Nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây cà chua chuyển gen

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LA VIỆT HỒNG

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN
TÁI TỔ HỢP MIRACULIN TRONG
DÒNG TẾ BÀO BY2, RỄ TƠ THUỐC LÁ
VÀ CÂY CÀ CHUA CHUYỂN GEN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2015


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LA VIỆT HỒNG

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN
TÁI TỔ HỢP MIRACULIN TRONG
DÒNG TẾ BÀO BY2, RỄ TƠ THUỐC LÁ
VÀ CÂY CÀ CHUA CHUYỂN GEN
Chuyên ngành

: Sinh lý học thực vật

Mã số

: 62 42 01 12

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Chu Hoàng Hà

Viện Công nghệ sinh học

HÀ NỘI, 2015


i

Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Chu Hoàng Hà đã tận tình
hƣớng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án.
Xin cảm ơn lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, các cán bộ Phòng Quản lý
tổng hợp, bộ phận quản lý đào tạo sau đại học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi
hoàn thành luận án.
Tôi cũng xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh-KTNN,
Phòng Tổ chức cán bộ, Phòng Khoa học Công nghệ trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo
điều kiện giúp đỡ tôi về mọi mặt trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS. Phạm Bích Ngọc-Phòng
Công nghệ tế bào thực vật, PGS.TS. Lê Văn Sơn-Phòng Công nghệ ADN ứng dụng,
Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quý báu
để tôi hoàn thành đề tài này. Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận đƣợc sự
giúp đỡ tận tình của tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng Công
nghệ ADN ứng dụng. Nhân dịp này tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, ngƣời thân, các bạn

đồng nghiệp, những ngƣời đã luôn động viên và góp ý cho tôi trong thời gian qua.
Hà Nội, tháng 6 năm 2015
Nghiên cứu sinh

La Việt Hồng


ii

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các
cộng sự khác;
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án này là trung thực, một phần đã
công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các
đồng tác giả;
Phần còn lại chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Hà Nội, ngày 19 tháng 6 năm 2015
Tác giả

La Việt Hồng


iii

Mục lục
Lời cảm ơn .................................................................................................................. i
Lời cam đoan .............................................................................................................. ii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. vi

DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. vii
DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT .......................................................... ix
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài ..........................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu ...............................................................................................2
4. Ý nghĩa lý luận và ý nghĩa thực tiễn .......................................................................3
4.1. Ý nghĩa lý luận .................................................................................................3
4.2. Ý nghĩa thực tiễn ..............................................................................................3
5. Đóng góp mới của luận án ......................................................................................3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................4
1.1. PROTEIN NGỌT, PROTEIN TẠO CẢM GIÁC NGỌT VÀ MIRACULIN .....4
1.1.1. Protein ngọt và protein tạo cảm giác ngọt.....................................................4
1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây thần kỳ và miraculin ..........................................6
1.2. TĂNG CƢỜNG SỰ BIỂU HIỆN CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG
THỰC VẬT...............................................................................................................14
1.2.1. Lựa chọn hệ thống biểu hiện .......................................................................14
1.2.2. Lựa chọn promoter (trình tự khởi đầu phiên mã) .......................................15
1.2.3. Ảnh hƣởng terminator đến sự biểu hiện của gen chuyển............................20
1.2.4. Thay đổi mã di truyền của gen đích cho phù hợp với hệ thống biểu hiện ..20
1.3. NGHIÊN CỨU VỀ CHUYỂN GEN TRONG DÒNG TẾ BÀO BY2, RỄ TƠ
VÀ CÂY CÀ CHUA .................................................................................................22
1.3.1. Dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana tabacum Bright Yellow 2) .............22
1.3.2. Hệ thống nuôi cấy rễ tơ thực vật .................................................................24
1.3.3. Cây cà chua chuyển gen ..............................................................................25
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................30


iv

2.1. VẬT LIỆU .........................................................................................................30
2.1.1. Vật liệu thực vật ..........................................................................................30
2.1.2. Vector và chủng vi khuẩn ...........................................................................30
2.1.3. Hóa chất và thiết bị máy móc ......................................................................31
2.1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ...............................................................31
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................................31
2.2.1. Thay đổi mã di truyền gen miraculin cho phù hợp với hệ thống biểu hiện ở
cây họ cà ................................................................................................................33
2.2.2. Thiết kế mồi ................................................................................................34
2.2.3. Phân lập promoter và terminator .................................................................34
2.2.4. Thiết kế vector chuyển gen mang gen miraculin ........................................38
2.2.5. Phƣơng pháp tạo dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây cà chua chuyển
gen .........................................................................................................................41
2.2.6. Phân tích các chỉ tiêu sinh lý của dòng chuyển gen ....................................43
2.2.7. Phân tích các dòng chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử .................44
2.2.8. Phân tích sự biểu hiện gen trong các dòng chuyển gen ..............................47
2.2.9. Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm .....................................................48
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .....................................................................49
3.1. THAY ĐỔI MÃ DI TRUYỀN CỦA GEN MIRACULIN PHÙ HỢP VỚI HỆ
BIỂU HIỆN Ở CÂY HỌ CÀ. PHÂN LẬP PROMOTER E8, PROMOTER VÀ
TERMINATOR HSP 18.2 ........................................................................................49
3.1.1. Thay đổi mã di truyền của gen miraculin phù hợp với hệ biểu hiện ở cây
họ cà ......................................................................................................................49
3.1.2. Phân lập và tách dòng promoter E8 từ cà chua, promoter và terminator
HSP 18.2 từ Arabidopsis .......................................................................................51
3.2. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MIRACULIN VÀO DÒNG TẾ BÀO
BY2, RỄ TƠ THUỐC LÁ VÀ CÂY CÀ CHUA .....................................................58
3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter ........................58
3.2.2. Thiết kế vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/HSP-ter .........................60
3.2.3. Thiết kế vector chuyển gen pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter ...........................62

