Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số hợp chất phân lập được từ cây cỏ seo gà

1

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI



NGUYỄN HẢI ĐƢỜNG

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG MỘT SỐ
HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC
TỪ CÂY CỎ SEO GÀ


LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC



HÀ NỘI – 2014


2

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN HẢI ĐƢỜNG

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG MỘT SỐ
HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC
TỪ CÂY CỎ SEO GÀ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 60720410

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
PGS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu
NCS.ThS. Nguyễn Duy Chí
Nơi thực hiện: Viện kiểm nghiệm nghiên cứu
Dƣợc và trang thiết bị y tế Quân đội




HÀ NỘI – 2014


3

MỤC LỤC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 2
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY CỎ SEO GÀ 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật 2
1.1.2. Thành phần hóa học 2
1.1.3. Tác dụng dƣợc lý 4
1.1.4. Công dụng 6
1.2. MỘT SỐ HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP ĐƢỢC TỪ CỎ SEO GÀ 6
1.2.1. Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid 6
1.2.2. Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-β-D-glucopyranosid 7
1.2.3. Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-[α-D-apiofuranosyl-(1-2)-β-
D-glucopyranosid] 9
1.2.4. 3,4-dihydroxybenzandehyd 10
1.2.5. Kaempferitrin 11
1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 12
1.3.1. Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao 12
1.3.2. Máy HPLC 13
1.3.3. Các thông số đặc trƣng của quá trình sắc ký 13
1.3.4. Ứng dụng của kỹ thuật HPLC 15
1.3.5. Kỹ thuật HPLC với detector DAD (diod array detector) 17


4

CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.1. ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ 19
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu 19
2.1.2. Dung môi, hóa chất 19
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị 19
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 20

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.3.1. Chuẩn bị mẫu thử 21
2.3.2. Chuẩn bị các chất đối chiếu 22
2.3.3. Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký 22
2.3.4. Thẩm định phƣơng pháp phân tích 23
2.3.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu 26
CHƢƠNG III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 27
3.1. ĐỘ ẨM VÀ HIỆU SUẤT CHIẾT CẮN TOÀN PHẦN 27
3.1.1. Độ ẩm của dƣợc liệu 27
3.1.2. Chiết xuất 27
3.2. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 28
3.2.1. Lựa chọn cột sắc ký 29
3.2.2. Lựa chọn pha động 30
3.2.3. Lựa chọn tốc độ dòng 30
3.2.4. Lựa chọn bƣớc sóng phát hiện 30
3.3. XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT VÀ NHẬN DẠNG CÁC PIC TRÊN SẮC
KÝ ĐỒ CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC TỪ CỎ SEO GÀ 34
3.4. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ
TRONG CỎ SEO GÀ 37


5

3.4.1. Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký 37
3.4.2. Độ lặp lại của phƣơng pháp 39
3.4.3. Khoảng nồng độ tuyến tính 41
3.4.4. Độ đúng 45
3.4.5. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) 48
3.5. ỨNG DỤNG XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ
TRONG CỎ SEO GÀ 49

3.5.1. Phân tích các phân đoạn thu đƣợc trong quá trình chiết xuất cây Cỏ Seo
gà 49
3.5.2. Xác định hàm lƣợng các chất có trong cây Cỏ Seo gà 52
CHƢƠNG IV: BÀN LUẬN 54
4.1. VỀ PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU 54
4.2. VỀ VIỆC TẠM DÙNG CÁC CHẤT ĐỐI CHIẾU ĐỂ XÂY DỰNG
PHƢƠNG PHÁP 54
4.3. VỀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 55
4.4. VỀ THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP 56
4.5. VỀ KẾT QUẢ ĐỊNH LƢỢNG CÁC CHẤT VÀ SO SÁNH THÀNH
PHẦN CÁC PHÂN ĐOẠN 57
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 59
KẾT LUẬN 59
ĐỀ XUẤT 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC




6

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
AEPM: Dịch chiết Cỏ Seo gà (aqueous extracts of Pretis
multifida Poiret)
DAD: Detector mảng diod (Diod Array Detector)
DMSO: Dimethyl sulfoxid
HDL – cholesterol:Lipoprotein tỷ trọng cao mang Cholesterol (High Density
Lipoprotein Cholesterol)
HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-Performance Liquid

Chromatography)
HPLC – MS: Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ (High-
Performance Liquid Chromatography – Mass
Spectrometry)
IR: Quang phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)
LDL – cholesterol: Lipoprotein tỷ trọng thấp mang Cholesterol (Low Density
Lipoprotein Cholesterol)
LOD: Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)
LOQ: Giới hạn định lƣợng (Limit of Qualification)
NMR: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic
Resonance)
RSD: Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative Standard Deviation)
S/N: Tín hiệu/nhiễu đƣờng nền (Signal/Noise)
SKĐ: Sắc ký đồ
STT: Số thứ tự
UV – Vis: Tử ngoại khả kiến (Ultraviolet Visible)






7

DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm bột dƣợc liệu 27
Bảng 3.2. Hiệu suất chiết cắn các phân đoạn chiết xuất từ cây Cỏ Seo gà 28
Bảng 3.3. Một số thông số trên phổ UV-Vis của các chất nghiên cứu. 32
Bảng 3.4. Sự phù hợp của hệ thống HPLC về thời gian lƣu. 37

