Nghiên cứu triển khai sản xuất l cystin ở quy mô pilot

Bộ YTÉ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
**********************
NGUVỄN THỊ THANH PHÚC
NGHIÊN CỨU TRIỂN KHAI SẢN
XUẤT L-CYSTIN ở QUY MÔ PILOT
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ
• • •
Người hướng dẫn:
PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp Dược
Đại học Dược Hà Nội
HÀ N Ộ I-2011
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn
Đình Luyện, Trưởng bộ môn Công Nghiệp Dược -Trưòmg Đại Học Dược Hà Nội,
người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt , dạy dỗ cho tôi trong suốt quá trình
thực hiện khóa luận này.
Đồng thời,tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành TS. Nguyễn Văn Hân, DS.
Nguyễn Văn Giang và anh Phan Tiến Thành cùng các thầy cô, anh chị thuộc bộ
môn Công nghiệp dược, cũng như các thầy cô trong trường Đại học Dược Hà Nội
này đã giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận này.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cám ơn đến gia đình và bạn bè là động lực lớn giúp
đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này.
Tôi xin chân thành cám ơn !
Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2011
Sinh viên
Nguyễn Thị Thanh Phúc
DANH MỤC CÁC KỶ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, Đ ồ THỊ
Trang
ĐẶT VẤN ĐÈ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Tổng quan về keratin 2
1.1.1. Khái niệm keratỉn 2
1.1.2. Cấu trúc của keratin 3
1.2. Tổng quan về L-cystin 4
1.2.1. Khái niệm L-cystỉn 4
1.2.2. Tỉnh chất vật lỷ
5
1.2.3. Tỉnh chất hóa học 5
1.2.4. Phương pháp điều chế 7
1.2.5. Các xác định L-cystỉn tạo thành 9
1.2.6. Các phương pháp điều chế từ keratin 12
1.2.7. Tác dụng sinh học và ứng dụng 14
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

16
2.1. Đối tượng nghiên cứu
16
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu 16
2.1.2. Hóa chất nghiên cứu 16
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu 17
CHƯƠNG 3. KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u 19
3.1. Phân tích và lựa chọn phương pháp 19
MỤC LỤC
3.1.1. Giai đoạn thủy phân 19
3.1.2. Giai đoạn kết tủa 20

3.2. Khảo sát các nguồn nguyên liệu keratin
21
3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ giai đoạn kết tủa đến hiệu suất sản
phẩm 23
3.4. Điều chế L-cystin ử quy mô pilot 25
3.5. Kết quả phân tích phổ 27
3.5.1. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại IR 27
3.5.2. Kết quả phân tích phổ khối MS 28
3.5.2. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân ^H-NMR 29
3.6. Kiểm nghiệm L-cystin thu được theo một số tiêu chuẩn của dược
điển Anh-BP 2007 30
3.7. BÀN LUẬN 30
KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIÉT TẮT
BP
Dược điển Anh (British Pharmacopoeia)
HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid
chromatography)
IR
Phổ hong ngoại (Infrared spectroscopy)
KĨPT
Khối lượng phân tử
MS
Phổ khối (Mass spectrometry)
NMR
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic
resonance spectroscopy)

SKLM
Sắc ký lóp mỏng
Rf
Thời gian lưu
Trang
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát hiệu suất tạo L-cystin từ các nguồn keratin
22
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ giai đoạn kết tủa đến
hiệu suất điều chế L-cystin 24
Bảng 3.3. Kết quả phân tích phổ khối của L-cystin điều chế được 28
Bảng 3.4. Kết quả phân tích phổ ^H-NMR của L-cystin điều chế được

