Xây dựng phương pháp xác định dư lượng cefixim có trong nước thải từ cơ sở sản xuất dược bằng HPLC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



TRẦN THỊ THANH HUẾ

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
DƯ LƯỢNG CEFIXIM CÓ TRONG NƯỚC THẢI
TỪ CƠ SƠ SẢN XUẤT DƯỢC BẰNG HPLC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC





HÀ NỘI – 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



TRẦN THỊ THANH HUẾ

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
DƯ LƯỢNG CEFIXIM CÓ TRONG NƯỚC THẢI
TỪ CƠ SƠ SẢN XUẤT DƯỢC BẰNG HPLC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC





HÀ NỘI – 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



TRẦN THỊ THANH HUẾ


XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
DƯ LƯỢNG CEFIXIM CÓ TRONG NƯỚC THẢI
TỪ CƠ SƠ SẢN XUẤT DƯỢC BẰNG HPLC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 60 72 0410

Người hướng dẫn: 1. PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh
2. TS. Đoàn Cao Sơn

HÀ NỘI - 2013

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS
Nguyễn Thị Kiều Anh và TS. Đoàn Cao Sơn, là những người thầy đã trực tiếp
hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành tốt luận văn này.
Đặc biệt, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám đốc Viện
kiểm nghiệm thuốc Trung ương và TS. Nguyễn Thị Kim Hương – Trưởng khoa
Dược lý, Viện kiểm nghiệm thuốc Trung
ương cùng tập thể cán bộ trong khoa đã
tạo điều kiện và giúp đỡ cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn.
Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể
các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường và thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin c
ảm ơn gia đình và bạn bè, những người luôn động viên,
khích lệ, tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn.

Hà Nội, ngày 20 tháng 8 năm 2013
Học viên
Trần Thị Thanh Huế







MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ CEPHALOSPORIN 3
1.1.1. Lịch sử ra đời, nguồn gốc 3
1.1.2. Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng 3
1.1.3. Đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu 5
1.2. TỔNG QUAN VỀ CEFIXIM 6
1.2.1. Công thức cấu tạo 6
1.2.2. Tính chất lý hóa 6
1.2.3. Dược lý 6
1.2.4. Chỉ định 7
1.2.5. Một số phương pháp nghiên cứu định lượng cefixim 7
1.4. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 11
1.4.1. Khái niệm 11
1.4.2. Nguyên tắc 11
1.4.3. Phân loại 11
1.4.4. Các thông số đặc trưng 12
1.4.5. Ứng dụng của HPLC
14
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
19
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 19
2.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 19
2.2.1. Hóa chất - thuốc thử - chất chuẩn 19





2.2.2. Thiết bị - dụng cụ 20
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.3.1. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu
21
2.3.2. Xây dựng điều kiện sắc ký
21
2.3.3. Đánh giá phương pháp 21
2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu 23
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
24
3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 24
3.1.1. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 24
3.1.2. Khảo sát quy trình phân tích 33
3.1.3. Quy trình phân tích 37
3.2. ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP 38
3.2.1. Độ thích hợp của hệ thống 38
3.2.2. Tính chọn lọc của phương pháp 39
3.2.3. Độ tuyến tính 43
3.2.4. Độ đúng và độ chính xác của phương pháp 45
3.2.6. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 49
3.2.6. Khảo sát độ ổn định 50
3.3. ỨNG DỤNG QUY TRÌNH XÂY DỰNG ĐƯỢC ĐỂ XÁC ĐỊNH DƯ
LƯỢNG CEFIXIM CÓ T
RONG NƯỚC THẢI CÔNG NGHIỆP DƯỢC 51
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN
54

4.1. LỰA CHỌN QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU 54
4.2. LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH 54
4.3. Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 56
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
58
KẾT LUẬN 58
KIẾN NGHỊ 59








DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ACN Acetonitril
BP 2010 Dược điển Anh 2010 (The Bristist Pharmacopoeia)
C18

Octadecyl carbon chain
DAD Detector
chuỗi diod (Diode array detector)
HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High perform liquid chromatography)
HPLC-MS Sắc kí lỏng khối phổ (High perform liquid chromatography –Mas
Spectrometry)
t
R
Thời gian lưu
S

píc
Diện tích pic
S
i
Diện tích pic của chuẩn nội
TB Trung
bình
CFM Cefixim
CRF Clorof
orm
DEE Diethyl
ether
CHX Cyclohe
xan
LLOQ Giới hạn định lượng dưới
ULOQ Giới hạn định lượng tr
ên
MeOH Methanol
mg Milligram
ml Mililit
PA Tinh
khiết phân tích (Pure analysis)
SĐK Số đăng kí
USP 32 Dược điển Mỹ 32 (The United States Pharmacopoeia)
UV - VIS
Quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (Ultraviolet and visible
absorption Spectrophotometry)






DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Phổ tác dụng của các cephalosporin 4
Bảng 1.2. Đặc tính của các cephalosporin liên quan nghiên cứu 5
Bảng 3.1. Khảo sát lựa chọn dung m
ôi xử lý mẫu 25
Bảng 3.2. Khảo sát xử lý mẫu với dung môi diethyl ether
29
Bảng 3.3. Khảo sát xử lý mẫu với dung môi cloroform
30
Bảng 3.4. Khảo sát xử lý mẫu với dung môi cyclohexan
31
Bảng 3.5. Khảo sát độ ổn định của quá trình xử lý mẫu
32
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát thể tích tiêm mẫu
35
Bảng 3.7. Kết quả độ thíc
h hợp của hệ thống 39
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp
44
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp
46
Bảng 3.10.a. Kết quả độ lặp lại và độ chính xác tr
ung gian ở nồng độ LQC 47
Bảng 3.10.b. Kết quả độ lặp lại và độ chính xác trung gian ở nồng độ MQC
47
Bảng 3.10.c. Kết quả độ lặp lại và độ chính xác tr
ung gian ở nồng độ HQC .48
Bảng 3.11. Kết quả khảo sá

t độ ổn định trong quá trình bảo quản mẫu 50
Bảng 3.12. Kết quả khảo sá
t độ ổn định trong giai đoạn chờ tiêm mẫu 51
Bảng 3.13. Kết quả phân tích mẫu nước thải công ty CP dược Medipla
ntex .52














DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Công thức chung của cephalosporin
3
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của cefixim
6
Hình 2.1. Hóa chất, thuốc thử, chất c
huẩn, thiết bị, dụng cụ 20
Hình 3.1. Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn dung môi xử lý mẫu 25
Hình 3.2. Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn lượng dung m
ôi xử lý mẫu 27
Hình 3.3. Sắc ký đồ khảo sát quá trình xử lý mẫu với diethyl ether

28
Hình 3.4. Sắc ký đồ khảo sát quá trình xử lý mẫu với cloroform
29
Hình 3.5. Sắc ký đồ khảo sát quá trình xử lý mẫu với cyclohexan 30
Hình 3.6. Sắc ký đồ khảo sát xử lý mẫu bằng c
loroform tỷ lệ 6:2 acid hóa 32
Hình 3.7. Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha động và
tốc độ dòng 34
Hình 3.8. Phổ hấp thụ tử ngoại của cefixim
36
Hình 3.9. Phổ hấp thụ tử ngoại của cefdinir
37
Hình 3.10. Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu: mẫu chuẩn cef
dinir (a), mẫu
chuẩn cefixim (b), mẫu trắng (c), mẫu tự tạo (d)
41
Hình 3.11.
So sánh phổ cefixim trong dung dịch mẫu tự tạo và dung dịch
chuẩn 41
Hình 3.12.
So sánh phổ cefdinir trong dung dịch mẫu tự tạo và dung dịch
chuẩn 42
Hình 3.13. Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu khi phân tích cefixim và 4
cephalosporin khác 42
Hình 3.14.
a. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ cefixim (ng/ml) và tỷ
lệ diện tích pic của cefixim/diện tích pic chuẩn nội 44
Hình 3.14.
b. Sắc ký đồ khảo sá
t độ tuyến tính 44

Hình 3.15. Sắc ký đồ mẫu LOD
49
Hình 3.16. Sắc ký đồ phâ
n tích mẫu nước thải Công ty CP dược Mediplantex
53


ĐẶT VẤN ĐỀ
Tình trạng kháng thuốc kháng sinh đang là một thảm họa mà con người
phải đối mặt. Theo thống kê của Tổ chức y tế thế giới, chỉ tính riêng năm 2010,
tình trạng vi khuẩn Klebsiella Pneumoniae kháng thuốc đã gây ra 25.000 ca tử
vong tại châu Âu. Hiện nay, ngay cả những thuốc kháng sinh thế hệ mới nhất,
chỉ dùng trong nhiễm khuẩn bệnh viện cũng đã có hiện tượng bị kháng, bằng
chứng mới đây nhất là sự lây lan của chủng vi khuẩn kháng carbapenem (ndm-1)
ở hơn 16 quốc gia trên thế giới. Tổng Giám đốc Tổ chức y tế thế giới, bà
Magaret Chan đã đưa ra lời cảnh báo về khả năng con người quay trở lại thời kỳ
trước khi thuốc kháng sinh được ra đời nếu không có một hành động toàn cầu
giải quyết vấn đề kháng thuốc đang ngày càng trầm trọng này [32,33].
Để giải quyết vấn đề kháng thuốc kháng sinh, các nghiên cứu trước đây
chỉ tập trung chú ý đến nguyên nhân do việc sử dụng thuốc không hợp lý. Ngày
nay, các nhà khoa học đã phát hiện được một nguyên nhân cũng không kém
phần quan trọng khác: đó là sự tồn dư của kháng sinh và các chất chuyển hóa của
chúng trong môi trường vì chỉ cần một dư lượng nhỏ kháng sinh thải ra môi
trường nhưng sẽ được tích lũy dần dần vào các vi khuẩn gây bệnh, giúp chúng
phát triển những gen kháng thuốc. Cũng vì lý do đó, từ những năm cuối thập kỉ
90 của thế kỷ 20, hướng nghiên cứu về dư lượng thuốc kháng sinh và những chất
chuyển hoá cũng như tác động của chúng trong môi trường được ra đời. Hiện
nay, hướng nghiên cứu này đang được quan tâm tại các nước phát triển như Mỹ,
Đức, Thuỵ Sỹ, Australia… Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng sự tồn tại của các
kháng sinh và chất chuyển hoá của chúng trong môi trường nước đã trở nên phổ