Bảng 3.5. Sự phù hợp của hệ thống HPLC về diện tích pic. 38
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM3. 39
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM12. 40
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM18. 40
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM15. 41
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM9. 41
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM3. 42
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM12. 42
Bảng 3.13. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM18. 43
Bảng 3.14. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM15. 44
Bảng 3.15. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM9. 44
Bảng 3.16. Kết quả khảo sát độ đúng với PM3. 45
Bảng 3.17. Kết quả khảo sát độ đúng với PM12. 46
Bảng 3.18. Kết quả khảo sát độ đúng với PM18. 46
Bảng 3.19. Kết quả khảo sát độ đúng với PM15. 47
Bảng 3.20. Kết quả khảo sát độ đúng với PM9. 47
Bảng 3.21. Tổng hợp kết quả khảo sát độ đúng của 5 hợp chất phân tích. 48
Bảng 3.22. Kết quả khảo sát LOD và LOQ 48
Bảng 3.23. Kết quả xác định nồng độ các chất trong phân đoạn cloroform 50


8

Bảng 3.24. Hàm lƣợng trung bình các chất nghiên cứu trong cắn cloroform 51
Bảng 3.25.Kết quả xác định nồng độ các chất phân tích trong cắn ethyl acetat 52
Bảng 3.26. Hàm lƣợng trung bình các chất phân tích trong cắn ethyl acetat . 52
Bảng 3.27. Kết quả xác định nồng độ chất phân tích trong các dung dịch thử. 53
Bảng 3.28. Kết quả xác định hàm lƣợng các chất có trong cây Cỏ Seo gà. 53

9

DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC. 13
Hình 1.2. Cấu tạo detector mảng diod (DAD). 17
Hình 3.1. SKĐ của hỗn hợp 5 chất nghiên cứu trên cột C18 dài 15 cm với các
hệ dung môi khác nhau. 29
Hình 3.2. Phổ UV – Vis với detector DAD của các chất nghiên cứu 31
Hình 3.3. Phổ UV – Vis của hợp chất PM18 phân lập đƣợc từ Cỏ Seo gà. 31
Hình 3.4. SKĐ của hỗn hợp 5 chất nghiên cứu. 33
Hình 3.5. SKĐ của dịch chiết toàn phần cây Cỏ Seo gà. 33
Hình 3.6. SKĐ của hợp chất PM3 phân lập đƣợc từ Cỏ Seo gà. 34
Hình 3.7. SKĐ của hợp chất PM12 phân lập đƣợc từ Cỏ Seo gà. 34
Hình 3.8. SKĐ của hợp chất PM18 phân lập đƣợc từ Cỏ Seo gà. 35
Hình 3.9. SKĐ của hợp chất PM15 phân lập đƣợc từ Cỏ Seo gà. 35
Hình 3.10. SKĐ của hợp chất PM9 phân lập đƣợc từ Cỏ Seo gà. 35
Hình 3.11. Phổ UV – Vis với detector DAD của pic tƣơng ứng 36
Hình 3.12. Chồng phổ UV – Vis với detector DAD của pic tƣơng ứng 36
Hình 3.13. SKĐ của mẫu trắng. 38
Hình 3.14. SKĐ của dung dịch thử chuẩn bị từ cắn cloroform 50
Hình 3.15. SKĐ của dung dịch thử chuẩn bị từ cắn ethyl acetat. 51

10

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đề tài “Xây dựng phương pháp xác định
hàm lượng một số hợp chất phân lập được từ cây Cỏ Seo gà”, ngoài sự
làm việc nghiêm túc, sự cố gắng, nỗ lực hết mình của bản thân, tôi đã nhận
đƣợc rất nhiều sự khích lệ từ phía thầy cô, gia đình, bạn bè và nhà trƣờng.
Trƣớc hết, tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
PGS .TS Thái Nguyễn Hùng Thu
PGS .TS Nguyễn Thái An
ngƣời đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hƣớng dẫn nghiên cứu, tạo mọi
điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: NCS .ThS Nguyễn
Duy Chí đã cho tôi những đóng góp quý giá về đề tài.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị kỹ thuật viên Khoa kiểm
nghiệm Hóa học, Khoa kiểm nghiệm Vật lý, Khoa nghiên cứu kiểm nghiệm
Dƣợc liệu và ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm nghiên cứu Dƣợc và trang
thiết bị y tế Quân đội. Đã hỗ trợ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá
trình nghiên cứu. Xin trân trọng cảm ơn thầy cô Trƣờng Đại học Dƣợc Hà
Nội, đặc biệt là những thầy cô đã trực tiếp giảng dạy tôi trong suốt thời
gian học tập tại trƣờng.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn gia đình, bạn bè đã động viên về
mọi mặt và giúp đỡ tận tình trong quá trình học tập, nghiên cứu, là động
lực không nhỏ để tôi có kết quả ngày hôm nay.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà nội, tháng 8 năm 2014

