Xây dựng phương pháp định lượng một số thành phần trong cao hoạt lạc vương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI








VŨ THỊ THU TRANG




XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH TÍNH ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ
THÀNH PHẦN TRONG CAO
HOẠT LẠC VƯƠNG


LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2013



BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI






VŨ THỊ THU TRANG




XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH TÍNH ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ
THÀNH PHẦN TRONG CAO
HOẠT LẠC VƯƠNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 60720410





Nơi thực hiện đề tài:
Bộ môn Dược học cổ truyền
Trung tâm kiểm nghiệm Hà Nội
Thời gian thực hiện: từ 11/2012 đến 09/2013





HÀ NỘI 2013






LỜI CẢM ƠN


Lời đầu tiên em chân thành gửi lời cảm ơn đến TS. Trần Việt Hùng, TS Bùi

Hồng Cường đã trực tiếp giúp đỡ em hoàn thành luận văn này.
Em cảm ơn Ths Nguyễn Thị Thanh Phương, Ths Nguyễn Thành Đạt, các cán
bộ tại khoa Kiểm nghiệm Hóa lý - Trung tâm kiểm nghiệm Hà Nội, các thầy cô bộ
môn Dược học cổ truyền - Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ em trong thời
gian thực hiện đề tài.
Em cũng cảm ơn sự quan tâm của Ban giám hiệu nhà trường, phòng Sau đại
học đã tạo cho em những điều kiện tốt nhất để hoàn thành quá trình học tập tại
trường.
Cuối cùng, em cảm ơn bạn bè, gia đình, đồng nghiệp đã luôn giúp đỡ, động
viên, khích lệ em trong học tập.
Em chân thành cảm ơn !

Hà Nội, tháng 10/2013
Học viên



Vũ Thị Thu Trang



ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1. TỔNG QUAN 3
1.1. Phương thuốc Hoạt lạc vương 3
1.1.1. Quế chi 3
1.1.1.1. Thành phần hóa học 4
1.1.1.2. Tác dụng sinh học 4
1.1.1.3. Tác dụng và công dụng theo YHCT 4
1.1.2. Hương phụ 5
1.1.2.1. Thành phần hóa học 5

1.1.2.2. Tác dụng sinh học 5
1.1.2.3. Tác dụng và công dụng theo YHCT 5
1.1.3. Bạch thược 5
1.1.3.1. Thành phần hóa học 6
1.1.3.2. Tác dụng sinh học 7
1.1.3.3. Tác dụng và công dụng theo YHCT 7
1.1.4. Xuyên Khung 7
1.1.4.1. Thành phần hóa học 7
1.1.4.2. Tác dụng sinh học 7
1.1.4.3. Tác dụng và công dụng theo YHCT 8
1.1.5. Sinh khương 8
1.1.5.1. Thành phần hóa học 8
1.1.5.2. Tác dụng sinh học 8
1.1.5.3. Tác dụng và công dụng theo YHCT 9
1.2. Tổng quan về kỹ thuật SKLM trong phân tích kiểm nghiệm 9
1.2.1. Định nghĩa 9
1.2.2. Các đại lượng đặc trưng 9
1.3. Tổng quan về kỹ thuật HPLC trong phân tích kiểm nghiệm 10
1.3.1. Định nghĩa 10
1.3.2. Các đại lượng đặc trưng 11
1.3.3. Cách đánh giá pic 14
1.3.3.1. Đánh giá diện tích 14
1.3.3.2. Đánh giá chiều cao 14
1.3.4. Cách tính kết quả 14
1.3.4.1. Phương pháp quy về 100 % diện tích 14
1.3.4.2. Phương pháp dùng chuẩn ngoại 15
1.3.4.3. Phương pháp dùng chuẩn nội 16
1.3.4.4. Phương pháp thêm chuẩn 17
1.4. Kỹ thuật chiết tách và nguyên lý ứng dụng trong phân tích kiểm nghiệm 17
1.4.1. Sai số xử lý mẫu 18

