Xác định một số corticosteroid trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp HPLC

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN ĐỨC THANH


XÁC ĐỊNH MỘT SỐ
CORTICOSTEROID
TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ





HÀ NỘI - 2014
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN ĐỨC THANH


XÁC ĐỊNH MỘT SỐ
CORTICOSTEROID
TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn: ThS. Bùi Đình Sơn

Nơi thực hiện: Viện KNVSATTP Quốc gia





HÀ NỘI - 2014


LỜI CẢM ƠN

Với tấm lòng biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Đình Sơn đã
giao đề tài và tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ, công nhân viên Viện kiểm nghiệm vệ sinh
an toàn thực phẩm quốc gia đã tạo moị điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành đề tài.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các giảng viên, nhân viên Bộ môn Hóa phân
tích - độc chất, Trường đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học
tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm động viên
tôi trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận
Hà nội, ngày 7 tháng 5 năm 2014
Nguyễn Đức Thanh



MỤC LỤC
Trang

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Giới thiệu một số steroid trong nghiên cứu 2
1.2. Vai trò của nhóm corticosteroid 4
1.3. Tình hình sử dụng corticosteroid 5
1.4. Các phương pháp xác định corticosteroid 6
1.4.1. Phương pháp ELISA 6
1.4.2. Phương pháp điện di mao quản 6
1.4.3. Phương pháp sắc ký khí 6
1.4.4. Phương pháp sắc ký lỏng 7
1.5. Cơ sở lý thuyết phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 9
1.5.1. Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng 9
1.5.2. Phân tích định tính và định lượng bằng HPLC 11
1.5.3. Phương pháp chiết pha rắn 11
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 14
2.1.1. Thiết bị 14
2.1.2. Dụng cụ 14
2.1.3. Hóa chất 14
2.2. Nội dung nghiên cứu 15
2.3. Phương pháp nghiên cứu 15
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu 15
2.3.2. Phương pháp phân tích 15
2.4. Thẩm định phương pháp phân tích 16
2.4.1. Tính đặc hiệu và chọn lọc 16
2.4.2. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 17
2.4.3. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 18
2.4.4. Độ lặp lại (độ chính xác) 19
2.4.5. Độ đúng 20

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22
3.1. Lựa chọn phương pháp phân tích 22
3.2. Tối ưu điều kiện xác định cortiosteroid trên thiết bị HPLC 22
3.2.1. Lựa chọn cột tách 22
3.2.2. Khảo sát pha động 24
3.2.3. Khảo sát gradient pha động 26
3.2.4. Các thông số tối ưu cho quá trình tách sắc ký 28
3.3. Khảo sát quá trình xử lý mẫu 29
3.3.1. Lựa chọn dung môi chiết 29
3.3.2. Khảo sát quy trình chiết pha rắn SPE 29
3.4. Đánh giá phương pháp phân tích 32
3.4.1. Đánh giá tính chọn lọc của bước sóng phân tích 32
3.4.2. Đánh giá độ lặp của hệ thống 32
3.4.3. Lập đường chuẩn 33
3.4.4. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp 34
3.4.5. Độ lặp lại và độ thu hồi 36
3.5. Kết quả phân tích một số mẫu thực 40
3.6. Bàn luận 43
3.6.1. Đối tượng nghiên cứu 43
3.6.2. Xây dựng quy trình phân tích 43
3.6.2. Khảo sát quy trình xử lý mẫu 43
3.6.4. Thẩm định phương pháp 44
3.6.5. Kết quả phân tích mẫu thực 44
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt Tiếng Anh hoặc tên khoa học Tiếng Việt
ACN Acetonitrile

AOAC
Association of Official Analytical
Chemists
Hiệp hội các nhà hóa học
phân tích
HPLC
High performance liquid
chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện
LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng
MeOH Methanol
MS Mass spectrometry Khối phổ
ppb Parts per billion Phần tỷ
ppm Parts per million Phần triệu
RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối
SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn
UV Ultra violet Tử ngoại
Vis Visible Khả kiến
v/v Tỷ lệ theo thể tích


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Giới thiệu một số corticosteroid 2
Bảng 2.1. Các chất chuẩn corticosteroid 14
Bảng 2.2. Yêu cầu độ lặp lại tại các nồng độ khác nhau theo AOAC 20
Bảng 2.3. Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau theo AOAC 21
Bảng 2.4. Quy định về độ thu hồi của hội đồng châu Âu 21
Bảng 3.1. Bảng khảo sát thành phần pha động 24