Nguyễn Hải Đƣờng


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây Cỏ Seo gà (Pteris multifida Poiret), thuộc họ Cỏ luồng
(Pteridaceae) là loài cây thảo, mọc phổ biến ở miền Bắc và miền Trung nƣớc
ta. Theo y học cổ truyền, Cỏ Seo gà có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, lợi
thấp, giảm đau… thƣờng đƣợc dùng để chữa bệnh lỵ, viêm tử cung, viêm dạ
dày, ruột, viêm đƣờng tiết niệu, viêm họng, viêm tuyến nƣớc bọt, sƣng vú,
mụn nhọt, lở ngứa, bệnh ngoài da, ung thƣ…[3]
Ngày nay, trên thế giới với xu hƣớng tìm kiếm nguồn thuốc mới từ các
chất thiên nhiên và sử dụng thuốc từ thảo dƣợc ngày càng tăng. Việt Nam có
nền y học cổ truyền lâu đời, với lợi thế về địa hình và khí hậu nhiệt đới gió
mùa, nóng ẩm đã tạo ra nguồn tài nguyên cây cỏ vô cùng phong phú. Tuy
nhiên nhiều loài cây đƣợc sử dụng rộng rãi theo kinh nghiệm dân gian mà
chƣa có hoặc còn rất ít nghiên cứu có giá trị khoa học.
Từ mẫu cây Cỏ Seo gà thu hái tại Ba Vì, Hà Nội, NCS. Nguyễn Duy
Chí đã nghiên cứu phân lập đƣợc một số hợp chất. Các hợp chất phân lập
đƣợc sau khi tinh chế đã đƣợc xác định và khẳng định cấu trúc bằng phổ khối
lƣợng và phổ cộng hƣởng từ hạt nhân.
Để đánh giá tiềm năng và góp phần tiêu chuẩn hóa dƣợc liệu, đề tài
“Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số hợp chất phân lập
được từ cây Cỏ Seo gà” đƣợc thực hiện với các mục tiêu sau:
1- Xây dư
̣
ng được các quy trình cho phép định lượng đồng thời một số
hợp chất đã được phân lâ

̣
p tư
̀
cây Cỏ Seo gà bằng HPLC.
2- Ứng dụng phương pha
́
p xây d ựng được để so sánh thành phần các
phân đoạn thu được trong quá trình chiết xuất và sơ bộ xác định hàm lượng
các hợp chất trên trong cây Cỏ Seo gà.





2

CHƢƠNG I
TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY CỎ SEO GÀ
1.1.1. Đặc điểm thực vật
Tên khoa học: Pteris multifida Poir., họ Cỏ luồng (Pteridaceae).
Tên đồng nghĩa: Pteris serrulata L.f.
Tên khác: Phƣợng vĩ thảo, cỏ luồng [3], theo gà, phƣợng vĩ [5].
Tên nƣớc ngoài: Spider brake (Anh) [3].
Cây thảo, cao 20-40 cm, có thể hơn [3]. Thân rễ nằm ngang dƣới mặt
đất, chừng 3-4 cm, hình cong queo, sần sùi, nhiều mấu, hơi cứng, vị hơi ngọt,
đắng và tê, mùi thơm hắc [5]. Lá mọc thẳng từ thân rễ, xẻ sâu hình lông chim
hai lần, nhẵn, gân lá rõ, có hai loại: lá không sinh sản ngắn, màu lục nhạt hơi
vàng, các thùy to nhỏ không đều mọc đối nhau, mép hơi khía răng, có đầu
tròn, riêng thùy tận cùng thuôn dài thành mũi nhọn; lá sinh sản dài, màu đen

sẫm gồm các thùy hình dải thuôn uốn éo, mọc đối, đầu nhọn hoắt, mép lá gập
lại mang túi bào tử dày đặc ở trong; cuống lá rất dài, màu nâu nhạt ở gốc, hơi
vàng ở phía trên [3].
Bào tử hình bốn cạnh, hơi tròn, màu vàng nhạt, có nhiều u sần nhỏ.
Mùa sinh sản: tháng 5 – 10 [3].
Cỏ Seo gà mọc phổ biến ở miền Bắc và miền Trung nƣớc ta, thƣờng gặp
nhất ở trên những vách đá, vách đất, xung quanh thành giếng, ven đƣờng đi,
những nơi thoáng ẩm và mát. Còn thấy mọc cả ở Trung Quốc, Nhật Bản [5].
Bộ phận dùng làm thuốc của cây là thân rễ và lá [5].
1.1.2. Thành phần hóa học
Năm 1996, từ Pteris multifida Poir., Woerdenbag HJ và cộng sự đã phân
lập bằng sắc ký cột silica gel thu đƣợc 2 hợp chất diterpen là: ent-kauran-2β,
16α-diol và ent-kaur-16-en-2β, 15α-diol. Cả 2 chất này đều có tác dụng gây
độc với tế bào u báng Ehrlich [38].