1.4.2. Mục tiêu của xử lý mẫu 18
1.4.3. Kỹ thuật xử lý mẫu 18
1.4.4. Chiết lỏng - lỏng 19
1.4.4.1. Nguyên tắc 19
1.4.4.2. Cơ chế chiết xuất 20
1.4.4.3. Kỹ thuật chiết xuất 20
1.4.4.4. Ứng dụng 20
1.5. Xây dựng và thẩm định quy trình phân tích 20
1.6. Cao thuốc 23
1.6.1. Định nghĩa cao thuốc 23
1.6.2. Đặc điểm của cao thuốc 23
1.6.3. Phân loại cao thuốc 23
1.6.3.1. Cao lỏng 23
1.6.3.2. Cao đặc 24
1.6.3.3. Cao khô 24
1.6.4. Yêu cầu chất lượng cao thuốc 24
2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
2.1. Đối tượng nghiên cứu 25
2.2. Phương tiện nghiên cứu 26
2.2.1. Thiết bị 26
2.2.2. Hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn 26
2.3. Phương pháp nghiên cứu 27
2.3.1. Định tính một số thành phần hóa học của cao Hoạt lạc vương và dược liệu đối
chiếu 27
2.3.2. Xây dựng phương pháp định tính, bán định lượng một số vị dược liệu trong
cao Hoạt lạc vương bằng phương pháp SKLM 27
2.3.3. Xây dựng quy trình định lượng paeoniflorin trong cao Hoạt lạc vương bằng
phương pháp HPLC 27
2.3.4. “Dự thảo” tiêu chuẩn cao Hoạt lạc vương 28
2.4. Phương pháp xử lý số liệu 28

2.5. Đánh giá kết quả 28
3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29
3.1. Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của mẫu cao Hoạt lạc vương 29
3.2. Định tính các nhóm chất chính trong cao và dược liệu bằng phương pháp
hóa học 30
3.3. Định tính các vị dược liệu Quế chi, Hương phụ, Xuyên khung, Bạch thược
bằng phương pháp SKLM 32
3.3.1. Định tính Quế chi 32
3.3.2. Định tính Bạch thược 35
3.3.3. Định tính Hương phụ, Xuyên khung 38
3.3.4. Định tính Bạch thược, Hương phụ, Quế chi 42
3.4. Định lượng paeoniflorin trong cao Hoạt lạc vương bằng phương pháp
HPLC 45
3.4.1. Xác định hàm lượng paeoniflorin trong dược liệu Bạch thược 45
3.4.2. Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký 49
3.4.3. Khảo sát lựa chọn phương pháp xử lý mẫu phân tích 50
3.4.4. Lựa chọn quy trình phân tích 51
3.4.5. Thẩm định quy trình phân tích 51
3.4.5.1. Tính đặc hiệu của phương pháp 51
3.4.5.2. Tính thích hợp của hệ thống 54
3.4.5.3. Độ tuyến tính và khoảng xác định 55
3.4.5.4. Độ đúng của phương pháp 56
3.4.5.5. Độ chính xác của phương pháp 58
3.4.5.6. Giới hạn phát hiện (LOD) 58
3.4.5.7. Giới hạn định lượng (LOQ) 59
3.4.6. Xác định hàm lượng paeoniflorin trong một số mẫu cao Hoạt lạc vương 59
3.5. “Dự thảo” tiêu chuẩn chất lượng cao đặc Hoạt lạc vương 61
3.5.1. Dự thảo tiêu chuẩn chất lượng cao chiết ethanol 60 % 61
3.5.2. Dự thảo tiêu chuẩn chất lượng cao chiết nước 61
4. BÀN LUẬN 62

4.1. Đối tượng nghiên cứu 62
4.2. Phương pháp nghiên cứu 63
4.3. Kết quả nghiên cứu 65
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67







DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT



DĐVN IV : Dược điển Việt Nam IV
YHCT : Y học cổ truyền
KLPT : Khối lượng phân tử
SKLM : Sắc ký lớp mỏng
HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao
MNC : Mẫu nghiên cứu
RSD : Độ lệch chuẩn tương đối
SPE :
Solid-phase extraction
R
f
*
: : R
f
x 100

TT : Thuốc thử
CN : Cao chiết nước
Et60% : Cao chiết ethanol 60 %.
QC : Quế chi
HP : Hương phụ
BT : Bạch thược
XK : Xuyên khung
DHCT : Dược học cổ truyền
TTKN HN : Trung tâm kiểm nghiệm Hà Nội.

















DANH MỤC BẢNG
Bảng Tên bảng Trang
Bảng 1.01 Thông số đánh giá phương pháp phân tích 22
Bảng 3.01 Kết quả đánh giá chất lượng mẫu cao Hoạt lạc vương

29
Bảng 3.02 Mã hóa các mẫu cao chiết ethanol 60 % 30
Bảng 3.03 Mã hóa các mẫu cao chiết nước

30
Bảng 3.04
Kết quả định tính thành phần hóa học trong cao và các vị
thuốc
31-32
Bảng 3.05 Kết quả SKLM định tính Quế chi ở 254 nm 34
Bảng 3.06 Kết quả SKLM định tính Bạch thược ở 254 nm 37
Bảng 3.07
Kết quả SKLM định tính Bạch thược khi phun thuốc thử
vanillin trong acid sulfuric 10 %
37
Bảng 3.08
Kết quả SKLM định tính Hương phụ và Xuyên khung ở
bước sóng 254 nm
40
Bảng 3.09
Kết quả SKLM định tính Hương phụ và Xuyên khung ở
bước sóng 366 nm
41
Bảng 3.10
Kết quả SKLM định tính Bạch thược, Hương phụ và Quế
chi sau khi hiện màu bằng hơi amoniac
44
Bảng 3.11
Kết quả xác định hàm lượng paeoniflorin trong dược liệu