biến [17,20,27].
Nhằm góp phần nâng cao nhiệm vụ chăm sóc và khám chữa bệnh cho
nhân dân, ngành công nghiệp Dược Việt Nam đang ngày càng lớn mạnh. Hiện cả
nước có hơn 200 doanh nghiệp có sản xuất dược phẩm với nhiều sản phẩm thuốc


1


với đủ chủng loại: kháng sinh, giảm đau, chống viêm, thuốc tim mạch, hormon,
thuốc bổ và vitamin… Cefixim, một kháng sinh thuộc nhóm Cephalosporin thế
hệ 3 có phổ rộng trên trực khuẩn Gram (-) và Gram (+), đang được chỉ định rộng
rãi trong việc điều trị các bệnh đường hô hấp trên và dưới đặc biệt ở trẻ em. Hiện
cũng có nhiều nhà máy, xí nghiệp dược đang sản xuất loại kháng sinh này với
các dạng bào chế khác nhau như: viê
n nén, viên nang, siro, bột pha hỗn dịch
uống… Tuy nhiên, việc kiểm soát sự tồn dư Cefixim trong nước thải ở các cơ sở
sản xuất này vẫn chưa được quan tâm đúng mức. Tới thời điểm hiện nay, ở Việt
Nam đã có một vài nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định dư lượng một số
kháng sinh trong nước thải bệnh viện [3], nhưng chưa có đề tài nào khảo sát đối
tượng nước thải từ các cơ sở sản xuất dược phẩm.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hà
nh đề tài: “Xây dựng
phương pháp xác định dư lượng Cefixim có trong nước thải từ cơ sở sản
xuất Dược bằng HPLC” với các mục tiêu chính như sau:
1. Xây dựng được phương phá
p xác định dư lượng kháng sinh Cefixim
trong nước thải từ cơ sở sản xuất Dược bằng HPLC ở nồng độ ppb.
2. Ứng dụng phương pháp xây dựng được để kiểm t
ra dư lượng Cefixim

có trong nước thải từ cơ sở sản xuất Dược trong nước.









2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ CEPHALOSPORIN
1.1.1. Lịch sử ra đời, nguồn gốc
Năm
1945, Giuseppe Brotzu từ nguồn nước biển tại Cagliari (Italia) đã
phân lập được chủng nấm Cephalosporium acremonium. Dịch lọc môi trường
nuôi cấy nấm này có tác dụng ức chế sự phát triển của tụ cầu vàng
Staphylococcus aureus và có tác dụng điều trị bệnh nhiễm khuẩn do tụ cầu vàng
và bệnh thương hàn ở người. Từ năm 1948 đến năm 1956, Abraham và Neuton
(Anh) từ m
ôi trường nuôi cấy này (nay được gọi là Acremonium chrysogenum)
đã chiết được một hỗn hợp kháng sinh cephalosporin P
1
, cephalosporin C và
penicillin N. Năm 1971, từ chủng Norcardia, Nagarazan chiết xuất được
cephamycin cũng có cấu trúc gần với cephalosporin C.
Có nhiều cepha

losporin tự nhiên được sinh tổng hợp từ các chủng nấm
mốc khác nhau nhưng chúng hầu như không có ý nghĩa trong trị liệu. Vì vậy
người ta đã tìm cách tạo ra các cephalosporin bán tổng hợp trên cơ sở cấu trúc
vòng β-lactam. Ưu thế của các cephalosporin là có tác dụng kháng khuẩn đối với
cả các vi khuẩn có hoạt tính β-lactamase, nhiều vi khuẩn Gram (-) và độc tính
thấp. Vì vậy chúng nhanh c
hóng chiếm vị trí quan trọng trong trị liệu [9].
1.1.2. Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng
* Công thức chung của cephalosporin