3

Năm 2006, Hao-Bin Hu, Xu-Dong Zheng và Hong Cao đã phân lập đƣợc
2 hợp chất xanthon glycosid mới là 1-hydroxy-4,7-dimethoxy-8-(3-methyl-2-
butenyl)-6-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D
glucopyranosyl xanthon và 1,3- dihydroxy-7-methoxy-8-(3-methyl-2-butenyl)
-6-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2) - [β-D-glucopyranosyl - (1→3)] -β-D-
glucopyranosyl xanthon cùng với 6 hợp chất khác là quercetin, dehydro
goniothalamin, vanillin, dihydro echioidinin, saucerneol D, licoagro
chalcon D [14].
Năm 2008, Xu-dong Zheng, Hao-bin Hu, Huai-sheng Hu đã phân lập
đƣợc hợp chất neolignan glycosid mới là multifidosid A: rel-(7S,8S)-Δ7'-2,9'-
dihydroxy-5'-methoxy-7,3'-dioxy-8,4'-neolignan- 4 - O- β – D - apiofuranosyl
- (1→6) – β – D - glucopyranosid và 4 chất khác là scaphopetalon, (−) -

isolariciresinol 3α – O – β - apiofuranosyl - (1→2) – O – β - glucopyranosid,
6,7 – dihydroxy - 3' – methoxy - 4',5 '- methylenedioxyisoflavon 6 – O – β –D
- xylopyranosyl - (1→6) – β – D - glucopyranosid, polyporusteron I [40].
Năm 2008, Liva Harinantenaina và cộng sự đã phân lập đƣợc 4-caffeoyl
quinic acid 5-O-methyl ether, (2R,3R)-pterosin L 3-O-β-D-glucopyrannosid,
β-sitosterol β - D - glucopyranosid, apigenin 7 – O – β – D - glucopyranosid,
luteolin 7 – O – β – D - glucopyranosid, sucrose, caffeic acid, pterosin C 3 –
O – β – D -glucopyranosid, pterosid C, 4,5-dicaffeoyl quinic acid, pterosid A,
wallichosid và (2S)-5,7,3',5'-tetrahydroxyflavanon [27].
Theo Wang WS, Wang ZQ, Zhou YW (2008), từ dịch chiết methanol
của P. multifida Poir., sau khi phân lập, tinh chế bằng sắc ký cột pha thuận,
sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột nhồi sephadex, đã thu đƣợc một sesquiterpen
glycosid là pterosin C-3-O-β-D-glucosid và 6 flavonoid là: apigenin, luteolin,
apigenin-7-O-β-D-glucosid, apigenin-7-O-β-D-glucosyl-4'-O-α-L-rhanrnosid,
apigenin-4'-O-α-L-rhanrnosid, luteolin-7-O-β-D-glucosid [37].


4

Năm 2008, Xin Ge và cộng sự đã phát hiện 6 hợp chất mới, trong đó có
3 hợp chất ent-kauran diterpenoid là pterokauran M1, pterokauran M2,
pterokauran M3 và 3 hợp chất C14 pterosin-sesquiterpenoid là multifidosid A,
multifidosid B, multifidosid C, đồng thời cũng phân lập đƣợc 18 diterpenoid
và sesquiterpenoid khác đã biết [39].
Jicheng Shu và cộng sự (2012) đã phân lập đƣợc 2S,3S-acetylpterosin C
và 2 hợp chất pterosin sesquiterpen mới là: 2R,3R-13-hydroxy-pterosin L 3-
O-β-D-glucopyranosid và 2R,3S-acetylpterosin C [20].
Năm 2013, Liu và cộng sự đã xác định đồng thời 5 flavonoid (vicenin-2,
lonicerin, rhoifolin, luteolin và apigenin) trong Pteris multifida Poir. bằng
HPLC. Phân tích đƣợc thực hiện trên một cột Diamonsil C18 (4,6 mm x

250 mm, 5 µm). Dung môi sử dụng là acetonitril-nƣớc (chứa 0,1% acid
formic) với chế độ rửa giải gradient (0-10 phút: 15-85; 20-30 phút: 25-75; 35-
40 phút: 50-50). Tốc độ dòng là 1,0 ml/phút, nhiệt độ ở 25
o
C và bƣớc sóng
phát hiện đã đƣợc xác định tại 350 nm. Tỷ lệ thu hồi trung bình của các chất
tƣơng ứng: vicenin-2, lonicerin, rhoifolin, luteolin và apigenin là
97,18-105,20% (RSD 1,72-3,20%), 95,02- 104,92% (RSD 1,96-2,93%),
98,45-103,70% (RSD 1,66-2,70%), 96,41-104,73% (RSD 1,03-3,46%),
95,82-99,34% (RSD 1,85-3,95 %). Các đƣờng chuẩn xây dựng cho thấy tuyến
tính tốt (r ≥ 0,999, n = 5). Hàm lƣợng 5 flavonoid trên xác định trong khoảng
0,5-2,2 mg /g [26].
1.1.3. Tác dụng dƣợc lý
Theo T.C. Wang, M.C. Ti, S.C. Lo, C.C. Yang (2007) dịch chiết Pteris
multifida Poir. có tác dụng thu dọn gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
(DPPH), hydroxyl và có khả năng khử [36].
Năm 2008, Xin Ge, Guan Ye, Ping Li, Wen-Jie Tang, Jin-Li Gao và
Wei-Min Zhao đã phát hiện ra 6 hợp chất mới ở loài P. multifida Poir., trong
đó multifidosid A và multifidosid B đƣợc chứng minh có tác dụng ức chế


