Xây dựng quy trình xác định dư lượng một số chất nhóm quinolon trong thực phẩm bằng kỹ thuật LC MS và MS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI






BÙI THỊ LUYẾN




XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH
DƯ LƯỢNG MỘT SỐ CHẤT NHÓM
QUINOLON TRONG THỰC PHẨM BẰNG
KỸ THUẬT LC-MS/MS





LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2014




BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI





BÙI THỊ LUYẾN




XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH
DƯ LƯỢNG MỘT SỐ CHẤT NHÓM QUINOLON
TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS




LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 60720410


Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS Nguyễn Tường Vy
2. Ths. NCS Cao Công Khánh




HÀ NỘI 2014

LỜI CẢM ƠN
Để có thể hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn và giúp đỡ về mọi
mặt từ các thầy cô, đồng nghiệp, gia đình và bạn bè.
Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới:
PGS.TS. Nguyễn Tường Vy – Phó Trưởng Phòng SĐH- ĐH Dược Hà Nội
Th.S NCS Cao Công Khánh – Viện KN ATVSTPQG
đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài này.
Đồng thời tôi xin cảm ơn các cán bộ Viện Kiểm Nghiệm An toàn vệ sinh thực
phẩm Quốc gia đã luôn sẵn lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong
quá trình thực nghiệm.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới những người thân trong gia đình và bạn bè đã
luôn động viên và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Thái Nguyên, ngày 20 tháng 08 năm 2014
Tác giả

Bùi Thị Luyến

MỤC LỤC
CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
Đặt vấn đề 1
Chương 1. TỔNG QUAN 1
1.1. Vài nét về Quinolon 3
1.1.1. Cấu tạo chung 3
1.1.2. Phân loại 3
1.1.3. Cơ chế tác dụng 3
1.1.4. Tác dụng phụ 3

1.1.5. Đặc tính của các quinolon nghiên cứu 4
1.2. Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao và chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc
ký 5
1.3. Nghiên cứu về tồn dư quinolon trong thực phẩm 12
1.3.1. Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi 12
1.3.2. Các nghiên cứu về tồn dư quinolon trong thực phẩm ở trong nước 13
1.3.3. Các nghiên cứu về tồn dư quinolon trong thực phẩm ở ngoài nước 14
1.3.4. Một số quy định về giới hạn tồn dư quinolon trong thực phẩm 16
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu của đề tài 20
2.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất 20
2.2.1. Thiết bị, dụng cụ 20
2.2.2. Thuốc thử, hóa chất 20
2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 20
2.3.1. Nghiên cứu các điều kiện LC-MS/MS 20

2.3.2. Nghiên cứu và lựa chọn quy trình xử lý mẫu 22
2.3.3. Thẩm định lại phương pháp đã xây dựng 24
2.3.4. Thực nghiệm xác định quinolon trên mẫu thịt, cá 24
2.4. Tính toán kết quả, xử lí số liệu 25

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả khảo sát và lựa chọn các thông số cho LC-MS 27
3.1.1. Xác định các thông số của detector khối phổ (MS 27
3.1.2. Xác định các thông số của phần LC để tách các chất nhóm Quinolon 28
3.2. Xác định kỹ thuật xử lý mẫu 29
3.2.1. Quy trình tách chiết các chất cần phân tích khỏi nền mẫu 29
3.2.2. Quy trình làm sạch và làm giàu mẫu qua SPE 31
3.2.3. Quy trình xử lí mẫu được lựa chọn 33
3.3. Thẩm định phương pháp đã xây dựng 34
3.3.1. Tính thích hợp của hệ thống 34
3.3.2. Độ đặc hiệu/độ chọn lọc 35
3.3.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 35
3.3.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 39
3.3.5. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp 39
3.4. Phân tích trên mẫu thực nghiệm 44
Chương 4. BÀN LUẬN
4.1. Xây dựng quy trình kỹ thuật 46
4.1.1. Các điều kiện phân tích trên hệ thống LC-MS/MS 46
4.1.2. Điều kiện xử lý mẫu 47
4.2. Thẩm định quy trình đã xây dựng 47
Kết luận 50
Kiến nghị 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt
HPLC High Performance Liquid
Chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
LC-MS/MS Liquid Chromatograph
Tandem Mass Spectrometer
Sắc ký lỏng ghép 2 lần khối
phổ
LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện
LOQ Limit of Quantitative Giới hạn định lượng
SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn
CE Capillary electrophoresis
Điện di mao quản
ESI Electrospray ionization
Ion hóa phun điện tử
EU European Union
Liên minh Châu Âu
APCI
Atmospheric pressure chemical
ionization

ion hoá hoá học áp suất khí
quyển
AOAC
Association of Official Analytical.
Chemists
Hiệp hội các nhà hoá phân tích
IS Internal Standard Nội chuẩn
Mẫu PT Mẫu phân tích

