Đánh giá sự đa dạng trình tự AND ribosom ITS của ba loài dược liệu chứa berberin họ rutaceae ở việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




PHAN LÊ BÌNH MAI


ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG TRÌNH TỰ
ADN RIBOSOM ITS
CỦA BA LOÀI DƯỢC LIỆU CHỨA
BERBERIN HỌ RUTACEAE Ở VIỆT NAM


LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2014




BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI







PHAN LÊ BÌNH MAI


ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG TRÌNH TỰ
ADN RIBOSOM ITS
CỦA BA LOÀI DƯỢC LIỆU CHỨA
BERBERIN HỌ RUTACEAE Ở VIỆT NAM


LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH HÓA SINH DƯỢC
60720408





Người hướng dẫn khoa học: TS. Phùng Thanh Hương








HÀ NỘI 2014



LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới cô giáo hướng dẫn
luận văn của tôi, Tiến sĩ Phùng Thanh Hương, đã tạo mọi điều kiện, động viên và
giúp đỡ tôi hoàn thành tốt luận văn “Đánh giá sự đa dạng trình tự ADN ribosom ITS
của ba loài dược liệu chứa berberin họ Rutaceae ở Việt Nam”. Tôi cũng xin chân
thành cảm ơn tới Thạc sĩ Hà Thu. Trong suốt quá trình nghiên cứu, chị đã kiên nhẫn
hướng dẫn, trợ giúp và động viên tôi rất nhiều. Sự hiểu biết sâu sắc về khoa học, cũng
như kinh nghiệm của hai người thầy chính là tiền đề giúp tôi đạt được những thành
tựu và kinh nghiệm quý báu.
Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự

giúp đỡ, tạo điều kiện của tập thể lãnh đạo, cán bộ Phòng Vi sinh phân tử - Viện Công
nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam ; Ban Giám Hiệu, bộ
môn Hóa sinh, phòng Sau đại học, phòng Đào tạo trường Đại học Dược Hà Nội. Tôi
xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành về sự giúp đỡ này.
Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã động viên, khích
lệ, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!



MỤC LỤC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH ẢNH
ĐẶT VẤN ĐỀ
1
Chương I. TỔNG QUAN
3
1.1. Tổng quan về vùng phiên mã nội thuộc ADN ribosom nhân (ITS-
rADN) 3
1.1.1. Cấu trúc của AND ribosom nhân
3
1.1.2. Cấu trúc của ITS-rADN nhân
4
1.1.3. Vai trò của ITS-rADN nhân
7
1.1.4. Ứng dụng của ITS-rADN trong nghiên cứu cây thuốc
7
1.2. Tổng quan về berberin 9
1.3. Các dược liệu chứa berberin ở Việt Nam và thế giới

11
1.4. Ba loài dược liệu là đối tượng nghiên cứu của đề tài
15
1.4.1. Dấu dầu xoan (Tetradium glabrifolium)
15
1.4.2. Xít xa (Toddalia asiatica)
17
1.4.3. Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae) 19
Chương II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
21
2.1. Đối tượng nghiên cứu
21
2.2. Hóa chất, sinh phẩm
22
2.3. Trang thiết bị
23
2.4. Phương pháp nghiên cứu
23
2.4.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số
25
2.4.2. Phương pháp khuếch đại ADN bằng PCR
25
2.4.3. Phương pháp điện di ADN trên gel agarose
27
2.4.4. Phương pháp tách dòng
27
2.4.5. Phương pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào khả biến E.coli chủng
TOP10F’
28

2.4.6. Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ vi khuẩn.
29
2.4.7. Phương pháp cắt ADN bằng enzym giới hạn
30
2.4.8. Phương pháp tinh sạch ADN plasmid
30
2.4.9. Phương pháp giải trình tự ADN
31
2.4.10. Phương pháp so sánh trình tự ADN
32
Chương III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
33
3.1. Kết quả giải trình tự ITS-rADN loài Muồng truổng
33
3.1.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số của các mẫu Muồng truổng
33
3.1.2. Kết quả khuếch đại ADN bằng PCR của các mẫu Muồng truổng
34
3.1.3. Kết quả chọn dòng gen ITS-rADN của các mẫu Muồng truổng
35
3.1.4. Kết quả giải trình tự vùng ITS-rADN của các mẫu Muồng truổng
37
3.1.5. Kết quả so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN của các mẫu Muồng truổng
41
3.1.6. Cây phân loại trình tự ITS-rADN của 10 mẫu Muồng truổng 46
3.2. Kết quả giải trình tự ITS-rADN loài Xít xa
47
3.2.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số của các mẫu Xít xa
47
3.2.2. Kết quả khuếch đại ADN bằng PCR của các mẫu Xít xa