5

đáng kể đối với tế bào HepG2 (ung thƣ biểu mô tế bào gan) và K562 (ung thƣ
máu). Từ kết quả của nghiên cứu này, có thể sử dụng P. multifida Poir. để
điều trị ung thƣ [39].
Harinantenaina L, Matsunami K, Otsuka H. (2009) nghiên cứu in vitro
đƣa ra kết luận: dịch chiết P. multifida Poir. có tác dụng chống oxy hóa thể
hiện ở khả năng thu dọn các gốc tự do nhƣ: anion superoxid, 2,2'-azinobis (3
ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid); tạo phức chelat với các ion kim loại

chuyển tiếp (Fe
2+
, Cu
2+
); chống lại sự kích thích của FeCl
2
/H
2
O
2
lên quá
trình peroxyd hóa acid linoleic, phá vỡ phản ứng dây chuyền của sự peroxyd
hóa lipid nên có tác dụng chống peroxyd hóa lipid [15].
Năm 2010, Wang TC và cộng sự đã phát hiện Cỏ Seo gà có tác dụng làm
hạ lipid máu trên chuột ăn chế độ giàu cholesterol: giảm triglycerid,
LDL-cholesterol và tỷ lệ LDL-cholesterol/HDL-cholesterol huyết tƣơng,
giảm cholesterol, triglycerid gan; đồng thời có tác dụng tăng đào thải lipid và
các sản phẩm chuyển hóa qua đƣờng tiêu hóa [35].
Theo Kuang-Ping Lan và cộng sự (2011), dịch chiết P. multifida Poir.
(AEPM) có tác dụng thu dọn các gốc tự do α-diphenyl-β-picrylhydrazyl,
hydroxyl, Fe
2+
và khả năng khử mạnh. Các chất chống oxy hóa trong AEPM
bao gồm acid ascorbic, β-caroten, tocopherol (dạng α-, β- và δ-) và phenol
toàn phần, trong đó thành phần chống oxy hóa chính là phenol toàn phần. Đây
là các chất chống oxy hóa hiệu quả, sự có mặt và lƣợng chất ảnh hƣởng đến
tác dụng chống oxy hóa. Dựa trên những kết quả thu đƣợc từ nghiên cứu này,
AEPM là chất bảo vệ có thể giúp cơ thể con ngƣời chống lại sự phá hủy của
quá trình oxy hóa [22].
Năm 2013, Yu C, Chen J, Huang L. đã công bố nghiên cứu về tác dụng

chống ung thƣ của flavonoid toàn phần trong P. multifida Poir. trên chuột
mang khối u H22, kết luận rằng các flavonoid toàn phần này có tác dụng ức
chế rõ ràng trên khối u H22 đƣợc cấy; cơ chế hoạt động của nó có thể liên


6

quan với việc cải thiện chức năng miễn dịch và tăng cƣờng khả năng chống
oxy hóa ở chuột [43].
1.1.4. Công dụng
Toàn cây Cỏ Seo gà có vị ngọt nhạt, hơi đắng, tính lạnh, có tác dụng
thanh nhiệt, lƣơng huyết, lợi thấp, chỉ lỵ. Rễ có vị ngọt, đắng hơi tê, mùi thơm
hắc [3].
Toàn cây Cỏ Seo gà đƣợc dùng chữa kiết lỵ mạn tính, lỵ trực khuẩn,
viêm ruột, viêm đƣờng tiết niệu, viêm họng, viêm tuyến nƣớc bọt, sƣng vú,
mụn nhọt, lở ngứa, bệnh ngoài da. Nƣớc sắc lá Cỏ Seo gà có tác dụng chữa
bỏng [3].
Rễ, lá sao vàng, tán nhỏ đun với dầu vừng thành thuốc dầu bôi chữa một
số bệnh ngoài da của trẻ em [5].
Ở Trung Quốc, Pteris multifida Poir. đã đƣợc sử dụng chủ yếu nhƣ một
loại thuốc dân gian truyền thống để điều trị bệnh eczema (chàm), nôn ra máu,
viêm ruột, tiêu chảy, lỵ trực trùng và có tác dụng chống ung thƣ và kháng
khuẩn [19].
Pteris multifida Poir. có tác dụng hạ sốt, giải độc, chống viêm, kháng
sinh, giải nhiệt, tác dụng chống gây đột biến và chủ yếu đƣợc sử dụng nhƣ
loại thuốc dân gian để điều trị bệnh tả, lỵ và trĩ nội [24].
1.2. MỘT SỐ HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP ĐƢỢC TỪ CỎ SEO GÀ
1.2.1. Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid

Tên khoa học: Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid.

Công thức phân tử: C
12
H
16
O
8
(M = 288,26 g/mol) [17].


7

1.2.1.1 Tính chất vật lý
Dạng dầu màu nâu sẫm [31], IR ν
max
KBr
: 3350, 1650, 1620, 1260, 890,
705 cm
-1
[31], [α]
D
= -50,0
o
(c = 0,36, CH
3
OH–H
2
O (5 giọt, 5 ml) [30].
1.2.1.2. Nguồn gốc
Theo [31], từ 10 kg lá Abies koreana (Pinaceae) phân lập đƣợc 54,6 mg
Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid.

