 9.000 người tử vong. Việc ngăn ngừa sự hình thành
huyết khối có vai trò quan trọng để phòng ngừa và điệu trị các bệnh này [16]. Trước
đây, để điều trị bệnh huyết khối người ta sử dụng các chất chống đông như heparin
và coumarin. Bước sang đầu thế kỷ 20, người ta đã phát hiện ra các enzym có khả
năng tiêu fibrin, các enzym hiện nay đang được dùng như streptokinase, urokinase
tuy nhiên các enzym này được dùng chủ yếu trong cấp cứu tai biến và có nhiều tác
dụng phụ [45].
Nattokinase là một protease có khả năng tiêu fibrin mạnh, được phát hiện năm
1980 bởi giáo sư Hiroyuki Sumi có nguồn gốc từ Natto - một món ăn truyền thống từ
Nhật Bản được lên men bằng cách ủ đậu nành nấu chín với Bacillus subtilis natto.
Đặc biệt, nattokinase còn dùng được đường uống để phòng bệnh huyết khối [24],
[43]. Trong điều kiện lên men chìm, B. subtilis natto còn có khả năng sinh nhiều
enzym ngoại bào như protease, amylase, cellulase,…Việc thay đổi môi trường dinh
dưỡng có thể ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp enzym của vi khuẩn. Với khả năng

phát triển tốt trên đậu tương đã nấu chín và nguồn đậu tương dễ kiếm trong nước,
việc lựa chọn môi trường lên men B. subtilis natto chứa đậu tương có ý nghĩa trong
sản xuất protease quy mô công nghiệp. Do đó khóa luận “Khảo sát ảnh hưởng của
môi trường lên men chứa đậu tương tới khả năng sinh protease của Bacillus subtilis
natto” được thực hiện với hai mục tiêu:
1. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn hydratcarbon chứa đậu tương tới khả
năng sinh protease của Bacillus subtilis natto.
2. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung kết hợp đậu tương và
casein đến khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto
2


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis natto
Bacillus subtilis natto (còn được gọi là Bacillus subtilis subsp. natto; Bacillus
var. natto) là vi sinh vật thuộc chi Bacillus, loài Bacillus subtilis được giáo sư
Sawamura phân lập và định danh lần đầu tiên vào năm 1905 [38].
1.1.1. Phân loại khoa học
B. subtillis natto là một vi khuẩn nhân thật (Eurobacteria) thuộc: Giới:
Bacteria; Ngành: Firmicutes; Lớp: Bacilli; Bộ: Bacillales; Họ: Bacillaceae; Chi:
Bacillus; Loài: Bacillus subtilis. Phân loại dưới loài: Bacillus subtilis natto [19].
Khi mới được phát hiện, Bacillus subtilis natto được coi như là một loài vi
sinh vật mới. Từ kết quả phân tích ADN nhiễm sắc thể B. natto và B. subtilis của Seki
năm 1975 và Tamang năm 2002 [36], [39], các khóa phân loại đã xếp B. subtilis natto
là một dòng thuộc loài B. subtilis nhưng phân biệt với các dòng khác là có khả năng
lên men tạo sản phẩm Natto [23].
Trong dòng B. subtilis natto còn có nhiều loại như B. subtilis natto B – 12
[41]; B. subtilis natto N – 77 [36]; B. subtilis natto B – OK2 [18]…
1.1.2. Nguồn gốc
B. subtilis natto được giáo sư Sawamura phân lập từ Natto – món ăn truyền

thống của người Nhật. Vi khuẩn có nhiều trong rơm rạ, cỏ khô, phát triển rất tốt trên
đậu tương đã nấu chín, chúng cũng phát triển trên các loại ngũ cốc, các nguồn thực
phẩm có nguồn gốc động vật như cá, thịt, tôm, cua,… [23], [37].
1.1.3. Đặc điểm hình thái
B. subtilis natto là trực khuẩn Gram (+), hình que. Nội bào tử hình que có kích
thước dưới 1. Các tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hay nối với nhau tạo thành chuỗi.
Khuẩn lạc khô, không màu, có kích thước lớn và hình dạng bất định. Bề mặt
hơi nhăn tạo thành lớp mịn, lan rộng trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào
môi trường thạch [37].
3