48
3.2.3. Kết quả chọn dòng gen ITS-rADN của các mẫu Xít xa
49
3.2.4. Kết quả giải trình tự vùng ITS-rADN của các mẫu Xít xa 51
3.2.5. Kết quả so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN của các mẫu Xít xa
52
3.2.6. Cây phân loại trình tự ITS-rADN của 3 mẫu Xít xa
55
3.3. Kết quả giải trình tự ITS-rADN loài Dấu dầu xoan
55
3.3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số của các mẫu Dấu dầu xoan
55
3.3.2. Kết quả khuếch đại ADN bằng PCR của các mẫu Dấu dầu xoan
57
3.3.3. Kết quả chọn dòng gen ITS-rADN của các mẫu Dấu dầu xoan
58
3.3.4. Kết quả giải trình tự vùng ITS-rADN của các mẫu Dấu dầu xoan
60
3.3.5. Kết quả so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN của các mẫu Dấu
dầu xoan
63
3.3.6. Cây phân loại trình tự ITS-rADN của 5 mẫu Dấu dầu xoan
66
Chương IV. BÀN LUẬN
68


4.1. Về quy trình xác định trình tự ITS-rADN
68
4.2. Về sự đa dạng di truyền của loài Muồng truổng ở Việt Nam

70
4.3. Về sự đa dạng di truyền của loài Xít xa ở Việt Nam
71
4.4. Về sự đa dạng di truyền của loài Dấu dầu xoan ở Việt Nam
72
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
75

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

A,T,G,C Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin
ADN Acid deoxyribonucleic
AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism
bp Base pair
dNTP Deoxyribonucleotid triphosphat
COX Cylco oxygenase
C-FLIP Cellular FLICE like inhibitory protein
DMH Dimethyl hydrazine
DSS Dextran sodium sulfate
E.coli Escherichia coli
EDTA Ethylen Diamin Tetra acetic Acid
EtBr Ethidium Bromid
ETS External transcribed spacer
IGS Intergenic spacer
ITS Internal Transcribed Spacer (Vùng phiên mã nội)
ITS-rADN
Internal Transcribed Spacer – ribosomal ADN (Trình tự ADN
ribosom đoạn ITS)
LB Luria-Bertani
LSU Large subunit

MCL-1 Myeloid cell leukemia – 1
NTS Non-transcribed spacer
PCR Polymerase Chain Reaction
rADN ADN mã hóa cho ARN ribosom
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
ROS Reactive oxygen species
SSU Small subunit


TAE Tris - Acetic acid – EDTA
Taq Thermus aquaticus
TRAIL Tumor necrosis factor related apoptosis including ligand
X-gal 5-bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactosid

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Kích thước và phần trăm G+C của vùng ITS1 và ITS2 của một số
loài thực vật hạt kín 5
Bảng 1.2. Các loài chứa berberin ở Việt Nam 12
Bảng 1.3. Trình tự gen đã được công bố trên NCBI của Tetradium
glabrifolium 16
Bảng 1.4. Trình tự gen đã được công bố trên NCBI của Toddalia asiatica 18
Bảng 1.5. Trình tự gen đã được công bố trên NCBI của Zanthoxylum
avicennae 20
Bảng 2.1. Danh sách địa điểm thu hái mẫu 21
Bảng 2.2. Cặp mồi dùng trong phản ứng PCR 22
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR 26
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 26
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng tạo vector tái tổ hợp 27

Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắt plasmid 30
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng tổng hợp 31
Bảng 2.8. Chu trình nhiệt phản ứng đọc trình tự 32
Bảng 3.1. Kết quả kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ ADN tổng số của 10
mẫu Muồng truổng 34
Bảng 3.2. Kết quả giải trình tự vùng ITS-rADN của 10 mẫu Muồng truổng 38
Bảng 3.3. Tỉ lệ %(G+C) và kích thước vùng ITS-rADN của 10 mẫu Muồng truổng 41
Bảng 3.4. Hệ số tương đồng trình tự vùng ITS-rADN giữa 10 mẫu Muồng truổng 45
Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ ADN tổng số của 3
mẫu Xít xa 48
Bảng 3.6. Kết quả giải trình tự vùng ITS-rADN của 3 mẫu Xít xa 51


Bảng 3.7. Tỉ lệ %(G+C) và kích thước vùng ITS-rADN của 3 mẫu Xít xa 52
Bảng 3.8. Hệ số tương đồng trình tự vùng ITS-rADN giữa 3 mẫu Xít xa 54
Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ ADN tổng số của 5
mẫu Dấu dầu xoan 57
Bảng 3.10. Kết quả giải trình tự vùng ITS-rADN của 5 mẫu Dấu dầu xoan 61
Bảng 3.11. Tỉ lệ %(G+C) và kích thước vùng ITS-rADN của 5 mẫu Dấu
dầu xoan 63
Bảng 3.12. Hệ số tương đồng trình tự vùng ITS-rADN giữa 5 mẫu Dấu dầu xoan 66