30
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Hình 1: cấu trúc keratin 2
Hình 2: sắc ký đồ của hỗn họp acid amin 11
Hình 3: Biểu đồ kết quả khảo sát hiệu suất L-cystin từ các nguồn keratin 23
Hình 4: Biểu đồ kết quả khảo sát ảnh hưỏng của nhiệt độ giai đoạn kết tủa
đến hiệu suất điều chế L-cystin 25
Hình 5: Quy trình điều chế L-cystin ở quy mô pilot 26
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐÈ
L-cystin là một acid amin có trong tự nhiên, thuộc nhóm acid amin có
chứa lưu huỳnh [2]. L- cystin chiếm một tỷ lệ lớn trong tóc, móng, sừng [8].
Được biết đến như một disulfide amino, L- cystin cấu thành từ hai phân
tử L-cystein qua cầu nối disulfide. Tên khoa học là: L(-)-3,3’-Dithiobis(2-
amino-propanoic acid).
L-cystin được dùng rộng rãi để bào chế các thuốc điều trị các bệnh lông,
tóc, móng như tóc dễ gẫy, chẻ, rụng tóc, giúp cho sự mọc tóc và giúp tóc tăng

trưởng. Ngoài ta, L-cystin còn được dùng để điều trị chứng ngứa và các bệnh
lý về da như: sạm da, ban chàm, mề đay, mụn nhọt [12]. L-cystin là nguyên
liệu trung gian để bán tổng hợp nhiều dẫn xuất có ứng dụng trong lâm sàng
như: L- cystein, S-carboxyl-methyl-cystein, N-acetyl-L-cystein
L-cystin có thể điều chế theo con đường tổng hợp hóa học hay tổng họfp
vi sinh nhưng phương pháp chiết từ dịch thủy phân keratin là phương pháp
đơn giản, dễ thực hiện, nguyên liệu dễ kiếm và có khả năng sản xuất ở quy
mô công nghiệp cao.
Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu điều chế L-cystin từ một số loại
keratin như tóc, lông cừu [16,17] Tại Việt Nam, các nghiên cứu điều chế L-
cystin từ keratin đã được tiến hành và khảo sát ở quy mô phòng thí nghiệm
[1,6,8,11]. Nhằm đưa việc sản xuất L-cystin ứng dụng vào sản xuất công
nghiệp, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu triển khai sản xuất L-cystin
ở quy mô pilot” với những mục tiêu sau:
1. Khảo sát một sổ yếu tổ ảnh hưởng đến hiệu suất điều chế L-
cystỉn, lựa chọn nguyên liệu, hóa chất và quy trình sản xuất L-cystin ở quy mô
pilot.
2. Tiến hành sản xuất L-cystin ở quy mô pilot và kiểm nghiệm sản
phâm L-cystỉn thu được.
CHƯC«VG 1: TỎNG QUAN
ỉ.l. Tổng quan về keratiii
1.1.1. Khái niêm về Keratin
Keratin là một protein có cấu trúc dạng sợi, rắn chắc, không tan trong
nước, chiếm tỷ lệ cao trong tóc, sừng, móng, lông của hầu hết các động vật
[3].
Ngoài vai trò giúp ổn định cấu trúc tế bào, keratin còn có tác dụng bảo vệ
chống các tác nhân có hại từ môi trưòng bên ngoài.
Keratin có hai dạng cấu trúc là a-keratin và |3-keratin:
- a-keratin có trong lông tóc (kể cả lông cừu), sừng, móng và móng guốc của
động vật có vú.

- P-keratin được tìm thấy ở móng vuốt vủa các loài bò sát, trong mai của các
loài baba, rùa., và trong lông vũ, mỏ, móng vuốt của chim, gai của nhím [23'.
Cấu trúc của p-keratin cứng hơn so với a-keratin.
1.1.2. Cẩu trúc của keratin
H ydrogen bond
Hydrogen —
bond
Hình 1: cấu trúc keratin
1.1.2.1. Cấu dạng xoắn a ( hĩnh A)
Là cấu dạng điển hình cho cấu trúc của a-keratin. Khoảng cách một chu
kỳ xoắn là 0,54nm (gồm 3,5 gốc acid amin).
Các nhóm R của nguyên tử cacbon a đều chĩa ra ngoài trung tâm xoắn.
Cấu dạng xoắn a có những đặc điểm quan trọng sau đây:
^ Cấu trúc bền vững nhờ có các liên kết hydro tạo ra giữa H (thuộc nhóm
-NH của mỗi liên kết peptid) với o (của nhóm -CO thuộc gốc acid amin thứ
4 trong chuỗi). Như vậy, mỗi liên kết peptid đều góp phần tạo ra sự bền vững
tối đa cho phân tử keratin.
Liên kết hydro nói trên làm giảm tính chất ưa nước của vùng xoắn a.
^ Là cấu dạng bền vững nhất của chuỗi polypeptide do có thể tạo xoắn a
mà không cần nhiều năng lượng.
1.1.2.2. Cấu dạng gấp nếp p (hình B)
Là điển hình cho cấu trúc của |3- keratin. Nó không bị cuộn lại như cấu
dạng xoắn a mà gấp nếp và hầu như hoàn toàn duỗi thẳng hình ziczac.
Các đặc điểm của cấu dạng gấp nếp P:
Các chuỗi polypeptid cạnh nhau có thể song song (có cùng hướng từ N-
đến C- tận) hay đối song (hướng ngược nhau). Hai cấu trúc này giống nhau
mặc dù độ dài lặp lại của cấu trúc song song là 0,65nm ngắn hơn so với 0,70
nm của cấu trúc đối song.
v' Khoảng cách giữa các acid amin cạnh nhau theo đường trục là 0,3 5nm
(xa hơn so với cấu trúc dạng xoắn a là 0,15nm).

