Khảo sát ảnh hưởng của tá dược lên khả năng sống sót của lactobacillus acidophilus trong pellet probiotic

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI







NGÔ XUÂN BÁCH

KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA TÁ
DƢỢC LÊN KHẢ NĂNG SỐNG SÓT
CỦA Lactobacillus acidophilus TRONG
PELLET PROBIOTIC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ



HÀ NỘI – 2015


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGÔ XUÂN BÁCH

KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA TÁ
DƢỢC LÊN KHẢ NĂNG SỐNG SÓT
CỦA Lactobacillus acidophilus TRONG
PELLET PROBIOTIC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Ngƣời hƣớng dẫn:
ThS. Nguyễn Khắc Tiệp
Nơi thực hiện:
BM Công nghiệp dược



HÀ NỘI – 2015


LỜI CẢM ƠN
Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành
đến thầy giáo,ThS Nguyễn Khắc Tiệp,người thầy đã tận tình hướng dẫn em trong
suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Đàm Thanh Xuân và DS. Lê
Ngọc Khánh, cùng các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghiệp Dược, những
người đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến quý báu và hỗ trợ tạo mọi điều kiện thuận lợi
giúp em hoàn thành khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị kỹ thuật

viên trong bộ môn Công nghiệp Dược.
Em cũng xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường và các thầy cô
giáo trong trường đã dạy dỗ và dìu dắt em trongnăm năm học tại trường.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ, khích lệ và hết
lòng giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn!!!
Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên


Ngô Xuân Bách












MỤC LỤC
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN 2
1.1. Đại cƣơng về probiotics 2

1.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotics trên thế giới và Việt Nam 3
1.3. Lactobacillus acidophilus 5
1.3.1. Đặc điểm hình thái, sinh lí, điều kiện nuôi cấy 5
1.3.2. Tác dụng của Lactobacillus acidophilus với sức khỏe 6
1.4. Kỹ thuật sản xuất pellet bằng phƣơng pháp đùn – tạo cầu 8
1.4.1. Định nghĩa pellet 8
1.4.2. Ƣu – nhƣợc điểm của pellet 8
1.4.3. Thành phần của pellet 9
1.4.4. Các phƣơng pháp bào chế pellet 10
CHƢƠNG II. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu 13
2.1.1. Nguyên vật liệu 13
2.1.2. Môi trƣờng sử dụng trong nghiên cứu 14
2.1.3. Thiết bị 14
2.2. Nội dung nghiên cứu 15
2.2.1. Khảo sát một số thông số trong quá trình tạo pellet probiotics
chứa Lactobacillus acidophilustừ nguyên liệu đông khô tự tạo. 15


2.2.2. Đánh giá ảnh hƣởng của một số giai đoạn trong quá trình tạo
pellet đến sự sống sót của vi sinh vật và theo dõi độ ổn định của pellet
probiotics 15
2.2.3. Khảo sát ảnh hƣởng của tỉ lệ dƣợc chất và tá dƣợc lactose đến số
lƣợng vi sinh vật trong pellet thu đƣợc. 15
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 15
2.3.1. Phƣơng pháp hoạt hóa giống 15
2.3.2. Phƣơng pháp nhân giống 15
2.3.3. Phƣơng pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 16
2.3.4. Phƣơng pháp đông khô 16
2.3.5. Phƣơng pháp bào chế pellet 16

2.3.6. Phƣơng pháp làm khô và bảo quản pellet 18
2.3.7. Phƣơng pháp xác định hàm ẩm pellet 18
2.3.8. Phƣơng pháp xác định số lƣợng vi sinh vật theo phƣơng pháp
pha loãng liên tục 19
2.3.9. Phƣơng pháp đánh giá sơ bộ một số chỉ tiêu chất lƣợng của pellet
19
CHƢƠNG III. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21
3.1. Khảo sát một số thông số trong quá trình tạo pellet probiotics chứa
Lactobacillus acidophilustừ nguyên liệu đông khô tự tạo. 21
3.1.1. Khảo sát lƣợng tá dƣợc dính HPMC E6 5% 22
3.1.2. Khảo sát thời gian ủ 24
3.1.3. Khảo sát thời gian làm khô bằng máy sấy tầng sôi 26
3.1.4. Đánh giá một số chỉ tiêu chất lƣợng của pellet 27
3.2. Đánh giá ảnh hƣởng của một số giai đoạn trong quá trình tạo pellet
đến sự sống sót của vi sinh vật và theo dõi độ ổn định của pellet probiotics . 28
3.2.1. Đánh giá ảnh hƣởng của một số giai đoạn trong quá trình tạo
pellet đến sự sống sót của vi sinh vật 29
3.2.2. Theo dõi độ ổn định của pellet probiotics trong quá trình bảo
quản 32


3.3. Khảo sát ảnh hƣởng của tỉ lệ dƣợc chất và tá dƣợc lactose đến số lƣợng
vi sinh vật trong pellet thu đƣợc. 35
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ATCC (American Type Culture Collection)
Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ
CT
Công thức
Cfu (Colony – Forming Units)
Số đơn vị khuẩn lạc
FAO (Food and Agriculture Organization)
Tổ chức Nông lƣơng thế giới

