Nghiên cứu biểu hiện kháng thể nanobody kháng her2 trong tế bào động vật hek293

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI





VŨ THỊ PHƯỢNG



NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN KHÁNG
THỂ NANOBODY KHÁNG HER2
TRONG TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
HEK293




LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC






HÀ NỘI 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


VŨ THỊ PHƯỢNG




NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN KHÁNG
THỂ NANOBODY KHÁNG HER2
TRONG TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
HEK293


LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC


CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH DƯỢC
MÃ SỐ: 60720408



Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS. Lê Quang Huấn

HÀ NỘI 2014



LỜI CẢM ƠN

Để có được bản luận văn hoàn thiện ngày hôm nay, xin cho phép tôi được
dành những trang đầu tiên để bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới:
Đảng ủy, Ban giám hiệu Trường Đại Học Dược Hà Nội, Phòng đào tạo
sau đại học, Bộ môn Hóa sinh dược, cùng các phòng ban của nhà trường đã
hết sức giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện luận
văn.
Phó giáo sư, Tiến sỹ Lê Quang Huấn – Trưởng phòng Công nghệ tế bào
động vật, Viện Công nghệ sinh học, Người trực tiếp dìu dắt, hướng dẫn tôi cả về
mặt chuyên môn và phương pháp nghiên cứu khoa học trong suốt quá trình thực
hiện đề tài.
Các Thầy giáo, Cô giáo trong hội đồng chấm luận văn Cao học, những
Người đã hết sức tận tình góp những ý kiến vô cùng quý báu giúp tôi hoàn thiện
bản luận văn.
Cuối cùng tôi xin được thành kính bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Bố, đặc
biệt là người Mẹ luôn thầm lặng dõi theo những bước đi của tôi, cảm ơn những
người thân trong gia đình luôn động viên kịp thời để tôi an tâm học tập và
hoàn thiện luận văn. Bên cạnh đó, tôi cũng xin chân thành cảm ơn các anh, các
chị, các bạn và các em, những người đã chia sẻ cùng tôi nhiều kiến thức hỗ trợ
trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 30 tháng 08 năm 2014
Vũ Thị Phượng

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1.

U
NG THƯ VÚ
3
1.1.1. Khái niệm 3
1.1.2. Dịch tễ 3
1.1.3. Các yếu tố nguy cơ 4
1.1.4. Phân loại 7
1.1.5. Điều trị 9
1.2.

K
HÁNG NGUYÊN
HER2
Đ
Ặ
C HI
Ệ
U T

Ế
BÀO UNG THƯ VÚ
9
1.2.1. Khái quát về gen her2 và kháng nguyên HER2 9
1.2.2. Cấu trúc của gen her2 và protein HER2 10
1.2.2.1. Cấu trúc gen her2 10
1.2.2.2. Cấu trúc protein HER2 10
1.2.3. Mô hình cơ chế gây UTV của gen her2 13
1.2.4. Thuốc điều trị ung thư vú với mục tiêu lâm sàng là HER2 14
1.3.

K
HÁI QUÁT CHUNG V
Ề
KHÁNG TH
Ể
VÀ KHÁNG TH
Ể
L
Ạ
C ĐÀ
16
1.3.1. Kháng thể lạc đà 17
1.3.2. Cấu trúc của nanobody 18
1.3.3. Ưu điểm của nanobody 20
1.3.4. Ứng dụng của nanobody 20
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
2.1.

ĐỐ

I TƯ
Ợ
NG NGHIÊN C
Ứ
U
23
2.1.1. Plasmid 23
2.1.2. Dòng vi khuẩn 23
2.1.3. Dòng tế bào 23
2.1.4. Hóa chất 23
2.2.

P
HƯƠNG PHÁP NGHIÊN C
Ứ
U
24
2.2.1. Nhân dòng gen Nb-antiHER2 25
2.2.1.1. Nhân bản gen Nb-antiHER2 bằng kỹ thuật PCR 25
2.2.1.2. Điện di ADN trên gel Agarose 26
2.2.1.3. Tinh sạch sản phẩm PCR 26
2.2.1.4. Phản ứng gắn gen Nb-antiHER2 vào vector pCR2.1 27
2.2.1.5. Thâm chuyển ADN plasmid vào tế bào E. Coli DH5α 27
2.2.1.6. PCR gen Nb – anti HER2 trên khuẩn lạc 28
2.2.1.7. Tinh sạch plasmid 29
2.2.2. Xây dựng cấu trúc vector biểu hiện pEGP-C2 30
2.2.2.1. Tích hợp oligonucleotid 6-histidine vào vector biểu hiện pEGFP – C2 30
2.2.2.2. Cắt vector pEGFP-C2 và plasmid pCR2.1-Nb- anti HER2 bằng enzym
giới hạn 31
2.2.2.3. Tinh sạch sản phẩm cắt giới hạn bằng kit thôi gel Bioneer và gắn gen

mã hóa Nb-antiHER. 32
2.2.3. Thâm chuyển ADN plasmid vào tế bào động vật 33
2.2.3.1. Thâm chuyển pEGFP- Nb - anti HER2 vào tế bào HEK 293 33
2.2.3.2. Kiểm tra gen Nb-antiHER trong tế bào HEK 293 sau khi chuyển gen 34
2.2.4. Phân tích protein thu được 34
2.2.4.1. Phương pháp điện di protein 35
2.2.4.2. Phương pháp Elisa 36
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ 37
3.1.

N
HÂN DÒNG GEN MÃ HÓA KHÁNG TH
Ể
KHÁNG
HER2 37
3.1.1. Nhân bản gen kháng thể kháng HER2 bằng phương pháp PCR 37
3.1.2. Nhân dòng gen Nb-antiHER2 bằng vector nhân dòng pCR2.1 trong tế bào
vi khuẩn E.coli DH5α 38
3.2.

X
ÂY D
Ự
NG C
Ấ
U TRÚC VECTOR TÁI T
Ổ
H
Ợ
P

41
3.3.