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Cấu trúc của vùng rADN 3
Hình 1.2. Cấu trúc của vùng ADN ribosom ITS 4
Hình 1.3. Dấu dầu xoan (Tetradium glabrifolium) 15
Hình 1.4. Xít xa (Toddalia asiatica) 17
Hình 1.5. Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae) 19
Hình 2.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu 24
Hình 3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số của 10 mẫu Muồng truổng 33
Hình 3.2. Sản phẩm PCR của 10 mẫu Muồng truổng 35
Hình 3.3. Ảnh điện di plasmid tách từ các khuẩn lạc của 10 mẫu Muồng truổng 36
Hình 3.4. Sản phẩm cắt plasmid bằng enzym giới hạn EcoRI của 10
mẫu Muồng truổng 37
Hình 3.5. So sánh gióng hàng trình tự nucleotid vùng ITS-rADN của 10
mẫu Muồng truổng 42
Hình 3.6. Cây phân loại 10 mẫu Muồng truổng dựa trên so sánh trình tự
ITS-rADN 46

Hình 3.7. Kết quả tách chiết ADN tổng số của 3 mẫu Xít xa 47
Hình 3.8. Sản phẩm PCR của 3 mẫu Xít xa 48
Hình 3.9. Ảnh điện di plasmid tách từ các khuẩn lạc của 3 mẫu Xít xa 49
Hình 3.10. Sản phẩm cắt plasmid bằng enzym giới hạn EcoRI của 3
mẫu Xít xa 50
Hình 3.11. So sánh gióng hàng trình tự nucleotid vùng ITS-rADN của 3
mẫu Xít xa 53
Hình 3.12. Cây phân loại 3 mẫu Xít xa dựa trên so sánh trình tự ITS-rADN 55
Hình 3.13. Kết quả tách chiết ADN tổng số của 5 mẫu Dấu dầu xoan 56
Hình 3.14. Sản phẩm PCR của 5 mẫu Dấu dầu xoan 58
Hình 3.15. Ảnh điện di plasmid tách từ các khuẩn lạc của 5 mẫu Dấu
dầu xoan 59
Hình 3.16. Sản phẩm cắt plasmid bằng enzym giới hạn EcoRI của 5 60

mẫu Dấu dầu xoan
Hình 3.17. So sánh gióng hàng trình tự nucleotid vùng ITS-rADN của 5
mẫu Dấu dầu xoan 63
Hình 3.18. Cây phân loại 5 mẫu Dấu dầu xoan dựa trên so sánh trình tự
ITS-rADN 67
Hình 4.1. Vector tách dòng pCR 2.1 68

1


ĐẶT VẤN ĐỀ
Berberin, một alcaloid có nhân isoquinolin, là hoạt chất có nhiều tác dụng
chữa bệnh như: tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, tác dụng kháng một số động vật
nguyên sinh [1], tác dụng chống ung thư, hạ huyết áp, hạ glucose máu,… [33, 35,
59, 63]. Các tác dụng này đã được chứng minh trên in vio, in vitro và đã được ứng
dụng rộng rãi trong lâm sàng.

Berberin được phát hiện trong 150 loài thuộc nhiều họ thực vật khác nhau,
trong đó ở Việt Nam có: họ Mao lương (Ranunculaceae), họ Hoàng liên gai
(Berberidaceae), họ Tiết dê (Menispermaceae), họ Cam (Rutaceae), họ Anh túc
(Papaveraceae). Với các giá trị làm thuốc rất lớn và tính chất quý hiếm của các loài
trên, chúng đã và đang được khai thác triệt để để làm thuốc, chiết xuất và buôn bán
ở thị trường trong nước cũng như xuất khẩu qua Trung Quốc, dẫn đến cạn kiệt
nguồn tài nguyên các loài thực vật cho berberin ở Việt Nam. Mặc dù nhiều loài
trong số này đã được ghi trong “Sách đỏ Việt Nam” như: Berberis julianae
Schneid, Berberis wallichiana DC., Mahonia baelii (Forti) Carr, Thalictrum
foliolosum DC,… nhưng cho đến nay, ngoài một số nghiên cứu quy mô nhỏ về nhân
giống và bảo tồn, vẫn chưa có công trình nào trong nước nghiên cứu đánh giá, tư
liệu hóa ở mức độ phân tử về đa dạng di truyền các loài cây này một cách sâu rộng
và có hệ thống. Để tiến tới quản lý, bảo vệ và khai thác hợp lý nguồn tài nguyên các
dược liệu chứa berberin nói trên, một dự án đánh giá tiềm năng di truyền các nguồn
gen dược liệu chứa berberin ở Việt Nam được triển khai từ tháng 6 năm 2011 với
các nội dung chính: thu thập và lưu trữ mẫu, phân tích đặc điểm hình thái, chỉ tiêu
nông học; phân tích hàm lượng berberin; phân tích đa dạng di truyền nguồn gen.
Trong phạm vi đề tài luận văn cao học, chúng tôi tiến hành một phần nhỏ
trong dự án, tập trung vào phân tích đa dạng di truyền các loài chứa berberin họ
Rutaceae ở Việt Nam. Hiện nay, trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền, quan hệ
tiến hóa trên thế giới, nhiều chỉ thị phân tử đã và đang được áp dụng rộng rãi làm
tiêu chí đánh giá, trong đó, một trong những chỉ thị được dùng phổ biến nhất là
trình tự vùng phiên mã nội thuộc ADN ribosom nhân (ITS-rADN) do nhiều ưu
điểm về cả giá trị khoa học và khả năng áp dụng thực tế. Do đó, trong đề tài này,
2