3.2.4. Thiết kế vector chuyển gen pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter ........................63


v

3.2.5. Biến nạp vector chuyển gen mang gen miraculin vào Agrobacterium .......65
3.3. BIỂU HIỆN PROTEIN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG DÒNG TẾ BÀO
BY2 VÀ HỆ THỐNG RỄ TƠ THUỐC LÁ .............................................................66
3.3.1. Biểu hiện protein miraculin tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2...................66
3.3.2. Biểu hiện protein miraculin tái tổ hợp trong rễ tơ thuốc lá .........................71
3.4. BIỂU HIỆN PROTEIN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG CÂY
CÀ CHUA .................................................................................................................79
3.4.1. Tạo dòng cà chua chuyển gen miraculin .....................................................79
3.4.2. Kiểm tra sự có mặt của gen miraculin trong các dòng cà chua bằng
kỹ thuật PCR .........................................................................................................83
3.4.3. Phân tích sự biểu hiện ở mức mRNA của gen miraculin trong một số dòng
cà chua chuyển gen ...............................................................................................84
3.4.4. Xác định số bản copy trong dòng cà chua chuyển gen bằng kỹ thuật
Southern ................................................................................................................85
3.4.5. Đánh giá một số chỉ tiêu sinh trƣởng của một số dòng cà chua
chuyển gen.............................................................................................................86
Chƣơng 4. THẢO LUẬN..........................................................................................91
4.1. Tăng cƣờng sự biểu hiện của protein tái tổ hợp trong thực vật .....................91
4.2. Biểu hiện miraculin tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2 và rễ tơ thuốc lá .......94
4.3. Biểu hiện miraculin tái tổ hợp trong cây cà chua chuyển gen .......................99
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................................104
NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ............105
SUMMARY ............................................................................................................106
1. Overview: ........................................................................................................106
2. Objectives:.......................................................................................................107

3. Contents: .........................................................................................................107
4. Results: ............................................................................................................107
5. Discussion: ......................................................................................................108
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................112


vi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Một số đặc tính của protein ngọt và tạo cảm giác ngọt

4

Bảng 1.2. So sánh ƣu nhƣợc điểm giữa các hệ thống biểu hiện protein tái
tổ hợp

14

Bảng 2.1. Trình tự nucleotide của các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

34

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng lai ghép tạo vector tái tổ hợp

37

Bảng 3.1. So sánh trình tự promoter E8 phân lập với trình tự promoter E8
đã công bố

53

Bảng 3.2. So sánh trình tự nucleotide của promoter HSP 18.2 phân lập đƣợc
với các trình tự gen/promoter HSP 18.2 đã công bố

56

Bảng 3.3. Kết quả tạo và chọn lọc các dòng tế bào BY2 mang gen chuyển
miraculin

66

Bảng 3.4. Khối lƣợng tƣơi và khối lƣợng khô của một số dòng tế bào BY2
chuyển gen

69

Bảng 3.5. Kết quả tạo dòng rễ tơ chuyển gen miraculin

72

Bảng 3.6. Khối lƣợng tƣơi và khối lƣợng khô của một số dòng rễ tơ
chuyển gen

75

Bảng 3.7. Chỉ tiêu chiều dài của một số dòng rễ tơ chuyển gen

76

Bảng 3.8. Kết quả tạo dòng cà chua chuyển gen miraculin

81

Bảng 3.9. Một số chỉ tiêu sinh trƣởng và hình thái của năm dòng cà chua
chuyển gen

87


vii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây thần kỳ (Richadella dulcifica) và quả cắt dọc

7

Hình 1.2. Miraculin tự nhiên đƣợc tích lũy trong phần thịt quả cây thần kỳ

8

Hình 1.3. Mô hình cấu trúc 3D của protein miraculin dạng homodimer

9

Hình 1.4. Mô hình thụ thể T1R2+T1R3 liên kết với protein cảm giác ngọt

10

Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

32

Hình 3.1. Trình tự gen miraculin trƣớc (AB512278.1) và sau khi thay đổi
mã di truyền

50

Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm phân lập và nhân dòng promoter E8

52

Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm phân lập và nhân dòng promoter
HSP 18.2

55

Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm phân lập và nhân dòng terminator
HSP 18.2

57

Hình 3.5. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter

58

Hình 3.6. Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen
pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter

59

Hình 3.7. Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen
pBI121/35S/Mir/HSP-ter

61

Hình 3.8. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter

62

Hình 3.9. Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen
pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter

63

Hình 3.10. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter

63

Hình 3.11. Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen
pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter

64

Hình 3.12. Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt vector chuyển gen thu từ
Agrobacterium

65

Hình 3.13. Quá trình tạo dòng tế bào thuốc lá BY2 mang gen miraculin

67

Hình 3.14. Hình ảnh điện di kiểm tra sự có mặt của gen miraculin trong
các dòng BY2 bằng kỹ thuật PCR

68


viii

Hình 3.15. Hình ảnh phân tích sự biểu hiện của protein miraculin trong
một số dòng tế bào BY2 chuyển gen

70

Hình 3.16. Hàm lƣợng miraculin tái tổ hợp trong một số dòng BY2
chuyển gen

71

Hình 3.17. Quá trình tạo và chọn lọc dòng rễ tơ đƣợc chuyển gen
miraculin

73

Hình 3.18. Hình ảnh điện di kiểm tra sự có mặt của gen miraculin trong
các dòng rễ tơ bằng kỹ thuật PCR

74

Hình 3.19. Hình ảnh chiều dài của một số dòng rễ tơ thuốc lá chuyển gen.