^ Các liên kết hydro tạo bởi -NH và -CO có thể nằm cùng chuỗi hay
giữa các chuỗi polypeptid khác nhau.
A: cấu dạng xoắn a, B: cấu dạng xoắn p
^ Các gốc R của acid amin cạnh nhau nằm ở những vị trí gấp khúc
ziczac.
1.2. Tổng quan về L- cystin.
1,2,1. Khái niệm L-cystìn
L-cystin được Wollaston phát hiện vào năm 1810 [17]. Đen năm 1899,
L- cystin được chiết ra từ dịch thủy phân sừng bởi K.A.H.Momer [20]. Các
nghiên cứu về Hóa học và Sinh học được D.M Greenberg thực hiện vào năm
1951 [15].
Công thức cấu tạo [22]:
\
OH
NH,
Tên khoa học: L(-)-3,3’-Dithiobis(2-amino-propanoic acid)
Công thức phân tử: C6H12O4N2S2
Phân tử lượng: 240,30
Thành phần: c 29,99%; H 5,03%; N 11,66%; o 26,63%; s 26,69%.
L- cystin có cấu trúc ổn định, là sản phẩm oxy hóa của L-cystein. L-
cystin được cấu thành từ hai phân tử L-cystein nối với nhau bằng cầu nối
disulfid. L-cystin có thể tạo thành L- cystein nhờ sự khử hóa.
coo-
H

c

HsN^
H2C

SH
Cystein
coo-
-H3N"
H2C

SH
Cystein
C00 -
C00-
NH,
H,c
-H
-s-
H-
-s-
-H,N*
■CH,
Cystin
1.3.2. Tính chất vật lỷ [23]:
- L- cystin là dạng bột kết tinh màu trắng,
- Thực tế không tan trong nước và alcol. Có thể hòa tan được trong dung
dịch kiềm loãng, khả năng tan trong nước (g/1) ở nhiệt độ 25®c là 0,112; ở
50°c là 0,239; ở is'^c là 0,523; ở loo^'c là 1,142.
- L-cystin có góc quay cực từ -215° đến -225® (dung dịch 5% trong dung
dịchHCl IM)
- Nhiệt độ nóng chảy khoảng 260-261 °c.
1.3.3. Tính chất hóa học: [4]
Với cấu trúc có chứa cả hai nhóm -COOH và nhóm -NH2 nên L-cystin
có những tính chất hóa học cơ bản của một acid amin, đồng thời L- cystin là

acid amin có chứa lưu huỳnh nên dương tính với phản ứng Folh.
• Phản ứng Ninhydrin
Nguyên tẳc:
rO
Ninhydrin là chất oxy hóa mạnh, khi đun nóng có khả năng khử nhóm
amin và nhóm carboxyl của a-amino acid tạo Ninhydrin khử, CO2, NH3 và
aldehyd.
H
+ R — ọ—coon-
L
NH2
V + r c h O
+ CO2
Ninhydrin Ninhydrin khử
Ninhydrin khử tác dụng với ninhydrin và NH3 tạo ra sản phẩm có khả
năng hỗ biến tạo hệ thống các nối đôi liên họp có màu tím có độ hấp thụ cực
đại ở
x =
570nm. Cường độ màu phụ thuộc vào nồng độ của acid amin.
0 - N H 4
o o
Màu xanh tím
• Phản ứng với Pluorescamin
Nguyên tắc:
Tạo sản phẩm huỳnh quang với a- amin của acid amin, đây là phản ứng
rất nhạy cho phép phát hiện acid amin tới hàng nghìn nano gram.
RCHCOOH
L
NH2
A c id am in