HPMC
Hydroxypropyl methyl cellulose
IDF (International Dairy Federation)
Liên đoàn bơ sữa thế giới
LAB (lactic acid bateria)
Nhóm vi khuẩn lactic
MT
Môi trƣờng
MRS (de Man, Rogosa, Sharpe)
Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn
SSG
Natri starch glycolat
VSV
Vi sinh vật
WHO (World Health Organization)
Tổ chức Y tế thế giới

DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Tên bảng
Trang
1.1
Một số tá dƣợc dùng trong công thức bào chế pellet
10
2.1
Các hóa chất dùng trong nghiên cứu
14
2.2
Các tá dƣợc sử dụng trong nghiên cứu
14
2.3
Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
15
2.4
Công thức bào chế pellet probiotics (mẻ 200g)
18
3.1
Công thức bào chế pellet probiotics (mẻ 200g)
21
3.2
Ảnh hƣởng của lƣợng dung dịch tá dƣợc dính tới quá trình
tạo pellet
22
3.3
Ảnh hƣởng của thời gian ủ tới thể chất pellet
24

3.4
Ảnh hƣởng của thời gian làm khô bằng máy sấy tầng sôi đến
hàm ẩm pellet
27
3.5
Số lƣợng vi sinh vật (cfu/g) và hàm ẩm trong quá trình tạo
pellet bằng phƣơng pháp đùn – tạo cầu
31
3.6
Số lƣợng vi sinh vật (cfu/g) và hàm ẩm của pellet trong thời
gian bảo quản
34
3.7
Số lƣợng vi sinh vật (cfu/g) và hàm ẩm của pellet đƣợc tạo
thành khi thay đổi tỉ lệ dƣợc chất và tá dƣợc lactose
36










DANH MỤC CÁC HÌNH
STT
Tên hình
Trang

1.1
Hình ảnh Lactobacillus acidophilus trên kính hiển vi điện tử
5
1.2
Sơ đồ các bƣớc sản xuất pellet bằng phƣơng pháp đùn – tạo cầu
11
2.1
Sơ đồ quy trình bào chế pellet
18
3.1
Sợi đùn trong quá trình đùn khi sử dụng 70ml dd HPMC E6 5%
23
3.2
Sợi đùn trong quá trình đùn khi sử dụng 75ml dd HPMC E6 5%
23
3.3
Biến thiên hàm lƣợng vi sinh vật (cfu/g) trong pellet và hàm ẩm
pellet trong quá trình tạo pellet
31
3.4
Đồ thị biến thiên hàm lƣợng vi sinh vật (cfu/g) và hàm ẩm pellet
trong thời gian bảo quản
34
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong vài năm gần đây các dạng thuốc probiotics đang rất đƣợc quan tâm
nghiên cứu và phát triển bởi nhiều lợi ích mà nó mang lại cho sức khỏe của con
ngƣời. Trong đó, Lactobacillus acidophilus là một trong những chủng vi sinh vật
probiotics phổ biến nhất hiện nay bởi nhiều lợi ích mà nó mang lại. L. acidophilus

xuất hiện từ rất sớm trong những thực phẩm truyền thống nhƣ sữa tƣơi, sữa chua,
cũng nhƣ các sản phẩm bổ sung dinh dƣỡng[23].
Ở nƣớc ta, việc phát triển các sản phẩm probiotics đang trong giai đoạn đầu.
Dạng bào chế probiotics thông dụng hiện nay là bột và cốm. Việc đảm bảo độ sống
sót của vi sinh vật và bảo vệ vi sinh vật khi sử dụng qua đƣờng uống là vấn đề lớn
còn mắc phải, do khi sử dụng theo đƣờng uống thuốc phải chịu tác động của các
yếu tố nhƣ: pH acid, enzym tiêu hóa, acid mật…[23] là các yếu tố làm suy giảm số
lƣợng sống sót của vi sinh vật đi rất nhiều. Trên thế giới, các nƣớc đã và đang tập
trung nghiên cứu phát triển nhiều loại chế phẩm probiotics dạng pellet, bởi dạng
pellet có nhiều ƣu điểm lớn nhƣ: rút ngắn thời gian lƣu thuốc ở dạ dày, ít bị rã ở dạ
dày; mặt khác do pellet hình cầu, bề mặt nhẵn thuận tiện cho quá trình bao màng
nhằm mục đích bảo vệ vi sinh vật, bao tan trong ruột…[2], [3].
Từ các lí do trên chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát ảnh hƣởng của tá
dƣợc lên khả năng sống sót của Lactobacillus acidophilustrong pellet probiotic”
nhằm 3 mục tiêu sau:
1. Khảo sát một số thông số trong quá trình tạo pellet probiotics chứa
Lactobacillus acidophilustừ nguyên liệu đông khô tự tạo.
2. Đánh giá ảnh hƣởng của một số giai đoạn trong quá trình tạo pellet đến sự
sống sót của vi sinh vật và theo dõi độ ổn định của pellet probiotics.
3. Khảo sát ảnh hƣởng của tỉ lệ dƣợc chất và tá dƣợc lactose đến số lƣợng vi sinh
vật trong pellet thu đƣợc.


2

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Đại cƣơng vềprobiotics
Thuật ngữ probiotics có nguồn gốc từ Hy Lạp, probiotics có thể hiểu theo
nghĩa là chất bổ sung dinh dƣỡng chứa những vi khuẩn hay nấm men có ích[28],
[36].