Bạch thược

48
Bảng 3.12 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký 54
Bảng 3.13 Bố trí nồng độ các dung dịch chuẩn paeoniflorin 55


Bảng 3.14
Kết quả xác định đáp ứng diện tích pic của các nồng độ
paeoniflorin trong dung dịch trong chuẩn
55
Bảng 3.15 Kết quả xác định độ đúng của phương pháp 58
Bảng 3.16 Kết quả xác định giá trị LOD của phương pháp 59
Bảng 3.17
Kết quả xác định hàm lượng paeoniflorin trong một số
mẫu cao Hoạt Lạc vương do nhóm nghiên cứu bào chế
60









DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình Tên hình Trang
Hình 1.01
Công thức cấu tạo hợp chất paeoniflorin

6
Hình 2.01
Sơ đồ quy trình bào chế cao chiết ethanol 60 %
25
Hình 2.02
Sơ đồ quy trình bào chế cao chiết nước
26
Hình 3.01
Sắc kí đồ định tính Quế chi
34
Hình 3.02
Sắc kí đồ định tính Bạch thược
36
Hình 3.03
Sắc kí đồ định tính Hương phụ và Xuyên khung
40
Hình 3.04
Sắc kí đồ định tính Bạch thược, Hương phụ và Quế chi
44
Hình 3.05
Ảnh vị thuốc Bạch thược
46
Hình 3.06
Ảnh đặc điểm vi học bột Bạch thược
46
Hình 3.07
Sắc ký đồ dung dịch chuẩn paeoniflorin (thử nghiệm định
lượng paeoniflorin trong vị dược liệu Bạch thược)
48
Hình 3.08

Sắc ký đồ dung dịch thử (thử nghiệm định lượng
paeoniflorin trong vị dược liệu Bạch thược)
49
Hình 3.09
Sắc ký đồ mẫu placebo
53
Hình 3.10
Sắc ký đồ mẫu chuẩn paeoniflorin (tính đặc hiệu)
53
Hình 3.11
Sắc ký đồ mẫu thử (tính đặc hiệu)
54
Hình 3.12
Đồ thị biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ
paeoniflorin trong dung dịch và đáp ứng diện tích pic
56

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ cổ xưa, dược liệu đã được dùng làm thuốc chữa bệnh cho con người. Việc
kết hợp hài hòa hai nền y học cổ truyền và y học hiện đại là xu thế tất yếu của thời
đại nhằm giải quyết những khó khăn của Y học. Trong những năm gần đây, xu
hướng quay trở lại sử dụng các sản phẩm thuốc có nguồn gốc thảo dược để phòng
và điều trị bệnh trở nên thịnh hành ở Việt Nam.
Đi cùng xu thế hiện đại hóa, nhiều sản phẩm nguồn gốc thảo dược bào chế
dưới các dạng hiện đại xuất phát từ các bài thuốc cổ phương đã ra đời. Những sản
phẩm này giúp người bệnh sử dụng đơn giản, không mất thời gian, công sức cho
việc đun sắc thuốc. Tuy nhiên quy trình bào chế và tiêu chuẩn hoá một bài thuốc
cũng là một vấn đề đang được các công ty, các nhóm nghiên cứu quan tâm. Liệu

qua quá trình bào chế những sản phẩm này có thay đổi thành phần hóa học, tác
dụng sinh học so với bài thuốc ban đầu hay không vẫn là một câu hỏi cần được trả
lời một cách khoa học bằng các nghiên cứu từ khâu bào chế, tiêu chuẩn hoá sản
phẩm và thử tác dụng trên lâm sàng của sản phẩm. Đó là lí do vì sao những công ty
Dược có uy tín luôn muốn nghiên cứu nâng cao chất lượng sản phẩm của mình, để
có thể đưa ra thị trường những sản phẩm tốt nhất cho người bệnh. Trong công tác
kiểm tra chất lượng thuốc việc sử dụng các chất chuẩn là các hoạt chất chiết được từ
dược liệu để định tính, định lượng hoạt chất trong dược liệu và các sản phẩm thuốc
có nguồn gốc từ dược liệu đã được DĐVN IV đưa vào một số chuyên luận, đây là
một phương án để kiểm soát chất lượng dược liệu hiện nay khi đa số dược liệu được
nhập từ Trung quốc cũng như từng bước nâng cao tiêu chuẩn chất lượng các sản
phẩm thuốc có nguồn gốc từ dược liệu.
Có rất nhiều các sản phẩm bào chế hiện đại đi từ bài thuốc cổ phương để
chữa các bệnh về cơ khớp, các triệu chứng cảm mạo, đau mỏi cơ thể…
Phương thuốc Quế chi thang gia giảm (Hoạt lạc vương) có công năng: phát
tán phong hàn, thông kinh lạc dùng điều trị các chứng đau trong hội chứng vai gáy,
đau dây thần kinh…, phương thuốc đã được các lương y đánh giá cao về hiệu lực
điều trị, tuy nhiên việc sử dụng dạng thuốc sắc cổ phương có thể mất nhiều thời
gian và thực sự không tiện dụng do vậy việc nghiên cứu bào chế cao làm bán thành
2