Bảng 3.2. Hiệu suất qua cột chiết pha rắn C
18
với dung môi rửa giải MeOH 31
Bảng 3.3. Độ lặp lại dung dịch chuẩn hỗn hợp 6 corticosteroid 33
Bảng 3.4. Các phương trình hồi quy tuyến tính của 6 corticosteroid 34
Bảng 3.5. Giới hạn phát hiện và định lượng của 6 corticosteroid 35
Bảng 3.6. Nồng độ chất phân tích cho vào nền mẫu ở các mức khác nhau 36
Bảng 3.7. Độ lặp lại và độ thu hồi tại nồng độ thêm chuẩn thấp 37
Bảng 3.8. Độ lặp lại và độ thu hồi tại nồng độ thêm chuẩn trung bình 38
Bảng 3.9. Độ lặp lại và độ thu hồi tại nồng độ thêm chuẩn cao 39
Bảng 3.10. Kết quả phân tích mẫu thực 42


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Cấu trúc khung cơ bản của steroid 2
Hình 1.2. Sắc ký đồ trong phân tích sắc ký 11
Hình 1.3. Các bước tiến hành của quá trình chiết pha rắn 12
Hình 2.1. Lược đồ quy trình phân tích mẫu dự kiến 16
Hình 2.2. Đường chuẩn trên nền mẫu thực 18
Hình 2.3. Xác định LOD bằng cách tính S/N 19
Hình 3.1. Sắc đồ phân tích trên cột X-Brigde C
18
23
Hình 3.2. Sắc đồ phân tích trên cột HiQ SIL C
18
23
Hình 3.3. Sắc đồ phân tích với pha động H
2
O – THF 24

Hình 3.4. Sắc đồ phân tích với pha động H
2
O – MeOH 25

Hình 3.5. Sắc đồ phân tích với pha động H
2
O – ACN 25
Hình 3.6. Sắc đồ phân tích với pha động KH
2
PO
4
– ACN 25
Hình 3.7. Sắc đồ phân tích theo chương trình 1 26
Hình 3.8. Sắc đồ phân tích theo chương trình 2 27
Hình 3.9. Sắc đồ phân tích theo chương trình 3 27
Hình 3.10. Sắc đồ phân tích theo chương trình 4 28
Hình 3.11. Sắc đồ phân tích ở điều kiện tối ưu 29
Hình 3.12. Sắc đồ phân tích dung môi và dung dịch chuẩn 6 corticosteroid 32
Hình 3.13. Sắc đồ tại giới hạn phát hiện của 6 chất phân tích 35
Hình 3.14. Quy trình phân tích mẫu thực 41
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo định nghĩa của Bộ Y tế, thực phẩm chức năng là thực phẩm dùng để hỗ
trợ chức năng của các bộ phận trong cơ thể người, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho
cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ bệnh tật. Một số
nhà sản xuất và kinh doanh đã lợi dụng lòng tin của người tiêu dùng nên đã thổi
phồng quá mức tác dụng của thực phẩm chức năng khiến không ít người coi thực
phẩm chức năng như là “thần dược” chữa bách bệnh.
Corticosteroid là nhóm chất có gốc steroid được tuyến thượng thận của cơ thể

sản xuất ra với tác dụng chống viêm mạnh, chống dị ứng và ức chế miễn dịch.
Corticosteroid có thể sử dụng để xử lý các biến chứng của bệnh ung thư và điều trị
ung thư, sử dụng trong các trường hợp viêm khớp nghiêm trọng. Song, việc sử dụng
và điều trị bằng corticosteroid cần có chỉ định của bác sĩ, sử dụng sai mục đích và
liều lượng gây ra những tác dụng phụ có thể dẫn tới hậu quả nghiêm trọng.
Trong những năm vừa qua, tại Việt Nam cũng như trên thế giới liên tiếp phát
hiện các vi phạm trong vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm: Sữa có chứa melamine để
tăng độ đạm, sản phẩm hỗ trợ điều trị xương khớp từ thảo dược nhưng lại chứa
dexamethasone, piroxicam, furosemide…
Do đó để giúp bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng cũng như hỗ trợ các cơ quan
chức năng kiểm soát tốt vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm nhất là đối với thực phẩm
chức năng, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Xác định một số corticosteroid trong
thực phẩm chức năng bằng phương pháp HPLC” với các mục tiêu sau:
+ Xây dựng quy trình phát hiện và định lượng một số corticosteroid trong thực
phẩm chức năng.
+ Ứng dụng quy trình đã xây dựng để phân tích một số sản phẩm thực phẩm
chức năng đang lưu hành trên thị trường.

2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu một số corticosteroid trong nghiên cứu
Corticosteroid là nhóm chất trong công thức có khung steroid và có chung cấu
tạo là ol - 21 - dion - 3,20 pregna - 4 - en và rất ít ngoại lệ.