Năm 1908, trong cuốn sách “Kéo dài sự sống”của nhà khoa học Eli
Metchnikoff, khái niệm probiotics lần đầu tiên xuất hiện.Ông cho rằng những ngƣời
nông dân Bulgary sống lâu là vì họ thƣờng xuyên sử dụng sữa chua có chứa vi sinh
khuẩn lactic, các vi khuẩn này có lợi cho vi sinh vật đƣờng ruột[37].
Theo Parker (1974), Probiotics là những vi sinh vật nhƣ vi khuẩn hay nấm
men mà có thể thêm vào thực phẩm với mục đích điều chỉnh quần thể sinh vật
đƣờng ruột của sinh vật chủ. Van De Kerkove (1979), Barrows và Deam (1985),
Lestradet (1995) cùng cho rằng probiotics đƣợc sử dụng nhƣ một liệu pháp trong
việc chữa trị bệnh tiêu chảy hay nhƣ là cách phòng bệnh ở ngƣời và động vật để
giảm đến mức tổi thiểu sự phát tán của vi sinh vật đƣờng ruột, sự kháng lại liệu
pháp sinh học và sự di căn của chứng viêm dạ dày ruột. Đến năm 1989, theo Fuller
thì probiotics cũng đƣợc nhận thấy là có những ảnh hƣởng có lợi trên sức khỏe của
sinh vật chủ.Năm 1992, Havenaar đã mở rộng định nghĩa về probiotics: probiotics
đƣợc định nghĩa nhƣ là sự nuôi cấy riêng lẻ hay hỗn hợp các vi sinh vật sống mà có
ảnh hƣởng có lợi cho sinh vật chủ bằng cách cải thiện những đặc tính của vi sinh
vật bản địa[38].
Năm 2002, WHOvà FAO đã đƣa ra định nghĩa ngắn gọn và hoàn chỉnh nhất
về Probiotics ở thời điểm hiện tại nhƣ sau: “Probiotics là những vi sinh vật sống mà
khi đƣa vào cơ thể với một lƣợng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật
chủ”[36], [38]. Tuy nhiên, không phải tất cả những vi sinh vật sống nào cũng là
probiotics. Theo đánh giá của tổ chức FAO và WHO, tiêu chuẩn quan trọng nhất để
chọn chủng khuẩn probiotics sử dụng dƣới dạng thực phẩm là chủng khuẩn đó phải
có khả năng sống sót qua hệ tiêu hóa và phải có khả năng phát triển trong ruột. Do
trong quá trình sử dụng vi khuẩn probiotics phải đối mặt với nhiều điều kiện bất lợi
3

của đƣờng tiêu hóa nên để đem lại tác dụngbất cứ sản phẩm chứa probiotics nào
cũng phải chứa ít nhất 10
6
cfu/ml tế bào vi sinh vật sống cho đến ngày hết hạn sử

dụng [17], [33].
1.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotics trên thế giới và Việt Nam
Việc sử dụng thực phẩm có chứa các vi sinh vật có lợi cho cơ thể đã đƣợc
biết đến từ lâu, tuy nhiên việc nghiên cứu hệ vi sinh vật đƣờng ruột và sử dụng
probiotics mới thực sự phát triển từ những năm 80 của thế kỉ 20. Năm 1998,
Apajalahti và cộng sựđã thực hiện những nghiên cứu về đặc điểm phân loại và quần
thể vi sinh vật đƣờng ruột ở ngƣời và động vật[13].
Netherwood và cộng sự (1999) [31]; Gong và cộng sự (2002) [20]; Zhu và
cộng sự (2002)[40] đã sử dụng kỹ thuật gen để nghiên cứu sự thay đổi cấu trúc quần
thể và đặc điểm sinh học của hệ vi sinh vật đƣờng ruột ở động vật dƣới tác động của
probiotics.Tuy nhiên, cho đến nay những nhân tố nào góp phần tạo nên một hệ vi
sinh vật cân bằng hoặc làm rối loạn sự cân bằng của hệ vi sinh vật đƣờng ruột cũng
chƣa đƣợc hiểu biết đầy đủ.
Probiotics đem lại nhiều tác dụng có lợi cho cơ thể vật chủ, nhƣng hiểu biết
của con ngƣời về cơ chế tác động của probiotics còn rất hạn chế. Có một số tác giả
cho rằng hiệu quả của probiotics trong việc ức chế sự phát triển của các vi khuẩn
gây bệnh trong đƣờng tiêu hóa của động vật có ý nghĩa rất quan trọng. Sự kìm hãm
đƣợc thực hiện theo những cách sau: cạnh tranh chất dinh dƣỡng, sản xuất độc tố và
các sản phẩm trao đổi (các acid béo bay hơi, các chất giống kháng sinh…), cạnh
tranh vị trí bám dính ở niêm mạc ruột và kích thích hệ thống miễn dịch ruột [19],
[32].
Trong thời gian gần đây đã có sự gia tăng mạnh mẽ về số lƣợng các sản
phẩm y tế chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc từ probiotics. Probiotics ngày càng
đƣợc bào chế dƣới nhiều dạng chế phẩm khác nhau sử dụng theo đƣờng uống nhƣ
bột, cốm, viên nang… hay sử dụng trong các sản phẩm cho đƣờng dùng khác nhƣ
viên đặt, kem bôi da. Tuy nhiên, nhiều báo cáo chỉ ra rằng số lƣợng các vi khuẩn
probiotics trong các chế phẩm này rất nghèo nàn. Để cải thiện số lƣợng vi khuẩn
4

sống sót trong suốt quá trình bảo quản và trong môi trƣờng có độ pH thấp trong cơ

thể, trên thị trƣờng đã có các sản phẩm probiotics đƣợc bao tới thế hệ 1,2,3…[6].
Thế hệ 1
Không bao nhƣ cốm, pellet… (Non – Coated)