Hình 1.1. Hình thái vi khuẩn của Bacillus subtilis natto [44]
1.1.4. Đặc điểm sinh dưỡng
B. subtilis natto là vi sinh vật dị dưỡng, có khả năng sử dụng nhiều nguồn
hydratcacbon: đường đơn như glucose, fructose,…; đường đôi như maltose, lactose,
saccharose,…; polysaccharid như tinh bột, Nguồn nitơ cần tiết cho sự phát triển của
vi khuẩn là amino acid và protein. VSV có thể sử dụng dễ dàng acid glutamic,
arginin,… nhưng không sử dụng được threonin, methionin, tryptophan, phenylalanin.
VSV cũng cần có biotin để phát triển, trong môi trường không có biotin các tế bào
dinh dưỡng không thể phát triển, bào tử cũng không nảy mầm được [37].
1.1.5. Đặc điểm sinh lý
B. subtilis natto là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, có thể phát triển ở nồng độ oxy
lớn hơn 3%. Vi khuẩn phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng (30 – 50
0
C); pH trung
tính hoặc hơi kiềm, khoảng pH tối ưu cho sự sinh trưởng là 7,2 – 7,6. Nhiệt độ tối ưu
là 37
0

C, nhiệt độ tối ưu cho sự nảy mầm của bào tử là 40
0
C, bào tử vẫn có thể nảy
mầm sau khi bảo quản ở 0
0
C. Sự phát triển của vi khuẩn bị ức chế ở 55
0
C và pH 
4,5 [37].
1.1.6. Sản phẩm trao đổi chất của Bacillus subtilis natto
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, B. subtilis natto có khả năng sinh
nhiều nhóm enzym ngoại bào khác nhau như: nhóm enzym -transpeptidase, phytase,
amylase, cellulase và nhóm enzym được nghiên cứu nhiều nhất là protease [20], [22].
Đặc điểm của một số protease ngoại bào của B. subtilis natto như sau :
 Nattokinase: là một enzym thuộc họ subtilisin; tên khác subtilisin NAT hay
subtilisin BSP. Kí hiệu: EC 3.4.21.62. Cấu tạo gồm một chuỗi polypeptid đơn
Bào tử
Tế bào vi khuẩn
4


có 275 gốc acid amin và không có cầu nối disulfua trong phân tử. TLPT:
27.728Da [30], [32], [41]. Nattokinase là protease ngoại bào có ý nghĩa nhất
và đang được nghiên cứu, ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y dược học.
 Elastase: theo nghiên cứu của Sumi, elestase có TLPT: 20kDa, pI = 8,7 [25].
Elastase mới do Muramatsu nghiên cứu có TLPT: 29,8kDa; ổn định hoạt tính
trong khoảng pH từ 8 – 9; nhiệt độ 50
0
C; bị bất hoạt bởi diisopropyl
fluorophosphat, phenyl methyl sulphonyl fluorid và ion kim loại [33].

 Bacillopeptidase F: có TLPT khoảng 34kDa. Trung tâm hoạt động là bộ ba
xúc tác: Ser, His, Asp [40].
 Protease serin: có TLPT khoảng 90 kDa; trung tâm hoạt động là bộ ba xúc
tác: Asp33, His81, Ser259 [23].
1.2. Natto và Nattokinase
1.2.1. Natto
Natto là một món ăn truyền thống của Nhật Bản đã có từ cách đây hơn 1000
năm, là những hạt đậu nành đã luộc chín và được lên men với vi khuẩn B. subtilis
natto ở nhiệt độ khoảng 40
0
C – 43
0
C trong vòng 24 – 32 giờ thành những hạt màu
nâu, độ nhớt cao và có mùi nồng. Natto truyền thống được làm bằng cách ủ hạt đậu
đã luộc chín trong các bó rơm hoặc phủ rơm lên, do trong rơm rạ có B. subtilis natto.
Natto là một thức ăn, một sản phẩm lên men chứa nhiều chất bổ dưỡng cho sức khỏe,
trong đó có nattokinase được cho là có hiệu quả trong việc ngăn ngừa các bệnh về
tim mạch [24], [30].