74

Hình 3.20. Hình ảnh phân tích sự biểu hiện của protein miraculintrong
một số dòng rễ tơ

78

Hình 3.21. Hàm lƣợng miraculin tái tổ hợp trong một số dòng rễ tơ
chuyển gen

79

Hình 3.22. Quá trình tạo và sàng lọc cà chua chuyển gen miraculin

82

Hình 3.23. Hình ảnh điện di kiểm tra sự có mặt của gen miraculin trong
các dòng cà chua bằng kỹ thuật PCR

83

Hình 3.24. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR kiểm tra sự biểu hiện
mRNA của gen chuyển miraculin trong các dòng cà chua

84

Hình 3.25. Hình ảnh xác định số bản copy trong các dòng cà chua chuyển

gen bằng kỹ thuật Southern Blot

86

Hình 3.26. Hình ảnh dòng cà chua chuyển gen ngoài tự nhiên

88

Hình 3.27. Quả cà chua giai đoạn chín đỏ

89

Hình 3.28. Hàm lƣợng miraculin tái tổ hợp ở vỏ ngoài quả cà chua chuyển
gen

89


ix

DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

µg

microgam

3‟UTR, 5‟ UTR

Vùng 3' hoặc 5‟ không dịch mã

35S

Promoter CaMV35S

AS

Acetosyringone

Asn

Asparagine

BAP

Benzylaminopurine

bp

Base pair

BY2

Bright Yellow2

cDNA

Complementary DNA

CTAB

Hexadecyltrimethyl ammonium bromide

Cys

Cysteine

DEPC

Diethylpyrocarbonate

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxyribo nucleotide triphosphate

E. coli

Escherichia coli

E8-pro

Promoter E8

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

ELISA

Enzyme-linked immunosorbent assay

HRP

Horseradish Peroxidase

HSE

Heat shock Element

HSP

Heat shock protein

HSP-pro

Promoter HSP 18.2

HSP-ter

Terminator HSP 18.2

IAA

Indole Acetic acid

kb

Kilobase

kDa

Kilodalton


x

LB

Biên trái (left T-DNA border)

mg

miligam

mg/l hoặc mg/ml

miligam/lít hoặc miligam/mililít

MIR

Protein miraculin

ml

mililít

Môi trƣờng LB

Môi trƣờng Luria và Bertani

MS

Murashige và Skoog

NAA

Naphthaleneacetic acid

ng

nanogam

NOS

nopaline synthase gen

NOS-ter

Terminator nopaline synthase gene

NptII (kanar)

Gen kháng kanamycin

PCR

Polymerase Chain Reaction

PCS

Polycloning site

RB

Biên phải (right T-DNA border)

RNA

Ribonucleic acid

RNase

Ribonuclease

scFv

Single-chain variable fragment

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel
electrophoresis

TAE

Tris Acetate EDTA

Taq DNA polymerase

Thermus aquaticus DNA polymerase

TMB

3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine

v/p

vòng/phút

WT

Wild type

ZR

Zeatin riboside


1

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Hiện nay, các chất làm ngọt nhân tạo nhƣ saccharin, aspartame, sucralose và
acesulfame-K đƣợc con ngƣời sử dụng phổ biến nhƣ những chất làm ngọt ít năng
lƣợng, nhằm giảm nguy cơ mắc các bệnh mạn tính liên quan đến đƣờng nhƣ béo
phì, đái tháo đƣờng. Tuy nhiên, một số hợp chất này có thể gây ung thƣ (Kant
2005).
Trong tự nhiên, có rất nhiều loại protein ngọt và protein tạo cảm giác ngọt đã
đƣợc phát hiện bao gồm thaumatin, monellin, mabinlin, pentadin, brazzein,
neoculin (curculin) và miraculin. Các protein này có thể đƣợc sử dụng để thay thế
các chất làm ngọt nhân tạo bởi vì chúng tạo vị ngọt cho ngƣời sử dụng, an toàn do
có nguồn gốc tự nhiên và ít sinh năng lƣợng. Tuy nhiên, sản lƣợng tự nhiên của các
protein này bị hạn chế do hầu hết các protein này thu đƣợc từ cây sống ở vùng nhiệt
đới, nơi có điều kiện khí hậu khắc nghiệt (Kant 2005).
Gần đây, các nhà khoa học đã nghiên cứu biểu hiện thành công một số
protein ngọt và tạo vị ngọt nhƣ thaumatin, monellin, brazzein và miraculin ở quy
mô phòng thí nghiệm trong một số hệ thống biểu hiện nhƣ vi khuẩn, nấm men, nấm,
tế bào BY2, hệ thống nuôi cấy rễ tơ và cây trồng chuyển gen (Masuda, Kitabatake
2006, Pham Bich Ngoc 2009). Tuy nhiên, mức độ tích lũy của các protein tái tổ hợp
này khá thấp, dẫn đến các nghiên cứu về protein ngọt và protein tạo vị ngọt đều
chƣa thể sản xuất thƣơng mại các sản phẩm tái tổ hợp.
Miraculin là một trong số các protein tạo vị ngọt, có trong quả của cây thần
kỳ (Richadella dulcifica), có đặc tính tạo ra cảm giác ngọt để thay đổi từ vị chua
thành cảm giác ngọt mà bản chất của miraculin là không ngọt. Tính chất độc đáo
này của miraculin rất có ích cho con ngƣời nhằm ngăn ngừa các căn bệnh hiện đại
do các chất làm ngọt nhân tạo gây ra. Miraculin cũng là chất ít sinh năng lƣợng. Do


2
vậy, có thể sử dụng miraculin để thay thế đƣờng, giúp ngƣời sử dụng tránh đƣợc các
nguy cơ mắc bệnh béo phì. Với tính chất độc đáo nhƣ vậy, xong sản lƣợng của
miraculin trong tự nhiên bị hạn chế do cây thần kỳ sinh trƣởng chậm ở nơi khí hậu

khắc nghiệt của Tây Phi.
Gần đây các nhà khoa học đã nghiên cứu nhằm sản xuất miraculin tái tổ hợp
trên một số đối tƣợng khác nhau. Tuy nhiên, mức độ tích lũy của miraculin tái tổ
hợp trong hệ thống biểu hiện vẫn chƣa đƣợc nhƣ kỳ vọng. Xuất phát từ lý do trên,
chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin
trong dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây cà chua chuyển gen”.