Thế hệ 2
Bao tan trong ruột (Enteric – Coated)

Thế hệ 3
Vi nang hóa (Micro – Encapsulated)

Thế hệ 4
Bao hai lớp (Dual – Coated)
Đa phần các sản phẩm probiotics sử dụng theo đƣờng uống, chúng phải chịu
tác dụng của dịch vị, cũng nhƣ của acid mật vì thế vi sinh vật bị chết rất nhiều và
không đến ruột đƣợc hoặc đến ruột với số lƣợng rất ít không đủ gây tác dụng. Việc
đảm bảo khả năng sống sót của vi sinh vật probiotics trong sản xuất, bảo quản, lƣu
hành, và tỉ lệ sống sót cao khi đến ruột không đơn giản; do vậy đã có nhiều hƣớng
nghiên cứu khác nhau nhƣ cải tiến phƣơng pháp đông khô tạo bột, áp dụng phƣơng
pháp lên men 2 bƣớc, phƣơng pháp vi nang hóa, phƣơng pháp sử dụng kết hợp với
tá dƣợc bảo vệ[18].
Một số cơ sở có sản xuất nguyên liệu probiotics ở nƣớc ta nhƣ công ty trách
nhiệm hữu hạn một thành viên Pasteur Đà Lạt, công ty trách nhiệm hữu hạn một
5

thành viên vaccin và sinh phẩm Nha Trang, với một số chế phẩm hay gặp trên thị
trƣờng nhƣ Enzym biosub, Biosubtyl DL, Viabiovit, Vivac bio, Healthy liver. Mới
đây, xuất hiện thêm công ty cổ phần ANABIO Research& Development với nhà
máy sản xuất nguyên liệu probiotics hiện đại không kém so với các nƣớc trên thế
giới Do vậy, thị trƣờng chế phẩm probiotics không chỉ lớn về số lƣợng mà còn đa
dạng về chủng loại vi sinh vật, đồng thời giá thành sản phẩm các chế phẩm

probioticscũng đƣợc hạ xuống. Tuy nhiên, sản phẩm ở đây vẫn chủ yếu thuộc thế hệ
1 nên khả năng bảo vệ vi sinh vật vẫn còn rất thấp.
1.3. Lactobacillus acidophilus
1.3.1. Đặc điểm hình thái, sinh lí, điều kiện nuôi cấy
Mô tả nguyên thủy về loài dựa trên các chủng đƣợc phân lập từ đƣờng tiêu
hóa của con ngƣời và động vật, khoang miệng và âm đạo ngƣời, cũng có thể tìm
thấy ở các sản phẩm bơ sữa. Vào thời điểm mô tả đầu tiên, chủng là loài hỗn tạp do
gồm một số chủng sau này đƣợc phân loại lại nhƣ các loài đặc biệt nhƣ L.
johnsonii[8].

Hình 1.1. Hình ảnh Lactobacillus acidophilus trên kính hiển vi điện tử
Lactobacillus acidophilus là đại diện chính của nhóm vi khuẩn sinh acid
lactic (LAB), là trực khuẩn Gram dƣơng, hình que hay hình cầu, kích thƣớc 0,6 –
0,9 × 1,5 – 6,0 µm, mọc đơn, đôi hoặc tạo thành chuỗi ngắn. L. acidophilus không
6

có lông roi, không di động, không sinh bào tử, không ƣa muối, ƣa acid, catalase âm
tính, kị khí tùy tiện. L. acidophilus phát triển tốt trong điều kiện sức căng bề mặt
thấp và có khả năng kháng lysozym[12].
Loài lên men đồng hình chuyển đƣờng hexose gần nhƣ hoàn toàn thành acid
lactic (cả hai dạng đồng phân D và L), tạo thành acid nhƣng không sinh khí từ
glucose, sucrose và lactose. Tạo acid từ glucose, fructose, galactose, mannose,
maltose, lactose và sucrose.Một vài chủng lên men raffinose và trehalose và lên
men dextrin yếu. Loài này không lên men các đƣờng xylose, arabinose, rhamnose,
glycerol, mannitol, sorbitol, dulcitol và inositol[12].
L. acidophilus là vi khuẩn vi hiếu khí, do đó môi trƣờng nuôi cấy thƣờng là
kị khí hoặc là giảm áp oxy với 5-10% CO
2
. L. acidophiluscó thể sinh trƣởng ở nhiệt
độ cao (ở 45

o
C), tuy nhiên nhiệt độ phát triển tối ƣu là 37
o
C, không phát triển trong
khoảng 20-22
o
C. Là đại diện chính của nhóm vi khuẩn sinh acid lactic, nó có khả
năng chịu đƣợc điều kiện acid trong khoảng pH 5-6 trong thời gian 24 – 36h [12].
1.3.2. Tác dụng của Lactobacillus acidophilus với sức khỏe
 Cải thiện chức năng miễn dịch
Chức năng ngăn cản và loại trừ kháng nguyên ngoại lai đi qua thành ruột
đƣợc chỉ huy bởi hệ thống miễn dịch ruột – chính là các mô bạch huyết ở ruột. Các
vi khuẩn sinh acid lactic có thể tăng các đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu nhƣ
chức năng thực bào, các tế bào NK – natural killer cells và các đáp ứng miễn dịch
đặc hiệu (hoạt động sản xuất kháng thể, cytokinase, tăng sinh các tế bào lympho,…)
của vật chủ. Sự gia tăng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu (hoạt động thực bào của
bạch cầu hạt) đã đƣợc ghi nhận ở những ngƣời tình nguyện sau khi sử dụng hỗn hợp
probiotics gồm L. acidophilus và Bifidobacterium bifidum [23].
 Củng cố hàng rào miễn dịch và không miễn dịch chống lại các nhiễm
khuẩn đƣờng ruột
7