Hình 1.2. Sản phẩm natto [30].
5


Bảng 1.1. Thành phần chính trong 100g Natto [27]:

Thành phần
Hàm lượng
Caloride
200Kcal

Protein
16,5g
Lipid
10,0g
Đường
9,8g
Nattokinase
7100CU
Vitamin B1
0,07mg
Vitamin B2
0,56mg
Vitamin B3
1,1mg
Vitamin K2
870µg
Calci
90mg

Từ hơn 1000 năm trước, Natto đã trở thành món ăn không thể thiếu của người
Nhật do nó chứa nhiều chất bổ dưỡng cho sức khỏe, có lợi cho tiêu hóa, tim mạch và
là một trong những món ăn làm tăng tuổi thọ của người Nhật. Vì thế, nhiều nghiên
cứu về Natto đã được tiến hành. Năm 1905, tiến sĩ Shin Sawamura (đại học Tokyo)
đã phân lập được hai loại vi khuẩn từ Natto bao gồm Bacillus subtilis natto có vai trò
lên men hạt đậu, gây ra mùi hương đặc biệt và vi khuẩn Bacillus mesentericus
vulgaris tạo chất nhớt đặc trưng và vị ngọt. Năm 1913, ông công bố kết quả của mình
qua nhiều mẫu nghiên cứu và kết luận vi khuẩn chủ yếu có trong Natto là Bacillus
subtilis natto; đồng thời mô tả chi tiết đặc điểm vi khuẩn, enzym và nhu cầu dinh
dưỡng [38]. Tại Hội nghị quốc tế về dinh dưỡng tổ chức tại New Zealand (30/04 –
03/05/2006), giáo sư Masafumi Kitakaze khẳng định tác dụng làm giảm rõ rệt chứng

mỡ máu cao và kêu gọi cộng đồng thế giới cải thiện nếp sống sinh hoạt và tiêu thụ
Natto [45].
1.2.2. Nattokinase
a) Nguồn gốc
6


Nattokinase (kí hiệu là EC 3.4.21.62) là một enzym có hoạt tính tiêu fibrin rất
mạnh có nguồn gốc từ Natto – món ăn truyền thống của Nhật Bản [30].
Trong đó: 3 (Loại): Hydroxylase
4 (Nhóm): Protease
21 (Dưới nhóm): Protease serin
62 (Enzym): Subtilisin
Tên ADN: arpN, định danh phân loại: 86.029 [NCBI] [30].
b) Đặc điểm cấu tạo
Nattokinase có cấu trúc là một chuỗi polypeptid gồm 275 gốc acid amin và
không có cầu nối disulfua trong phân tử. Nattokinase có trung tâm hoạt động bao gồm
nhóm hydroxyl của Ser – 221, imidazol của His – 64 và nhóm carboxyl của Asp – 32
[7].

Hình 1.3. Cấu trúc bậc 3 của nattokinase [30].
c) Tính chất
Nattokinase có điểm đẳng điện pI = 8,6 ± 0,3; ổn định trong khoảng pH từ 6 –
10, nhiệt độ < 50
0
C; bị bất hoạt khi pH < 5, nhiệt độ ≥ 70
0
C và các ion Fe
3+
, Al

3+
;
hoạt tính của enzym được tăng lên một phần khi có mặt HgCl
2
, H
2
O
2
và bị ức chế
hoàn toàn bởi phenylmethylsulphonyl fluorides (PMSF); trung tâm hoạt động là bộ
ba xúc tác: Ser, His và Asp. Cơ chất đặc hiệu: Suc – Ala – Ala – Pro – Phe – pNA
[30], [40].
d) Cơ chế tiêu fibrin
7


Nattokinase tiêu fibrin trực tiếp hay gián tiếp thông qua ba con đường khác
nhau.