2. Mục tiêu nghiên cứu
Thay đổi mã di truyền gen miraculin của cây thần kỳ, thiết kế vector chuyển
gen cùng với các promoter đặc hiệu và promoter cảm ứng để chuyển vào dòng tế
bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây cà chua nhằm thu đƣợc các dòng chuyển gen có khả
năng biểu hiện miraculin tái tổ hợp.

3. Nội dung nghiên cứu
1) Thay đổi mã di truyền của gen miraculin cho phù hợp với hệ thống biểu hiện
ở cây họ cà. Phân lập, nhân dòng promoter E8 từ cà chua, promoter HSP
18.2 và terminator HSP 18.2 từ Arabidopsis thaliana.
2) Thiết kế vector biểu hiện miraculin trong dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và
cây cà chua.
3) Biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong dòng tế bào BY2 và rễ tơ thuốc
lá.
4) Biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong cây cà chua.


3

4. Ý nghĩa lý luận và ý nghĩa thực tiễn
4.1. Ý nghĩa lý luận
Đề tài cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tăng cƣờng mức độ biểu
hiện của gen chuyển ở thực vật bằng cách thay đổi mã di truyền, promoter,

terminator và hệ thống biểu hiện thực vật.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
1) Sản xuất protein tái tổ hợp miraculin quy mô phòng thí nghiệm bằng dòng tế
bào BY2 và rễ tơ chuyển gen.
2) Sản xuất protein tái tổ miraculin ngoài tự nhiên bằng cây cà chua chuyển
gen.

5. Đóng góp mới của luận án
1) Protein tái tổ hợp miraculin đã đƣợc biểu hiện thành công trong dòng tế bào
BY2 với hàm lƣợng từ 1,13-3,10 ng/µg protein tan tổng số; biểu hiện trong
hệ thống rễ tơ thuốc lá, hàm lƣợng tự 13,7-19,97 ng/µg protein tan tổng số.
2) Miraculin tái tổ hợp đã đƣợc biểu hiện thành công trong cà chua, trong đó
gồm 5 dòng mang bản đơn copy của gen chuyển, hàm lƣợng cao ở các dòng
cà chua đƣợc chuyển cấu trúc biểu hiện đặc hiệu ở quả, đạt 118,0 ng/µg
protein tan tổng số, cao gấp hơn 4 lần so với các dòng đƣợc chuyển cấu trúc
mang promoter 35S.


4

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. PROTEIN NGỌT, PROTEIN TẠO CẢM GIÁC NGỌT VÀ
MIRACULIN
1.1.1. Protein ngọt và protein tạo cảm giác ngọt
Hiện nay, các nghiên cứu trên thế giới đã xác định đƣợc 7 loại protein ngọt
và protein tạo cảm giác ngọt từ tự nhiên. Theo đặc tính có thể chia thành 3 nhóm: (i)
các protein ngọt (thaumatin, monellin, mabinlin, pentadin và brazzein), (ii) protein
cảm ứng độ ngọt (miraculin) và (iii) protein có đủ đặc tính của hai nhóm trên
(neoculin). Các thuộc tính và tính chất chất của các protein này đƣợc trình bày ở

bảng 1.1.
Bảng 1.1. Một số đặc tính của protein ngọt và tạo cảm giác ngọt (Kant 2005)
Đặc
tính
Nguồn
gốc
Phân bố
Biến thể

Thaumatin

Monellin

Mabilin

Pentadin

Brazzein

Curculin

Miraculin

T. danielli
Benth
Tây Phi
I, II, a, b, c

D. cumminsii
Diels

Tây Phi
-

C. masaikai

P. Baillon

P. Baillon

R. dulcifica

Tây Phi
-

Tây Phi
-

Độ ngọt
(*)
KLPT
(kDa)
Acid
amin

3000

3000

Trung Quốc
I, II-a, III,

IV
100

C.
latifolia
Malaysia
-

500

2000

550

-

22,2

10,7

12,4

12,0

6,5

24,9

24,6

207

45 (chuỗi A)
50 (Chuỗi B)

-

54

114

191

Monomer

(A+B)

33
(chuỗi
A)
72 (Chuỗi
B)
(A+B)(1)

-

Monomer

(A+A)(2)

(A+A),
(A+A+A+A)(3)

Dạng
hoạt
tính
(*)

Tây Phi
-

độ ngọt được tính dựa theo khối lượng phân tử, (1) : heterodimer, (2): homodimer, (3): tetramer.