S
N
NH
R
1
O
R
2
H
O
OOH
H
H
R
3

Hình 1.1. Công thức chung của cepha
losporin



3


Cephalosporin là dẫn chất acyl hóa của acid 7-aminocephalosporanic
(A7AC), mang cấu trúc
3
-cephem,
3
mới đủ liên hợp điện tử với vòng β –
lactam để hợp chất có tác dụng sinh học.
Trong A7AC, các carbon bất đối C
(6)
và C
(7)
đều có cấu hình R, và hầu
như là nguyên nhân làm cho các cephalosporin có tính hữu tuyền khá mạnh [7].
* Phân loại và phổ tác dụng
Hiện nay, cepha
losporin được phân loại thành 4 thế hệ dựa trên phổ tác
dụng. Các cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn Gram (+) mạnh
hơn, nhưng trên Gram (-) yếu hơn thế hệ sau và ngược lại. Phổ chung của các thế
hệ cephalosporin được giới thiệu tại Bảng 1.1 [10].
Bảng 1.1. Phổ tác dụng của các cephalosporin
Nhóm Tên đại diện Phổ tác dụng
Thế hệ I Cephalexin - Phổ tác dụng trung bình, tác dụng trên các vi khuẩn Gram
(+) như tụ cầu, liên cầu, phế cầu (trừ liên cầu kháng
methicillin).
Cephalothi
n
Cephazolin

…
- Thuốc cũng có tác dụng trên một số vi khuẩn Gram (-) như
E.coli, Kebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis và Shi
gella.
Thế hệ II Cephaclor
Cefuroxim
Cefotetan…
- Phổ tác dụng tương tự như thế hệ 1. Tuy nhiên tác dụng trên
vi khuẩn Gram (+) yếu hơn còn tác dụng trên vi khuẩn Gram
(-) mạnh hơn.
Thế hệ
III
Cefixim
Cefoperazon
Cefotaxim
- Tác dụng tốt trên vi khuẩn Gram (-), bền vững với β-
lactamase, tác dụng trê
n cả P. aeruginosa.
- Trên vi khuẩn Gram (+), tác dụng kém thế hệ 1.
Thế hệ
IV
Cefdinir
Cefepim…
- Phổ tác dụng tương tự nhưng mạnh hơn thế hệ 3. Thuốc tác
dụng tốt với các vi khuẩn Enterobacteriaceae, Haemophilus,
Pseudomonas, Streptococcus, lậu cầu, não mô cầu.
- Bền vững với β-lactamase.


4



1.1.3. Đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu
Trong khuôn khổ của đề tài chúng tôi xin giới thiệu đặc tính của một số
cephalosporin được liên quan nghiên cứu trong đề tài tại Bảng 1.2
[6,7,10,15,26,29,35].
Bảng 1.2. Đặc tính của các cephalosporin liên quan nghiên cứu
Tên chất
Thế
hệ
Công thức phân tử Tính chất vật lí
1. Cefadroxil
monohydrat
I C
16
H
17
N
3
O
5
S.H
2
O - Bột màu trắng hoặc gần như trắng.
- K
hó tan trong nước, rất khó tan
trong ethanol 96%.
- Độ tan trong nước: 0,
339 g/l.
- pK

a1
= 3,45; pK
a2
= 7,43
2. Cefuroxim II C
20
H
22
N
4
O
10
S - Bột trắng hoặc hơi vàng.
- Ít tan trong nước, tan trong acet
on,
ethyl acetat và methanol, ít tan trong
ethanol.
- Độ tan trong nước: 0,284 g/l.
- pK
a1
= 3,15; pK
a2
= 1,1
3. Cefdinir III C
14
H
13
N
5
O

5
S
2
- Bột trắng hoặc hơi vàng.
- Tan trong dung dịch đệm phosphat
0,1M (pH = 7), ít tan trong nước,
trong alcol và diethylether.
- Độ tan trong nước: 8,87.10
-2
g/l.
- pK
a1
= 1,74; pK
a2
= 7,45
4. Cefoperazon III C
25
H
26
N
9
NaO
8
S
2
- Bột trắng hoặc hơi vàng.
- Dễ tan trong nước, tan trong
methanol, hơi tan trong ethanol
96%.
- Độ tan trong nước: 0,286 g/l.

- pK
a1
= 3,38; pK
a2
= - 1,7


5


1.2. TỔNG QUAN VỀ CEFIXIM
1.2.1. Công thức cấu tạo

.3H
2
O
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của
cefixim
+ Công thức phân tử: C
16
H
15
N
5
O
7
S
2
.3H
2

O
+ Khối lượng phân tử: 507,5
+Tên khoa học: (6R, 7R)- 7- [[(Z)- 2- (2- aminothiazol- 4- yl)- 2- [(carboxy
methoxy) imino] acetyl] amino]- 3- ethenyl- 8- oxo- 5- thia- 1-azabicyclo [4.2.0]
oct- 2- en- 2- carboxylic trihydrat [6,15,29].
1.2.2. Tính chất lý hóa
Bột trắng hoặc gần như trắng, hơi hút ẩm. Ít tan trong nước, aceton,
glycerin, tan trong methanol, propylen glycol, hơi tan trong ethanol, thực tế
không tan trong ether, ethyl acetat và hexan, hầu như không tan trong dung dịch
sorbitol 70% và octanol. Dung dịch chứa 0,7 mg cefixim trong 1 ml nước có pH
từ 2,6 đến 4,1 [6,15,29].
Độ tan tr
ong nước: 0,104 g/l.
Hằng số pK
a1
= 3,45; pK
a2
= 2,92 [35].
1.2.3. Dược lý
Cef
ixim (CFM) là một kháng sinh cephalosporin thế hệ 3, được dùng theo
đường uống.