Hình 1.4. Cơ chế tiêu fibrin của nattokinase [31].
- Nattokinase trực tiếp giáng hóa fibrin trong cục máu đông, làm biến đổi fibrin
từ dạng polymer không tan thành các sản phẩm giáng hóa có trọng lượng phân tử
thấp, hòa tan. Như vậy, nattokinase có cơ chế tiêu fibrin giống với plasmin.
- Nattokinase giáng hóa fibrin gián tiếp bằng cách hoạt hóa Pro - urokinase
thành urokinase, dẫn đến thúc đẩy quá trình biến đổi plasminogen thành plasmin, làm
tăng plasminogen nội sinh là enzym phân giải fibrin tự nhiên trong cơ thể.
- Nattokinase giáng hóa fibrin gián tiếp bằng cách hoạt hóa quá trình tổng hợp
t -PA trong huyết tương. Kết quả là tăng cường tạo thành plasmin.
Đặc biệt, nattokinase không ảnh hưởng tới sự hình thành fibrin từ fibrinogen,
do đó không làm suy giảm cơ chế đông máu bình thường của cơ thể. Vì vậy,

nattokinase không gây ra biến chứng chảy máu như các thuốc chống đông thông
thường khác [31].
e) Công dụng
Đã có rất nhiều nghiên cứu về hiệu quả của nattokinase trong điều trị huyết
khối, tim mạch như nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng của Fujita năm 1995 [32],
Haritha M. năm 2011 [30]. Năm 2008, Kim J. đã chỉ ra nattokinase có vai trò trong
việc phòng ngừa và điều trị tăng huyết áp [28]. Enzym này cũng được dùng để giảm
8


đau, đau xơ cơ, hội chứng mệt mỏi mạn tính, viêm màng dạ con, u xơ tử cung, co thắt
cơ, vô sinh, ung thư và bệnh beriberi [46].
Ở nước ta cũng có một số nghiên cứu về tác dụng của nattokinase trên lâm
sàng: nghiên cứu của bác sĩ Nguyễn Chí Tuệ năm 2008 ở bệnh viện Quân Y 103 đã
công bố kết quả nghiên cứu tác dụng của chế phẩm Nattospes (Nattokinase) trên 73
bệnh nhân đột quỵ não, hầu hết bệnh nhân có hiệu quả về lâm sàng, có xu hướng giảm
đông máu, không có trường hợp nào bị tai biến chảy máu [15]; nghiên cứu của GS.TS
Nguyễn Văn Thông (2008) tại Bệnh viện 108 cũng cho thấy Nattospes có hiệu quả
tương đương Aspirin (thuốc đầu tay trong điều trị đột quỵ não) [13]; năm 2009,
Nguyễn Bá Anh với nghiên cứu hỗ trợ điều trị phục hồi chức năng vận động của bệnh
nhân nhồi máu não sau giai đoạn cấp ở Bệnh viện Bạch Mai cũng cho thấy trên lâm
sàng và trong dự phòng tái phát Nattospes và Aspirin có tác dụng tương đương,
enzym còn rất ít tác dụng phụ so với Aspirin khi dùng trong thời gian dài [1].
Hiện nay, trên thị trường đang lưu hành một số thực phẩm chức năng chứa
nattokinase dưới dạng viên nang: Nattospes (300FU/g), S-Nattokinase (5.000FU/g),
Nattokinase plus FUcoidan (2.000FU/g), Nattokinase plus (3.000FU/g), Japato
(600FU/g), Nattovena (4.000FU/g).
1.2.3. Đậu nành
Cây đậu nành có tên khoa học là Glycine max (L) Merrill, đậu nành có nhiều
màu sắc khác nhau. Trong đó đậu nành có màu vàng là loại tốt nhất nên được trồng