Trong số các protein kể trên, monellin có độ ngọt là 100.000 lần, sau đó là
brazzein và thaumatin lần lƣợt là khoảng 500 lần và 3000 lần so với sucrose (dựa
theo nồng độ mol/lít). Tất cả các protein này đều đƣợc phân lập từ cây sống trong
rừng mƣa nhiệt đới. Các protein này có tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp để


5
thay thế chất làm ngọt nhân tạo mà ít sinh năng lƣợng và an toàn cho ngƣời sử
dụng.
Brazzein
Brazzein là protein nhỏ nhất thuộc nhóm protein tạo vị ngọt, protein này
chứa 54 acid amin. Brazzein rất bền với nhiệt độ và độ pH, có độ ngọt vào khoảng
500-2000 lần so với sucrose (dựa theo khối lƣợng phân tử) và rất có tiềm năng sử
dụng nhƣ chất làm ngọt với năng lƣợng thấp. Brazzein đƣợc phân lập từ quả
Pentadiplandra brazzeana Baillon, một loại cây sống ở Châu Phi. Với đặc tính bền
nhiệt và bền với pH của brazzein giúp các nhà khoa học có thể sử dụng brazzein để
nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ và độ pH đến hoạt tính tạo cảm giác ngọt của

các protein ngọt nói chung (Izawa et al., 1996).
Thaumatim
Thaumatin thuộc nhóm protein tạo vị ngọt đƣợc phân lập từ cây vùng nhiệt
đới Thaumatococcus danielli. Thaumatin có 207 acid amin với 8 cầu liên kết
disulfide và không chứa cystein tự do. Khi nhiệt độ trên 70oC và pH 7,0 thì
thaumatin có xu hƣớng kết dính lại và mất hoạt tính tạo vị ngọt (Kaneko, Kitabatake
1999). Thaumatin có độ ngọt khoảng 10.000 lần so với sucrose (dựa theo nồng độ
mol/lít), protein này đƣợc sử dụng ở nhiều quốc gia theo hƣớng tạo cảm giác ngọt
hoặc tăng cƣờng độ ngọt (Zemanek, Wasserman 1995).
Monellin
Monellin là một protein ngọt chứa 2 chuỗi peptide, chuỗi A có 44 acid amin
và chuỗi B chứa 50 acid amin (Ota et al., 1999). Protein này đƣợc tinh sạch từ quả
cây Dioscoreophyllum cumminsii sống ở Tây Phi. Độ ngọt của monellin là khoảng
100.000 lần so với đƣờng sucrose và khoảng vài trăm lần dựa theo nồng độ mol/lít
và khối lƣợng. Chuỗi đơn của monellin có 94 acid amin đã đƣợc chứng minh là có
độ ngọt tƣơng tự nhƣ hai chuỗi monellin trong tự nhiên, dạng chuỗi đơn cũng bền
với nhiệt độ và độ acid so với monellin tự nhiên (Lee et al., 1999). Các nghiên cứu
gần đây cũng xác định các vị trí liên kết của monellin với thụ thể vị giác của ngƣời,


6
các vị trí đó gồm AsnA16, AsnA22, GlnA25 và AsnA26 có hoạt tính tạo cảm giác ngọt
lần lƣợt là 7500, 750, 2500 và 5500 lần so với sucrose (dựa theo khối lƣợng phân
tử) (Kohmura et al., 1992).
Curculin
Curculin đƣợc thu nhận từ cây Curculigo latifolia, curculin có hoạt tính nhƣ
chất làm ngọt ít sinh năng lƣợng. Độ ngọt tối đa của curculin tƣơng đƣơng với dung
dịch sucrose 0,35 M. Nó có khả năng tạo ra vị ngọt đối với nƣớc và các chất chua
sau khi sử dụng curculin. Hoạt tính tạo vị ngọt của curculin không thay đổi sau khi
đƣợc xử lý ở nhiệt độ 50oC trong 1 giờ với pH từ 3-9.

Mabinlin
Mabinlin là một protein ngọt rất bền với nhiệt độ, đƣợc bắt nguồn từ cây
Capparis masaikai, có độ ngọt khoảng 400 lần so với sucrose (dựa theo khối lƣợng
phân tử). Protein này có chứa hai chuỗi, chuỗi A có 33 acid amin và chuỗi B có 72
acid amin, trong chuỗi B có chứa hai liên kết disulfide và chuỗi B liên kết với chuỗi
A thông qua ba liên kết disulfide (Kohmura et al., 1992). Độ ngọt của mabinlin-2
không thay đổi sau xử lý 48 giờ ở điểm sôi, đối với mabinlin-3 và mabinlin-4 vẫn
giữ đƣợc hoạt tính sau khi xử lý ở 80oC trong 1 giờ (Nirasawa et al., 1994).
Pentadin
Pentadin là một loại protein ngọt đƣợc tách chiết từ cây Pentadiplandra
brazzeana, đây là một loại cây bụi đƣợc phát hiện ở rừng nhiệt đới của một số quốc
gia Châu Phi. Độ ngọt của nó bằng khoảng 500 lần so với sucrose (dựa theo khối
lƣợng phân tử), trong phân tử cũng chứa hai tiểu phần liên kết với nhau qua cầu
disulfide. Đến nay cũng chƣa có nhiều thông tin về protein này (van der Wel et al.,
1989).

1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây thần kỳ và miraculin
1.1.2.1. Đặc điểm sinh học của cây thần kỳ


7
Cây thần kỳ (Richadella dulcifica) thuộc họ Hồng xiêm (Sapotaceae)
(Matsuyama et al., 2009). Đây là loại cây bụi sống ở vùng nhiệt đới Tây Phi. Trong
điều kiện tự nhiên, cây cao khoảng 6 m còn trong điều kiện nhân tạo thì chiều cao
khoảng 3 m. Loại cây này sinh trƣởng tốt ở đất có pH từ 4,5-5,8, trong điều kiện
lạnh, chịu bóng và ở nơi có độ ẩm tƣơng đối cao.
Cây thần kỳ có quả màu đỏ, kích thƣớc quả nhỏ (hình 1.1A, B), khi nhai
phần thịt quả thần kỳ sau đó ăn vị chua chẳng hạn nhƣ chanh, lúc đó chanh sẽ có
cảm giác ngọt mà không còn vị chua. Do vậy, cây này đƣợc gọi tên “thần kỳ”, có
quả đƣợc ngƣời dân Châu Phi dùng cách đây hàng trăm năm (Kurihara, Beidler

1968).