DBi XUÔ huúnh quang
• Phản ứng Fohl xác định acid amin chứa lưu huỳnh
Nguyên tắc\
L- cystin đun nóng trong môi trường kiềm sẽ phản ứng với muối chì tạo
sulfiir chì PbS màu đen xám.
CH— NH2
Cơ chế phản ứng như sau:
CH2— SH ■
+ 4NaOH
LCOOH J ^
Pb(CH3COO)2 + 2NaOH
Pb(0 H)2 + 2NaOH
Ne2S +Pb(ONa)2 +H 2O
CH2— OH
CH— NH2
COOH
+ 2N32S + H2O
Pb(0 H)2 + 2CH3COONa
Pb(ONa)2 + 2H2O
PbS H-4NaOH
I.J.4. Các phương pháp điều chế L-cystin
1.3.4.1. Phương pháp tổng hợp hóa học
Người ta có thể tổng hợp L- cystin từ serin hay từ acid arcrylic. Sau đây
là một ví dụ cho việc sử dụng nguyên liệu ban đầu là dẫn xuất ester của serin
[19]:
I.PCI5
CH2CHCOOCH3
OH NH2.HCI
2. HCl
CH2CHCOOH

Cl NH2.HCI
8
CeHsCHzMgCI
CgHsCHzSMgCI
CH2CHCH2COOH
+ CgHsCHaSMgCI
Cl NH2.HCI
C6H5SCH2CHCOOH
NH2
C6H5SCH2CHCOOH
NH,
L- cystin
1. Na trong NH^
2. không khí
iNn2
1.3.4.2. Phương pháp tổng hợp từ vỉ sinh vật
K. Sano và các cộng sự người Nhật bản thực hiện điều chế L-cystein và
L-cystin bằng con đường sinh tổng họrp. Bằng các chủng vi sinh vật khác
nhau như Pseudomonas thiazolỉnophỉlum AJ 3854, Pseudomonas ovalỉs AJ
3865, Pseudomonas desmoỉytica AJ 3891, với các môi trường dinh dưỡng
khác nhau và sử dụng tiền chất là acid 2-amino-thiazolin-4-carboxylic [24].
1.3.4.3. Phương pháp thủy phân keratỉn
Các phương pháp trên nói chung phải qua nhiều giai đoạn khá phức tạp
và hiệu suất không cao. Vì thế người ta hướng tới một phương pháp đon giản
hon nhiều là thủy phân keratin để thu lấy L- cystin [18]. Phương pháp này
thực sự có ý nghĩa trong thời gian gần đây, khi nhu cầu về nguồn L- cystin
ngày càng lớn và tính hiệu quả của quá trình thủy phân ngày càng nâng cao.
keratin
thuy phân pH - 5

-

► acid amin

L-cystin
Qua khảo sát, L- cystin có tỷ lệ cao trong keratin của lông, tóc, sừng,
móng. Hàm lượng L- cystin trong một số nguyên liệu như sau [21];
Tóc 14,0% Lông lợn: 14,4%
Sừng; 12,1% Len: 10,3
Do đó, các nguồn nguyên liệu keratin khác nhau chính là nguyên liệu
để tách chiết L-cystin.
vấn đề cần nghiên cứu trong quá trình thủy phân là các yếu tố ảnh
hưởng đến hiệu suất L-cystin như: nồng độ acid, lưọng acid sử dụng, thời
gian thủy phân, nhiệt độ thủy phân
1.3.5. Cách xác định L-cystin tạo thành [7]:
Sau khi thủy phân hoàn toàn keratin thu được L- cystin, người ta có thể
dùng các phương pháp phân tích khác nhau để xác định L- cystin có trong
dịch thủy phân: phương pháp Kendan, phương pháp Serensen, phương pháp
sắc ký giấy, phương pháp sắc ký trao đổi ion
> Phưong pháp Kendan:
Phương pháp Kendan dựa trên cơ sở dùng acid sulfuric đậm đặc để vô cơ
hóa nguyên liệu, các chất hữu cơ bị đốt cháy thành CO2 và H2O còn Nitơ
được chuyển thành (NH4)2S04. Khi cho dung dịch NaOH tác dụng với
(Nĩỉ4)2S04 thì NH3 sẽ giải phóng ra, cất kéo NH3 theo hơi nước và chuyển
tới bình đựng dung dịch H2SO4 N/50 chuẩn độ. Chuẩn độ H2SO4 dư bằng
dung dịch NaOH N/50, từ đó tính ra hàm lượng Nitơ toàn phần.
Phương pháp này đánh giá được hàm lượng Nitơ toàn phần trong chế
phẩm. Tuy nhiên, phưong pháp này khó phân biệt được lượng Nitơ trong L-
cystin với lượng Nitơ nguồn gốc khác.
> Phưong pháp Nitơ formón (phương pháp Serensen)