chúng tôi tiến hành nghiên cứu về trình tự ITS-rADN nhân của 3 loài dược liệu
chứa berberin họ Rutaceae ở Việt Nam với mục tiêu:
- Xác định được trình tự ITS-rADN nhân của các mẫu thu hái thuộc 3 loài

dược liệu chứa berberin ở Việt Nam gồm: Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae),
Xít xa (Toddalia asiatica), Dấu dầu xoan (Tetradium glabrifolium).
- So sánh độ tương đồng trình tự ITS-rADN nhân giữa các mẫu thu được của
mỗi loài trong 3 loài nói trên để đánh giá sự đa dạng di truyền của dược liệu chứa
berberin họ Rutaceae ở Việt Nam.

3


Chương I. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về vùng phiên mã nội thuộc ADN ribosom nhân (ITS-rADN nhân)
1.1.1. Cấu trúc của ADN ribosom nhân
ADN ribosom (rADN) là các gen mã hóa rARN nằm trong nhân tế bào và
đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài. rADN là gen
có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa cho bất kỳ protein nào. Các bản sao của
gen nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hóa. Phần
lớn trình tự nucleotid trên phân tử rADN tương đối bảo tồn nên được xem là cơ sở
để tìm ra sự tương đồng và khác biệt về di truyền khi so sánh giữa các bậc phân loại
khác nhau [56].
rADN được quan tâm nghiên cứu từ rất sớm với các phương pháp như nhân
dòng và giải trình tự ADN. Ngoài ra trên cơ sở kỹ thuật PCR, một số phương pháp
mới được phát triển gần đây như RFLP, RAPD, AFLP đã được áp dụng để nghiên
cứu tính đa dạng di truyền của sinh vật thay vì phân tích toàn bộ trình tự vùng
rADN.
Cấu trúc của rADN được mô tả trong hình 1.1:

(a): Vị trí của ADN ribosom trên nhiễm sắc thể.
(b): Các đoạn gen (18S-5,8S-26S) xếp liên tiếp nhau trên ADN ribosom
IGS: Vùng đệm giữa các gen; NTS: vùng không phiên mã;
ETS: vùng phiên mã ngoại; ITS: vùng phiên mã nội

Hình 1.1. Cấu trúc của vùng rADN [45]
4


Mỗi đoạn gen lặp lại của rADN gồm các vùng IGS, 18S, ITS1, 5,8S, ITS2 và
26S. IGS là vùng kém bảo tồn nhất của ADNr. Ở đầu kết thúc 5’ của 18S và đầu kết
thúc 3’ của 26S có một vùng được biết đến là vùng phiên mã ngoại ETS (external
transcribed spacer). Các vùng rADN 5,8S, 18S, 26S phiên mã thành các đoạn tiền
rARN riêng rẽ, nằm xen kẽ với các vùng phiên mã nội (ITS) và các vùng phiên mã
ngoại (ETS). Vùng phiên mã 18S tạo thành tiểu đơn vị nhỏ (SSU), vùng 26S cộng
với 5,8S tạo thành tiểu đơn vị lớn (LSU) của ribosom.
Trong các vùng này, vùng 18S và vùng ITS được coi là những marker phân
tử hiện đang được dùng trong nghiên cứu đa dạng di truyền và quan hệ tiến hóa [15,
45, 43].
1.1.2. Cấu trúc của ITS-rADN nhân
Vùng phiên mã nội (ITS) của ADN ribosom thường được sử dụng cho
nghiên cứu phân loại thực vật. Vùng ITS có 3 phần: ITS1, ITS2 và vùng có tính bảo
tồn cao là 5,8S nằm giữa (hình 1.2.).