và sử dụng nhiều [4].
 Hạt đậu nành
Hạt đậu nành có ba bộ phận: vỏ hạt, phôi và tử diệp. Hàm lượng dinh dưỡng
của đậu nành thay đổi phụ thuộc vào giống và điều kiện trồng trọt nhưng nhìn chung
chứa từ 35 – 40% protein, 15 – 25% chất béo, 15 – 30% cacbonhydrat; các muối
khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các vitamin A, B1, B2, D, E, F; các enzym, sáp,
nhựa, cellulose và khoảng 5% tro [4].
Trong thành phần hóa học của đậu nành, thành phần protein chiếm một lượng
rất lớn. Thành phần acid amin trong protein của đậu nành ngoài hai thành phần
9


methionin và tryptophan ra còn có các acid amin khác, số lượng khá cao tương đương
acid amin có trong thịt. Trong protein đậu nành glubolin chiếm 85 – 95%. Ngoài ra
còn có một lượng nhỏ albumin, một lượng không đáng kể prolamin và glutelin.
Hydratcacbon chiếm khoảng 34% hạt đậu nành. Phần hydratcacbon có thể chia
làm hai loại, loại tan trong nước và loại không tan trong nước, loại tan trong nước chỉ
chiếm khoảng 10% toàn bộ hydratcacbon.
Thành phần khoáng chiếm khoảng 5% trọng lượng khô hạt đậu nành. Trong
đó đáng chú ý nhất là calci, phospho, mangan, kẽm và sắt [8].
Bảng 1.2. Thành phần hóa học trong đậu nành [8]:

Thành phần
Tỷ lệ
Protein
Dầu
Tro
Hydratcacbon
Hạt đậu nành nguyên
100

40,0
21,0
4,9
34,0
Tử diệp
90,3
43,0
23,0
5,0
29,0
Vỏ hạt
8,0
8,8
1,0
4,3
86,0
Phôi
2,4
41,1
11,0
4,4
43,0

 Công dụng của đậu nành:
Đậu nành chứa nhiều protein, 8 loại acid amin thiết yếu, là nguồn cung cấp
chất xơ, sắt và vitamin nhóm B. Các hợp chất isoflavon và hóa thảo (phytochemicals)
khác trong đậu nành như protease inhibitors, phytates, phytosterol, lecithin, acid
Omega-3,…có khả năng phòng ngừa và trị liệu một số bệnh như: đau tim, tai biến
mạch máu não, ung thư vú, ung thư kết tràng…(theo Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ,
Viện Đại học Havard, Viện Đại học Alabama. Minnesota, Iowa và Helsinki, Phần

Lan).
1.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự tổng hợp protease của Bacillus subtilis natto
1.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzym của vi
sinh vật cũng như tính chất của enzym được tổng hợp. Mỗi loại vi sinh vật có nhiệt
độ thích hợp khác nhau. Tuy nhiên đa số các vi sinh vật tổng hợp enzym không bền
với nhiệt độ và bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp. Khi
10


nhiệt độ quá cao thì vi sinh vật sẽ chết, enzym bị biến tính, màng tế bào bị tổn thương
tới mức khó phục hồi. Tại điều kiện nhiệt độ rất thấp màng sinh chất bị đông kết lại,
enzym cũng ngừng hoạt động [10], [45].
1.3.2. Ảnh hưởng của pH môi trường
pH môi trường biến đổi khá rõ rệt trong quá trình nuôi cấy và gây ảnh hưởng
lớn đến sự tổng hợp enzym. Do đó người ta điều chỉnh pH để thu được enzym với
hiệu suất cao nhất. Việc lựa chọn pH của môi trường thu enzym phụ thuộc vào chủng
vi sinh vật và loại enzym [6].
1.3.3. Độ thông khí
Độ thông khí trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh tổng hợp
protease. Tuy nhiên, ảnh hưởng này có khác nhau tùy theo giống vi sinh vật. Ở vi
khuẩn hiếu khí, tăng tốc độ thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng, tăng khả năng
tích lũy các sản phẩm trao đổi chất trong tế bào như các enzym, acid amin, kháng
sinh. Tuy nhiên, nếu độ thông khí quá mức thích hợp thì sự tích lũy của vi sinh vật sẽ
giảm [6].
1.3.4. Ảnh hưởng của thành phần môi trường
Thành phần môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp
enzym. Nếu môi trường có những chất khó đồng hóa thì vi sinh vật sẽ tiết ra những
enzym tương ứng để phân hủy chúng thành những chất đồng hóa được. Vì vậy, khi
cho chất cảm ứng vào môi trường dinh dưỡng thì khả năng tổng hợp enzym của vi