Hình 1.1. Cấu trúc khung cơ bản của steroid
Dưới đây là một số corticosteroid được nghiên cứu trong đề tài này:
Bảng 1.1 Giới thiệu một số corticosteroid
TT
Tên

Công thức
phân tử
Khối
lượng
phân tử
(g/mol)
Tính chất vật lý

Công thức cấu tạo
1
Cortison acetat
21-(acethyloxy)-
17-
hydroxypregna-
4-ene-3,11,20-
trione
C
23
H
30
O
6
402,49
Tinh thể màu
trắng, nhiệt độ
nóng chảy 220-
240
0
C.

2
Hydrocortison
acetat
(11β)-11,17,21-
trihydroxypregn
a-4-ene-3,20-
dione 4-amino
C
23
H
32
O
6
404,2
Tinh thể màu
trắng tan tốt
trong dung môi
hữu cơ.


3

TT
Tên

Công thức
phân tử
Khối
lượng

phân tử
(g/mol)
Tính chất vật lý

Công thức cấu tạo
3
Prednison
17,21-
dihydroxypregn
a-1,4-diene-
3,11,20-trione
C
21
H
26
O
5
358,428
Dạng tinh thể
hoặc bột mịn
màu trắng,
không mùi và
có vị hơi đắng.


4
Prednisolon
(11β)-11,17,21-
trihydroxypregn
a-1,4-diene-

3,20-dione
C
21
H
28
O
5


360,444
Dạng bột kết
tinh màu trắng,
không mùi. Ít
tan trong nước,
tan trong dung
môi hữu cơ.

5
Methyl
prednisolon
(6α, 11β)-
11,17,21-
trihydroxy-6-
methylpregna-
1,4-diene-3,20-
dione
C
22
H
30

O
5
374,471
Dạng bột kết
tinh màu trắng,
điểm nóng
chảy từ 262 –
264
o
C.

4

TT
Tên

Công thức
phân tử
Khối
lượng
phân tử
(g/mol)
Tính chất vật lý

Công thức cấu tạo
6
Betamethason
(8S,9R,10S,11S,
13S,14S,16S,17
R)-9-fluoro-

11,17-dihyroxy-
17-(2-
hydroxyacethyl)
-10,13,16-
trimethyl-
6,7,8,9,10,11,12,
13,14,15,16,17-
dodecahydro-
3H-
cyclopenta[α]ph
enaanthren-3-
one
C
22
H
29
FO
5
392,461
Dạng tinh thể,
bột màu trắng,
không mùi.
Nhiệt độ nóng
chảy 231-
234
o
C.
1.2. Vai trò của nhóm corticosteroid [1], [2]
Dựa vào tác dụng dược lý cơ bản, các corticosteroid được phân thành hai dạng:
mineralocorticoid và glucocorticoid. Các mineralocorticoid làm thay đổi cân bằng

nước - điện giải bằng cách giúp tái hấp thu natri, bài tiết hydro và kali ở ống thận
xa, gây phù và cao huyết áp. Glucocorticoid cũng có một số tác dụng của
mineralocorticoid đồng thời tham gia vào một số chu trình chuyển hóa khác gồm:
tái tạo đường, phân bố lại mỡ, chuyển hóa protein và cân bằng calci.
5

Kháng viêm và ức chế miễn dịch: Glucocorticoid có tác dụng chống lại các
biểu hiện của quá trình viêm, do làm giảm tác dụng hoặc ức chế các chất trung gian
gây viêm như cytokin, ecosanoid, giảm giải phóng histamin.
Tác dụng chuyển hóa: Glucocorticoid làm tăng đường huyết lúc đói để cung
cấp glucose cho các mô phụ thuộc glucose như não và tim.
Tác dụng lên chất điện giải và cân bằng nước: Mineralocorticoid liều cao gây
giữ natri và nước, đồng thời gây đào thải kali, điều đó có thể dẫn đến phù và nhược
cơ. Các dẫn xuất tổng hợp ít gây tác dụng này. Ngăn hấp thu calci ở ruột và tăng
đào thải qua thận nên giảm dự trữ calci trong cơ thể. Sự đào thải Ca
2+
qua thận làm
tăng calci niệu. Có thể trị calci niệu do mineralocorticoid bằng lợi tiểu.
1.3. Tình hình sử dụng Corticosteroid