Hình 1.1. Cây thần kỳ (Richadella dulcifica) và quả cắt dọc

Tính chất tạo cảm giác ngọt khi sử dụng quả thần kỳ là do miraculin chứa
trong quả tạo ra mà bản thân miraculin là không ngọt. Ƣu điểm của việc sử dụng
miraculin là vừa tạo ra cảm giác ngọt vừa có năng lƣợng hấp thu thấp, do đó rất tốt
cho cải thiện bữa ăn của bệnh nhân tiểu đƣờng và béo phì (Sun et al., 2006a).
Trong tự nhiên, miraculin đƣợc tích lũy ở quả của cây thần kỳ 6 tuần tuổi khi
quả chuyển từ màu xanh lá cây sang màu cam và miraculin đƣợc tích lũy nhiều nhất
khi quả ở trạng thái đỏ hoàn toàn, miraculin đƣợc tiết ra và tích lũy trong lớp gian
bào của quả thần kỳ (Hirai et al., 2010b) (hình 1.2).


8

µg miraculin/g
khối lƣợng tƣơi

A

B

Quá chín

Đỏ

Da cam

Đổi màu

Quả xanh 2

Quả xanh 1

Hoa

Nụ hoa

Lá

Thân

Rễ

C

Quả

Hình 1.2. Miraculin tự nhiên đƣợc tích lũy trong phần thịt quả cây thần kỳ. (A). Hàm
lƣợng miraculin đƣợc tích lũy trong thịt quả; (B). Miraculin trong thịt quả đƣợc phân tích
bằng Western blot; (C). Các giai đoạn phát triển của quả thần kỳ (Hirai et al., 2010a, Hirai
et al., 2011a, Kim et al., 2010b).

Tại Việt Nam, Trần Danh Thế et al (2009) đã bƣớc đầu trồng thử nghiệm cây
thần kỳ tại Thành phố Hồ Chí Minh, theo dõi đặc điểm sinh học cũng nhƣ phân tích
thành phần từ thịt quả cây thần kỳ ở giai đoạn chín đỏ, kết quả phân tích cho thấy
dịch chiết quả gồm: nƣớc (68,9%), đƣờng tan tổng số (2,38%), đƣờng khử (0,40%),
protein (0,10%), đạm tổng số (1,91%) và khoáng tổng số (0,99%). Ngoài ra cũng đã
định tính đƣợc một số thành phần cơ bản trong dịch chiết thịt quả gồm tinh dầu,

carotenoid, phytosterol, acid béo, flavonoid, polyphenol, acid hữu cơ, saponin
steroid, đƣờng khử, hợp chất uronic (Trần Danh Thế et al., 2009).
1.1.2.2. Cấu trúc của miraculin
Miraculin là một glycoprotein, chuỗi polypeptide chứa 220 acid amin trong
đó có 29 acid amin là trình tự tín hiệu (Masuda et al., 1995). Khối lƣợng phân tử
của chuỗi đơn peptide đƣợc tính toán dựa trên trình tự acid amin là khoảng 24,6


9
kDa, trong đó hàm lƣợng hydrocacbon chiếm khoảng 13,9% (Theerasilp et al.,
1989).
Miraculin tự nhiên tinh khiết là tetramer, dịch chiết thô chƣa khử và chƣa
biến tính của miraculin là dimer. Cả hai dạng tetramer và dimer tự nhiên của
miraculin đều có tác dụng tạo cảm giác ngọt (Igeta et al., 1991), trong khi đó dạng
monomer lại không có tính chất này (Ito et al., 2007). Vì vậy, quá trình dimer hóa
từ hai monomer của miraculin thông qua việc tạo một liên kết cộng hóa trị ở vị trí
Cys138-Cys138 (Cysteine) cần thiết để tạo ra miraculin dimer có hoạt tính (hình 1.3).

Hình 1.3. Mô hình cấu trúc 3D của protein miraculin dạng homodimer. Mũi tên màu xanh:
liên kết disulfide (Cys138-Cys138) giữa hai monomer.

Phân tử miraculin có hai vị trí glycosyl hoá là Asn42 và Asn186 tạo thành các
oligosarcharide (Hiwasa-Tanase et al., 2011). Miraculin có bảy phân tử Cys, hình
thành ba chuỗi tƣơng tác qua cầu disulfide ở Cys47-Cys92, Cys148-Cys159 và Cys152Cys155 và một chuỗi tƣơng tác qua cầu disulfide ở Cys138 (Igeta et al., 1991).
1.1.2.3. Cơ chế tạo cảm giác ngọt của miraculin
Miraculin có bản chất không ngọt, sau khi sử dụng miraculin từ quả thần kỳ
thì vị chua của quả chanh có vị ngọt của cam. Miraculin có khả năng tạo ra cảm
giác ngọt từ các loại acid khác nhau nhƣ HCl, acid oxalic, acid lactic, acid formic,
acid axetic và acid citric. Tác dụng tạo cảm giác ngọt của miraculin phụ thuộc vào
độ chua và độ pH của acid (Kurihara, Beidler 1969). Hoạt tính tạo cảm giác ngọt

của dung dịch miraculin đạt mức tối đa sau khi ngậm dung dịch trong miệng khoảng


10
3 phút (Kurihara, Beidler 1969). Để có thể tạo ra cảm giác ngọt tối đa, nồng độ của
miraculin là từ 4.10-7 M và độ ngọt đạt đƣợc tƣơng đƣơng với độ ngọt của dung dịch
sucrose 0,4 M. Tác dụng tạo cảm giác ngọt kéo dài khoảng 1 giờ sau khi sử dụng,
tùy thuộc vào nồng độ của dung dịch miraculin.
Ở ngƣời, vị đƣợc cảm nhận nhờ vào các tế bào thụ thể trong chồi vị giác. Có
5 loại vị giác cơ bản: mặn, chua, ngọt, đắng và umami, trong đó cảm giác ngọt và vị
umami là các vị ngon chính của con ngƣời. Thụ thể vị giác ở động vật có vú có bản
chất là phức hệ G protein, trong đó phức hệ thụ thể cảm giác ngọt là T1R2+T1R3
(Zhao et al., 2003).