Lactobacillus acidophilus có tác dụng đối kháng lại sự phát triển của các vi
khuẩn gây bệnh đƣờng ruột nhƣ Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium,
Yersinia enterocolitica và Clostridium perfringens thông qua cơ chế kháng vi sinh
vật, bằng cách cạnh tranh chất dinh dƣỡng, năng lƣợng cũng nhƣ vị trí bám lên
niêm mạc ruột của các vi khuẩn gây bệnh và sinh ra các chất có tác dụng kháng
khuẩn làm cho vi khuẩn có hại không phát triển đƣợc nhƣ: các barteriocine (nhƣ:
nisin, lactobrevin, acidophilin, acidolin, lactobacillin,lactocidin và lactolin), acid
lactic, acid acetic, hydrogen peroxide, carbon dioxide, diacetyl…[23].

 Phòng ngừa bệnh tiêu chảy
Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy probiotics có tác dụng điều trị trong các
trƣờng hợp tiêu chảy do sử dụng kháng sinh ở ngƣời lớn, tiêu chảy khi đi du lịch,
cũng nhƣ tiêu chảy ở trẻ em do rotavirus. Khi sữa có chứa L. acidophilus, S.
thermophilus và B. longum đƣợc dùng cho những bệnh nhân lão suy bị tiêu chảy do
thƣờng xuyên dùng thuốc xổ, tần suất tiêu chảy của ngƣời bệnh đã giảm xuống,
đồng thời tình trạng bệnh tiêu chảy cũng đƣợc cải thiện [12], [23].
 Ngăn ngừa ung thƣ ruột kết
Những thử nghiệmin-vitro và in-vivo gần đây đã chỉ ra rằng vi khuẩn
probiotics có thể làm giảm nguy cơ, tỷ lệ và số lƣợng các khối u đại tràng, gan và
bàng quang. Hiệu quả bảo vệ chống lại sự phát triển ung thƣ có thể do liên kết của
chất gây đột biến với vi khuẩn đƣờng ruột, hoặc do khả năng ức chế sự tăng trƣởng
của vi khuẩn chuyển đổi procarcinogens thành chất gây ung thƣ, do đó làm giảm
lƣợng chất gây ung thƣ trong ruột, hoặc chỉ đơn thuần là ức chế sự phát triển của
các khối u bằng cách tăng cƣờng hệ thống miễn dịch của vật chủ…[23].
 Ngăn ngừa cholesterol máu cao
L. acidophilus có tác dụng phân giải các acid mật thành các acid tự do. Các
acid tự do này đƣợc đào thải khỏi đƣờng tiêu hóa nhanh hơn nhiều so với các acid
mật dạng kết hợp khiến nồng độ acid mật giảm xuống, đòi hỏi cơ thể phải tổng hợp
8

mới acid mật từ cholesterol, gây ra tác dụng giảm nồng độ cholesterol toàn phần
trong cơ thể[11],[22],[39].
 Cải thiện khả năng dung nạp lactose
L. acidophilus có khả năng sản sinh ra β-D-galactosidase có tác dụng hỗ trợ
tiêu hóa và cải thiện khả năng dung nạp lactose [23].
1.4. Kỹ thuật sản xuất pellet bằng phƣơng pháp đùn – tạo cầu
1.4.1. Định nghĩa pellet
Pellet là những “hạt thuốc nhỏ” có dạng hình cầu hoặc gần nhƣ cầu, thƣờng
có đƣờng kính từ 0,25mm đến 1,5mm; đƣợc hình thành do quá trình liên kết của các

tiểu phân dƣợc chất với các tá dƣợc khác nhau. Pellet có thể là một dạng bào chế
hoàn chỉnh hoặc là những “chế phẩm trung gian” đƣợc đóng vào nang cứng, dập
thành viên mới hoặc bao màng bảo vệ rồi đóng nang… tạo thành các chế phẩm
hoàn chỉnh [2], [3], [34].
1.4.2. Ƣu – nhƣợc điểm của pellet
 Ƣu điểm
Pellet dễ dàng phân tán đều khắp trong dạ dày, hạn chế đƣợc tác dụng kích
ứng tại chỗ của dƣợc chất, giảm bớt nguy cơ gây tổn thƣơng niêm mạc dạ dày. Do
có kích thƣớc nhỏ nên các pellet dễ dàng đi qua môn vị xuống ruột non, giảm thời
gian lƣu thuốc ở dạ dày, tạo điều kiện cho quá trình hấp thu dƣợc chất xảy ra nhanh
hơn và triệt để hơn, làm tăng sinh khả dụng của thuốc. Sử dụng viên nén hoặc nang
thuốc bào chế từ pellet bao tan ở ruột sẽ khắc phục đƣợc hiện tƣợng dồn liều hoặc
viên không rã nhƣ đã từng gặp ở viên nén bao tan trong ruột [2], [3].
Việc bao màng cho pellet thuận lợi hơn nhiều so với bao màng viên nén hay
bao hạt (do pellet có hình cầu, bề mặt trơn nhẵn). Pellet có độ trơn chảy tốt nên dễ
dàng thu đƣợc viên nén hay nang thuốc có khối lƣợng hay hàm lƣợng dƣợc chất có
độ đồng nhất và độ lặp lại cao [2], [3].
Nhờ công nghệ pellet mà các dƣợc chất tƣơng kị nhau vẫn có thể kết hợp
trong cùng một viên nén hoặc nang thuốc. Ngoài ra còn có thể bào chế các chế
phẩm thuốc có tác dụng kéo dài từ pellet [2], [3].
9