6


CFM có độ bền vững cao với sự thủy phân của β- lactamase mã hóa bởi
gen nằm trên plasmid và chromosom. CFM có tác dụng cả in vitro và trên lâm
sàng với hầu hết các chủng của các vi khuẩn sau đây:

- Vi khuẩn Gram (+): Streptoc
occus pneumonia, Streptococcus pyogenes.
- Vi khuẩn Gram (-): Haemophilus influenzae (tiết hoặc không tiết β-
lactamase), Moraxella catarrhalis (đa số tiết β- lactamase), Escherichia coli,
Proteus mirabilis, Neisseria gonorrhoeae (tiết hoặc không tiết penicillinase).
CFM không có hoạt tính đối với Enterococcus, Staphylococcus,
Pseudomonas aeruginosa và hầu hết các chủng Bacteroides và Clostridia
[5,10,13,14,26].
1.2.4. Chỉ định
- Nhiễm khuẩn đường hô hấp trên và dưới, viêm tai giữa cấp tính.
- Nhiễm khuẩn đường niệu không biến chứng.
- Viêm niệu đạo do lậu cầu.
- Điều trị các nhiễm k
huẩn nặng do các vi khuẩn đã kháng cephalosporin
thế hệ I và thế hệ II: Viêm màng não cấp, áp xe não, nhiễm khuẩn đường huyết,
viêm màng trong tim, nhiễm khuẩn đường hô hấp nặng, nhiễm khuẩn tiêu hóa,
nhiễm khuẩn đường mật, nhiễm
khuẩn tiết niệu và sinh dục [5,26].
1.2.5. Một số phương pháp nghiên cứu định lượng cefixim
Nghiê
n cứu định lượng CFM rất phong phú với nhiều loại nền mẫu khác
nhau. Chúng tôi xin giới thiệu một số nghiên cứu định lượng CFM.
1.2.5.1. Nghiên cứu định lượng cefixim bằng phương pháp đo quang
- Định lượng CFM trong viên nén khi đánh giá độ hòa tan tại λ = 288 nm,
mẫu trắng là dung dịch đệm phosphat 0,05 M pH = 7,2 (6,8 g KH
2
PO
4
, điều
chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1M) [6,29].



7


- Trong một nghiên cứu khác của Mahesh Attimarad và Anroop B Nair
năm 2011, CFM và Ofloxacin được định lượng đồng thời bằng phương pháp đạo
hàm và đạo hàm tỷ đối bậc nhất. Với phương pháp phổ đạo hàm bậc nhất, nhóm
nghiên cứu đã tìm ra bước sóng thích hợp cho định lượng CFM là 318,6 nm và
nồng độ định lượng trong khoảng từ 2-20 µg/ml [25].
1.2.5.2. Nghiên cứu định lượng cefixim bằng phương pháp HPLC
 Mẫu: nguyên liệu, viên nén, hỗn dịch
- Cột: C
18
(0,125 m x 4 mm, 5 µm)
- Pha động: ACN : dung dịch tetra
butylamoni hydroxyd 0,4 M pH = 6,5
(chỉnh pH bằng dung dịch H
3
PO
4
1,5 M) (1:3)
- Detector: UV λ = 254 nm
- Tốc độ dòng: điều chỉnh c
ho thời gian lưu của cefixim khoảng 10 phút
[6,15,29].
Cũng theo một nghiên cứu khác của K. Azhagesh Raj và cộng sự năm
2010, CFM và Cefuroxim axetil trong dạng thuốc bán thành phẩm và thành
phẩm được định lượng đồng thời bằng phương pháp HPLC pha đảo với cột C-18
của Merck (100 x 4,6 mm, 5 µm). Pha động sử dụng methanol: nước (90:10).