phẩm để sản xuất dạng bào chế hiện đại và xây dựng tiêu chuẩn chất lượng sản
phẩm là cần thiết.
Nhóm nghiên cứu đã bào chế cao đặc Hoạt Lạc Vương, một trong những bán
thành phẩm của quy trình nghiên cứu hiện đại hóa phương thuốc Hoạt lạc Vương.
Từ những lý do trên đề tài “Xây dựng phương pháp định tính, định lượng
một số thành phần trong cao Hoạt Lạc Vương” được thực hiện với các mục tiêu
sau:
- Xây dựng phương pháp định tính một số vị dược liệu chính trong cao Hoạt
Lạc Vương.

- Xây dựng phương pháp định lượng paeoniflorin trong cao Hoạt Lạc Vương.
-

Dự thảo tiêu chuẩn chất lượng của cao đặc Hoạt Lạc Vương.



















3

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Phương thuốc Hoạt lạc vương
Thành phần:
[10]

Quế chi 20 g
Hương phụ 15 g
Bạch thược 5 g
Xuyên khung 5 g
Sinh khương 5 g
Một số vị khác (Bán hạ): Tổng khối lượng một thang là 70 g.
Công năng:
phát tán phong hàn, thông kinh lạc
[3], [10].
Chủ trị:
các chứng cảm mạo do phong hàn, đau trong hội chứng vai gáy, đau
dây thần kinh [3], [10].
Giải thích bài thuốc:
Hoạt lạc vương là phương Quế chi thang gia giảm trong
đó giảm Đại táo, Cam thảo, gia thêm Hương phụ, Xuyên khung và một số vị khác
(Bán hạ) nhằm tăng tác dụng giảm đau, hành khí, hoạt huyết. Các nhóm tác dụng
chính của phương thuốc [3], [10]:
-
Tác dụng phát tán phong hàn: Quế chi, Xuyên khung, Sinh khương.
-
Tác dụng thông kinh lạc: Quế chi.
-
Tác dụng hoạt huyết: Xuyên khung.
-
Tác dụng hành khí giải uất: Hương phụ.
-
Tác dụng thư cân: Bạch thược.
-
Tác dụng giảm đau: Xuyên khung, Hương phụ, Bạch thược.
Cách dùng:

sắc nước uống, sắc vũ hỏa, uống nóng, ngày 1 thang [3], [10].
Chống chỉ định:
Phụ nữ có thai, người đang chảy máu [3], [10].
Thận trọng:
Khi dùng cho trẻ em [3], [10].
Thông tin về các vị thuốc trong bài thuốc:
1.1.1. Quế chi
4

Cành phơi hay sấy khô của cây Quế (
Cinnamomum cassia
Presl.) hoặc một
số loài Quế khác (
Cinnamomum

zeylanicum
Blume,
Cinnamomum loureirii
Nees.),
họ Long não (Lauraceae) [8].
1.1.1.1. Thành phần hóa học
Tinh dầu: hàm lượng tinh dầu thay đổi ở các bộ phận từ 1 - 3%, lá 0,14%,
cành con 0,3 - 0,33% [5], [8].
Thành phần chính trong tinh dầu Quế là aldehyd cinnamic, hàm lượng có thể
từ 70 - 95%; ngoài ra còn có cinnamyl acetat, coumarin, cinnamyl alcol, methyl
cinnamat [2], [3], [5], [12].

Các thành phần khác: tinh bột, chất nhầy, dầu béo, tanin, chất màu, chất
ngọt, gôm, calcioxalat; các dẫn chất flavonoid gồm cả procyanidin; các chất chứa
nhân thơm; β-sitosterol, cholin, acid protocatechic [5], [7], [11], [12], [37].