T
HÂM CHUY
Ể
N PLASMID P
EGFP-N
B
-
ANTI
HER2
VÀO T
Ế
BÀO Đ
Ộ
NG V
Ậ
T
HEK

293
46
3.4.

PHÂN

TÍCH

PROTEIN

THU

ĐƯỢC 48
3.4.1 Kiểm tra protein thu được bằng SDS-PAGE 48
3.4.2. Kiểm tra hoạt tính kháng thể thu được bằng phản ứng ELISA 49
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 51
4.1.

X
ÂY D
Ự
NG KHÁNG
THỂ
NANOBODY KHÁNG
HER2 51
4.2.

X
ÂY D
Ự
NG PLASMID BI
Ể
U HI
Ệ
N P
EGFP-C2
VÀ T
Ế
BÀO V

Ậ
T CH
ỦHEK293 53
4.3.

KẾ
T QU
Ả
BI
Ể
U HI
Ệ
N KHÁNG TH
Ể
KHÁNG
HER2
TRONG T
Ế
BÀO Đ
Ộ
NG V
Ậ
T
. 54
KẾT LUẬN 55
KIẾN NGHỊ 56

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
bp Cặp bazơ (base pair)
CBB Coomassie Blue Brillant
BSA Albumin huyết thanh bò (Bovine Serum Albumin)
dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate
ddNTP Dideoxyribonucleoside triphosphate
dd H
2
O Nước cất loại ion, khử trùng (deionnized distilled H
2
O)
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside
kb Kilobase
kDa Kilodalton

LB Luria Bertani
OD Mật độ quang học (Optical Density)
PAGE Điện di gel polyacrylamide (Polyarylamide Gel
Electrophoresis)
PBS Muối chứa đệm phosphate (Phosphate Buffered Saline)
PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction)
PMSF Phenyl Methylsulphonyl Fluoride
PVDF Polyvinylidere Fluoride
SDS Sodium Dodecyl Sulphate
TAE Tris base-Acetic-EDTA
TEMED N,N,N’,N’-Tetramethyl-Ethylenediamine
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cấu trúc của HER2
Hình 1.2: Hai con đường truyền tín hiệu qua thụ thể HER
Hình 1. 3: Bất thường trong truyền tín hiệu do biểu hiện quá mức gen her2
Hình 1.4: Các dạng kháng thể từ trái qua phải: kháng thể thông thường, kháng thể
lạc đà, nanobody (VHH)
Hình 1.5: Sự khác biệt của kháng thể nanobody (VHH) và VH của kháng thể thông
thường
Hình 3.1: Điện di đồ sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi Nb-Fw và Nb-Rv.
Hình 3.2: Điện di đồ sản phẩm PCR khuẩn lạc và plasmid pCR2.1-Nb-antiHER2
sau khi tinh sạch
Hình 3.3: Điện di đồ sản phẩm sau khi cắt plasmid pCR2.1-NbG-antiHER2 bằng EcoRI
Hình 3.4: Điện di đồ sản phẩm PCR khuẩn lạc và cắt plasmid bằng enzyme EcoRI
Hình 3.5: Kết quả điện di đồ vector pEGFP-C2 và gen Nb-antiHER2 sau khi cắt bởi
enzyme giới hạn.
Hình 3.6: Điện di đồ sản phẩm sau PCR plasmid pEGFP-Nb-antiHER2 bằng cặp
mồi đặc hiệu.
Hình 3.7: Điện di đồ sau khi cắt plasmid pEGFP-Nb-antiHER2 bằng cặp enzyme
BglII và EcoRI.

Hình 3.8: Phân tích trình tự gen Nb-antiHER2 sau khi thâm chuyển vào vector pEGFP-
C2.
Hình 3.9: Hình ảnh tế bào HEK 293 sau thâm chuyển 2 ngày
Hình 3.10: Điện di đồ sản phẩm PCR ADN tổng số tách từ tế bào HEK 293 sau thâm
chuyển.
Hình 3.11: Điện di đồ biểu hiện ban đầu của tế bào HEK 293 sau thâm chuyển.
Hình 3.12 : Kết quả phản ứng ELISA
Hình 3.13 : Biểu đồ kết quả xác định khả năng nhận biết và gắn kết của phức hệ
kháng nguyên kháng thể bằng kỹ thuật ELISA


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Thành phần của phản ứng PCR khuếch đại gen Nb-anti Her2
Bảng 2.2: Thành phần của phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pCR2.1
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng PCR gen Nb-antiHER2 trên khuẩn lạc
Bảng 2.4: Thành phần phản ứng cắt cắt vector pEGFP-C2 và plasmid pCR2.1-
Nb- anti HER2 bằng enzyme giới hạn
Bảng 2.5: Thành phần phản ứng gắn gen mã hóa Nb-antiHER2 vào vector biểu
hiện pEGFP-C2
Bảng 2.6: Thành phần gel tách mẫu và gel cô mẫu
Bảng 3.1 : Kết quả đo quang phổ sản phẩm phản ứng ELISA