Corticosteroid là nhóm thuốc được sử dụng rộng rãi nhất trên thế giới trong
nhiều năm qua. Corticosteroid thường được coi là con dao hai lưỡi mà cả hai lưỡi
đều hết sức sắc bén.
Năm 1949, Hench, Richstein và Kendall đã dùng cortison để điều trị cho một
phụ nữ 29 tuổi gần như tàn phế vì chứng thấp khớp. Thành công này đã mở ra cho
những người bệnh thấp khớp một niềm hy vọng lớn, vì cho đến thời điểm đó việc
giúp cho người bệnh giảm bớt đau đớn và đem họ trở về với công việc thường nhật
hầu như là điều bất khả kháng. Những đột phá trong điều trị viêm khớp đã đem lại
cho êkíp của Hench giải Nobel y học danh giá vào năm sau đó, năm 1950.
Corticosteroid trở thành một thần dược, các labo tìm cách sản xuất các dạng

thuốc có thể tiêm, để có tác dụng nhanh hơn, hoặc thay đổi cấu trúc hóa học để kéo
dài thời gian tác dụng của thuốc; các nhà lâm sàng học thì tìm các ứng dụng điều trị
trong nhiều loại bệnh khác nhau từ thấp khớp, cho đến hen suyễn, dị ứng, phù, mề
đay, sốc thuốc, các bệnh lý tại các cơ quan khác nhau như thận, da, mạch máu, có
căn nguyên miễn dịch. Trong nhiều trường hợp, corticosteroid cho thấy những khả
năng đa dạng của nó và hứa hẹn cho việc giải quyết một số bệnh lý mạn tính.
Tuy nhiên, việc sử dụng ồ ạt và đại trà cũng làm cho người ta phát hiện ra
những tác dụng phụ của thuốc sớm hơn. Hàng loạt các biến chứng nguy hiểm do
6

quá liều corticoid như suy tuyến thượng thận, xuất huyết tiêu hóa, loãng xương, xẹp
đốt sống, gù vẹo cột sống, tăng đường máu, tăng huyết áp, teo cơ, rối loạn tâm thần,
trầm cảm, đục thủy tinh thể, suy giảm chức năng miễn dịch gây nhiễm trùng cơ hội,
chậm phát triển thể chất ở trẻ em… đã làm cho ngành y phải đưa ra những cảnh báo
khẩn cấp cho việc lạm dụng corticosteroid.
Hiện nay ở Việt Nam, tình trạng lạm dụng các loại thuốc corticosteroid đang
diễn ra khá phổ biến ở các cơ sở khám chữa bệnh tư nhân, thuộc nhiều tỉnh thành
trong cả nước. Rất nhiều người bệnh đang phải hàng ngày gánh chịu những hậu quả
khôn lường do việc lạm dụng các thuốc này gây ra.
1.4. Các phương pháp xác định corticosteroid.
1.4.1. Phương pháp ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) [11]
M.Ebrahimi [11] đã phân tích 17, 20β-dihytroxy-4-pregenen-3-one sử dụng
enzyme acethylcholinesterase làm chất phát hiện. Phương pháp dựa trên nguyên lý
sự liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể để tạo thành cộng hợp kháng
nguyên - kháng thể. Cộng hợp kháng nguyên - kháng thể này sẽ tiếp hợp với kháng
thể thứ 2 được đánh dấu bằng enzym acethylcholinesterase. Phức hợp này sẽ được
tạo màu với thuốc thử Ellman và đo quang ở bước sóng 405nm. Phương pháp cho
kết quả nhanh chóng, chính xác và độ nhạy cao.
1.4.2. Phương pháp điện di mao quản [9]
Phương pháp phân tích cortisol tự do trong nước tiểu được Lokinendi V.Rao và

cộng sự phát triển năm 1999 [9]. Mẫu được làm giàu bằng kỹ thuật chiết pha rắn sử
dụng cột SPE C
18
biến đổi trên nền chất trơ của polytetrafluoroethylane. Mẫu nước
tiểu được đưa nhanh qua cột đã được hoạt hóa trước với 250μl methanol và 1ml
nước cất. Sau đó, cột được rửa 2 lần, mỗi lần 1ml hỗn hợp aceton : nước tỷ lệ 1 : 9
(v/v). Cuối cùng, rửa giải với 80μl ACN và phân tích trên hệ thống điện di mao
quản. Sử dụng hệ đệm 75mmol/l SDS, 20% ACN (v/v) và 20mmol/l MES (pH 6,0).
Ống mao quản đường kính trong 50μm x 375μm x 37cm. Mẫu được bơm vào hệ
thống dưới áp suất 5psi trong 20s và nhiệt độ cột được duy trì ở 16 ± 0,1
0
C, detector
7