Vùng ITS
Hình 1.2. Cấu trúc của vùng ADN ribosom ITS [15]
Ở một số loài thực vật có hoa, kích thước của vùng ITS1 và ITS2 thường nhỏ
hơn 300 bp (ITS1: 187-298 bp; ITS2 : 187-252 bp). Vùng tiểu phân 5,8S có kích
thước không đổi là 163-164 bp. Ở thực vật, kích thước của vùng ITS xấp xỉ 650-750
bp ở thực vật hạt kín và khoảng xấp xỉ 1500-3700 bp ở thực vật hạt trần [15, 39].
Vùng ITS1 thường có kích thước lớn hơn vùng ITS2, ví dụ 1 số loài sau:
Adoxaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Canellaceae, Malvaceae, Onagraceae,
Polemoniaceae, Ranunculaceae, Salicaceae, Saxifragaceae, Styracaceae, và
Winteraceae. Ngược lại, ở một số loài vùng ITS2 có kích thước lớn hơn vùng ITS1
5

như: Betulaceae, Cucurbitaceae, Scrophulariaceae và Viscaceae. Ở loài
Solanaceae, 2 vùng này có kích thước bằng nhau [17, 24].
Bảng 1.1. Kích thước và phần trăm G+C của vùng ITS1 và ITS2 của
một số loài thực vật hạt kín [15]

Loài
ITS1 ITS2
Kích thước
(bp)
% G+C Kích thước
(bp)
% G+C
Adoxaceae, Viburnum, 28 loài 224-231 59-69 215-227 59-69
Apiaceae, Daucus, 1 loài 215 49 224 52
Apioideae 204-221 49-58 215-226 43-61
Asteraceae, Madiina, 42 loài 254-261 48-51 216-223 50-53
Asteraceae, Lactucea, 45 loài. 246-253 52-54 220-222 53-58
Betulaceae, Alnu, 11 loài 215-216 58-64 228-229 53-65
Betulaceae, Betula, 3 loài 214-219 62-63 226-231 63-65
Betulaceae, Ostrya,1 loài 215 61 227 62
Brassicaceae, Arabidopsis,1 loài 268 57 187 55
Brassicaceae, Sinapis, 1 loài 265 51 188 54
Canellaceae, Canella, 1 loài 272 63 209 63
Cucurbitaceae, Cucumis, 1 loài 216 56 237 60
Cucurbitaceae, Cucurbita, 2
loài
187-229 51-60 245-525 54-66
Fabaceae, Galegeae, 31 loài 221-231 55-60 207-217 50-54

Fabaceae, Vicia, 1 loài 235 52 208 50
Fabaceae, Vigna, 1 loài 205 60 220 59
Onagraceae, Epilobium, 22 loài 240-244 53-62 211-216 54-60
Malvaceae, Gossypium, 1 loài 287 58 229 60
Malvaceae 277-298 49-53 240 57
Poaceae, Pooideae,10 loài 217-223 55-64 213-221 59-67
6



Loài
ITS1 ITS2
Kích thước
(bp)
% G+C Kích thước
(bp)
% G+C
Poaceae, Sorghum, 1 loài 207 56 217 67
Poaceae, Oryza, 1 loài 194 73 233 77
Polemoniace, 38 loài 242-262 42-65 187-195 48-62
Ranunculace, 27 loài 214-246 198-216
Rosaceae, Fragaria, 1 loài 249 68 207 65
Rosaceae, Maloideae, 20 loài 208-221 65-72 211-224 67-72
Rosaceae, Prunus, 1 loài 242 62 209 69
Rosaceae, Rosa, 1 loài 249 60 207 57
Rosaceae, Spiraea, 1 loài 251 65 230 70
Salicaceae, Populus, 1 loài 214 67 207 70
Saxifragace, 28 loài 256-267 224-238
Scrophulariaceae,Mimulus, 8
loài

189-214 44-49 203-225 45-48
Solanaceae, Lycopersicon, 1 loài

217 68 217 71
Solanaceae, Nicotiana, 1 loài 216 69 217 65
Styracaceae, Styrax, 19 loài 255-264 208-221
Viscaceae, Arceuthobiu, 22 loài 208 31-36 226 30-37
Winteraceae, 11 loài 235-252 213-226