Dược điển Việt nam IV quy định:
-

Hàm lượng tinh dầu không được nhỏ hơn 0,3% [8]
-

Hàm lượng chất chiết được trong Dược liệu không ít hơn 4 % tính theo dược
liệu khô kiệt [8].
1.1.1.2. Tác dụng sinh học
Quế chi có khả năng kích thích tuyến mồ hôi bài tiết, giãn mạch, tác dụng
giảm đau, giải co quắp. Ngoài ra có tác dụng cường tim, kích thích niêm mạc dạ
dày, tăng nhu động dạ dày, ruột [2], [3], [5].
Tác dụng kháng khuẩn: ức chế hoạt động của một số vi khuẩn đường ruột
như lỵ trực khuẩn, ức chế hoạt động của men và vi khuẩn sinh hơi, ức chế virus
bệnh cúm [31], [32], [33], [38], [39].
1.1.1.3. Tác dụng và công dụng theo YHCT [3], [10]
-

Giải biểu, tán hàn: dùng chữa chứng cảm mạo phong hàn (kết hợp với các vị
khác).
-

Làm thông dương khí: dùng trong trường hợp khí huyết lưu thông kém.
-

Làm ấm kinh thông mạch: Dùng điều trị các chứng do phong hàn, thấp trệ.
-

Hành huyết giảm đau: Dùng trong các trường hợp bế kinh, ứ huyết của phụ

nữ.
5

1.1.2. Hương phụ
Thân rễ đã loại bỏ rễ con và lông, phơi hay sấy khô của cây Hương phụ vườn
(Cyperus rotundus
L.), hoặc cây Hương phụ biển
(Cyperus stoloniferus
Retz.), họ
Cói (Cyperaceae) [8].
1.1.2.1. Thành phần hóa học
Tinh dầu: Hương phụ chứa 0,3 - 2,8% tinh dầu; chứa hơn 30 cấu tử với hàm
lượng khác nhau: cyperen 3,67%, α-cyperon 8,96%, α-cyperol 16,74%, đồng phân
của cyperon 12,26% [2], [5], [8].
Thành phần khác: flavonoid 1,25%, tanin 1,66%, các acid phenol, alcaloid
0,21 - 0,24%, glycosid tim 0,62 - 0,74%. Ngoài ra còn có chất đắng, tinh bột 9,2%,
pectin 8,7%, chất béo 2,98%, acid hữu cơ 3,25%, protein, vitamin C 8,8%, nhiều
nguyên tố vi lượng [2], [5], [8], [12].
Dược điển Việt Nam IV quy định: Hàm lượng tinh dầu trong dược liệu
không ít hơn 0,35 % tính theo dược liệu khô kiệt [8].
1.1.2.2. Tác dụng sinh học
Cao hương phụ dạng lỏng có tác dụng ức chế sự co bóp, làm dịu sự căng
thẳng của tử cung động vật [2], [3], [12].
Nước sắc của hương phụ vườn và hương phụ biển có tác dụng kiểu estrogen
và mức độ khác nhau. Tinh dầu hương phụ cũng có tác dụng kiểu estrogen. Điều
này chứng minh việc dùng hương phụ trong việc điều trị các bệnh của phụ nữ [2].
1.1.2.3. Tác dụng và công dụng theo YHCT [3], [10]
-

Hành khí, giảm đau: Dùng điều trị các bệnh đau bụng, đau hai bên sườn, sôi

bụng, tiết tả.
-

Khai uất, điều kinh: Dùng khi kinh nguyệt không đều do tinh thần căng
thẳng, đau bụng khi có kinh nguyệt.
-

Kiện vị, tiêu thực: Dùng trong các trường hợp ăn uống không tiêu. Ngoài ra
còn dùng trong các trường hợp đau bụng do khí lạnh, đau vùng thượng vị,
ngực đầy trướng.
-

Thanh can hỏa: Dùng trong bệnh mắt sung huyết đau đỏ.
1.1.3. Bạch thược
6

Rễ đã cạo bỏ lớp bần và phơi hay sấy khô của cây Thược dược (
Paeonia
lactiflora
Pall.), họ Hoàng liên (Ranunculaceae) [8].
1.1.3.1. Thành phần hóa học
Glycosid monoterpen: rễ Bạch thược chứa 3,30 - 5,70% paeoniflorin,
benzoyl paeoniflorin, oxypaeoniflorin, albiflorin [8]. Gần đây, người ta đã tìm thấy
glycosid monoterpen mới: 4-O-methyl paeoniflorin, isopaeoniflorin và
isobenzoylpaeoniflorin [1], [4],[12], [28], [29].
Bạch thược còn chứa các hợp chất triterpen và flavonoid: 11,12α - epoxy -
3β, 23 - dihydroxy - 30 - norolean - 20 (29) - en - 28, 13 - olid [3], [22]; một
glycosid phenonic mới: 2 - methoxy - 5(E) - propenyl - phenol - β - vicianosid [20],
[30].
Thành phần khác: tinh bột, tanin, canxi oxalat, một ít tinh dầu, acid benzoic