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư vú là ung thu phổ biến nhất đối với phụ nữ và là nguyên nhân thứ
2 gây tử vong do ung thư ở nữ giới, chiếm khoảng 10% trên toàn bộ các ca gây
tử vong ở các nước phương Tây. Tại Việt Nam năm 2010 ước tính có khoảng
12.533 trường hợp mới mắc, cao gấp đôi so với năm 2000 với 5.538 trường hợp.
Tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi là 30/100.000 phụ nữ, đứng đầu trong ung thư nữ giới,
cao gấp đôi so với loại ung thư xếp thứ 2 là ung thư đại trực tràng 15/100.000
phụ nữ [3].
HER2 là một loại thụ thể thuộc họ các yếu tố phát triển biểu mô (Human
Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR), có hoạt tính tyrosine kinase, đóng
vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và biệt hoá tế bào. Biểu hiện quá
mức HER2 có thể biến đổi tế bào thành dạng ác tính và làm tăng quá trình hình
thành khối u. Theo nhiều nghiên cứu gần đây, khoảng 25-30% bệnh nhân ung
thư vú cho thấy có sự khuếch đại gen her2 hoặc biểu hiện quá mức gen này trong
các tế bào ung thư.Thời gian kéo dài sự sống và thời gian tái phát bệnh nhân ung
thư vú dương tính HER2 là ngắn hơn đáng kể so với bệnh nhân không có biểu
hiện quá mức HER2. Theo các nghiên cứu in vitro cho thấy rằng ức chế biểu
hiện HER2 gây ra sự chết theo chương trình (apoptosis) đáng kể trong các tế bào
ung thư vú. Đặc điểm này làm cho HER2 trở thành một marker hữu hiệu để chẩn
đoán và điều trị ung thư vú cũng như đích tấn công một số ung thư biểu mô khác
[48].
Điều trị ung thư vú cũng như nhiều loại ung thư khác theo các liệu pháp
truyền thống như hoá trị liệu và xạ trị liệu mặc dù hiệu quả tiêu diệt khối u cao
nhưng lại có một nhược điểm rất lớn, đó là tác dụng lên cả các cơ quan bình
thường xung quanh. Mặt khác, các phương pháp này đa phần chỉ áp dụng đối với
trường hợp các khối u đã phát triển và ở giai đoạn muộn nên có hiệu quả điều trị
thấp. Hiện nay, 2 kháng thể đơn dòng được FDA phê chuẩn dùng trong điều trị

ung thư vú dương tính HER2 là tratuzumab và petuzumab. Đây là 2 kháng thể
2

hoàn chỉnh có kích thước lớn nên còn một số hạn chế như khó thâm nhập vào khối
u dẫn đến hiệu quả điều trị không cao, chi phí sản xuất lớn nên giá thành còn quá
cao vì vậy bắt đầu có hiện tượng kháng thuốc [12].
Để góp phần nghiên cứu nhằm tạo các bộ kít chẩn đoán và các loại thuốc có
hiệu quả điều trị cao đối với dạng ung thư vú dương tính với HER2 chúng tôi
tiến hành đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện kháng thể nanobody kháng HER2
trong tế bào động vật HEK293”. Với mục tiêu chính là: Tạo được kháng thể
nanobody tái tổ hợp đặc hiệu với kháng nguyên HER2 trong tế bào động vật
HEK293.
3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Ung thư vú
1.1.1. Khái niệm
Bệnh ung thư là bệnh lý ác tính của tế bào, khi bị kích thích bởi tác nhân
gây ung thư, tế bào tăng sinh một cách vô hạn độ, vô tổ chức không tuân theo
các cơ chế kiểm soát về phát triển của cơ thể [1].
Ung thư vú (UTV) là một khối u ác tính được phát triển từ các tế bào vú.
Thông thường UTV hoặc là khởi phát trong các tế bào có khả năng sản sinh sữa
của tiểu thùy tuyến vú, hoặc là trong các ống dẫn sữa từ các tiểu thùy ra núm vú.
Ít phổ biến hơn, UTV có thể khởi phát trong các mô đỡ nơi chứa các mô liên kết
dạng sợi và các mô mỡ của vú [2].
1.1.2. Dịch tễ
Trên thế giới, UTV là ung thư hàng đầu của phụ nữ, chiếm 16% trong
tổng số các ung thư trên nữ giới. Tỷ lệ mắc bệnh ngày càng tăng và làm cho
ung thư vú trở thành bệnh ung thư nguy hiểm nhất gây tử vong ở nữ giới. Ước
tính trên toàn thế giới có hơn 1,1 triệu ca mắc mới và hơn 410.000 bệnh nhân

tử vong hàng năm [18].
Theo thống kê năm 2010, tỷ lệ mắc UTV tại Hà Nội là 30/100.000 dân và
tại Thành phố Hồ Chí Minh là 20/100.000 dân.
Tỷ lệ mắc UTV có khoảng dao động động lớn giữa các nước. Bệnh có tỷ lệ
mắc cao nhất ở Hoa Kỳ và Bắc Âu, tỷ lệ mắc trung bình ở Nam Âu, Tây Âu và
thấp nhất ở Châu Á. UTV có xu hướng tăng lên ở tất cả các nước đặc biệt là các
nước có lối sống phương Tây hóa một cách nhanh chóng như Nhật Bản,
Singapore và cả Việt Nam.
Người ta nhận thấy tỷ lệ mắc UTV tăng gấp 2 lần so với những năm 50 thế
kỷ XX ở một số nước có nền công nghiệp phát triển mạnh trong những năm qua
4

như Nhật Bản, Singapore, một số các thành phố Trung Quốc… Sự ra tăng nhanh
chóng tỷ lệ mắc ở các vùng này có thể giải thích do sự thay đổi về lối sống, kinh
tế phát triển, ngày càng có nhiều phụ nữ làm việc trong lĩnh vực công nhiệp, tuổi
thọ trung bình tăng, thay đổi về sinh sản, chế độ ăn…
UTV hiếm gặp ở lứa tuổi dưới 30. Sau độ tuổi này, tỷ lệ mắc bệnh ra tăng
một cách nhanh chóng. Tỷ lệ mắc ung thư dao động ít ở độ tuổi ngay trước và
sau mãn kinh. Điều này gợi ý rằng UTV là loại ung thư có liên quan mật thiết
với nội tiết.
Tỷ lệ chết do UTV tăng theo tỷ lệ mắc. Tuy nhiên, ở một số nước phát triển
mặc dù tỷ lệ ra tăng nhanh chóng nhưng tỷ lệ chết vẫn giữ được ở mức độ ổn
định nhờ các tiến bộ trong sàng lọc phát hiện sớm và thành tựu đạt được trong
điều trị, đặc biệt là điều trị hệ thống [2].
1.1.3. Các yếu tố nguy cơ
Cho đến nay, căn nguyên của bệnh sinh UTV chưa được rõ. Tuy nhiên, các
nhà nghiên cứu đã tìm ra yếu tố nguy cơ gây bệnh bao gồm:
Các yếu tố nội tiết
Ảnh hưởng của hormone với sự phát triển của UTV đã được nghiên cứu.
Estrogen thúc đẩy sự phát triển và hoạt động tăng sinh của hệ thống ống làm tăng