UV bước sóng 254 nm và thế 10kV. Phương pháp cho độ thu hồi 89 - 94%, giới hạn
phát hiện là 10μg/l.
1.4.3. Phương pháp sắc ký khí [14]
Theo tài liệu hướng dẫn của hãng Thermo Fisher Scientific [14], phương pháp
GC-MS/MS có thể phân tích được các steroid. Thông số thiết bị gồm: thể tích bơm
mẫu là 1μl, sử dụng cột Rtx-CLP 0,32mm x 20m x 0,5micron và tốc độ khí là
1ml/phút. Chương trình gradient nhiệt độ cài đặt 60
0
C trong 1 phút sau đó tăng lên
220
0
C tốc độ 40
0
C/phút, tăng tiếp lên 260
0
C tốc độ 10

o
/phút và giữ 1 phút ở nhiệt
độ 260
0
C, tiếp đó tăng lên 300
0
C với tốc độ 40
0
C/phút và giữ 10 phút ở nhiệt độ
này. Hãng khảo sát thấy phương pháp có độ nhạy cao, khoảng tuyến tính từ 4pg đến
4ng. Giới hạn phát hiện trong mẫu nước tiểu thêm chuẩn là 50ng/ml. Các steroid có
đến 70% có mảnh con tương đồng nhau khi quét phổ.
Các steroid là các hợp chất có khối lượng phân tử tương đối cao, do đó muốn sử
dụng phân tích bằng phương pháp sắc ký khí, yêu cầu phải được dẫn xuất trước với
các thuốc thử để tạo hợp chất dễ bay hơi rồi mới tiến hành phân tích. Do đó, hóa
chất cũng như thao tác thực hiện phức tạp, quá trình dẫn xuất có thể không hoàn
toàn gây ra sai số phân tích.
1.4.4. Phương pháp sắc ký lỏng
Sắc ký lỏng là phương pháp tách được sử dụng phổ biến nhất trong lĩnh vực
phân tích hiện nay vì phạm vi ứng dụng rất rộng rãi.
1.4.4.1. Phương pháp sắc kí lỏng khối phổ LC-MS [7], [13], [15]
Robin Difrancesco và các cộng sự [13] đã sử dụng phương pháp sắc kí lỏng
khối phổ để xác định một số steroid trong huyết thanh người. Mẫu được thêm
chuẩn, ly tâm loại bỏ cặn, dịch trong được chiết qua cột chiết pha rắn Oasis HLB
(1ml, 30mg). Dịch rửa giải được làm khô và hòa cặn với 1ml pha động rồi đem
phân tích LC-MS/MS. Giới hạn phát hiện 3,6 - 7,2ppb đối với các steroid, khoảng
tuyến tính từ 3,6ppb - 50ppm, độ thu hồi nằm trong khoảng cho phép của cấp hàm
lượng phân tích, sự lặp lại trong ngày có độ độ lệch chuẩn tương đối RSD ± 0,76%,
trong các ngày khác nhau có RSD ± 9,57%.
8

Để định lượng hàm lượng prednison, prednisolon, dexamethasone và cortisol
trong dịch huyết thanh, tác giả Valerie A.Frerichs, Kathleen M. Tornatore [15] cũng
dùng phương pháp LC-MS. Các chất được chuẩn bị trong hỗn hợp dung môi gồm
50% methanol và 50% dung dịch đệm acetat 5mM, pH 3,5 ở nồng độ 1ppm. Mẫu
được thu thập, thêm chuẩn sau đó được bảo quản ở -70
0
C trong 3 tháng. Khi phân
tích, giã đông mẫu và tiến hành xử lý chiết tách các steroid. Giới hạn phát hiện của
phương pháp từ 0,2 - 0,58ppb và giới hạn định lượng của phương pháp từ 5,4 -
10,7ppb tương ứng với từng hợp chất.
Adam Tolgyesi và cộng sự [7] năm 2011 đã phân tích các corticosteroid trong
mỡ lợn sử dụng sắc ký khối phổ. Các tác giả tiến hành nghiên cứu đối với 5 chất
thuộc nhóm corticosteroid bao gồm methyl prednisolon, methyl prednison,
prednisolon, dexamethasone, flumethasone. Phương pháp có độ thu hồi từ 81-
100%, giới hạn phát hiện trong khoảng 0,1 - 0,3μg/kg, thời gian phân tích chỉ
7,5phút. Độ lệch chuẩn tương đối trong phòng thí nghiệm và độ tái lặp giữa các
ngày phân tích cũng cho kết quả trong giới hạn cho phép.
1.4.4.2. Phương pháp sắc kí lỏng với detector huỳnh quang [16]
Nhiều tác giả đã nghiên cứu sử dụng detector huỳnh quang để tăng độ nhạy và
độ chọn lọc. Bản thân các steroid không có khả năng phát huỳnh quang, vì vậy khi
sử dụng phương pháp này các steroid được tạo dẫn xuất có khả năng phát huỳnh
quang.
Wei Gao và cộng sự [16] xác định cortisol trong tóc bằng cách cho cortisol tạo
dẫn xuất với axit sulfuric trong methanol (70:30 theo thể tích) trong 2 phút ở nhiệt
độ 70
0
C. Dẫn xuất sau đó được cho qua cột SPE C
18
để làm sạch và làm giàu mẫu.