(tỷ lệ acid benzoic khoảng 1,07%), nhựa, chất béo và chất nhầy [12].
Paeoniflorin
-

Công thức phân tử: C
23
H
28
O
11
-

Khối lượng phân tử: 480,45
-

Công thức cấu tạo (hình 1.01)

Hình 1.01: Công thức cấu tạo hợp chất paeoniflorin
Tính chất:
-

Dạng tinh thể hình kim, có màu trắng ngà.
-

Tan trong nước, ethanol và methanol.
-

Nhiệt độ nóng chảy: Khoảng 196
o
C

7

Dược điển Trung quốc 2010 quy định: Hàm lượng paeoniflorin trong Bạch
thược không được ít hơn 1,6 %, tính theo dược liệu khô kiệt [24].
Dược điển Việt Nam IV chưa quy định kiểm tra hàm lượng paeoniflorin
trong dược liệu Bạch thược [8].
1.1.3.2. Tác dụng sinh học
Glycosid của bạch thược (paeoniflorin) có tác dụng ức chế hệ thần kinh trung
ương: tiêm vào phúc mạc chuột nhắt liều 1 g/ kg có tác dụng kéo dài thời gian ngủ
của barbituric [1], [3], [4].
Tác dụng kháng khuẩn: Cao nước Bạch thược có tác dụng kháng khuẩn trên
Shigella, Vibrip Cholerae, Staphylococcus, Salmonella, Preumococcus, và
Corynebacterium Diphtheriae [3], [12]
Tác dụng kháng Cholin: Cao methanol 50 % và hoạt chất paeoniflorin có tác
dụng Anticholinergic trên Chuột cống trắng In Vivo mà biểu hiện là tác dụng chống
co thắt, chống tiêu chảy. Ngoài ra, còn tác dụng giảm đau [3], [12].
1.1.3.3. Tác dụng và công dụng theo YHCT [3], [10]
-

Bổ huyết, cầm máu: dùng trong các trường hợp thiếu máu, chảy máu (chảy
máu cam, ho ra máu, chảy máu trong ruột…), chứng ra mồ hôi trộm.
-

Điều kinh dùng khi huyết hư, kinh nguyệt không đều, đau bụng kinh nguyệt.
-

Thư cân giảm đau: Dùng trong trường hợp can khí uất dẫn đến đau bụng, đau
ngực, chân tay co quắp.
-

Bình can: dùng trong các chứng đau đầu, hoa mắt.
1.1.4. Xuyên Khung
Thân rễ đã phơi hay sấy khô của cây Xuyên khung (
Ligusticum wallichii

Franch.). Họ Hoa tán (Apiaceae) [8].
1.1.4.1. Thành phần hóa học
Dược liệu có alcaloid và tinh dầu; trong đó có acid ferulic, 4 hydroxy - 3 -
butylphthalid, senkyunolid, ligustilid, tetramethylpyrazin, chuanxiongol, acid
sedanic [2], [3], [5], [8], [12], [34], [35].
1.1.4.2. Tác dụng sinh học
8

Nước sắc xuyên khung kéo dài giấc ngủ của chuột khi dùng kèm với thuốc ngủ
barbituric [3].
Liều nhỏ tinh dầu xuyên khung có tác dụng ức chế hoạt động não, hưng phấn
trung khu hô hấp và trung khu phản xạ ở tủy sống, làm tăng huyết áp. Nếu dùng liều
cao tinh dầu xuyên khung sẽ làm não tê liệt, huyết áp hạ, hô hấp khó khăn [3].
Tác dụng kháng khuẩn: Có tác dụng ức chế
Streptococcus
và
Candida albicans

[3].
1.1.4.3. Tác dụng và công dụng theo YHCT [3], [10]
-

Hoạt huyết, thông kinh: Dùng các trường hợp phụ nữ kinh nguyệt không đều,
bế kinh, đau bụng kinh, vô sinh.
-

Giải nhiệt, hạ sốt: Dùng trong ngoại cảm phong hàn.
-

Hành khí, giải uất, giảm đau: Dùng trong trường hợp khí trệ gây ngực sườn
đau tức, khí huyết vận hành khó khăn gây đau cơ đau khớp.
-