nguy cơ UTV do sự khích thích tăng sinh các tế bào chưa biệt hóa. Progestin gây cả
phát triển cả biệt hóa của các tế bào biểu mô và sau đó ảnh hưởng đến quá trình bảo
vệ. Androgen làm giảm hoạt động tăng sinh của biểu mô tuyến vú và có vai trò bảo
vệ. Prolactin khích thích và duy trì tiết sữa của những tế bào phụ thuộc estrogen và
liên quan đến chức năng của những tế bào đã biệt hóa, vì thế nó không được coi là
yếu tố nguy cơ trong UTV. Trên thực tế có nhiều bằng chứng cho thấy ảnh hưởng
của hormon đến nguy cơ UTV như:
- Nồng độ estrogen nội sinh ở phụ nữ bị UTV cao hơn so với những người
bị ung thư.
5

- Điều trị nội tiết có hiệu quả với những bệnh nhân UTV có thụ thể
estrogen dương tính.
- Tỷ lệ UTV gặp ở đàn ông rất thấp (dưới 1% trong tổng số UTV ở cả
hai giới).
- Những người có kinh nguyệt sớm, mãn kinh muộn, nguy cơ UTV cao.
Tiền sử kinh nguyệt và sinh sản
Phụ nữ có kinh lần đầu trước tuổi 13 nguy cơ UTV cao gấp 2 lần so với
những phụ nữ có kinh ở tuổi 13 hoặc lớn hơn. Tuổi mãn kinh cũng liên quan
đến nguy cơ UTV, phụ nữ nãn kinh sau tuổi 55 có nguy cơ cao gấp 2 lần so
với những phụ nữ mãn kinh trước tuổi 45.
Số lần đẻ cũng là một yếu tố quan trọng. Phụ nữ chưa sinh đẻ lần nào có
nguy cơ mắc UTV cao hơn so với phụ nữ đã sinh đẻ một hoặc nhiều lần. Phụ
nữ có thai lần đầu trên 30 tuổi có nguy cơ UTV tăng từ 4 đến 5 lần so với phụ
nữ đẻ con trước tuổi 20. Phụ nữ không có con có nguy cơ ung thư vú tăng gấp
đôi so với những phụ nữ có từ 1 đến 2 con.
Một số nghiên cứu tại Mỹ cũng chỉ ra rằng việc phá thai có sử dụng chất
kích thích có thể làm tăng nguy cơ ung thư vú. Nạo phá thai vào tuần thứ 9 đến
tuần thứ 12 cũng làm tăng nguy cơ ung thư vú gấp 2 lần.
Hormon tránh thai và hormone thay thế

Có nhiều nghiên cứu đã đưa ra các quan điểm khác nhau về mối liên quan
giữa việc sử dụng hormone tránh thai và nguy cơ UTV. Tuy nhiên một số tác giả
lại bác bỏ mối liên quan giữa hai yếu tố này. Nguy cơ tiềm tàng đối với sự phát
triển UTV thứ phát do sử dụng hormone thay thế cần phải được xem xét lại về
lợi ích của nó như làm giảm nguy cơ tim cấp, bệnh tim do thiếu máu cục bộ.
Việc sử dụng hormone thay thế cần cân nhắc kỹ để xem xét những mặt lợi và
mặt hại của nó nhằm đạt được kết quả mong muốn nhất trên từng bệnh nhân.
Tiền sử gia đình
6

Phụ nữ có tiền sử gia đình UTV đều tăng nguy cơ mắc bệnh này, sự tăng
nguy cơ còn phụ thuộc vào người thân gần gũi ở mức nào và có bao nhiêu người
thân bị UTV. Phụ nữ có mẹ bị UTV trước tuổi 40 nguy cơ phát triển UTV tăng
gấp 2 lần so với những phụ nữ không có mẹ bị UTV. Nguy cơ UTV giảm nếu
người mẹ của phụ nữ đó ở tuổi cao tại thời điểm chẩn đoán UTV. Phụ nữ nếu có
chị hoặc em gái bị UTV thì nguy cơ UTV cũng tăng gấp đôi và tỷ lệ tăng lên gấp
2,5 lần nếu cả mẹ và chị hoặc em gái bị ung thư vú.
Từ đầu thập niên 90 các chương trình nghiên cứu về gen đã bắt đầu được
tiến hành. Có 6 gen được chú trọng nghiên cứu và có khả năng nhiều liên quan
đến UTV là BRCA1, BRCA2, P53, Cowden, AR (DNA rogen receptor gene) và
TA (ataxia telangiectasia gene) có liên quan nhiều đến ung thư cũng đang được
chú trọng nghiên cứu (bảng 1.1).
Bảng 1.1: Những gen liên quan tới nguy cơ mắc UTV có tính di truyền [2]
Gen Tỷ lệ
Liên quan
tới UTV
Vị trí tr
ên
NST
Ung thư đang xác định

BRCA1 Hiếm Cao 17q21 Vú nữ, buồng trứng
BRCA2 Hiếm Cao 13q12-13 Vú nữ, nam, buồng trứng
p53 Hiếm Cao 17p13.1
Sarcom vú, thư
ợng thận,
não, bạch cầu
Cowden Hiếm Cao 10q22-23 Vú
AR Hiếm Chưa rõ Xq11.2-12 Vú nam
TA Thường gặp Thấp 11q22-23 Tăng sinh lympho
Tuổi
Nguy cơ mắc UTV tăng theo tuổi, trên thực tế rất hiếm gặp bệnh nhân
UTV dưới tuổi 20, thậm chí cũng hiếm gặp tại độ tuổi 20 – 30. Tuy nhiên tỷ
lệ mắc UTV dao động ít ở độ tuổi trước và sau mãn kinh, đây có thể là gợi ý
căn nguyên của bệnh có liên quan đến yếu tố nội tiết.
Ảnh hưởng của phóng xạ
7