Năm 2013, Djimtombaye BJ và cộng sự đã phân lập đƣợc Maltol-3-O-β-
D-glucopyranosid từ toàn cây Astragalus halicacabus [9].
Từ 3,0 kg phần trên mặt đất khô của cây Elsholtzia rugulosa
(Lamicaeae) phân lập đƣợc 52,2 mg Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid [12].
Từ 12 kg bột dƣợc liệu thô Drynaria fortunei phân lập đƣợc 11,5 mg
Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid [25].
Từ 4 kg củ của cây Smilax bockii (Liliaceae) phân lập đƣợc 15 mg
Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid [11].
Từ 980 g bột dƣợc liệu khô cây Scleranthus uncinatus Schur.
(Illecebraceae) phân lập đƣợc 7,2 mg Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid [30].
1.2.2. Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-β-D-glucopyranosid

Tên khoa học: Kaempferol -3 - O – α – L – rhamnopyranosid – 7 – O – β – D
- glucopyranosid.
Công thức phân tử: C
27
H
30
O
15
(M = 594 g/mol).




8

1.2.2.1. Tính chất vật lý
Chất rắn vô định hình, màu vàng. [α]
D

25
: -72
o
(c = 0,42, MeOH);
IR ν
max
: 3400, 1654 cm
-1
[15].
1.2.2.2. Nguồn gốc
Năm 1997, Mohamed Sharaf và cộng sự đã chiết xuất và phân lập đƣợc
Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-β-D-glucopyranosid từ một số
loài thuộc chi Cleome: Cleome amplyocarpa Barr. and Murb., C. brachycarpa
Vahl., C. chrysantha Decne., C. droserifolia (Forssk.) Del. [28].
Kaempferol – 3 - O-α-L-rhamnopyranosid -7-O-β-D-glucopyranosid còn
đƣợc tìm thấy ở trong cây Chenopodium murale [10].
Năm 2007, từ 8,1 kg toàn bộ cây tƣơi Pteris ensiformis Burm. phân lập
đƣợc 30,0 mg Kaempferol – 3 – O – α – L – rhamnopyranosid – 7 – O – β – D
- glucopyranosid với hàm lƣợng 2,62 ± 0,02 mg/g khối lƣợng cắn [44].
1.2.2.3. Tác dụng dược lý
Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-β-D-glucopyranosid có tác
dụng thu dọn các gốc cation tự do DPPH và ABTS
.+
(ABTS là 2,2
’
-azino-
bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonic acid) [44].
1.2.2.4. Phương pháp định lượng
Sử dụng phƣơng pháp HPLC với cột TSK-GEL ODS-80TM (4,6mm x
250 mm); pha động: methanol và nƣớc với tỷ lệ methanol ban đầu là 20%,

tăng tuyến tính đến 40% trong 20 phút và tăng đến 60% trong 5 phút; tốc độ
dòng: 1 mL/phút; bƣớc sóng 297 nm [44].


9

1.2.3. Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-[α-D-apiofuranosyl-
(1-2)-β-D-glucopyranosid]

Tên khoa học: Kaempferol – 3 – O – α – L – rhamnopyranosid – 7 – O –[ α –
D – apiofuranosyl - (1-2) –β – D – glucopyranosid].
Công thức phân tử: C
32
H
38
O
19
(M = 726 g/mol) [24].
1.2.2.1. Tính chất vật lý
Chất rắn vô định hình màu vàng, [α]
D
25
: -60
o
(c = 0,35, MeOH),
IR ν
max
: 3410, 1650 cm
-1
[44]

1.2.3.2. Nguồn gốc
Từ 8,1 kg toàn bộ cây tƣơi Pteris ensiformis Burm. phân lập đƣợc
37,5 mg Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-[α-D-apiofuranosyl - (1-
2)-β-D-glucopyranosid] với hàm lƣợng 2,41 ± 0,04 mg/g khối lƣợng cắn [44].
1.2.3.3. Tác dụng dược lý
Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-[α-D-apiofuranosyl-(1-2)-β-
D-glucopyranosid] có tác dụng thu dọn các gốc cation tự do DPPH và
ABTS
.+
(ABTS là 2,2
’
-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonic acid) [44].
1.2.3.4. Phương pháp định lượng
Sử dụng phƣơng pháp HPLC với cột TSK-GEL ODS-80TM (4,6mm×
250 mm); pha động: methanol và nƣớc với tỷ lệ methanol ban đầu là 20%,
tăng tuyến tính đến 40% trong 20 phút và tăng đến 60% trong 5 phút; tốc độ
dòng: 1 mL/phút; bƣớc sóng 297 nm [44].