7


1.1.3. Vai trò của ITS-rADN nhân
Trình tự nucleotid của vùng ITS vừa mang tính bảo thủ (ở đoạn 5,8S) vừa
mang tính siêu biến (ở đoạn ITS1 và ITS2) nên cho phép phân biệt được giữa các
đơn vị ở bậc phân loại thấp (dưới giống- genus). Vùng ITS-rADN nhân có khả năng
phản ánh quan hệ giữa những loài có nguồn gốc tiến hóa gần gũi trong khi đó trình
tự nucleotid của vùng 18S, một marker phân tử phổ biến khác có mức độ bảo thủ
quá cao nên không đủ chi tiết để phân định giữa các loài lân cận trong cùng chi [13].
Ưu điểm của vùng ITS trong nghiên cứu phát sinh loài:
- Vùng ITS mang đặc tính di truyền của cả “bố” và “mẹ”, khác với các
marker ADN lạp thể hay ADN ti thể chỉ mang đặc tính di truyền của “mẹ”.
- Với độ lặp lại cao trong ADN ribosom của thực vật, mỗi đoạn ADN được
sắp xếp lặp lại hàng nghìn bản ở nhiễm sắc thể, do đó thuận lợi cho việc phát hiện,
khuếch đại và xác định trình tự ADN ribosom cũng như vùng ITS trên đó.
- Trình tự ITS có tính phổ quát (universal), vì thế các cặp mồi dùng cho phản
ứng khuếch đại đã được thương mại hóa và sử dụng rộng rãi cho các nghiên cứu
khác nhau, không cần phải thiết kế mồi riêng cho mỗi nghiên cứu.
- Vùng ITS có kích thước nhỏ nên dễ dàng khuếch đại.
Với những ưu điểm trên, trình tự nucleotid vùng ITS của rất nhiều loài đã

được nghiên cứu và công bố trong ngân hàng gen thế giới rất phong phú, thuận lợi
cho phân tích và so sánh trình tự gen [45].
Trong nghiên cứu di truyền, vùng phiên mã nội của rADN có một số ứng
dụng quan trọng như: xác định các điểm đột biến trong quá trình hình thành loài,
đánh giá sự tương đồng trình tự ADN, dùng các phần mềm chuyên dụng tạo ra các
cây tiến hóa loài, đánh giá đa dạng di truyền trong phạm vi một bậc phân loại [12].
1.1.4. Ứng dụng của ITS-rADN trong nghiên cứu cây thuốc
Với những ưu điểm nổi trội trên, giá trị dữ liệu về trình tự vùng ITS được sử
dụng phổ biến trong các nghiên cứu phát sinh loài, đánh giá đa dạng di truyền hay
nhận diện dược liệu.
Chi Zanthoxylum có hơn 200 loài như Zanthoxylum piperitum, Zanthoxylum
schinifolium và Zanthoxylum bungeanum. Trong nền y học cổ truyền của Trung
8


Quốc, quả của các loài trong chi này được dùng làm thuốc để điều trị đau thượng vị
và thuốc bổ máu. Zanthoxylum là một chi phức tạp có nhiều điểm khác biệt giữa
các loài, vì vậy phương pháp dựa vào các đặc tính hình thái bên ngoài và các đặc
tính sinh lí không thể phân biệt một cách chính xác quan hệ của các loài. Để giải
quyết khó khăn này, ngày nay các nhà nghiên cứu đã sử dụng trình tự gen để xác
định hệ thống phát sinh loài. Trong nghiên cứu của Sun Yan-Lin đã lựa chọn vùng
ITS để phân biệt các loài trong chi Zanthoxylum. Kết quả nghiên cứu không những
cung cấp trình tự ITS của loài Zanthoxylum piperitum mà còn giúp phân biệt được
Zanthoxylum piperitum với loài Zanthoxylum schinifolium, qua đó giải thích quan
hệ giữa các loài trong chi Zanthoxylum [62].
Một số nghiên cứu ở Việt Nam gần đây trong lĩnh vực cây thuốc bắt đầu
hướng vào phân tích tính đa dạng sinh học ở cấp độ phân tử, dựa trên chỉ thị RAPD
hoặc ADN ribosom ITS. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Nga cho thấy trình tự
ADN vùng gen ITS của 12 mẫu dược liệu thuộc chi Đẳng Sâm có chiều dài giữa
các loài dao động từ 638 đến 650 bp, tỷ lệ GC trong vùng này khoảng từ 60,3% đến

62,5%, có 113 điểm sai khác giữa các loài, chiếm 17,4% trên toàn bộ trình tự, trong
đó có 51 sai khác được tìm thấy ở vùng ITS1, 8 điểm ở vùng 5,8S và 53 điểm ở
vùng ITS2. Trong đó sai khác trong nội loài từ 0,0-0,2%, sai khác giữa các loài khác
nhau đạt đến 15,4%. Nghiên cứu này kết luận sự đa hình trong trình tự nucleotid ở
vùng ITS1 và ITS2 là rất cao, tại đây xảy ra các biến đổi lớn như thêm hoặc mất
một đoạn nucleotid, trong khi đó vùng 5,8S với chiều dài trung bình khoảng 164 bp
là vùng bảo thủ cao, với sự biến đổi rất ít trong trình tự ở tất cả các loài. Trong các
mẫu nghiên cứu, 11 mẫu có trình tự tương đồng hoàn toàn 100% với trình tự ADN
của loài C. javanica trên GenBank, 1 mẫu có trình tự tương đồng hoàn toàn với
trình tự ADN của loài C. tangshen trên GenBank [9].
Trong lĩnh vực nhận diện dược liệu, nghiên cứu của Xing GUO và cộng sự
cho thấy vùng gen ITS cung cấp số lượng thông tin đặc trưng lớn nhất và khả năng
phân biệt tốt nhất 6 mẫu Hedyotis L họ Rubiaceae, phân biệt 14 loài Hedyotis L,
bao gồm cả loài chính thống trong phương thuốc điều trị khối u “Baihuasheshecao”
9