Những bức xạ ion hóa được coi là tác nhân gây ung thư bởi nó phá hủy
DNA trong các tế bào nguồn.
Ảnh hưởng của chế độ dinh dưỡng:
Tại các nước phương Tây, chế độ ăn nhiều mỡ được coi là một nhân tố
gây ung thư, tuy nhiên kết luận của các nghiên cứu về vấn đề này chưa thực
sự thống nhất. Béo phì đặc biệt là béo nửa người trên là yếu tố nguy cơ cao
gây UTV và giảm tỷ lệ sống đối với bệnh nhân này.
Rượu cũng được coi là yếu tố tăng nguy cơ UTV. Uống rượu quá nhiều
và kéo dài sẽ gây cản trở chuyển hóa estrogen tại gan do dó gây tăng nồng độ
estrogen trong máu.
Các yếu tố khác
Theo một số nghiên cứu tại Canada thì việc sử dụng kéo dài thuốc chống
trầm cảm trên một số bệnh nhân làm tăng tỷ lệ ung thư vú.

Có nhiều nghiên cứu về vai trò của thuốc lá với UTV nhưng các kết quả
chưa thực sự thống nhất.
Yếu tố virus: một số nhà nghiên cứu tìm hiểu một số retrovirus có trong
mèo, chuột có thể liên quan đến UTV người xong mối liên quan chưa được
nhiều người công nhận [2].
1.1.4. Phân loại
UTV có thể được phân loại bằng nhiều cách phụ thuộc vào các đặc tính,
giai đoạn phát triển của bệnh. Cụ thể như sau:
Theo bệnh học (pathology): phân loại dựa trên sự biểu hiện về mô học bao
gồm ung thư xâm lấn ống biểu mô (invasive ductal carcinoma), hình thành khối
u ác tính ở các ống của tuyến vú (breast’s ducts), sự xâm lấn các thùy vú (lobular
carcinoma) và ung thư ác tính các thùy vú.
Theo mức độ phát triển của khối u (grade of tumor): phương pháp này được
xác định dựa trên các cấp độ mô học của khối u dưới kính hiển vi gồm giai đoạn
8

nhẹ (low grade - sự sai khác ít giữa tế bào bình thường với tế bào ung thư), giai
đoạn nặng (high grade - có khối u khác biệt so với mô bình thường do tế bào bị
rối loạn chức năng), và giai đoạn vừa (intermediate grade - nằm trong khoảng hai
mức biểu hiện trên).
Theo sự biểu hiện của gen và protein: Tất cả các dạng của UTV có thể kiểm
tra sự biểu hiện hoặc những ảnh hưởng có thể nhận biết của ER (estrogen
receptor), PR (progesterone receptor) và protein HER2/neu. Hiện nay có nhiều
gen hoặc protein đã và đang được nghiên cứu như các dấu hiệu chuẩn (marker)
dùng cho chẩn đoán bệnh UTV.
Theo các giai đoạn của khối u: Đây là hệ thống phân loại miêu tả sự phát
triển của khối u trong cơ thể bệnh nhân. Trong đó, T (tumor) miêu tả kích thước
của khối u, N (lymph nodes) miêu tả các hạt lympho có liên quan và M
(metastatic) dùng để miêu tả sự di căn. Hệ thống phân loại này được xây dựng và
phát triển bởi UICC (International Union Against Cancer), nó cũng được AJCC

(American Joint Committee on Cancer) sử dụng và được thống nhất thành một
hệ thống phân loại với UICC vào năm 1987. Trong đó các đặc tính trên lại có
các cấp độ phân loại nhỏ hơn như sau: (i) Có 5 mức phân loại khối u (Tis, T1,
T2, T3, và T4). Điểm khác nhau ở các cấp độ phụ thuộc vào sự có mặt hoặc
không của việc xâm lấn, hướng xâm lấn, và sự xâm lấn ra các cơ quan bên ngoài
vú (như phần da của vú, cơ hay dưới lồng ngực); (ii) Có 4 mức độ phân loại dựa
trên hạt lympho (N0, N1, N2 và N3), dựa vào số lượng, kích cỡ và vị trí của tế
bào ung thư vú có mặt trong hạt lympho; (iii) Có 2 mức phân loại dựa trên sự di
căn (M0 và M1), dựa trên sự có hay không có mặt của các tế bào UTV ngoài các
vị trí ở vú.
Một trong các hệ thống phân loại phổ biến hiện nay là hệ thống phân loại
của Tổ chức Y tế thế giới WHO. Hệ thống này phân loại UTV thành 4 kiểu
chính (hình 1): (1) Ung thư không xâm lấn (tại chỗ) gồm có ung thư ống tuyến
tại chỗ và ung thư tiểu thùy tại chỗ; (2) Ung thư thâm nhiễm gồm có ung thư ống
tuyến thâm nhiễm và ung thư tiểu thùy thâm nhiễm; (3) Ung thư viêm nhiễm; (4)
9

Bệnh paget núm vú [2].
1.1.5. Điều trị
Có nhiều phương pháp điều trị UTV, nhưng đối với những giai đoạn muộn
mặc dù đã có nhiều tiến bộ (phẫu trị, hóa trị, xạ trị, nội tiết) tỷ lệ tử vong vẫn còn
rất cao.
- Phẫu trị: bao gồm phẫu thuật bảo tồn như cắt khối u, nạo hạch nách sau đó
xạ trị đối với các khối u < 3cm, ung thư hai ổ, ung thư tại chỗ lan tỏa.
- Xạ trị: có tác dụng điều trị bổ túc, xạ trị có hệ thống sau phẫu thuật tận
gốc để làm giảm nguy cơ tái phát.
- Hóa trị: là dùng thuốc kháng ung thư có tác dụng điều trị toàn thân. Hóa
trị được sử dụng khi có các yếu tố nguy cơ tái phát, là phương pháp điều trị hỗ
trợ rất cần thiết nhưng có nhiều tác dụng phụ và rất tốn kém.
- Liệu pháp đích: Các liệu pháp ung thư đích là các liệu pháp điều trị dựa