Bước sóng phát hiện cũng ở 254 nm [24].
 Mẫu dịch sinh học
 Phạm Thu Trang [11]: mẫu huyết tương
- Tủa protein bằng dung dịch HClO
4
20%
- Điều kiện phân tíc
h:
o Cột Rp 18e (250 x 4,6 mm, 5 µm) có bảo vệ cột, nhiệt độ cột 40°C
o Pha động: MeOH : đệm phosphat pH = 2,1 (NaH
2
PO
4
12,5 mM, KH
2
PO
4

5 mM; TBAH 0,06 mM) = 35 : 65, tốc độ dòng 1,5 ml/phút


8


o Detector: DAD λ =285 nm
 Abbas Khan và cộng sự [12]: mẫu huyết tương
- Tủa protein bằng acid tricloroacetic
- Điều kiện phân tích:
o Cột S
upelco Discovery HS C

18
(150 mm x 4,6 mm, 5 µm), nhiệt độ cột
50°C
o Pha động: ACN : methanol (50:50): dung dịch trifloroacetic (19:81), tốc
độ dòng 2 ml/phút
o Detector: UV λ = 285 nm
 Emirhan Nemutlu và cộng sự [18]: mẫu huyết tương và nước ối
- Chiết pha rắn cột polymeric sorbent (Strata X)
- Điều kiện sắc ký:
o Cột Xterra C
18
(250 x 4,6 mm, 5 µm), nhiệt độ cột 32°C
o Pha động: dung dịch đệm phosphat 40 mM pH = 3,2 và MeOH, gradient,
tốc độ dòng 0,85 ml/phút
o Detector: DAD λ = 285 nm
 Joy A. McAteer và cộng sự [23]: mẫu huyết tương, định lượng đồng thời 5
cephalosporin dùng đường uống là cefixim, cephalexin, cefaclor,
cephradin, cefadroxil
- Tủa prote
in bằng ACN
- Điều kiện sắc ký:
o Cột

Altex Ultrasphere C
8
(150 x 4,6 mm, 5 µm)
o Pha động: MeOH : dung dịch đệm phosphat 12,5 mmol/l pH 2,6 = 20:80,
tốc độ dòng 2 ml/phút
o Detector: UV λ = 254 nm
 Mẫu: nước bề mặt, nước ngầm, nước uống



9


Nghiên cứu xác định cefixim trong mẫu nước bề mặt, nước ngầm, nước
uống đã được công bố [31].
- Chiết pha rắn cột SPE: Isolute EVN 100 mg
- Điều kiện sắc ký:
o Cột Luna C
18
(250 x 2 mm, 5 µm)
o Pha động: Acid formic 0,1% : ACN : MeOH, gradient thành phần pha
động, tốc độ dòng 0,2 ml/phút
o Detector: MS-MS
Nhận xét

CFM là một kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 được sử dụng trong nhiều
trường hợp. Vậy nên CFM là một trong những kháng sinh được quan tâm nghiên
cứu nhiều. Các nghiên cứu về CFM rất phong phú đa dạng từ định lượng CFM
trong chế phẩm, huyết tương tới định lượng trong nước thải.
Các dược điển các nước đều c
ó chuyên luận riêng về CFM [6,15,29].
Nghiên
cứu định lượng CFM trong huyết tương cũng rất được quan tâm
chú ý. Trên thế giới đã có nhiều nghiê
n cứu định lượng riêng CFM hay định
lượng CFM đồng thời với các chất khác [12,18,23]. Tại Việt Nam, cũng đã có
những nghiên cứu định lượng CFM trong huyết tương [11].
Tuy nhiên những nghiên cứu về CFM trong nước thải nhà máy còn khá ít.

Các quy trình định lượng CFM trong chế phẩm và huyết tương không thể áp
dụng cho định lượng CFM trong nước thải nhà máy. Trên thế giới, chúng tôi mới
chỉ tìm thấy một nghiên cứu định lượng CFM trong nước thải bệnh viện [
27].
Nghiên cứu này sử dụng phương pháp phân tích bằng LC-MS/MS, xử lý mẫu
bằng chiết pha rắn. Phương pháp này cho độ đặc hiệu cao, giới hạn phát hiện
thấp. Tuy nhiên, hệ thống LC-MS/MS và chiết pha rắn giá thành cao, hiện nay
chưa phổ biến tại Việt Nam. Trong khi đó, hệ thống HPLC-DAD và chiết lỏng -
lỏng khá thông dụng, dễ kiếm, dễ áp dụng tại Việt Nam. Vì vậy chúng tôi xây


10


dựng quy trình phân tích CFM trong nước thải nhà máy với hệ thống HPLC với
detector DAD.
1.4. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.4.1. Khái niệm
Sắc ký lỏng hiệu năn
g cao (HPLC) là kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở của
sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của
pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp thụ, phân bố,
trao đổi ion hay loại cỡ tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng [2].
1.4.2. Nguyên tắc
Mẫu phân tích được hòa tan trong pha động. Pha này là một chất lỏng
được cho qua cột chứa các hạt pha tĩnh một cách liên tục. Các chất tan là thành
phần của mẫu sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc
vào hệ số phân bố giữa chất tan với pha tĩnh và pha động. Nhờ tốc độ di chuyển
khác nhau các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho
phân tích định tính và định lượn

g [1,2].
1.4.3. Phân loại
Các kĩ thuật sắc ký lỏng: sắc ký phâ
n bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi
ion, sắc ký loại cỡ, sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học.
Trong khuôn khổ của đề tài tôi xin tr
ình bày chi tiết về sắc ký phân bố.
Sắc kí phân bố là kĩ thuật được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay. Có thể
phân thành 2 dạng tùy thuộc vào pha tĩnh:
- Sắc ký lỏng - lỏng: Pha tĩnh là lớp chất lỏng ba
o quanh các hạt chất
mang rắn, đó là chất nhồi cột. Quá trình lưu giữ chất phân tích liên quan đến sự
phân bố giữa 2 pha lỏng.