Serensen đã dựa vào tính chất hóa học của các acid amiĩi để định lượng
Nitơ của acid amin. Các acid amin đều có nhóm -COOH và -NH2, cả 2
nhóm này đều yếu, quá trình điện ly kém, khi gặp dung dịch formón thì
nhóm -NH2 chuyển thành nhóm metylenic -N=CH2, làm mất tính kiềm của
các acid amin, do vậy mà tính acid của nhóm -COOH mạnh hơn và có thể
định lượng được bằng một chất kiềm mạnh với chỉ thị màu là phenolphtalein.
Phương trình phản ứng:
10
H
-COOH +
ÑH2
Hc;
O
H
H
R

c

COOH
N^^^CH2
HoO
R-
H
-COOH
N=CH2
NaOH
H
R

c

COONa +
N

CH2
HoO
Phương pháp này chọn lọc Nitơ amin nhưng có thể gây sai số do phát
hiện điểm tương đương khó, mặt khác nếu không đủ formón để khóa nhóm -
NH2 sẽ gây sai số thiếu.
> Phương pháp Pepe -Steven
Pepe-steven đã dựa vào khả năng tạo phức của acid amin với đồng bền
vững trong môi trường kiềm có dung dịch đệm photphat. Hai tác giả đã đề
nghị xác định hàm lượng Nitơ amin theo phuofng pháp định lượng ion gián
tiếp (phương pháp thừa trừ) theo phưong trình phản ứng:
R-
H
-C-
-COOH + + H2N-
H
-C-
NH,
COOH
+
+
KI
Na2S203
Cul
Na2S4Ơ6
O:

R
+
+
'Q
,0'
pú.
/ N
N
H2
HoN'
I2
Nal
Như vậy việc xác định hàm lượng Ni tơ amin được chuyển sang xác định
hàm lượng I2, từ đó để tính ra hàm lượng liên kết trong phức chất và
suy ra hàm lượng acid amin trong sản phẩm.
> Phương pháp sắc ký
;0
'R
11
So sánh Rf của mẫu thử với Rf của mẫu chuẩn trong cùng một điều kiện,
từ đó suy ra acid amin có trong mẫu thử. Hệ dung môi sử dụng là n-
butanohacid acetic:nước = 4:1:5. Hiện mầu bằng thuốc thử Ninhydrin.
> Phương pháp tách các acid amin bằng sắc ký trao đổi ion:
Dùng nhựa trao đổi ion để tách riêng các acid amin. Các nhựa thường
được sử dụng trong sắc ký tách acid amin là: Dowex 2x8, Amberlite IRC-
120, Amberlite IRC-50, Wofatit Kps-200 Các acid amin thường được tách
riêng biệt nhờ cột chứa cationit gắn Na"^, và anionit gắn OH'. ở môi
trường pH khác nhau, các acid amin tách ra và hoà tan vào dung dịch rồi dịch
chuyển theo dung dịch với tốc độ dịch chuyển khác nhau. Người ta hứng
dung dịch này theo từng phần nhỏ, mỗi loại acid amin được phân bố theo