trên các đặc tính đặc hiệu của các tế bào ung thư, ví dụ như protein. Các liệu
pháp đích thường ít gây hại đến các tế bào khỏe mạnh bình thường hơn liệu pháp
hóa học. Một vài liệu pháp đích là các kháng thể mà có cơ chế hoạt động giống
với các kháng thể được tạo ra trong tự nhiên bởi hệ thống miễn dịch của chúng
ta. Những loại liệu pháp đích này đôi khi được gọi là các liệu pháp đích miễn
dịch [2].
1.2. Kháng nguyên HER2 đặc hiệu tế bào ung thư vú
1.2.1. Khái quát về gen her2 và kháng nguyên HER2
Đặc điểm của các kháng nguyên trên bề mặt các tế bào ung thư là luôn luôn
biến đổi để trốn tránh sự kiểm soát của hệ thống miễn dịch, do đó việc chọn lựa
phân tử biểu thị trên bề mặt làm chỉ thị cho tế bào ung thư là rất cần thiết. Đối
với mỗi dạng ung thư đều có một hoặc một vài kháng nguyên đặc trưng cho nó.
Với UTV, gen her2 là một gen chỉ thị đặc trưng được nhiều nhà khoa học quan
10

tâm do nó có tính ổn định cao và số bản lặp lại trong hệ gen thấp thuận tiện cho
việc tách và nghiên cứu [11, 17,38].
Vị trí của gen her2 gần tâm động của nhiễm sắc thể 17 và ở vị trí q11.2-
q12.0. Đối với phương pháp lai phân tử, từ tần xuất có phát màu có thể tính
được số bản sao của gen. Ngoài ra có thể quan sát trực tiếp sự biểu hiện của
HER2 trên bề mặt các tế bào ung thư khi sử dụng phương pháp lai miễn dịch
huỳnh quang, đây cũng chính là phương pháp sử dụng để phát hiện UTV dựa
trên cơ sở miễn dịch phân tử [36, 52, 54].

1.2.2. Cấu trúc của gen her2 và protein HER2
1.2.2.1. Cấu trúc gen her2
Gen her2 thuộc họ gen mã hóa các yếu tố phát triển biểu mô (Human
Epidermal Growth Factor Receptor). Nó còn có các tên gọi khác như v-erb-b2,
Neu, tkr1, ngl, her 2, nằm ở nhiễm sắc thể số 17, gần với tâm động, ở vị trí
q11.2, q12.0. Her2 là một gen tiền ung thư (proto-oncogen) có chiều dài 30528

bp chứa 27 exon, tổng chiều dài các exon là 4477 bp trong đó exon dài nhất có
969 bp, exon ngắn nhất có chiều dài 48 bp, gen này có 3 bản sao tương đồng
tương ứng với 3 allele B1 (Ile-654/Ile655); allele B2 (Ile-654/Val-655); allele B3
(Val-654/Val-655). Mặc dù kích thước gen her2 trong hệ gen là rất lớn nhưng
quá trình hiệu chỉnh sau khi phiên mã tạo ra mARN trưởng thành với khoảng
1800 bp [28, 48].
1.2.2.2. Cấu trúc protein HER2
HER2 là thành viên của họ thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu bì có hoạt tính
tyrosine kinase (EGFR – Epidermal Growth Factor Receptor) nằm trên bề mặt tế
bào ở người, nó tương đương với protein NEU ở chuột. Các thành viên của họ thụ
thể này có vai trò quan trọng đối với sự sinh sản, biệt hóa và phát triển của tế bào.
Thụ thể có hoạt tính tyrosine kinase là các thụ thể nằm trên bề mặt tế bào có ái lực
cao đối với các nhân tố phát triển (GF – Growth Factor) có bản chất là polypeptid,
11

các cytokin và các hormon. Trong số khoảng 90 gen mã hóa cho thụ thể tyrosine
kinase ở người đã được biết đến, có khoảng 58 gen mã hóa cho các thụ thể tyrosine
kinase có bản chất là protein. Thụ thể tyrosine kinase có vai trò điều hòa, giúp cho
các quá trình trong tế bào được diễn ra bình thường, ngoài ra nó còn là nguyên nhân
hình thành và phát triển của nhiều dạng ung thư trong đó có UTV [7].
Họ các thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu mô gồm 4 loại thụ thể: HER-1,
HER-2, HER-3 và HER-4. Trong đó, được biết đến và được nghiên cứu nhiều
nhất là HER-2. Đây là một protein có khối lượng phân tử khoảng 185 kDa (còn
được gọi là p185HER2), cấu trúc không gian của nó gồm 3 phần:
+ Một vùng ngoại bào giàu Cystein có chứa phần đầu N của thụ thể. Nằm ở
vùng ngoại bào này là một vùng lớn có khả năng gắn kết với các yếu tố tăng
trưởng biểu mô.
+ Vùng xuyên màng lipid.
+ Vùng nội bào có chứa đuôi C có mang các gốc tyrosine được phosphoryl
hóa chịu trách nhiệm cho hoạt tính tyrosine kinase của thụ thể.