 Nhƣợc điểm
Quy trình bào chế thƣờng kéo dài và chi phí khá cao. Thời gian để hoàn
thành một pellet có thể kéo dài nhiều giờ hay nhiều ngày phụ thuộc vào loại thiết bị
và phƣơng pháp bào chế đƣợc áp dụng [3].
Trong quá trình bào chế có rất nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến chất lƣợng của
pellet thu đƣợc. Do vậy đòi hỏi phải có quá trình nghiên cứu đầy đủ mới có thể bào
chế đƣợc pellet có chất lƣợng nhƣ mong muốn [3].
1.4.3. Thành phần của pellet

Các tá dƣợc thƣờng dùng trong pellet gồm [2], [3]:
Bảng 1.1. Một số tá dược dùng trong công thức bào chế pellet
Nhóm
tá dƣợc
Vai trò
Một số tá dƣợc điển hình
Tá dƣợc
tạo cầu
Giúp pellet tạo đƣợc hình cầu hoàn
chỉnh
Cellulose vi tinh thể (avicel pH
101, avicel pH 102),
carboxymethyl cellulose,…
Tá dƣợc
độn
Còn gọi là tá dƣợc pha loãng, đƣợc
thêm vào để đảm bảo khối lƣợng
cần thiết của pellet hoặc để cải
thiện tính chất cơ lí của dƣợc chất,
giúp cho quá trình tạo pellet đƣợc
thuận lợi
Lactose, manitol, tinh bột,
cellulose vi tinh thể, calci
sulfat, calci dibasic
phosphat,…
Tá dƣợc
dính
Là tác nhân liên kết các tiểu phân
tạo độ bền cơ học thích hợp
Hydroxypropyl methyl

cellulose, hydroxypropyl
cellulose, methyl cellulose,
gelatin,…
Tá dƣợc
Làm giảm ma sát giữa các tiểu
Aerosil, magnesi stearat,
10

trơn
phân với nhau và giữa các tiểu phân
với bề mặt của thiết bị tạo pellet
talc,…
Tá dƣợc
rã
Làm cho pellet rã nhanh và mịn,
giải phóng tối đa bề mặt tiếp xúc
ban đầu của tiểu phân dƣợc chất
với môi trƣờng hòa tan
Natri starch glycolat, natri
crosscarmellose,
crosspovidone,…
Tá dƣợc đƣa vào giúp cho pellet có độ bền cơ học thích hợp, không bị vụn
bở trong quá trình sản xuất, đảm bảo độ đồng nhất về hình dạng, tính chất bề mặt,
kích thƣớc và tốc độ giải phóng dƣợc chất.
1.4.4. Các phƣơng pháp bào chế pellet
Có rất nhiều phƣơng pháp bào chế pellet khác nhau, mỗi phƣơng pháp đều
có thiết bị chuyên dụng riêng và cho pellet có đặc tính khác nhau.Các phƣơng pháp
bào chế pellet bao gồm [3]:
 Phƣơng pháp đùn – tạo cầu
 Phƣơng pháp bồi dần

 Phƣơng pháp phun sấy
 Phƣơng pháp phun đông tụ











11

Phƣơng pháp đùn – tạo cầu
Đùn – tạo cầu là phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp
sản xuất thuốc do có ƣu thế về năng suất và chất lƣợng pellet thu đƣợc. Quá trình
tạo pellet bao gồm các bƣớc sau:








Hình 1.2: Sơ đồ các bước sản xuất pellet bằng phương pháp đùn – tạo cầu
 Trộn bột khô: Dƣợc chất và các tá dƣợc sau khi qua bƣớc nghiền mịn thành
bột có kích thƣớc tiểu phân xác định đƣợc trộn bột khô tạo khối bột phân tán đồng

nhất [3], [25].
 Tạo khối ẩm: Thêm tá dƣợc dính lỏng vào hỗn hợp bột và nhào trộn thành
một khối ẩm có độ dẻo thích hợp cho quá trình đùn. Sau khi nhào ẩm xong, ủ khối
bột ẩm để pha lỏng phân bố cân bằng trong toàn bộ khối ẩm, cũng nhƣ các thành
phần tạo cầu có thể trƣơng nở, giúp khối bột có đủ độ dẻo cần thiết trong quá trình
tạo cầu sau khi đùn [3], [29].
Tá dƣợc dính và dung môi có ảnh hƣởng rất lớn đến khả năng hình thành liên
kết giữa các tiểu phân dƣợc chất và tá dƣợc. Nếu lƣợng dƣợc chất quá ít, liên kết
Tạo khối ẩm
Đùn
Vo tạo cầu
Làm khô
Trộn bột khô
12