sinh vật tăng lên nhiều lần so với bình thường. Trong công nghiệp sản xuất enzym
cần lựa chọn chất cảm ứng thích hợp và xác định nồng độ tối ưu của nó trong môi
trường để có hiệu suất sinh tổng hợp cao nhất [10], [17].
1.3.5. Ảnh hưởng của thời gian lên men
Thời gian nuôi cấy thích hợp của mỗi loại vi sinh vật được xác định bằng thời
gian cho phép tích tụ enzym tối đa. Thời gian đó phụ thuộc chủ yếu vào chủng vi sinh
vật. Enzym vi sinh vật thường được sinh vào pha log (pha lũy thừa). Protease ngoại
bào của loài B. subtilis được tăng cường sản xuất và tiết ra bên ngoài tế bào vi khuẩn
vào cuối pha lũy thừa cùng với thời điểm bắt đầu hình thành bào tử [10].
11


1.3.6. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng
sinh enzym protease của B. subtilis natto
a) Nghiên cứu trên thế giới
Năm 2005, Junguo Liu và cộng sự đã nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện dinh
dưỡng cho sinh tổng hợp nattokinase sử dụng chủng Bacillus subtilis natto NLSSE.
Nghiên cứu đã tiến hành khảo sát các nguồn nitrogen: (NH
4
)
2
SO
4
, NaNO
3
, natri
glutamate, casein, pepton đậu nành; khảo sát các nguồn hydratcacbon: glucose,
saccharose, maltose, xylose và glycerol với hàm lượng 20g/l; tối ưu hóa 6 nhân tố
dinh dưỡng: nguồn C, N, MgSO
4

.7H
2
O, KH
2
PO
4
.3H
2
O, cao nấm men và CaCl
2
. Kết
quả nguồn carbon tốt nhất là maltose 2%, nguồn nitơ tốt nhất là pepton đậu nành,
hoạt tính Nattokinase đạt 1.300U/ml với thành phần môi trường tối ưu (g/l): pepton
đậu nành: 8,28, CaCl
2
: 0,64 và cao nấm men: 0,74 [29].
Deepak và cộng sự (2008) nghiên cứu tối ưu hóa môi trường cho sinh tổng
hợp nattokinase từ chủng Bacillus subtilis. Các nhân tố được chọn để khảo sát:
glucose, pepton, MgSO
4
và CaCl
2
ở 5 mức độ. Hoạt tính nattokinase đạt 3.194 U/ml
với thành phần môi trường (%): glucose 1%, pepton 5,5%, MgSO
4
0,2% và CaCl
2

0,5% [21]. LiHui Rong (2011) xác định môi trường tối ưu cho sản xuất nattokinase
từ vi khuẩn Bacillus subtilis natto gồm: MgSO

4
0,02%, K
2
HPO
4
0,02%, KH
2
PO
4

0,01%, CaCl
2
0,05%, maltose 3%, pepton từ đậu nành 3% [35].
b) Nghiên cứu trong nước
Lê Thị Bích Phượng và cộng sự (2012) đã phân lập được hai chủng Bacillus
sp.7.2 và Bacillus sp. NP3 có khả năng sinh tổng hợp enzym nattokinase 470FU/g
trên môi trường thạch đậu nành hấp chín ở điều kiện nuôi cấy trên đĩa petri và trên
khay từ một số chủng Bacillus spp. lấy từ bộ sưu tập giống của Viện sinh học nhiêt
đới và phân lập từ thực phẩm natto [12].
Hin Vireak (2012) đã xác định được enzym do Bacillus subtilis natto sinh ra
là protease và amylase; enzym protease của vi khuẩn có khả năng tiêu fibrin; xác định
môi trường nuôi cấy vi sinh vật cho hoạt tính enzym tốt nhất là canh thang có bổ sung
0,05% casein; xác định thời gian thu enzym có hoạt tính tốt nhất là 28 giờ [17].
12