Hình 1.1: Cấu trúc của HER2 [7]
(1): Vùng ngoại bào gồm có 2 vùng liên kết với chất cảm ứng LD1, LD2 (Ligand
binding regions); (2): Hai vùng giàu Cystein (CR1 và CR2); (3): Một vùng xuyên
12

màng (TM – transmembrane); (4): Một vùng có hoạt tính tyrosine kinase (TK); (5):
Một đuôi Cacboxyl (CT – Carboxyl terminal)
Thụ thể HER2 bao gồm phần ngoại bào khoảng 632 axit amin, vùng xuyên
màng đơn chuỗi dài 22 axit amin và vùng tyrosine kinase nội bào được cấu trúc
từ 580 axit amin. Vùng ngoại bào của HER2 gồm 4 tiểu vùng: Tiểu vùng I bao
gồm các gốc axit amin từ vị trí số 1 đến vị trí 195 (SEQ1); tiểu vùng II từ 196 - 319
(SEQ2); tiểu vùng III từ 320 - 488 (SEQ3); tiểu vùng IV từ 489 -630 (SEQ4). Thụ
thể HER bình thường tồn tại ở trạng thái đơn phân bất hoạt. Sự hoạt hóa thụ thể xảy
ra khi có phối tử bám vào và làm hoạt hóa một dãy các quá trình dẫn đến sự nhị hợp
giữa các thụ thể, và cuối cùng làm trung gian cho các quá trình sinh học như sự tăng
trưởng và biệt hóa tế bào [7, 8, 10].
Thụ thể HER2 không cần có các chất liên kết để hoạt hóa mà cấu trúc của
nó luôn luôn trong trạng thái “mở”, bắt chước trạng thái liên kết với phối tử, làm
cho nó có khả năng hình thành trạng thái nhị hợp (dimer) với bản thân nó hoặc
với các thành viên khác trong họ như HER1, HER3, HER4 mà chúng ở trạng
thái đã liên kết với phối tử để hoạt động. Quá trình nhị hợp ở vùng ngoại bào làm
hoạt hoá vùng xuyên màng của thụ thể, dẫn đến sự tự phosphoryl hóa hàng loạt
gốc tyrosine của vùng nội bào. Các gốc đã được phosphoryl hoá đó hoạt động
như một trung tâm liên kết của protein có chứa Src homology 2 (SH2) hoặc vùng
liên kết phosphotyrosine (PTB). Nó còn gồm có các protein liên kết như Shc,
Crk, Grb2, Grb7; kinase như phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), protein
phosphatase tyrosine như SHP1 và SHP2 và yếu tố trao đổi nucleotid guanidin
như SOS. Mỗi thụ thể đều có một vùng liên kết riêng khác biệt, qua đó sẽ hình
thành các phức hệ protein nối khi có sự phosphoryl hóa. Điều này dẫn đến hàng

loạt các con đường mà chúng kích hoạt. Hai con đường quan trọng nhất được
hoạt hoá bởi sự nhị hợp trong họ HER là PI3K/Akt kích hoạt cho các tế bào khối
u sống sót và con đường hoạt hoá MAPK (mitogen – Activated protein kinase)
kích thích quá trình biệt hoá tế bào (hình 1.2). Cả hai con đường này đều dẫn truyền
tín hiệu đến đích cuối cùng là nhân và kích hoạt sự hoạt động của gen đích [25, 45].
13


Hình 1.2: Hai con đường truyền tín hiệu qua thụ thể HER
1.2.3. Mô hình cơ chế gây UTV của gen her2
Sự biểu hiện quá mức của gen her2 là tác nhân làm tăng dimer hóa giữa thụ thể
HER2 với chính nó và các thụ thể khác (HER1, HER3). Đó cũng là những tín hiệu
khởi đầu cho các con đường sinh ung thư khác nhau. Tuy nhiên mối liên quan giữa
các con đường đó vẫn chưa được làm sáng tỏ. Dưới đây là một đề xuất của Moasser
về con đường sinh ung thư do sự biểu hiện quá mức của HER2.
Biểu hiện quá mức của gen her2 là nguyên nhân của sự tăng dimer hóa HER2-
EGFR dẫn tới sự tăng sinh và sự xâm lấn của tế bào. Sự tăng dimer hóa đồng hình
HER2 làm mất tính phân cực của tế bào. Sự tăng dimer HER2-HER3 có ảnh hưởng tới
sự tăng sinh, khả năng tồn tại, tính xâm lấn và chức năng trao đổi chất của tế bào. Tăng
biểu hiện quá mức của HER2 dẫn tới tăng cường độ truyền tín hiệu nội bào. Những sự
thay đổi biểu hiện gen ở mức dư thừa dẫn đến một vài yếu tố phiên mã được cảm ứng
trong các tế bào có sự biểu hiện quá mức HER2.
Feldman và cộng sự đã đưa ra mô hình về con đường truyền tín hiệu của
những thụ thể hoạt động này (hình 1.3). Ở trạng thái hoạt động, nó kích thích
con đường truyền tín hiệu phosphatidyl inositol 3′-kinase (PI3K) thông qua việc
gắn tiểu phần p85 vào Akt, dẫn tới hoạt hóa Akt. Akt làm bất hoạt các phân tử
14

tiền apoptosis bao gồm Bad, caspase-9, và p53. Hơn thế nữa, sự hoạt hóa các yếu
tố phiên mã B (nuclear factor B) còn kích ứng sự biểu hiện của các gen kháng

apoptosis thông qua các protein c-IAP1-2, TRAP 1-2, và A1/Bfl-1. Kết quả của
sự tăng sinh này cũng là một trong những nguyên nhân dẫn tới quá trình hình
thành ung thư [14, 20].

Hình 1. 3: Bất thường trong truyền tín hiệu do biểu hiện quá mức gen her2
Ở tế bào bình thường, gen her2 chỉ tồn tại hai bản sao, còn ở tế bào UTV có
thể có tới 25 - 30 bản sao của gen her2 và làm tăng 40 - 100 lần sự biểu hiện của
protein HER2 (lên đến hơn 2 triệu thụ thể trên bề mặt tế bào khối u), từ đó qua
các con đường dẫn truyền khác nhau, tín hiệu được truyền vào bên trong tế bào
đến nhân và kích hoạt gen đích hoạt động, phiên mã và dịch mã mà tế bào không
kiểm soát được [38].
1.2.4. Thuốc điều trị ung thư vú với mục tiêu lâm sàng là HER2
Có một số liệu pháp đích điều trị ung thư vú do biểu hiện quá mức của
HER2 như: Lapatimid (
Tykerb ,
GlaxoSmithKline, London, Anh) – thuốc tương
tác với vùng nội bào của HER2 qua đó lấy đi tín hiệu cần thiết cho sự phát triển
15