10

1.2.4. 3,4-dihydroxybenzandehyd
OH
OH
H
O
1
2
3
4

5
6

Tên khoa học: 3,4-dihydroxybenzandehyd.
Công thức phân tử: C
7
H
6
O
3
(M = 138,12 g/mol).
1.2.4.1. Tính chất vật lý
Dạng bột màu trắng, T
o
nc
: 152-154
o
C [7].
1.2.4.2. Nguồn gốc
Năm 2007, Buniyamin A. Ayinde, Doris N. Onwukaeme và Eric K.
Omogbal phân lập đƣợc 3,4-dihydroxybenzandehyd từ vỏ thân cây Musanga
cecropioides R.Brown (Moraceae) [7].
Theo Nova Syafni và cộng sự, từ 6,0 kg lá; 4,3 kg thân cây; 1,5 kg rễ cây
Trichomanes chinense L. tƣơng ứng phân lập đƣợc 35 mg (chiếm 0,002%
khối lƣợng cắn), 33 mg (0,003% khối lƣợng cắn) và 8 mg (0,0007% khối
lƣợng cắn) 3,4-dihydroxybenzandehyd [29].
Ngoài ra 3,4-dihydroxybenzandehyd còn đƣợc phân lập từ nấm
Phellinus gilvus (Schwein) Pat. (Hymenochaetaceae), cây Cremastra
appendiculata (D. Don) Makino (Orchidaceae) và lá Vitis vinifera L.
(Vitaceae) [29].

1.2.4.3. Tác dụng dược lý
3,4-dihydroxybenzandehyd đƣợc tinh chế từ quả Xanthium strumarium
có tác dụng ức chế của phosphotransferase CKII (casein kinase II) với IC
50

khoảng 783 μM. Nồng độ 300 μM 3,4-dihydroxybenzandehyd gây ra ức chế


11

50% sự tăng trƣởng của tế bào ung thƣ U937 ở ngƣời. Nó có thể có khả năng
ức chế bệnh ung thƣ thông qua sự ức chế hoạt động CKII [23].
3,4-dihydroxybenzandehyd đƣợc phân lập từ lúa mạch Hordeum vulgare
có tác dụng ức chế sự oxy hóa phá hủy DNA và quá trình hủy hoại tế bào bởi
H
2
O
2
. 3,4-dihydroxybenzandehyd có tác dụng thu dọn gốc DPPH (1,1-
diphenyl-2-picrylhydrazyl), hydroxyl, ROS nội bào. Nó cũng tạo phức chelat
với Fe
2+
[16].
1.2.5. Kaempferitrin

Tên khoa học: Kaempferol-3,7-di-O-α-L-rhamnopyranosid.
Công thức phân tử: C
27
H
30

O
14
(M = 578,53 g/mol) [18].
1.2.5.1. Tính chất vật lý:
Tinh thể hình kim sáng bóng màu vàng nhạt [13].
Tan trong ethanol hoặc DMSO, t
o
nc
: 201-203
o
C [18].
1.2.5.2. Nguồn gốc
Kaempferitrin đƣợc chiết xuất từ lá Hedyotis verticillata [6].
Năm 2006, Kaempferitrin đƣợc chiết xuất từ Celastrus orbiculatus,
C. punctatus, C. paniculatus, Trichosanthes cucumeroides [34].
Từ 1,5 kg bột dƣợc liệu khô cây Lotus lalambensis phân lập đƣợc
180 mg Kaempferitrin [13].
Năm 2009, Yerra Koteswara Raoa và cộng sự đã chiết xuất đƣợc 156 mg
Kaempferitrin từ 500 g bột lá khô Cinnamomum osmophloeum [41].



12

1.2.5.3. Tác dụng dược lý
Kaempferitrin có tiềm năng chống viêm, có tác dụng ức chế một số chức
năng của đại thực bào tham gia vào quá trình viêm. Nó ức chế
lipopolysaccharid, interferon (IFN) - γ – tạo ra nitric oxid (NO) và các cytokin
[yếu tố hoại tử khối u TNF-α và interleukin (IL)-12] [32].
Kaempferitrin có tác dụng hạ đƣờng huyết và có tiềm năng chống oxy

hóa (phản ứng cao với DPPH (1,1- diphenyl -2- picryl hydrazyl), ức chế hoạt
động myeloperoxidase và làm giảm quá trình peroxy hóa lipid – gây ra bởi
gốc ascorbyl [8], [21].
Nghiên cứu này chứng minh tác dụng kép của Kaempferitrin là: vừa cải
thiện đề kháng insulin bằng cách hoạt hóa đƣờng dẫn truyền insulin kinh điển
vừa tăng tiết adiponectin (kích thích tế bào mỡ tiết adipokin) [42].
Kaempferitrin có tác dụng chống rối loạn lipid máu: làm giảm
cholesterol toàn phần, triglycerid và lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL-C) huyết
tƣơng ở chuột bị rối loạn lipid máu [33].
1.2.5.4. Phương pháp định lượng
Sử dụng phƣơng pháp HPLC pha đảo với cột C18 Hypersil ODS (4,6mm
x100 mm, 3 μm); pha động: acetonitril (A) và nƣớc chứa 0,1% acid
trifluroacetic (B) với tỷ lệ A:B là 10:90, chạy gradient tuyến tính tới 30:70
trong 0-20 phút, duy trì trong 10 phút; tốc độ dòng: 0,8 mL/phút; bƣớc sóng
phát hiện 265 nm; nhiệt độ cột: 25ºC; khoảng tuyến tính: 5 –100 μg/mL; độ
tìm lại: 98% [41].
1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.3.1. Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở
của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di
chuyển của pha động lỏng dƣới áp suất cao. Tốc độ di chuyển khác nhau liên
quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực


13

tƣơng đối của các chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất
ra khỏi cột phụ thuộc vào các yếu tố đó. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đƣợc
phát hiện bởi detector và đƣợc ghi lại nhờ máy ghi và bộ phận xử lý số liệu
thành SKĐ với các thông tin về pic của chất phân tích.