Nguyễn Ngọc Ánh (2013) đã phân lập được vi khuẩn Bacillus subtilis natto từ
sản phầm natto thương mại và đã xác định được vi khuẩn sinh ra 3 enzym ngoại bào
là protease, amylase, cellulase, trong đó protease có khả năng tiêu fibrin; đồng thời
xác định được môi trường tổng hợp giúp vi khuẩn sinh nhiều protease và sinh ít

amylase, cellulase là môi trường canh thang bổ sung 2% maltose, 0,5% casein, 0,05%
CaCl
2
[2].





















13


Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và thiết bị sử dụng

2.1.1. Vi sinh vật sử dụng
Bacillus subtilis natto – (chủng được phân lập từ chế phẩm natto Nhật Bản
trên thị trường được lưu giữ tại phòng Vi sinh – Bộ môn Công nghiệp Dược – Trường
Đại học Dược Hà Nội).
2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng
Nguyên liệu và hóa chất sử dụng được đưa ra trong Bảng 2.1
Bảng 2.1. Nguyên liệu và hóa chất sử dụng:
Tên
Nguồn gốc
Tên
Nguồn gốc
Pepton
Ấn Độ
Dung dịch Xanh methylen
Việt Nam
Cao thịt
Đức
KI, Iot, HCl, NaOH
Trung Quốc
NaCl
Trung Quốc
KH
2
PO4
Trung Quốc
Thạch bột
Trung Quốc
Đậu nành
Việt Nam
Casein

Trung Quốc
CMC
Trung Quốc
Tinh bột
Việt Nam



 Cách pha chế một số dung dịch hóa chất (theo Dược điển Việt Nam
IV):
Dung dịch đệm phosphat pH= 7,6:
+ Pha dung dịch kali dihydrophosphat 0,2M: Hòa tan 1,36g KH
2
PO
4
trong
nước vừa đủ 50,0ml.
+ Pha dung dịch natri hydroxyd 0,2M: Hòa tan 0,4g NaOH trong 30ml nước.
Thêm nước vừa đủ 50,0ml.
+ Trộn 50ml dung dịch kali dihydrophosphat 0,2M với 42,8ml dung dịch natri
hydroxyd 0,2M. Thêm nước vừa đủ 200,0ml.
14


Thuốc thử Lugol:
Hòa tan 2,0g KI trong nước. Tiếp tục hòa tan 1,0g Iod, thêm nước vừa đủ
100,0ml. Bảo quản trong lọ nút kín.
2.1.3. Môi trường
a) Công thức môi trường thạch thường (MT1)
Thành phần

Pepton
Cao thịt
NaCl
Thạch thường
Nước máy vđ
Lượng
1,0g
0,5g
0,5g
2,3g
100ml
b) Công thức môi trường canh thang (MT2)
Thành phần
Pepton
Cao thịt
NaCl
Nước máy vđ
Lượng
1,0g
0,5g
0,5g
100ml
c) Công thức môi trường canh thang sữa đậu (MT3)
Thành phần
Pepton
Cao thịt
NaCl
Sữa đậu nành tách bã
Lượng
1,0g

0,5g
0,5g
100ml

2.1.4. Máy móc và dụng cụ
Danh sách thiết bị sử dụng được đưa ra trong Bảng 2.2



15



Bảng 2.2. Thiết bị được sử dụng:
Tên
Nguồn gốc (Hãng)
Tên
Nguồn gốc (Hãng)
Tủ cấy vô trùng
Italia (UV Bioair)
Máy lắc
Đức (Bioshaker)
Tủ ấm, tủ sấy
Đức (Memmert)
Cân phân tích
Đức (Satorius)
Nồi hấp tiệt
trùng
Nhật (ALP)
Cân kỹ thuật