của khối u, kháng thể đơn dòng Trastuzumab (Herceptin, Genentech, South San
Francisco, Mỹ)– thuốc tương tác với các miền khác nhau trên một phần ngoại
bào của HER2 do đó thuốc làm ngăn chặn khả năng để nhận các tín hiệu hóa
học cho biết của tế bào ung thư phát triển, và Pertuzumab (Hohman – La Roche,
Basel, Thụy Điển)- liên kết với vùng nhị hợp của HER2 và bất hoạt quá trình nhị
hợp của thụ thể HER2 với chính nó hoặc với các thành viên khác trong họ HER,
qua đó làm bất hoạt cả chất liên kết hoạt hóa tín hiệu HER2. Trong một số
nghiên cứu, Pertuzumab không giống như Herceptin, nó được phát hiện là có
hoạt tính trong cả khối u không có sự biểu hiện mạnh HER2. Hiện nay, áp dụng
Trastuzumab trong điều trị ung thư vú với biểu hiện quá mức của HER2 đã cho
thấy một hiệu quả đáng kể trong các khối u di căn. Hơn thế nữa trong thử

nghiệm lâm sàng pha III đã đánh giá vai trò của Trastuzumab khi sử dụng cùng
các tác nhân hóa trị liệu khác như Paclitaxel và một Anthracycline dẫn đến sự ra
tăng hiệu quả điều trị. Với những lý do trên Trastuzumab được sử dùng là thuốc
kê đơn đầu bảng cho bệnh nhân ung thư vú dương tính với HER2 [12].
Bất chấp những thành công đã thấy được của Trastuzumab, nhiều bệnh nhân
không đáp ứng hoặc đáp ứng thấp. Theo nghiên cứu, gần 15% bệnh nhân sử dụng
Trastuzumab đi kèm hóa trị liệu, khối u vẫn tiếp tục phát triển. Nguyên nhân của vấn
đề trên là do thiếu tiên lượng và chẩn đoán trong giai đoạn đầu của bệnh. Vì vậy hiệp
hội Ung thư Mỹ (American Society of Clinical Oncology – ASCO) đã đánh giá mức
độ biểu hiện của HER2 trên tất cả bệnh nhân ung thư vú [12].
Ngoài ra, khả năng kháng Trastuzumab đã được phát hiện trong số những
bệnh nhân sử dụng thuốc lặp đi lặp lại. Điều này dẫn đến các nỗ lực để tìm ra các
phương pháp mới chống lại khả năng kháng thuốc Trastuzumab trong điều trị.
Chúng bao gồm kháng thể mới dựa trên liệu pháp kháng HER2, chất ức chế hoạt
tính tyrosine kinase của họ ErbB (TKIs), liệu pháp chống tạo mạch, các chất ức chế
protein sock nhiệt. Do đó việc phát triển các thuốc có cơ chế điều trị như
Trastuzumab đến bây giờ vẫn là một trong những phương pháp phổ biến nhất để
phát triển những yếu tố đích trong điều trị ung thư vú dương tính với HER2.
16

1.3. Khái quát chung về kháng thể và kháng thể lạc đà
Liệu pháp miễn dịch điều trị ung thư là liệu pháp kích thích hệ thống miễn
dịch của bệnh nhân để tiêu diệt tế bào ung thư ác tính. Liệu pháp này có thể
thông qua tiêm chủng: vacxin (tạo miễn dịch chủ động) hoặc thuốc chứa kháng
thể (miễn dịch thụ động). Mục đích của điều trị tế bào ung thư bằng liệu pháp
miễn dịch là tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể đối với khối u mà không
làm ảnh hưởng đến các mô khỏe mạnh [22]. Tuy nhiên sau khi sử dụng liệu pháp
tiêm các vaxcin cũng không có nhiều kết quả tích cực được ghi nhận, nguyên
nhân có thể là do đáp ứng miễn dịch thấp của kháng nguyên khối u và do sự suy
giảm hệ thống miễn dịch của bệnh nhân ung thư [29]. Vì vậy các nhà khoa học

đang tích cực để tìm ra các phương pháp mới nhằm nâng cao hiệu quả điều trị
ung thư bằng liệu pháp miễn dịch.
Sự ra đời của kháng thể đơn dòng ( monoclonal antibodies – mAbs) vào
cuối những năm 1970 đã mang lại một bước nhảy vọt trong điều trị hàng loạt các
bệnh ở người trong đó có ung thư. Sự phát triển của kháng thể đơn dòng dựa trên
sự khám phá ra cấu trúc của kháng thể và sự ra đời của công nghệ lai tạo tế bào
hybridoma. Cho đến nay kháng thể đơn dòng đã trở thành lĩnh vực phát triển
nhanh chóng nhất trong lĩnh vực dược phẩm để điều trị ung thư với nhiều kháng
thể được chấp thuận. Kỹ thuật kháng thể đơn dòng cũng cho phép các nhà khoa
học phát triển và sản xuất nhiều kháng thể khác nhau: kháng thể đơn dòng tái tổ
hợp, các kháng thể khảm và kháng thể đa dòng tái tổ hợp. Kháng thể đơn dòng
có thể gây ra tác dụng của mình thông qua kích hoạt hoạt tính gây độc tế bào phụ
thuộc kháng thể dẫn đến quá trình chết theo lập trình - apoptosis của tế bào và
phong tỏa các thụ thể thuộc yếu tố tăng trưởng [29]. Hơn nữa những tiến bộ của
công nghệ tái tổ hợp kháng thể đã dẫn đến sự ra đời các dạng mới của kháng thể
đơn dòng trong điều trị như các miền kháng thể hoặc các mảnh kháng thể khuyết
vùng Fc – vùng hằng định. Chúng bao gồm vùng biến đổi – Fab, mảnh kháng thể
đơn chuỗi – scFv, miền kháng thể - dads, kháng thể bispesific và intrabodies