có nguồn gốc từ H. diffusa Willd, và cả loài giả mạo có nguồn gốc từ H. corymbosa
(L.) Lam [60].
1.2. Tổng quan về berberin
Berberin là alcaloid có nhân isoquinolin, có trong nhiều các cây thuộc các họ
khác nhau như: Berberidaceae, Ranunculaceae, Rutaceae, Menispermaceae,
Papaveraceae [7]. Berberin có công thức hóa học:

Các tác dụng đã được phát hiện của berberin bao gồm:
a. Tác dụng kháng khuẩn: Hoạt chất berberin có phổ kháng khuẩn rộng đối với
một số chủng gram (+) và gram (-), berberin có tác dụng ức chế các vi khuẩn
Streptococcus, Pneumococcus, Vibrio cholera, Bacillus anthracis ở nồng độ
1:16.000, Streptococcua viridians, Sh. Shigae, Sh. Flexneri, Bacillus diphtheria, B.
subtilus 1:8.000, B. typhoid 1:1.000. Đối với Vibrio cholera đã được xử lý trước với

berberin đem tiêm truyền cho những con thỏ thì không gây nên những triệu chứng
thổ tả. Điều đó chứng tỏ độc tố của vi khuẩn tả đã bị trung hòa hoặc bị bất hoạt.
Trên những thỏ còn non cho uống trước berberin, sau đó 18 – 24 giờ bơm vào ruột
thỏ một liều độc tố tả gây chết thì phòng ngừa được hiện tượng tiêu chảy do độc tố
gây nên và kéo dài được thời gian sống của thỏ dùng thuốc [1].
Về cơ chế tác dụng kháng khuẩn của berberin, một số tác giả cho rằng có
liên quan đến tác dụng ức chế sinh tổng hợp ARN, ADN và protein của thuốc đối
với vi khuẩn. Nhóm ammonium bậc 4 rất cần thiết cho tác dụng kháng khuẩn,
những dẫn chất không có ammonium bậc 4 như tetrahydroberberin có tác dụng
kháng khuẩn rất yếu [1].
10


Một số nghiên cứu đã được thực hiện cho thấy berberin có thể sử dụng để
chống lại nhiễm khuẩn MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus -
Staphylococcus aureus kháng Methicillin) [64].
b. Tác dụng kháng nấm: Berberin sulfat với nồng độ 10 – 25 mg/ml ức chế sự
sinh trưởng của các nấm Alternaria spp. Aspergillus flavus, A. fumigates, Candida
albicans, Curvularia spp., Drechslera spp., Fusarium spp., Rhizopus oryzae,
Scophulariopsis spp.,… [1].
c. Tác dụng kháng đơn bào: Berberin trên ống kính với nồng độ 1:5000 và trên
chuột nhắt trắng đã gây nhiễm amip với liều 50mg/kg bằng đường uống có tác dụng
ức chế sự sinh trưởng của amip.
Berberin còn có tác dụng diệt Typanosoma brucei rhodesiense với nồng độ
ức chế 50% - IC
50
là 0,4 mg/ml [1].
d. Tác dụng chống ung thư: Berberin được chú ý nhiều nhất tới tác dụng chống
ung thư [53]. Trên in vitro berberin có thể ức chế nhiều loại tế bào ung thư, bao
gồm ung thư vú [32], bệnh bạch cầu, u ác tính [50], ung thư da, ung thư gan, ung