Đức (Satorius)
Lò vi sóng
Hàn Quốc (Daewoo)
Máy làm sữa
đậu
Hà Lan (Philips)
Tủ lạnh
Nhật (Toshiba)
Máy li tâm
Đức (Rotofix)
(Universal)

Các dụng cụ được sử dụng: Bình nón, bình định mức, cốc có mỏ, đĩa petri
nhựa (đường kính 8,8cm), ống nghiệm, pipetman, pipet tip, thước kẹp Palmer…
2.2. Nội dung nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu giải quyết 2 mục tiêu sau:
2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung nguồn dinh dưỡng chứa đậu tương
tới khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto
- Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung sữa đậu nành và bột đậu tới khả năng
sinh enzym ngoại bào của Bacillus subtilis natto.
- Khảo sát thời gian thu enzym protease khi nuôi cấy vi khuẩn trong các môi
trường canh thang có bổ sung sữa đậu nành và bột đậu.
2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung kết hợp đậu tương và casein
tới khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto
- Lựa chọn nồng độ casein thích hợp bổ sung vào môi trường canh thang, khảo
sát thời gian cho hoạt độ protease cao nhất.
- Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung kết hợp bột đậu và casein, khảo
sát thời gian cho hoạt độ protease khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường bổ sung.
16

2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp giữ giống và nuôi cấy Bacillus subtilis natto
a) Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng
Pha môi trường thạch thường (theo mục 2.1.3), đun cho đồng nhất. Chia đều
môi trường vào trong các ống nghiệm (5-6ml/ống), nút kín. Hấp tiệt khuẩn ở điều
kiện 1atm/20 phút. Sau khi tiệt khuẩn xong, đặt nghiêng các ống nghiệm và để nguội
cho thạch đông lại. Tiến hành cấy truyền từ ống giống gốc sang ống môi trường mới
theo hình ziczac. Đặt các ống đã cấy giống vào tủ ấm, ở 37
0
C/24 giờ. Bảo quản các
ống giống trong tủ lạnh 4-5
0
C. Việc cấy truyền được thực hiện 1-2 tháng/lần [11].
b) Phương pháp nhân giống trong bình nón
Pha 100ml môi trường canh thang (theo mục 2.1.3) cho vào bình nón 250ml,
nút kín. Hấp tiệt khuẩn môi trường ở điều kiện 1atm/20 phút. Sau khi tiệt khuẩn, để
môi trường nguội xuống dưới 40
0
C, dùng que cấy vô khuẩn cấy khuẩn lạc trong ống
giống vào môi trường. Nuôi trên máy lắc ở 37
0
C/24 giờ, tốc độ lắc 110 vòng/phút [5],
[11].
c) Phương pháp lên men
Pha 100ml môi trường nghiên cứu cho vào bình nón 250ml, nút kín. Hấp tiệt
khuẩn môi trường ở điều kiện 1atm/20 phút. Sau khi tiệt khuẩn, để môi trường nguội
xuống dưới 40
0
C, cấy giống từ môi trường nhân giống sang môi trường mới, với tỉ lệ

cấy truyền là 10%. Nuôi trên máy lắc ở 37
0
C trong thời gian thích hợp, tốc độ lắc 110
vòng/phút [5], [11].
2.3.2. Phương pháp làm sữa đậu nành
Rửa sạch 80g đậu tương hạt. Ngâm trong nước lạnh trong 12 giờ. Cho đậu
tương vào máy làm sữa đậu. Đong chính xác 1000ml nước cất vào máy. Khởi động
máy, bật máy đến khi đậu tương hoàn toàn mịn thì tắt máy. Giữ sữa đậu nành trong
ngăn mát tủ lạnh, sử dụng trong vòng 2 tuần.
2.3.3. Phương pháp làm đậu natto
Rửa sạch 20g đậu nành hạt. Ngâm trong nước lạnh 12 giờ. Cho đậu đã ngâm
vào đĩa petri, hấp tiệt trùng ở điều kiện 1atm/20 phút. Sau tiệt khuẩn, để nguội xuống