không hình thành sẽ không tạo đƣợc pellet; ngƣợc lại, tá dƣợc dính quá nhiều sẽ
khiến pellet có hình dùi trống, không tạo đƣợc hình cầu hoàn chỉnh [24].
Độ ẩm của khối bột là một yếu tố quan trọng trong quá trình tạo pellet. Quá
trình đùn yêu cầu khối bột phải đủ dẻo để hình thành sợi đùn, nhƣng nếu quá dẻo sẽ
khiến khối bột bị dính lại với nhau trong quá trình đùn và vo [3], [21].
 Đùn: Khối ẩm đƣợc đùn qua sàng máy đùn tạo thành các sợi hình trụ có
đƣờng kính đồng nhất. Các sợi đùn phải đủ dẻo để có thể biến dạng, nhƣng cũng
không quá dẻo khiến cho các tiểu phân dính vào nhau trong quá trình vo tạo cầu [3],
[35].
Tốc độ đùn quá cao sẽ cho sợi đùn có bề mặt thô ráp, sinh ra nhiều bột mịn
và pellet tạo thành sẽ không đồng đều về kích thƣớc, tỉ lệ vụn nát cao [3], [35].
Kích thƣớc mắt sàng sẽ quyết định đƣờng kính pellet tạo thành. Tùy theo
mục đích sử dụng pellet để chọn mắt sàng có kích thƣớc phù hợp.
 Vo tạo cầu: Trong quá trình tạo cầu, các sợi sẽ đƣợc cắt thành các tiểu phân
hình ống có chiều dài tƣơng đƣơng với đƣờng kính, sau đó đƣợc làm tròn bằng lực

ma sát, tạo thành các tiểu phân hình cầu. Thời gian tạo pellet thƣờng kéo dài từ 2 –
10 phút với tốc độ quay của đĩa khoảng 200 – 400 vòng/phút [3].
Tốc độ tạo cầu lớn sẽ tạo nhiều bột mịn nếu sợi không đủ ẩm; ngƣợc lại, nếu
sợi đủ ẩm, số lƣợng các tiểu phân mịn giảm, đồng thời đƣờng kính trung bình của
pellet sẽ tăng lên. Thời gian tạo cầu tăng sẽ thu đƣợc pellet có kích thƣớc đồng nhất,
chắc, tỉ trọng lớn hơn, pellet có dạng cầu hoàn chỉnh hơn. Khối lƣợng một mẻ tạo
cầu tăng sẽ làm tăng độ cứng và giảm độ cầu của sản phẩm [3].
 Làm khô: Pellet sao khi đƣợc tạo thành sẽ đƣợc đem đi làm khô nhằm đạt
đƣợc độ ẩm mong muốn cho pellet với nhiều phƣơng pháp làm khô khác nhau nhƣ:
đông khô, sấy bằng tủ sấy hoặc thiết bị sấy tầng sôi [4].



13

CHƢƠNG II. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Nguyên vật liệu
 Nguyên liệu chứa vi sinh vật
 Chủng vi sinh vật Lactobacillus acidophilus ATCC 4563 (Bộ môn Công
Nghiệp Dƣợc – Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội).
 Nguyên liệu pha môi trƣờng
Bảng 2.1: Các hóa chất dùng trong nghiên cứu
Tên hóa chất
Nguồn gốc
Tên hóa chất
Nguồn gốc
Glucose
Trung Quốc
Sữa gầy

Trung Quốc
Pepton
Merk-Đức
MnSO
4
.4H
2
O
Trung Quốc
Cao thịt
Merk- Đức
Triamoni citrate
Trung Quốc
Cao nấm men
Merk- Đức
Acetat natri
Trung Quốc
K
2
HPO
4

Trung Quốc
Natri clorid
Trung Quốc
MgSO4.7H2O
Trung Quốc
Thạch agar
Việt Nam

 Tá dƣợc sử dụng
Bảng 2.2: Các tá dược sử dụng trong nghiên cứu
Tên tá dƣợc
Nguồn gốc
Avicel PH 101
Braxin
Natri starch glycolat
Trung Quốc
HPMC E6
Trung Quốc
Lactose
Trung Quốc
Aerosil
Trung Quốc

14

2.1.2. Môi trƣờng sử dụng trong nghiên cứu
 Môi trƣờng MRS lỏng (MT1)
Glucose 20g Acetat natri 5g
Pepton 10g K
2
HPO
4
2g
Cao thịt 10g MgSO
4
.7H
2
O 0,2g

Cao nấm men 5g MnSO
4
.4H
2
O 0,05g
Triamoni citrate 2g Nƣớc máy vừa đủ 1000ml
pH 6,8 ÷ 7,0
 Môi trƣờng MRS thạch (MT2)
MT2= MT1 + Thạch agar (20g/1000ml môi trƣờng)
2.1.3. Thiết bị
Bảng 2.3. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
Tên thiết bị
Nguồn gốc
Máy đùn – tạo cầu
Trung Quốc (QZJ)
Máy sấy tầng sôi
Đức (diosna)
Tủ cấy vô trùng
Nhật (Sanyo)
Tủ ấm CO
2
Nhật (Sanyo)
Tủ lạnh sâu
Đức
Tủ lạnh LG
Hàn Quốc
Thiết bị đông khô
Đức
Máy li tâm
Đức