11


- Sắc ký pha liên kết: pha tĩnh có liên kết hóa học với bề mặt chất mang
rắn ví dụ như silica, alumina [1,2].
1.4.4. Các thông số đặc trưng
* Hệ số phân bố K [2]

Trong đó:

C
S
: nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh.

C

M
: nồng độ mol của chất tan trong pha động.
K càng lớn, sự di chuyển của các chất tan qua pha tĩnh càng chậm. Nếu
các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều thì khả năng tách
diễn ra càng dễ dàng hơn.
* Thời gian lưu t
R
[2]
Thời gian lưu t
R
là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất
phân tích đến detector. Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lưu
của mỗi chất là hằng định. Vì vậy có thể dùng thời gian lưu để phát hiện định
tính các chất.
Thời gia
n lưu phụ thuộc vào các yếu tố:
- Bản chất của pha tĩnh
- Bản chất,
thành phần, tốc độ của pha động
- Cấu tạo và bản chất phâ
n tử của chất tan
- Trong một số trường hợp c
òn phụ thuộc vào pH pha động.
* Hệ số dung lượng k’ [2]

k’ = = K.


12



Trong đó: K: hệ số phân bố
V
S
: thể tích pha tĩnh
V
M
: thể tích pha động
Cần chọn cột, pha động sao cho k’ nằm trong khoảng tối ưu: 1 ≤ k’ ≤ 8.
* Hệ số đối xứng của pic AF [2]
a
W
2
20/1
AF =
Trong đó: W
1/20
: Chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic,
a: Khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường
cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic.
Trong phép định lượng yêu cầu 0,8 ≤ AF ≤ 2
* Số đĩa lí thuyết và hiệu lực cột N [2]
Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột.
2
2/1
2
54,516















W
t
W
t
N
RR

Trong đó:
W
1/2
là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh,
W
là độ rộng đáy pic.
* Độ phân giải [2
]
- Độ phân giải đánh giá khả năng tách hai chất trên sắc ký đồ cho 2 pic liền
kề.
AB
RARB

AB
RARB
S
WW
tt
WW
tt
R
2/12/1
)(18,1)(2







- Trong đó : t
RA
, t
RB
: Thời gian lưu pic của chất A và chất B (2 pic liền kề)


13


W
A
, W

B
: Độ rộng của pic đo ở các đáy pic của chất A và chất B.

W
1/2A
, W
1/2B
: Độ rộng của pic đo ở nửa chiều cao các pic của chất
A và chất B.
Các giá trị t
RA
, t
RB
,W
A
, W
B
, W
1/2A
, W
1/2B
phải tính theo cùng đơn vị.
- Yêu cầu R
S
> 1, giá trị tối ưu R
S
= 1,5.
1.4.5. Ứng dụng của HPLC
* Định tính:
- Sự giống nha

u về thời gian lưu của pic chất phân tích trên sắc ký đồ của
dung dịch chuẩn và thử là cơ sở của phép định tính. Trên các máy HPLC hiện
đại với detector mảng diod ta có thể quét phổ UV-VIS của pic chất phân tích trên
sắc ký đồ mẫu chuẩn và mẫu thử rồi chồng phổ với nhau để xác định sự giống
nhau về dạng phổ thông qua hệ số Match (SI- similarity index).
- Hệ số Match xấp xỉ 1,000 chỉ ra một phổ định tính giống nhau hoà
n toàn.
- Hệ số Match cà
ng gần 1,000 thì sự tương tự của phổ càng cao.
- Hệ số Match > 0,
990: hai phổ tương tự nhau.
- Hệ số 0,900 ≤ Matc
h ≤ 0,990: hai phổ có những điểm tương đồng.
- Hệ số Match < 0,900: hai phổ khác nhau.
* Định lượng:
Việc so sánh độ lớn tín hiệu thu được từ pic của chất phân tích trong dung
dịch (diện tíc
h pic hoặc chiều cao pic) trong cùng một điều kiện sắc ký là cơ sở
của phép định lượng.
Các phương phá
p định lượng có thể áp dụng là:
- Phương pháp dùng chuẩn ngoại.
- Phương pháp dùng chuẩn nội.