Tùy thuộc vào cơ chế của quá trình tách sắc ký mà ta có những kỹ thuật
sắc ký khác nhau: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký
loại cỡ, sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học [1].
1.3.2. Máy HPLC
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận sau: Bình chứa pha
động, bơm đẩy pha động qua hệ thống sắc ký ở áp suất cao, hệ tiêm mẫu để
đƣa mẫu vào pha động, cột sắc ký, detector, hệ thu nhận và xử lý dữ liệu.








Hình 1.1. Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC.
1.3.3. Các thông số đặc trƣng của quá trình sắc ký
1.3.3.1. Thời gian lưu t
R

Thời gian lƣu t
R
là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic
đến detector. Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lƣu của mỗi
chất là hằng định, vì vậy có thể dùng thời gian lƣu để phát hiện định tính các
chất.
Thời gian chết t
M
là thời gian lƣu của chất không bị lƣu giữ.
Thời gian lƣu hiệu chỉnh t

’
R
= t
R
– t
M
.
Hệ thống cấp
dung môi
Bơm
Bộ phận
tiêm mẫu
Cột sắc ký
Detector
Hệ thu nhận xử lý dữ
liệu (máy ghi, máy tính)
Thải


14

1.3.3.2. Hệ số dung lượng k
’

Hệ số k
’
mô tả tốc độ di chuyển của chất phân tích qua cột. Hệ số k
’
còn
đƣợc gọi là hệ số phân bố khối lƣợng giữa hai pha:

'
S S S
RM
M M M M
C V V
tt
kK
C V V t


   


trong đó: V
S
: thể tích pha tĩnh
V
M
: thể tích pha động
C
S
: nồng độ pha tĩnh
C
M
: nồng độ pha động
K: hệ số phân bố
k
’
phụ thuộc vào bản chất chất phân tích, bản chất của hai pha và tỷ lệ V
S

/V
M

Thƣờng lựa chọn điều kiện sắc ký để k
’
= 1 – 5.
1.3.3.3. Hệ số chọn lọc


Hệ số chọn lọc  đặc trƣng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B.
Thƣờng chọn  dao động từ 1,05 – 2. Nếu  quá lớn, thời gian phân tích sẽ
dài.
1.3.3.4. Độ phân giải R
S
Độ phân giải của cột đánh giá khả năng tách hai chất trong hỗn hợp trên
cột sắc ký:
   
1 2 1 2
2 ( ) ( ) 1,18 ( ) ( )
(W W ) (W W )
R B R A R B R A
S
A B A B
t t t t
R




trong đó: R

S
: độ phân giải
(t
R
)
A
, (t
R
)
B
: thời gian lƣu chất A, B
W
A
, W
B
: lần lƣợt là độ rộng pic A, B ở các đáy pic
W
1/2A
, W
1/2B
: lần lƣợt là độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic
R
S
 1,5 thì 2 pic coi nhƣ tách đƣợc hoàn toàn.



15

1.3.3.5. Số đĩa lý thuyết

Mỗi cột sắc ký có thể đƣợc coi gồm nhiều lớp mỏng xếp sát nhau gọi là
đĩa lý thuyết. Ở mỗi đĩa lý thuyết sẽ diễn ra sự phân bố cân bằng tức thời của
chất tan giữa pha tĩnh và pha động. Số đĩa lý thuyết là đại lƣợng đặc trƣng cho
hiệu lực cột sắc ký.
2
54,5
2
16
2/1













W
t
W
t
N
RR

trong đó : W là chiều rộng pic ở đáy pic

W
1/2
là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của pic
1.3.4. Ứng dụng của kỹ thuật HPLC
1.3.4.1. Định tính [1]
Ngƣời ta có thể dùng HPLC để định tính bằng một số cách sau:
 So sánh thời gian lƣu của các chất phân tích trong dung dịch thử với thời
gian lƣu của chất chuẩn chạy cùng điều kiện sắc ký.
 So sánh sắc ký đồ của mẫu phân tích với sắc ký đồ của mẫu phân tích đã
thêm chuẩn đối chiếu.
 So sánh phổ UV-Vis (chồng phổ) giữa phổ mẫu thử với phổ chất đối chiếu
bằng detector DAD thông qua hệ số match.
 Có thể kết nối HPLC – phổ IR hoặc HPLC – MS định tính dựa vào nhóm
chức (IR) hoặc số khối (MS).
1.3.4.2. Định lượng [2]
Tất cả các phƣơng pháp định lƣợng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc:
nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó.
Có 4 phƣơng pháp định lƣợng thƣờng đƣợc sử dụng trong sắc ký:
 Phƣơng pháp chuẩn ngoại
 Phƣơng pháp chuẩn nội
 Phƣơng pháp thêm chuẩn
 Phƣơng pháp chuẩn hóa diện tích