thư tuyến tụy [44], ung thư miệng, ung thư lưỡi [29], u nguyên bào đệm, ung thư
tuyến tiền liệt và ung thư dạ dày [14, 19, 40, 53].
Thử nghiệm trên mô hình chuột Wistar gây ung thư ruột kết bằng DMH cho
thấy berberin có thể ức chế sự hình thành khối u ACF và gây ra bởi DMH + DSS,
Các tác dụng chống khối u của berberin có thể thông qua một con đường chưa biết
rõ nhưng thông qua đó biểu hiện của protein và mARN COX-2 bị ức chế [58]
Berberin có tác dụng tăng cường gây chết tế bào ung thư qua trung gian
TRAIL trong ung thư thận ở người thông qua việc điều hòa giảm c-FLIP và MCL-1
thông qua trung gian ROS [34].
e. Tác dụng hạ huyết áp: Sulfat berberin tiêm truyền tĩnh mạch trên thỏ gây hạ
huyết áp, chậm nhịp tim. Tác dụng này cũng xuất hiện ở những chuột cống trắng đã
cắt dây thần kinh số X ở cả hai bên. Chlorid berberin dùng với liều từ 0,5 – 5 mg/kg
cho thỏ gây mê bằng urethan gây hạ huyết áp kéo dài. Tác dụng hạ huyết áp có thể
do ức chế α –andrenoceptor chứ không phải do tác dụng giãn mạch. Trên tiêu bản
cô lập động mạch phổi thỏ và động mạch vành tim mèo, berberin không có tác dụng
11


giãn mạch trực tiếp nhưng lại đối kháng với hiện tượng co mạch do các thuốc giống
adrenalin gây nên [1].
f. Tác dụng hạ glucose máu: Berberin có tác dụng làm giảm lượng glucose
trong máu tương đương với tác dụng của metformin [63]. Các cơ chế của tác dụng
này bao gồm sự ức chế aldose reductase [59], hoạt hóa enzym đường phân, ức chế
tân tạo đường [63]. Một nghiên cứu mới chỉ ra rằng berberin có thể khắc phục tính
kháng insulin thông qua điều chỉnh các phân tử quan trọng trong con đường dẫn
truyền tín hiệu của insulin [36].
Theo Prabhakar và cộng sự, berberin được sử dụng để tăng tác dụng của
metformin và 2,4-thiazolidinedione, và có thể thay thế một phần các sản phẩm
thuốc thương mại trên thị trường, nhằm làm giảm độc tính và tác dụng phụ của các
thuốc này [47].

Berberin hydroclorid ở nồng độ 150mg/kg theo đường uống, dùng hàng
ngày, mỗi ngày 1 lần trong 3 tuần trên chuột gây đái tháo đường bằng
streptozotocin có tác dụng giảm nồng độ glucose trong máu, cải thiện chức năng
gan, thận, điều hòa nồng độ lipid ở chuột gây đái tháo đường bằng streptozotocin
[41].
1.3. Các dược liệu chứa berberin ở Việt Nam và thế giới
Trên thế giới có khoảng 150 loài thực vật có berberin đã được phát hiện,
thuộc 23 chi (Berberis, Coptis, Corydalis, Dicranostigma, Euodia, Glaucium,
Hydratis, Macleaya, Mahonia, Nandina, Papaver (Papaveraceae), Phellodendron,
Sanguinaria, Sankezhen, Thalictrum, Chelidonium, Cissampelos, Coscinium,
Cyclea, Toddalia, Xanthorhiza, Xylopia, Zanthoxylum) và 7 họ, bao gồm:
Annonaceae, Berberidaceae, Fumariaceae, Menispermaceae, Papaveraceae,
Ranunculaceae, Rutaceae, trong đó các họ chủ yếu là Berberidaceae,
Menispermaceae, Papaveraceae, Ranunculaceae và Rutaceae [2].
Ở Việt Nam thống kê cho thấy berberin có ở 20 loài thực vật thuộc 5 họ khác
nhau là Berberidaceae, Menispermaceae, Ranunculaceae, Rutaceae, Papaveraceae
(Bảng 1.2).
12



Bảng 1.2. Các loài chứa berberin ở Việt Nam
TT

Tên
cây
Tên khoa
học
Họ
Bộ phận

chứa
berberin

Hàm
lượng
alcaloid
toàn
phần
(%)
Hàm
lượng
berberin
(%)
Tài
liệu
tham
khảo

1
Hoàng
liên gai

Berberis
wallichiana
DC.
Berberidaceae Thân, Rễ

3,0 - 4
[1, 5,
7, 8]

2
Hoàng
liên
Kloss
Mahonia
klossi Bak. f.

Berberidaceae [5]
3
Hoàng
liên lá
rộng
Mahonia
baelii (Forti)
Carr.
Berberidaceae Thân, vỏ


0,35 -
2,5
[1, 2,
5]
4
Hoàng
liên Ô
rô
Mahonia
nepalensis
DC.
Berberidaceae Thân, lá 0,3 – 2,5

[1, 5,
7, 8]
5
Mã hồ
thùy
hẹp
Mahonia
leptodonta
Gagnep.
Berberidaceae [3]
6 Cổ An
Arcangelisia
flava (L.)
Merr.
Menispermaceae

[6]
7
Dây kí
ninh
Tinospora
crispa (L.)
Miers.
Menispermaceae

Rễ [8]