Bổ huyết: Dùng trong trường hợp suy nhược huyết kém.
1.1.5. Sinh khương
Thân rễ của cây Gừng (
Zingiber officinale
Rose.), họ Gừng (Zingiberaceae)
[8].
1.1.5.1. Thành phần hóa học
Gừng chứa 2 - 3% tinh dầu, 5% chất nhựa dầu, 3,7% chất béo, tinh bột và
các chất cay [2], [3], [5].
Tinh dầu Gừng có thành phần chủ yếu là các hợp chất hydrocacbon
sesquiterpenic: β-zingiberen (35%), ar-curcumenen (17%), β-farnesen (10%) và một
lượng nhỏ các hợp chất alcol monoterpenic như geraniol, linalol, borneol. Ngoài ra,
trong tinh dầu Gừng còn chứa α-camphen, β-phelandren, eucalyptol và các gingerol
[2], [3], [5], [12].
Nhựa dầu Gừng chứa 20 - 25% tinh dầu và 20 - 30% các chất cay [2], [3],
[5], [12].
Thành phần chủ yếu của nhóm chất cay là zingeron, shogaol và zingerol,
trong đó gingerol chiếm tỷ lệ cao nhất [2], [3], [5], [12].
1.1.5.2. Tác dụng sinh học
9

Nước gừng có tác dụng gây co mạch, hưng phấn thần kinh TW và thần kinh

giao cảm, tăng tuần hoàn, tăng huyết áp [3], [25], [26], [27].
1.1.5.3. Tác dụng và công dụng theo YHCT [3], [10]
Tính vị: Vị cay, tính ấm
Quy kinh: Phế, vị, tỳ.
Công năng, chủ trị:
-

Phát tán phong hàn, dùng chữa cảm mạo do phong hàn gây ra.
-

Làm ấm vị (ấm dạ dày): Dùng làm hết nôn khi bị lạnh, bụng đầy trướng
không tiêu.
-

Hóa đờm, chỉ ho: Dùng trong bệnh ho do viêm phế quản.
-

Lợi niệu, tiêu phù thũng.
-

Giải độc khử trùng: dùng chữa khi giun chui lên ống mật, tắc ruột do giun
đũa, giải độc khi ăn cua cá bị dị ứng.
1.2. Tổng quan về kỹ thuật SKLM trong phân tích kiểm nghiệm
1.2.1. Định nghĩa
SKLM là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di
chuyển qua pha tĩnh, trên đó đã đặt các chất cần tách [15],[16], [19], [23], [36].
-

Pha tĩnh: là chất bột rắn, mịn được trải thành lớp mỏng mịn và đồng nhất
được cố định trên phiến kính hoặc phiến kim loại, nhựa [15], [19]

-

Pha động: Là một hệ gồm dung môi đơn hay hỗn hợp nhiều dung môi phối
hợp với nhau theo tỷ lệ quy định [15], [19].
Trong quá trình di chuyển qua chất hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu
thử di chuyển trên lớp mỏng theo hướng pha động với những tốc độ khác nhau dẫn
đến việc tách và phân bố khác nhau trên lớp mỏng. Kết quả thu được một sắc ký đồ
trên lớp mỏng. Cơ chế của sự tách có thể là hấp phụ, phân bố, trao đổi ion [15],
[19].
1.2.2. Các đại lượng đặc trưng
Hệ số di chuyển Rf:
[15], [16], [19]
Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích.
Rf = a/b
10

Trong đó:
-

a: Là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử (cm).
-

b: Là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường
đi của vết (cm).
Rf có giá trị từ 0 -1, Rf phụ thuộc vào nhiều yếu tố như chất lượng của bột
hấp phụ, độ dày, độ hoạt hóa của lớp mỏng, chất lượng dung môi, kỹ thuật
khai triển, chất phân tích, tạp chất, nhiệt độ… nên độ lặp lại thường không
cao. Do đó trong SKLM người ta thường triển khai song song với chất
chuẩn/ chất đối chiếu để so sánh [15], [16], [19].
Hệ số dịch chuyển tương đối Rr:

[15], [16], [19].
Dùng để xác định vị trí vết chất thử trên sắc ký đồ khi không xác định được
tuyến dung môi
Rr = a/c
Trong đó:
-

a: Là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử (cm).
-

c: Là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu chuẩn (cm).
Rr có thể lớn hơn hoặc nhỏ hơn 1.
1.3. Tổng quan về

kỹ thuật HPLC trong phân tích kiểm nghiệm
1.3.1. Định nghĩa
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phân tích hoá lý dùng để
phân tách các thành phần của một hỗn hợp dựa vào ái lực khác nhau của các chất
khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc và không hoà tan nhau. Trong quá trình sắc ký
luôn xảy ra quá trình cân bằng động về sự phân bố của chất tan vào pha tĩnh và pha
động khi pha động luôn luôn chảy qua cột với một tốc độ nhất định [15], [16], [19].
Các chất cần phân tách trong dung dịch của hỗn hợp khi được đưa vào cột sẽ
được hấp phụ hoặc liên kết với pha tĩnh tuỳ thuộc vào bản chất của cột và kiểu sắc
ký áp dụng. Dung môi pha động được bơm vào cột sắc ký dưới áp suất cao. Các
chất tan sẽ di chuyển qua cột với tốc độ khác nhau tuỳ thuộc vào cấu trúc và tính
chất của mỗi chất. Thời gian chất tan bị pha tĩnh lưu giữ được quyết định bởi bản
chất sắc ký của pha tĩnh, cấu trúc và tính chất của các chất tan, bản chất và thành
11