Phân tích trên hệ thống sắc ký với các điều kiện: Cột ODS C
18
(250cm x 4,6mm x
5μm), pha động gồm nước và methanol, detector huỳnh quang với bước sóng kích
thích là 360nm và phát xạ là 480nm. Giới hạn phát hiện của phương pháp là
1pg/mg. Hiệu suất thu hồi qua cột SPE là 81,4 ± 3,3% đối với nội chuẩn, 100,3 ±
5,2% đối với cortisol ở nồng độ 20ng/ml. Độ lệch chuẩn tương đối giữa các ngày là
7,3%.
9

1.4.4.3. Phương pháp sắc kí lỏng với detector UV-Vis [8], [12]
Để phân tích tồn dư dexamethasone và prednisolon trong sữa bò, Eszter Desi và
cộng sự [8] đã sử dụng phương pháp chiết pha rắn để xử lý mẫu và phân tích trên
sắc ký lỏng với detector UV. Phương pháp sử dụng cột C
18
, pha động gồm ACN và
nước cất với chương trình gradient, detector 240nm, thể tích bơm mẫu 100μl.
Phương pháp phân tích có thể ứng dụng để phân tích dexamethason và prednisolon
trong sữa đạt yêu cầu cho phép của Châu Âu với giới hạn phát hiện của
dexamethason và prednisolon lần lượt là 0,075μg/kg và 0,05 μg/kg.
Qiang Fu và cộng sự [12] phân tách 26 hợp chất liên quan với betamethason
bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo. Betamethason và các hợp chất liên quan
được chuẩn bị trong hỗn hợp dung môi axit acetic và ACN tỷ lệ 0,1:100 (v/v).
Phương pháp sử dụng cột C
18
ACE3 (15cm x 4,6mm x 3μm), pha động gồm 2 kênh:
kênh A là 0,1% methanesulfonic acid, kênh B là hỗn hợp tert-butanol và 1,4
dioxane tỉ lệ 7:93 (v/v) với chương trình gradient pha động, tốc độ dòng 1ml/phút,
thể tích bơm mẫu là 50μl, detector UV 254nm. Tổng thời gian phân tích là 68 phút.
Phương pháp tách được các chuẩn rõ ràng, peak cân đối, giới hạn định lượng và

giới hạn phát hiện thu được của betamethason là 0,05mg/kg và 0,02mg/kg, với các
hợp chất khác là 0,01mg/kg và 0,02mg/kg.
1.5. Cơ sở lý thuyết phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.5.1. Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng [3], [4], [5]
Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn hoặc
chất lỏng và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn, lỏng-lỏng). Mẫu phân tích
được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất
phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất
phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả
năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau, chúng di chuyển với
tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.
1.5.1.1. Pha tĩnh trong sắc ký lỏng
10

Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng pha liên kết
thường chia làm 2 loại: sắc ký pha thường (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo (RP-
HPLC).
+ Sắc ký pha thường: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó là các silica
trần hoặc các silica được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức
phân cực: -NH
2
, -CN…)
+ Sắc ký pha đảo: pha tĩnh thường là các silica đã được ankyl hoá, không phân
cực, loại thông dụng nhất là –C
18
H
37

Ưu điểm của sắc ký pha đảo là tách và phân tích các chất có độ phân cực rất đa
dạng: từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực. Hơn nữa, trong rất nhiều

trường hợp thì thành phần chính của pha động lại là nước nên rất kinh tế.
1.5.1.2. Pha động trong sắc ký lỏng
Pha động trong sắc ký lỏng là thành phần được cho đi qua cột liên tục để phân
tách các hợp chất trong một hỗn hợp, có những yêu cầu sau:
+ Pha động phải trơ với pha tĩnh
+ Bền vững, ổn định và không bị phân huỷ trong quá trình chạy sắc ký
+ Hoà tan được mẫu
+ Phải có độ tinh khiết cao, có độ nhớt thấp và phù hợp với detector
Có thể chia pha động làm hai loại:
+ Pha động có độ phân cực cao: có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên để
phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi để giảm độ phân cực. Pha động
loại này được dùng trong sắc ký pha ngược.
+ Pha động có độ phân cực thấp: là các dung môi ít phân cực như cyclopentan,
n-pentan, n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS
2
), CCl
4
, toluene…
Để tách một nhóm chất thông thường pha động một thành phần đôi khi không
đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có
được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích. Sự thay
đổi thành phần pha động đôi khi diễn ra theo thời gian, trường hợp này người ta gọi
là gradient pha động.
11

1.5.1.3. Detector trong sắc ký lỏng
Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp. Tuỳ thuộc
bản chất lí hoá của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp
+ Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis: áp dụng cho các chất có khả
năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) hoặc vùng khả kiến (Vis).