những phần nhất định. Kỹ thuật sắc ký trao đổi ion có ý nghĩa rất lớn trong
việc định tính, định lượng và tách từng acid amin riêng biệt ra khỏi hỗn hợp.
Ngày nay, một trong những kỹ thuật sắc ký hiện đại là “Sắc ký lỏng hiệu
năng cao” (HPLC) cho phép tách tốt hofn và tiết kiệm được nhiều thời gian
hơn. Toàn bộ quy trình phân tích có thể tự động hóa trên máy phân tích. Diện
tích dưới píc tương ứng với nồng độ của acid amin trong hỗn hợp.
Ncrm.
24.0
210 -
GLU
ASP
Prỉmesep 100 250 X 4.6 mm
MoblỊe phase: Mecrsl/H20-
30/70. TFA gradient 0.,0Õ to
0 3% ỉn 25 rĩTin
Flow rate; 1.0 mỉ/min
Detector: ELSD
v:al
CYS
PH F
&RG
■10
15
Hình 2: sắc ký đồ của hỗn hợp acid amin
12
1.3.6. Phương pháp điều chế L-cystin từ keratin
1.3.6.1. Phương pháp điều chế theo Vogel [16]:
Nội dung phương pháp:
Cân 500g tóc cho vào bình cầu ba cổ, thêm vào lOOOml hỗn họp acid
clorhydric đặc và acid formic theo tỷ lệ 1:1. Đun cách dầu hồi lưu ở nhiệt độ

120°c cho đến khi phản ứng Biuret âm tính (khoảng 20 giờ). Tẩy màu bằng
khoảng 12g than hoạt, lọc nóng và cô đặc dịch lọc, đến khi tạo thành sirô có
khối lượng không đổi. Hòa tan phần sirô trong 250ml nước cất, thêm từ từ
dung dịch natri acetat 50% cho đến khi dung dịch có pH khoảng từ 4-5. Để
yên hỗn họp ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày, tủa xuất hiện. Lọc lấy tủa, rửa
tủa nhiều lần bằng 50ml nước cất ở khoảng 60°c. Tinh chế sản phẩm bằng
cách hòa tan trong 750ml acid clorhydric IM và tẩy màu bằng 5g than hoạt.
Nếu dịch lọc vẫn có màu vàng nhạt, tiếp tục tẩy màu bằng 5g than hoạt. Điều
chỉnh dịch lọc đến pH=4-5 bằng natri acetat 50%. Đe yên hỗn hợp ở nhiệt độ
phòng khoảng 5-6 giờ. Tủa xuất hiện. Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng 50ml nước
cất 60°C.Khối lượng L-cystin thu được: 25g.
Hiệu suất: 5%.
Chú ý: Sản phẩm thô có thể chứa tyrosin. Một phần của nó được loại
bằng than hoạt và rửa bằng nước nóng. Nhưng khi kết tinh lại có thể sản
phẩm vẫn chứa tyrosin nếu thời gian kết tinh để quá 5-6 giờ.
1.3.6.2. Phương pháp điều chế theo Gortner và Hoffman [17]:
Nội dung phương pháp:
Gortner và Hoffman tiến hành thí nghiệm bằng dung dịch acid HCl 20%
lượng acid sử dụng gấp 2-4 lần khối lưọng tóc. Sau khi thủy phân được hỗn
hợp các acid amin, tiến hành kết tinh L-cystin bằng cách đưa về điểm đẳng
điện ở pH=5. Để trong 3 ngày, tủa xuất hiện. Lọc lấy tủa, tiến hành tinh chế
bằng dung dịch HCl IM và chất hấp phụ bề mặt. Kết quả thu được sản phẩm
13
thô. ở đây, hai tác giả không sử dụng acid HCl đặc vì theo các ông, dung
dịch acid 20% tương đối ổn định và ít gây nguy hiểm hơn so với acid đặc.
Hiệu suất L-cystin thu được từ 4-5%.
1.3.6.3. Các phương pháp điều chế khác:
Các tác giả này đã khảo sát phản ứng thuỷ phân tóc bằng acid HCl
đặc theo những cách khác nhau, cụ thể như sau:
> Theo tác giả Lê Thị Vinh [6]:

Nội dung phương pháp :
Trong bình cầu dung tích 1 lít cho 200g tóc khô sạch và một thể tích acid
HCl 30% hoặc HCl 37% theo tỷ lệ acid/tóc bằng 2:1. Hỗn họp đun sôi với
sinh hàn hồi lưu trực tiếp trên bếp điện trong thời gian 10 giờ. Sau khi để
nguội đến nhiệt độ phòng, dung dịch thuỷ phân được trung hoà từ từ với dung
dịch NaOH 30% đến pH=5, thử phản ứng Biuret để xác định mức độ thuỷ
phân. Tủa đen xuất hiện, để qua đêm, lọc và hoà tan trở lại trong acid HCl
5%. Lọc để loại họp chất chất không tan, rửa tủa bằng 50ml HCl 5% (chia 3
lần). Khử màu toàn bộ dung dịch lọc bằng cách đun sôi nóng với 20g than
hoạt và lắc trong Igiờ. Lọc và rửa than bằng một ít HCl 5%. Trung hoà dịch
lọc màu vàng nhạt bằng dung dịch NaOH 30% đến pH=5. Đe kết tủa trong 3-
4 giờ, lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước nóng để loại tyrosin. Sản phẩm thu được
là L-cystin, có thể tinh chế bằng một lần hòa tan và kết tủa nữa. Tủa được thử
phản ứng Millón để xác định tạp chất tyrosin.
Hiệu suất là: 5%.
> Theo tác giả Bành Đức Lâm [ 1 ]:
Nội dung phương pháp:
Cho Ikg tóc vào bình thuỷ phân 4 lít (có thể chia vào 5 bình nhỏ 1 lít).
Thêm 2 lít HCl 37%. Đậy kín. Ngâm trong thời gian 1 tuần. Tóc bị tan một
phần tạo thành dịch huyền phù. Tiến hành thuỷ phân cách thuỷ dưới sinh hàn
14
hồi lưu. Sau từng thời gian 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ lấy ra 1 lượng nhỏ dịch đang
thuỷ phân, để nguội. Thử phản ứng Biuret đến khi âm tính thì ngừng thuỷ
phân. Trung hoà bằng dung dịch natri acetat 50% đến pH=5. Để kết tủa trong
4 giờ. Lọc lấy tủa bằng phễu hút chân không. Hoà tan tủa trong 200ml HCl
5%. Khử màu dung dịch bằng than hoạt và rửa than bằng 50ml HCl 5%.
Trung hoà dịch lọc bằng dung dịch natri acetat 50% đến pH=5. Đe kết tủa
trong 4 giờ. Lọc lấy tủa. Rửa tủa nhiều lần bằng nước nóng. Sản phẩm thu
được là L-cystin thô. Có thể tinh chế bằng cách hòa tan và kết tủa lần nữa.
Sấy ở nhiệt độ 60-70°C đến khô.

Hiệu suất: 5%.
1.3.7. Tác dụng sinh học và ứng dụng [12]:
L-cystin chiếm một tỷ lệ lớn trong tóc khoảng 14% và trong sừng khoảng
12,1%, ngoài ra nó còn chiếm một tỷ lệ ít hơn trong da (2% đến 4%). L-
cystin tham gia vào quá trình tổng họp keratin (chất sừng) của tóc và móng.
Nó thúc đẩy sự tăng sinh của té bào mầm ở các vùng tạo chất sừng và có ảnh
hưởng tới sự tăng trưởng của chúng. Tác dụng này đã được chứng minh qua
các thử nghiệm có đánh dấu bằng phóng xạ ở các nhân của tế bào mầm.
L-cystin được sử dụng rộng rãi để điều trị các bệnh về lông, tóc, móng
như: tóc móng dễ gẫy, chẻ, chống rụng tóc, hoạt hoá sự mọc tóc, chăm sóc
cho tóc, móng tăng trưởng. Ngoài ra nó còn được sử dụng để điều trị các
chứng ngứa và các bệnh lý biểu bì da, tóc, móng, sạm da, chàm, ban da, nổi
mề đay, viêm nhiễm, mụn nhọt, trứng cá trên da
L-cystin được dùng dưới dạng các chế phẩm như; viên nang mềm 500mg
(hộp 12 vỉ X 5 viên), viên nén bao film (hộp 20 viên),
Một số chế phẩm có trên thị trưÒTig hiện nay như: Blooming, L-cystin
500mg có công dụng điều trị các bệnh về suy nhược cơ thể, các chứng liên
quan đến da, tóc, biểu bì. Liều lượng trung bình dành cho người lớn và trẻ
15
em trên 8 tuổi là 1 viên nang 500mg X 2 lần mỗi ngày, nên dùng liên tục 2-3
tháng hoặc 10-20 ngày mỗi tháng.
16
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu
Các nguyên liệu được nghiên cứu sử dụng để sản xuất L-cystin là tóc,
sừng trâu, sừng bò, lông lợn, móng trâu, móng lợn.
Tóc là nguồn nguyên liệu được thu mua tại các hiệu cắt tóc. Trước khi sử
dụng nguyên liệu cần phải loại bỏ các tạp chất cơ học. Đặc biệt khi rửa
nguyên liệu cần chú ý loại bỏ các chất dầu mỡ và dầu tự nhiên. Nên rửa