phần của pha động dùng để rửa giải chất tan ra khỏi cột. Kết quả là các chất được

phân tách khỏi nhau. Sau khi ra khỏi cột, các chất sẽ được phát hiện bằng detector
và được chuyển qua bộ phận xử lý kết quả. Kết quả sau khi được xử lý sẽ được đưa
ra máy ghi hoặc hiển thị trên màn hình [15], [16], [19].
Tín hiệu phân tích định tính mỗi thành phần trong hỗn hợp là thời gian lưu
của chất đó trên cột hay vị trí của pic tương ứng trên sắc ký đồ, còn tín hiệu phân
tích định lượng là diện tích pic ( hoặc chiều cao pic ) thu được, phụ thuộc vào nồng
độ của chất đó trong dung dịch đem đo HPLC [15], [16], [19].
1.3.2. Các đại lượng đặc trưng
Thời gian lưu ( t
R
) và thể tích lưu: [15], [16], [19]
Thời gian lưu là thời gian cần thiết để một chất tan di chuyển từ nơi tiêm
mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ ( tính từ lúc tiêm tới khi xuất
hiện đỉnh của pic ). Dựa vào thời gian lưu có thể phát hiện định tính chất đó là chất
gì. Nếu gọi t
R
là thời gian lưu của chất tan thì ta có:
t
R
= t
0
+ t’
R

Trong đó:
-

t
0
: thời gian chết hay thời gian không lưu giữ.

-

t’
R
: thời gian lưu giữ thực của chất tan.
Thời gian lưu phụ thuộc vào nhiều yếu tố như bản chất sắc ký của pha tĩnh;
bản chất, thành phần, tốc độ của pha động; cấu tạo và bản chất của phân tử chất tan;
pH của pha động, nồng độ chất tạo phức.
Tương ứng với thời gian lưu, đại lượng thể tích lưu của một chất là thể tích
của pha động chảy qua cột sắc ký trong khoảng thời gian từ lúc bơm mẫu vào cột
cho đến khi chất tan được rửa giải ra ở thời điểm có nồng độ cực đại.
Hệ số phân bố ( K ): [15], [16], [19]
Quá trình tách sắc ký của các chất là dựa trên cơ sở sự phân bố của chất tan
giữa pha động và pha tĩnh. Sự phân bố này được đặc trưng bởi hệ số phân bố, nó
được tính theo công thức: K =
M
C
C
s

Trong đó: C
S
và C
M
lần lượt là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động.
12

Khi nồng độ chất tan không cao quá thì K là một hằng số chỉ phụ thuộc vào
bản chất các pha và chất tan, vào nhiệt độ.
Thừa số dung lượng ( k’ ): [15], [16], [19]

Đây là một đại lượng quan trọng được dùng để mô tả tốc độ di chuyển của
một chất. Nó cho ta biết khả năng phân bố của chất tan trong mỗi pha như thế nào.
Thừa số dung lượng được tính theo công thức: k’ =
M
S
Q
Q

Trong đó: Q
S
và Q
M
là lượng chất tan phân bố trong pha tĩnh và pha động.
Quan hệ giữa hệ số phân bố và thừa số dung lượng: k’ = K
M
S
V
V

Trong đó: V
S
và V
M
là thể tích pha tĩnh và pha động.
Ngoài ra có thể định nghĩa k’ theo một cách khác: k’ =
M
0R
T
T

-
T

Hệ số chọn lọc (
α
): [15], [16], [19]
Tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất được đặc trưng bởi hệ số chọn lọc:
α
=
A
B
K
K
=
A
B
k'
k'
=
AR,
BR,
t'
t'

Theo quy ước, chất B là chất bị lưu giữ mạnh hơn chất A, như vậy
α
>1.
α

càng lớn thì hai chất tách ra khỏi nhau càng xa, thường dùng

α
trong khoảng 1,05
đến 2,0 để thời gian phân tích không quá dài.
Hệ số bất đối xứng: [15], [16], [19]
Hệ số bất đối xứng A
S
được dùng đế đánh giá sự cân đối của đỉnh:
A
S
=
f
W
2
20/1

Trong đó:
-

W
1/20
: Độ rộng đỉnh ở 1/20 chiều cao.
-

f : Khoảng cách từ đường cao của đỉnh đến chân trước của đỉnh ở 1/20 chiều
cao.