14


- Phương pháp thêm chất chuẩn.
- Phương pháp c

huẩn hóa diện tích.
Trong đó phương pháp dùng c
huẩn nội là phương pháp hay được sử dụng
khi nền mẫu phức tạp, phải qua quá trình xử lý mẫu. Phương pháp này có nhiều
ưu điểm làm giảm thiểu sai số qua các quá trình khác nhau. Đây cũng là phương
pháp được sử dụng trong nghiên cứu này. Sau đây chúng tôi xin trình bày chi tiết
về phương pháp chuẩn nội dùng trong định lượng bằng HPLC.
* Phương pháp dùng chuẩn nội [1,2
]
Nguyê
n tắc: Người ta chọn một chất chuẩn nội đưa vào trong mẫu phân tích
và trong dung dịch chuẩn đối chiếu. Tỷ số diện tích pic của chất phân tích và
chất chuẩn nội là thông số phân tích được dùng để xây dựng đường chuẩn.
Hai yêu cầu đối với chuẩn nội là
:
- Pic của chất c
huẩn nội phải tách khỏi pic các thành phần khác (R
S
> 1,25).
- Pic của chất c
huẩn nội phải gần với pic của chất phân tích.
Ưu điểm:
Phương pháp này đáng tin cậy nhất (sai số cực tiểu khoảng 0,5 –
1,0%). Sai số do quá trình tiêm mẫu cũng được loại bỏ.
1.5. TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ NGHIÊN CỨU DƯ LƯỢNG KHÁNG
SINH CÓ TRONG NƯỚC Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI
Nghiên cứu của Dương Hồng Anh và cộng sự (2006) đã xây dựng được
phương pháp phân tíc
h sự có mặt của các kháng sinh họ Floquinolon trong nước
thải bệnh viện. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn dùng cột

silicagel tự chế tạo và định lượng được các kháng sinh ciprofloxacin,
norfloxacin, levofloxacin, ofloxacin và lomefloxacin có mặt trong nước thải
bệnh viện bằng HPLC với detectơ huỳnh quang. Điều kiện sắc ký: cột C16, nhiệt
độ cột 50ºC, tốc độ dòng 0,7 ml/phút, bước sóng kích thích 278 nm và bước sóng


15


phát xạ 445 nm. Hiệu suất thu hồi trong nền nước thải đạt từ 80 đến 106% và
giới hạn phát hiện trong khoảng 0,5 đến 1,0 µg/L [3].
Một nghiên cứu của Dennis McQuellan và cộng sự (2002) tại New
Mexico đã phát hiện ra một số chất như: chống trầm cảm, chống dị ứng, viêm,
kháng sinh và hoóc môn trong nước ở nồng độ nanogam/lít. Các nhà nghiên
cứu đã sử dụng phương pháp HPLC-MS để phát hiện sự tồn tại các kháng sinh
Tetracyclin và nhóm Macrolid có trong các nguồn nước tự nhiên [
17].
Một nghiên cứu của Carolina Quesada- Molina và cộng sự (2012) đã xây
dựng phương pháp xác định đồng thời dư lượng một số kháng sinh họ
Cephalosporin (cephalexin, cefoperazon, ceftiofur, cephapirin, cephalozin) có
trong các nguồn nước tự nhiên bằng kỹ thuật điện di mao quản với detector
DAD. Điều kiện phân tích sử dụng dung dịch đệm acetat 70 mM pH 7,0, đặt
trong một điện thế 22,5V ở 25ºC và sử dụng cefadroxil làm chuẩn nội. Giới hạn
phá
t hiện của phương pháp là 0,1 µg/L đối với cephalexin; 0,2 µg/L đối với
cefoperazon, ceftiofur, cephapirin và 0,3 µg/L đối với cephazolin [16].

Trong luận văn tiến sĩ của Haomin Xu ở Trường Đại học California,
Irvine (2010), tác giả cũng đã xây dựng phương pháp và đánh giá hàm lượng
kháng sinh Amoxicillin, thuốc chẹn Beta, trimetropim và cimetidin có trong

nguồn nước tự nhiên tại châu Âu và Mỹ. Trong đó, điều kiện phân tích
Amoxicillin như sau: máy HPLC Agilent 1200 với 2 detector là UV-VIS và
huỳnh quang, cột C18 Phenomenex, pha động dung dịch đệm phosphat 10 mM
pH 3,0: methanol (85:15), tốc độ dòng: 1,0 ml/phút; bước sóng phát hiện 230
nm. Các phương pháp này đã được ứng dụng để nghiên cứu quá trình quang
chuyển hoá của các hợp chất trê
n [20].
Nghiên cứu của Vishal Diwan và cộng sự năm 2010 đã xây dựng và đánh
giá dư lượng của 7 kháng sinh: amoxicillin, ceftriaxon, amikacin, ofloxacin,
ciprofloxacin, norfloxacin và levofloxacin trong nước thải tại một bệnh viện ở
Ujjain, Ấn Độ. Nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn và phương pháp
HPLC-MS/MS. Kết quả đã xây dựng được phương pháp với LOD từ 0,01 đến


16