Hình 1.4. Mô hình thụ thể T1R2+T1R3 liên kết với protein cảm giác ngọt. (A). Mô hình
mô phỏng tƣơng tác giữa protein ngọt với thụ thể; (B). Mô hình phân tử thể hiện tƣơng tác
giữa miraculin với thụ thể T1R2+T1R3 (Kant 2005, Koizumi et al., 2011).

Miraculin có thể làm thay đổi cấu hình của các chồi vị giác trên lƣỡi sau khi
sử dụng. Điều này có thể là kết quả của sự hoạt hoá các thụ quan cảm giác ngọt trên
lƣỡi bởi miraculin: đầu tiên protein cảm giác ngọt (ký hiệu màu đỏ, hình 1.4A) sẽ
liên kết với thụ thể T1R2+T1R3 ở dạng I, liên kết này làm thay đổi cấu hình của thụ
thể, trở thành dạng II ổn định hơn (Kant 2005, Koizumi et al., 2011). Cơ chế chi tiết
về hoạt động và thuộc tính cảm ứng lƣỡi của miraculin đến nay vẫn chƣa rõ ràng, có
quan niệm cho rằng các chồi vị giác khác nhau cho cảm giác vị khác nhau chẳng
hạn nhƣ các chồi vị giác nhận ra vị mặn và truyền tín hiệu này lên não để hoạt hóa
các thụ quan vị mặn và cho chúng ta có cảm giác vị mặn này. Trong trƣờng hợp của
miraculin, các tế bào thụ quan cảm giác ngọt trên chồi vị giác không nhận ra vị của

11
miraculin mà nó hoạt hoá các thụ quan cảm giác ngọt trên não. Vì thế miraculin đã
“đánh lừa” não bộ.
1.1.2.4. Tình hình nghiên cứu miraculin tái tổ hợp
Cây thần kỳ là loại cây sống ở vùng nhiệt đới, cây không thể sống đƣợc nếu
nhiệt độ môi trƣờng thấp hơn 7oC, thêm vào đó, cây cần đến 3-4 năm tuổi để có thể
ra hoa và chỉ một phần nhỏ số hoa đó mới đƣợc thụ phấn. Ngoài ra, hoạt động tạo
cảm giác ngọt của miraculin trong quả thần kỳ sẽ bị mất hoạt tính sau khoảng 2-3
giờ thu hoạch khi quả đƣợc bảo quản ở nhiệt độ phòng (Kurihara, Nirasawa 1997).
Vì vậy, nguồn miraculin tự nhiên bị hạn chế. Từ các tính chất ƣu việt của miraculin
nên việc sản xuất sinh khối miraculin là cần thiết.
Hiện nay, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, đặc biệt là
công nghệ gen đã giúp nghiên cứu và sản xuất thử nghiệm miraculin tái tổ hợp trên
nhiều đối tƣợng biểu hiện khác nhau nhƣ E.coli, nấm men, nấm mốc (Aspergillus
oryzae) và thực vật. Miraculin tái tổ hợp đƣợc tạo ra trong E.coli không có hoạt tính
tạo cảm giác ngọt mặc dù có biểu hiện protein này (Kurihara 1992). Gần đây,
miraculin tái tổ hợp đƣợc biểu hiện lại trong E.coli với một số cải tiến bởi nhóm
nghiên cứu Matsuyama et al (2009), nhóm đã thành công trong việc sản xuất
miraculin dimer có hoạt tính. Tuy nhiên, hoạt tính của nó chỉ bằng khoảng 1/6 so
với miraculin tự nhiên. Kết quả này cho thấy quá trình glycosyl hóa là cần thiết cho
quá trình cuộn gấp và ổn định của protein này (Matsuyama et al., 2009). Miraculin
tái tổ hợp có hoạt tính cũng đƣợc sản xuất trong nấm mốc (có quá trình glycosyl
hóa) (Ito et al., 2007). Một hệ thống vi sinh vật khác đƣợc sử dụng để biểu hiện
miraculin tái tổ hợp là tế bào nấm men có mã di truyền đã tối ƣu và bổ sung thêm
trình tự tín hiệu, kết quả là miraculin tái tổ hợp đƣợc tạo ra có hoạt tính (Ito et al.,
2010). Hoạt tính của miraculin tái tổ hợp ở cả hệ thống nấm mốc và nấm men đƣợc
đánh giá là khoảng 1/5 so với hoạt tính của miraculin tự nhiên, kết quả này cũng có
thể giải thích rằng không chỉ quá trình glycosyl hóa quan trọng mà còn phụ thuộc
vào bản chất của chuỗi đƣờng liên kết, sự sự ổn định của miraculin đƣợc tổng hợp.