+ Detector huỳnh quang: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát huỳnh
quang. Đối với những chất không có khả năng như vậy, cần phải dẫn xuất hoá chất
phân tích, gắn nó với chất có khả năng phát huỳnh quang hoặc chất phân tích phản
ứng với thuốc thử để tạo thành sản phẩm có khả năng phát huỳnh quang.
+ Detector độ dẫn: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hoá: Các ion, các hợp
chất có tính dẫn điện…
Hiện nay, các detector hiện đại ngày càng được phát triển như: detector PDA,
MS, cho độ nhạy và độ chọn lọc tốt hơn.
1.5.2. Phân tích định tính và định lượng bằng HPLC [3], [4]
Phân tích định tính: Đại lượng đặc trưng cho sự tách sắc ký là thời gian lưu của
các chất. Dựa vào thời gian lưu của chất phân tích trong chuẩn và trong dung dịch
phân tích để định tính từng chất trong hỗn hợp.

Hình 1.2. Sắc ký đồ trong phân tích sắc ký
Để định lượng chất phân tích, dùng phương pháp đường chuẩn, thêm chuẩn
hoặc so sánh.
12

1.5.3. Phương pháp chiết pha rắn [5]
Chiết pha rắn (SPE) là một phương pháp chuẩn bị mẫu với mục đích để làm
giàu và làm sạch mẫu phân tích từ dung dịch bằng cách hấp phụ lên cột chiết pha
rắn. Sau đó chất phân tích được rửa giải bằng một lượng nhỏ dung môi thích hợp.
Các chất ảnh hưởng được loại bỏ.
Cột SPE được nhồi bằng những hạt nhỏ, xốp có các nhóm chức khác nhau. Chất
lỏng qua cột dưới tác dụng của áp suất hoặc chân không.
Các bước tiến hành trong quá trình chiết pha rắn:

Hình 1.3. Các bước tiến hành của quá trình chiết pha rắn
Bước 1: Hoạt hoá chất hấp phụ pha rắn
+ Làm ướt vật liệu nhồi, chuyển các nhóm chức của chất hấp phụ về dạng hoạt

động
+ Loại không khí trong các khoảng trống trong lớp chất hấp phụ
+ Không được để chất hấp phụ bị khô
Bước 2: Mẫu và chất phân tích được chảy qua cột
+ Chất phân tích được làm giàu trên chất hấp phụ
13

+ Một vài thành phần ảnh hưởng khác cũng có thể bị giữ lại
+ Các thành phần không bị hấp phụ bị loại ra làm sạch mẫu phân tích
Bước 3: Loại bỏ các chất gây ảnh hưởng ra khỏi cột
+ Giữ lại chất phân tích
+ Loại bỏ các chất gây ảnh hưởng, tạp bẩn
Bước 4: Giải hấp chất phân tích bằng dung môi thích hợp
+ Phá vỡ tương tác giữa chất phân tích và chất hấp phụ với mục đích tách được
chất phân tích vào dung dịch rửa giải
+ Dung môi được chọn phù hợp để đạt hiệu quả cao đồng thời càng ít chất gây
ảnh hưởng tới phép phân tích càng tốt.
Hiện nay, phương pháp chiết pha rắn ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ
biến do những ưu điểm vượt trội sau:
+ Hiệu suất thu hồi cao
+ Khả năng làm giàu, làm sạch chất phân tích lớn
+ Giảm lượng dung môi sử dụng
+ Có khả năng kết hợp các phương pháp phân tích
+ An toàn, đơn giản, dễ sử dụng, có thể tiến hành hàng loạt
Với đối tượng nghiên cứu là thực phẩm chức năng, thành phần rất đa dạng. Việc
làm sạch dung dịch phân tích trước khi đưa vào phân tích trên hệ thống HPLC là rất
quan trọng. Khi dung dịch phân tích càng sạch, sự ảnh hưởng nền đối với chất phân
tích càng ít, đồng thời tuổi thọ của cột sắc ký cũng được kéo dài.