Nồi hấp tiệt khuẩn
ALP - Nhật
Cân phân tích
Đức (Satorious)
Cân kĩ thuật
Đức(Satorious)
Máy đo hàm ẩm
Mỹ (Ohaus)
Máy khuấy từ
Hàn Quốc (Wisd)
Máy lắc (Vortex)

15

Chày, cối, đĩa petri, ống nghiệm …

2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Khảo sát một số thông số trong quá trình tạo pellet probiotics chứa
Lactobacillus acidophilustừ nguyên liệu đông khô tự tạo.
 Khảo sát lƣợng tá dƣợc dính HPMC E6 5%.
 Khảo sát thời gian ủ.
 Khảo sát thời gian làm khô bằng máy sấy tầng sôi.
 Đánh giá một số chỉ tiêu chất lƣợng của pellet.
2.2.2. Đánh giá ảnh hƣởng của một số giai đoạn trong quá trình tạo pellet đến
sự sống sót của vi sinh vật và theo dõi độ ổn định của pellet probiotics
 Đánh giá ảnh hƣởng của một số giai đoạn trong quá trình tạo pellet đến sự
sống sót của vi sinh vật.
 Theo dõi độ ổn định của pellet probiotics trong quá trình bảo quản.
2.2.3. Khảo sát ảnh hƣởng của tỉ lệ dƣợc chất và tá dƣợc lactose đến số lƣợng
vi sinh vật trong pellet thu đƣợc.

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng pháp hoạt hóa giống
Pha môi trƣờng MRS lỏng theo công thức ở mục 2.1.2. Dùng đũa thủy tinh
hòa tan hết các thành phần. Dùng pipet chính xác phân phối đều 10ml môi trƣờng
vừa pha vào các ống nghiệm sạch, nút kín ống nghiệm rồi đem đi hấp tiệt trùng ở
điều kiện 0,6 atm trong 20 phút bằng nồi hấp tiệt trùng. Để nguội ống nghiệm rồi
cấy giống vào các ống nghiệm từ nguyên liệu bột đông khô có chứa Lactobacillus
acidophilus. Cấy giống tiến hành trong tủ cấy vô trùng. Nuôi trong tủ ấm có5% CO
2

ở điều kiện 37
o
C trong 24h [9].
2.3.2. Phƣơng pháp nhân giống
Pha môi trƣờng MRS lỏng theo công thức ở mục 2.1.2. Hòa tan hết các thành
phần. Chia đều môi trƣờng vào các ống nghiệm sạch, mỗi ống nghiệm 10 ml, nút
kín ống nghiệm rồi đem đi hấp tiệt trùng ở điều kiện 0,6 atm trong 20 phút bằng nồi
16

hấp tiệt trùng. Để nguội ống nghiệm rồi cấy giống vào các ống nghiệm. Ủ trong tủ
ấm ở điều kiện 37
o
C, 5% CO
2
trong 24h[9].
2.3.3. Phƣơng pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào
Pha 100ml môi trƣờng MRS lỏng với tỉ lệ nhƣ trong công thức ở mục 2.1.2
trong cốc có mỏ. Hòa tan hết các thành phần rồi cho vào bình nón 250ml, nút kín và
hấp tiệt trùng ở điều kiện 0,6 atm trong 20 phút. Để nguội, cấy 10ml giống vào bình
nón chứa môi trƣờng MRS lỏng trong tủ cấy vô trùng. Ủ trong tủ ấm có5% CO

2
ở
điều kiện 37
o
C trong 24h, thu đƣợc hỗn dịch tế bào Lactobacillus acidophilus[9].
2.3.4. Phƣơng pháp đông khô
 Chuẩn bị mẫu
Nuôi cấy VSV trong các bình nón chứa môi trƣờng MRS ở điều kiện 37
o
C
trong 24h trong tủ ấm 5%CO
2
(nhƣ phƣơng pháp nêu trong mục 2.3.3).Lắc đều cho
đồng nhất dịch nuôi cấy. Li tâm thu sinh khối với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10
phút. Loại bỏ phần dịch trong, giữ lại phần cắn sinh khối. Cho dung dịch sữa gầy
10% đã hấp tiệt trùng vào các ống li tâm chứa cắn sinh khối và lắc trên máy lắc
vortex để sinh khối phân tán đều. Tập hợp tất cả hỗn dịch trong các ống li tâm vào
cốc có mỏ đã hấp tiệt trùng và khuấy từ để đồng nhất.Đổ hỗn dịch này ra các đĩa
petri đã đƣợc làm sạch và hấp tiệt khuẩn từ trƣớc, đậy kín bằng giấy nhôm[7].
 Tiền đông: Các mẫu đƣợc làm đông lạnh trong tủ lạnh sâu -80
o
C cho tớikhi
mẫu đông rắn hoàn toàn (trong khoảng từ 18h đến 24h).
 Làm khô: Các mẫu đƣợc làm khô trong không gian lạnh của máy đông khô
ở nhiệt độ khoảng -54
o
C; 0,055mbar.
Kết thúc quá trình làm khô, lấy mẫu ra khỏi thiết bị chuyển vào bao polymer
có khóa, lấy mẫu xác định số vi sinh vật sống sót hoặc đậy kín rồi bảo quản trong tủ
lạnh ở nhiệt độ 4-6

o
C [7].
2.3.5. Phƣơng pháp bào chế pellet
 Chuẩn bị nguyên liệu