12
Các nghiên cứu gần đây xác định thực vật là hệ thống thích hợp nhất để sản
xuất miraculin có hoạt tính sinh học, có thể ở thực vật nói chung có quá trình
glycosyl hóa tƣơng tự nhƣ ở cây thần kỳ. Cây xà lách (Lactuca sativa) là thực vật
đầu tiên đƣợc sử dụng để biểu hiện miraculin tái tổ hợp, hoạt động của gen này
đƣợc điều khiển bởi promoter 35S và NOS terminator, kết quả là miraculin tái tổ
hợp đƣợc tạo ra có đầy đủ hoạt tính tạo cảm giác ngọt với độ ngọt tƣơng đƣơng với
miraculin tự nhiên (Sun et al., 2006a). Tuy nhiên, sự “câm lặng” của gen chuyển
xảy ra ở các dòng chuyển gen thế hệ con cháu (Sun et al., 2007). Tiếp theo,
miraculin đƣợc biểu hiện trong cây dâu tây chuyển gen, đây là loại cây có ƣu thế
sinh sản vô tính, tuy nhiên miraculin tái tổ hợp đƣợc tích lũy có hàm lƣợng rất thấp,
chỉ khoảng 2,0 µg/g khối lƣợng tƣơi, mặc dù mức độ tích lũy ổn định qua các thế hệ
nhờ sinh sản vô tính (Sugaya et al., 2008). Miraculin tái tổ hợp cũng đã đƣợc biểu
hiện trong cây cà chua, đây đƣợc xem là loại cây thích hợp nhất trong số các loài
thực vật đƣợc sử dụng để biểu hiện miraculin tái tổ hợp (Kurokawa et al., 2013).
Cây cà chua cũng có nhiều ƣu điểm khác nhƣ chuyển gen dễ dàng thông qua
Agrobacterium, hiệu suất biến nạp có thể lên đến 40% (Sun et al., 2006b). Các thể
biến nạp có thể thu đƣợc trong khoảng 3 tháng sau khi hạt nảy mầm. Hơn nữa, cây
cà chua chuyển gen tạo ra miraculin tái tổ hợp có hàm lƣợng khoảng 90,7 µg/g khối
lƣợng tƣơi của quả, có đầy đủ hoạt tính tạo cảm giác ngọt, tƣơng đƣơng với
miraculin tự nhiên (Sun et al., 2007). Ngoài ra, mức độ tích lũy và biểu hiện của
gen chuyển là ổn định từ thế hệ T1 đến T5 (Yano et al., 2010). Tuy nhiên, sự tích lũy
của miraculin tái tổ hợp cũng phụ thuộc vào bản chất giống cà chua, số lƣợng bản
copy của gen chuyển và thời điểm chín của quả cà chua (Hirai et al., 2011a,
Hiwasa-Tanase et al., 2011, Sun et al., 2007). Một hệ thống gần đầy cũng đƣợc sử
dụng để biểu hiện miraculin tái tổ hợp là cây cam quýt, đây cũng hệ thống này rất
tiềm năng để sản xuất miraculin trong tƣơng lai (Jin et al., 2013).
Trong quá trình nghiên cứu sản xuất miraculin tái tổ hợp cũng nhƣ miraculin
đƣợc phân lập từ tự nhiên, việc xác định chính xác khối lƣợng phân tử cũng nhƣ

tinh sạch đƣợc sản phẩm này rất quan trọng, phục vụ các nghiên cứu chi tiết. Trƣớc


13
đây các mẫu phân lập đƣợc chƣa hoàn toàn tinh sạch và do đó việc xác định cấu
trúc chủ yếu của miraclin chƣa đƣợc thực hiện. Kỹ thuật tinh sạch miraculin từ quả
cây thần kỳ đƣợc phát triển từ những năm 1968 (Kurihara, Beidler 1968). Tuy
nhiên, các phƣơng pháp này không thể loại bỏ của chất tạo màu polyphenolic và
giảm hoạt tính tạo cảm giác ngọt. Năm 1988, Theerasilp và Kurihara đã sử dụng
dung dịch NaCl để tách chiết dịch thô từ quả thần kỳ, sau đó tiến hành sắc ký trao
đổi ion và sắc ký ái lực để tinh sạch miraculin thu đƣợc (Theerasilp, Kurihara
1988), khối lƣợng phân tử đƣợc xác định bằng SDS-PAGE là khoảng 28 kDa trong
khi các thông báo trƣớc đó đã cho rằng khối lƣợng của miraculin dao động 40 kDa
tới 48 kDa. Miraculin là một glycoprotein có chứa khoảng 13,9% carbohydrate
(Theerasilp, Kurihara 1988). Gần đây, hệ thống tinh sạch một bƣớc sử dụng sắc ký
ái lực kim loại nikel cố định đã đƣợc phát triển (Duhita et al., 2009). Phƣơng pháp
này sử dụng chuỗi histidine tiếp xúc trên bề mặt của dimer miraculin. Phƣơng pháp
này đơn giản hơn so với các phƣơng pháp trƣớc đây và làm giảm đƣợc bƣớc sử
dụng cột lọc nên tiết kiệm về thời gian, giảm chi phí cho quá trình tinh sạch. Thêm
vào đó, phƣơng pháp này cũng cho phép tinh sạch dạng miraculin hoạt tính bởi vì
cột IMAC liên kết chỉ với miraculin có cấu trúc không gian 3 chiều ở dạng dimer
(cấu trúc không gian này có liên quan đến hoạt động tạo cảm giác ngọt) và không
liên kết với miraculin dạng monomer (dạng không có hoạt tính). Mặc dù phƣơng
pháp tinh sạch sử dụng IMAC là hiệu quả hơn so với các phƣơng pháp khác, trong
tƣơng lai cần thiết phải phát triển các phƣơng pháp khác để ứng dụng trên quy mô
công nghiệp.
Đối với miraculin tái tổ hợp, quá trình tinh sạch có thể đƣợc thực hiện theo
phƣơng pháp của Theerasilp và Kurihara (1988) bằng cách thêm sắc ký cột khối
lƣợng phân tử (Sephacryl S-200 HR) nhƣng phƣơng pháp này mất thời gian và có
mức độ thu hồi thấp vì liên quan đến nhiều bƣớc tinh sạch (Sun et al., 2007).