nguyên liệu bằng xà phòng, sau đó rửa sạch lại bằng nước nhiều lần, để khô.
Sừng trâu, sừng bò cũng là nguồn nguyên liệu chứa hàm lưcmg cao L-
cystin. Nguyên liệu này được thu mua từ các lò mổ và những nơi chế biến đồ
thủ công mỹ nghệ. Đây là dư phẩm của các lò mổ và các cơ sở thủ công mỹ
nghệ trên toàn quốc. Trước khi sử dụng tiến hành bỏ phần tuỷ, rửa sạch, để
khô.
Lông lợn, móng lợn, móng trâu thu mua từ các lò mổ, rửa sạch, phơi
khô. Nguồn nguyên liệu này yêu cầu phải được xử lý ngay, vì có thể lẫn da
lợn cho nên dễ bị phân huỷ, gây thối.
2.1.2. Hoá chất và thuốc thử
Tên hoá chất và thuốc thử
Nguồn gốc
Acid hydrochloric đậm đặc
Trung Quôc
Acid sulfuric đậm đặc
Trung Quôc
NaOH
Trung Quôc
Đông sulfat
Trung Quôc
Ethanol
Trung Quôc
Nước cât 1 lân, nước cât 2 lân
Đại học Dược Hà
17
Than hoạt
Nhật Bản
Chỉ thị màu vạn năng
Merck (Đức)
2.1.3. Thiết bị và mảy móc

Tên thiết bị và máy móc
Nguồn gốc
Cân phân tích METTLER TOLEDO AB204S
Thụy sỹ
Máy HPLC Shimadzu SPD-MIO Avp với detetor
Nhật
Cân kỹ thuật Sartorius BP2001S
Đức
Máy đo nhiệt độ nóng chảy Gallenkamp
Đức
Tủ sây Memmert
Đức
Phân cực kê A-KRƯSS PIOOO
Đức
Máykhâycơ IKA-RW20
Đức
Tủ hôt
Việt Nam
Nôi gia nhiệt Wise therm lOL, 50L
Hàn quốc
Nhiệt kế thủy ngân
Trung Quốc
Máy đo phổ hồng ngoại Perkin Elmer
Mỹ
Máy đo phổ khối HP-5989-MS
Mỹ
Máy đo cộng hưởng từ hạt nhân Bruker 500MHz
Mỹ
Dụng cụ thủy tinh sạch, sấy khô Trung Quốc
2.2. Phương pháp nghiên cứu

• Thủy phân một số nguồn keratin điều chế L-cystin bằng dung dịch acid
hydrochloric.
'ỉ'R I"ƠNG ĐH ịỳựợc HẪ Nộỉ
^ 9 à y

ináno
ố ĐKCB:
"-'^0

năm 20
18
• Xác định hàm lượng tủa thô bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao HPLC
• Xác định cấu trúc của sản phẩm:
Đo các phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ cộng hưởng từ của L-cystin điều
chế được.
• Kiểm nghiệm sản phẩm L-cystin theo tiêu chuẩn BP 2007:
- Tính chất.
- Đinh tính.
- Giới hạn tạp.
- Độ ẩm.
- Độ trong.
- Định lượng bằng phương pháp chuẩn độ thể tích.
• Xử lý các kết quả, số liệu nghiên cứu bằng phần mềm Excel.