14


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Thiết bị
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao của Shimadzu, Máy lắc vortex VELP, Máy
li tâm lạnh Hermle, Cân phân tích (0,1mg và 0,01mg), Cân kĩ thuật (0,01g), Máy cất
quay chân không Eyela.
2.1.2. Dụng cụ
Ống ly tâm 50ml, Ống đong, Các loại pipet, Màng lọc mẫu 0,2µm, Bình định
mức, Ống nghiệm thủy tinh có nút xoáy, Bộ chiết pha rắn SPE
2.1.3. Hóa chất
+ Các corticosteroid chuẩn
Bảng 2.1. Các chất chuẩn corticosteroid
STT Tên chuẩn Xuất xứ Độ tinh khiết
1 Cortison acetat Viện kiểm nghiệm thuốc TW

99,7%
2 Hydrocortison acetat
Viện kiểm nghiệm thuốc TW
99,8%
3 Prednison
Viện kiểm nghiệm thuốc TW

99,8%
4 Prednisolon
Viện kiểm nghiệm thuốc TW
99,7%
5 Methyl prednisolon
Viện kiểm nghiệm thuốc TW
99,9%
6 Betamethason
Viện kiểm nghiệm thuốc TW
100,1%
- Dung dịch chuẩn gốc 1000ppm: cân chính xác khoảng 0,1000g trên cân phân
tích 10
-4
g từng chất chuẩn corticoteroid hòa tan và định mức 100,00ml bằng
methanol. Bảo quản trong tủ lạnh 4
0
C, sử dụng trong 6 tháng.
- Dung dịch chuẩn trung gian 100ppm: lấy chính xác 1,00ml dung dịch chuẩn
gốc 1000ppm vào bình định mức 10,00ml và định mức tới vạch bằng methanol.
- Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian 10ppm: hút lần lượt 1,00ml mỗi chuẩn
đơn 100ppm vào bình định mức 10,00ml, định mức tới vạch bằng methanol.
- Các dung dịch chuẩn làm việc nồng độ 1, 2, 5ppm được pha trong methanol.
15

+ Các loại hóa chất, dung môi khác: Methanol (Merck 99,9%), Acetonitril
(Merck 99,9%), n-hexan (Merck 99,9%), Kalidihydrophotphat (Merck), Nước cất
dùng cho sắc ký lỏng.
+ Chuẩn bị pha động: Kênh A là dung dịch KH
2
PO

4
20mM trong nước, kênh B
là ACN.
2.2. Nội dung nghiên cứu
+ Đối tượng nghiên cứu: Thực phẩm chức năng
+ Nội dung nghiên cứu của đề tài này là:
- Xây dựng quy trình phân tích một số chất thuộc nhóm corticosteroid bằng
kỹ thuật sắc ký lỏng với detector UV
- Lấy mẫu và áp dụng phương pháp để đánh giá một số mẫu thực tế.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu
+ Đối tượng mẫu: Thực phẩm chức năng có tác dụng hỗ trợ trong việc giảm
cân, làm đẹp, tăng cường sinh lực, hỗ trợ trong điều trị và phòng viêm xương khớp.
+ Phương pháp lấy mẫu: ngẫu nhiên
+ Địa điểm: Thành phố Hà nội
+ Đơn vị mẫu lấy: hai đơn vị mẫu (hộp, gói, lọ)/mẫu
+ Bảo quản và lưu trữ mẫu: Điều kiện thường.
2.3.2. Phương pháp phân tích
+ Nguyên tắc: Các corticosteroid được tách ra khỏi nền mẫu bằng methanol, cô
đuổi dung môi methanol. Hòa tan phần cặn trong nước, làm sạch qua cột chiết pha
rắn C
18
, dịch sau khi qua cột SPE được tách và định lượng bằng kỹ thuật sắc ký
lỏng hiệu năng cao sử dụng detector UV.
+ Quy trình phân tích dự kiến như sau:
16


Hình 2.1. Lược đồ quy trình phân tích mẫu dự kiến
+ Tóm tắt quy trình:

- Cân mẫu vào ống ly tâm, thêm dung môi để chiết corticosteroid
- Đảo trộn đều mẫu bằng máy lắc Vortex
- Rung siêu âm để tăng hiệu suất hòa tan chất phân tích vào dung môi chiết
- Ly tâm với tốc độ cao, phân tách phần dung dịch và lắng chặt phần bã
- Cô quay gần cạn, hòa cặn, cho dịch qua cột SPE để làm sạch và làm giàu chất
phân tích
- Bơm dịch rửa giải vào hệ thống HPLC để định tính và định lượng chất phân
tích có trong mẫu.
2.4. Thẩm định phương pháp phân tích [6]
2.4.1. Tính đặc hiệu và chọn lọc
+ Tính đặc hiệu: là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các tạp
chất khác. Tính đặc hiệu thường liên quan đến việc chỉ xác định một chất phân tích.
+ Tính chọn lọc: là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến phân tích
nhiều chất trong cùng một quy trình. Tính chọn lọc có thể bao trùm cả tính đặc hiệu
Cân mẫu
Chiết, lấy dịch
Lọc
Dịch rửa giải

HPLC
Cô quay gần khô
Hòa cặn, qua cột SPE C
18