TL Thịt lợn
TG Thịt gà
C01 Cá 01
RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối
Ppb Part per billion Phần tỷ
Ppm Part per million Phần triệu

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Giới hạn tồn dư tối đa của các quinolone theo quyết định số 2377/90/EC của
Ủy ban Châu Âu……………………………………………………….………… …15
Bảng 1.2 : Danh mục các quinolone hạn chế sử dụng trong sản xuất kinh doanh thủy
sản ……………………………… ………………………………… ….………….16
Bảng 3.1. Thông số chung của detector khối phổ………… ……… 27
Bảng 3.2 Thông số chi tiết của 4 Quinolon……………………… …………………27
Bảng 3.3 Gradient pha động khi sử dụng cột Symmetry……………….… ……….28
Bảng 3.4 Gradient pha động khi sử dụng cột Xbridge……… ……………… … 28
Bảng 3.5: Kết quả thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích Norfloxacin…… 29
Bảng 3.6: Kết quả thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích Ciprofloxacin… 30
Bảng 3.7: Kết quả thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích Enrofloxacin …30
Bảng 3.8: Kết quả thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích Flumequin.… ….30
Bảng 3.9: Kết quả thử nghiệm cột SPE khi phân tích Norfloxacin……… ……….31
Bảng 3.10: Kết quả thử nghiệm cột SPE khi phân tích Ciprofloxacin…… ….…… 32
Bảng 3.11: Kết quả thử nghiệm cột SPE khi phân tích Enrofloxacin……… ………32
Bảng 3.12: Kết quả thử nghiệm cột SPE khi phân tích Flumequin ………… …… 33
Bảng 3.13. Kết quả phân tích tính thích hợp của hệ thống……… ………………… 34
Bảng 3.14: Kết quả phân tích dãy chuẩn Norfloxacin………………….…………… 36
Bảng 3.15: Kết quả phân tích dãy chuẩn Ciprofloxacin……………… ……………37
Bảng 3.16: Kết quả phân tích dãy chuẩn Enrofloxacin……… ………………… …37
Bảng 3.17: Kết quả phân tích dãy chuẩn Flumequin…………………………….……38

Bảng 3.18: LOD và LOQ của các chất phân tích tính trên nền mẫu thịt……… ……39
Bảng 3.19: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE HLB của Norfloxacin……… ……40
Bảng 3.20: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE HLB của Ciprofloxacin…… …….40
Bảng 3.21: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE HLB của Enrofloxacin……… ….41
Bảng 3.22: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE HLB của Flumequin ……….…….41
Bảng 3.23: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE C18 của Norfloxacin…….……… 42
Bảng 3.24: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE C18-E của Ciprofloxacin…………42
Bảng 3.25: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE C18-E của Enrofloxacin…….…….41

Bảng 3.26: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE C18-E của Flumequin.…… …….41
Bảng 3.27 : Kết quả phân tích 20 mẫu thịt gà (đơn vị là µg/kg)…… ………… …44
Bảng 3.28: Kết quả phân tích 20 mẫu thịt lợn (đơn vị là µg/kg)……………… … 44
Bảng 3.29: Kết quả phân tích 20 mẫu cá nước ngọt (đơn vị là µg/kg)…………… 44
















DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc cơ bản của nhóm quinolon ………………………………… …….3
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Ciprofloxacin ……………… …………………… 4
Hình 1.3. Công thức cấu tạo của Enrofloxacin ……….………….…….…… ……….5
Hình 1.4. Công thức cấu tạo của Norfloxacin ….…………………………………… 5
Hình 1.5. Công thức cấu tạo của Flumequin …….……………………………………5
Hình 3.1: Sắc ký đồ thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích norfloxacin…… 29
Hình 3.2: Sắc ký đồ thử nghiệm cột SPE khi phân tích Norfloxacin…………………32
Hình 3.3: Sắc ký đồ khi phân tích tính thích hợp của hệ thống……………… ….35
Hình 3.4: Đồ thị đường chuẩn của Norfloxacin (trái) và Ciprofloxacin (phải)……….36
Hình 3.5: Sắc ký đồ khi xây dựng đường chuẩn của norfloxacin…………………….37
Hình 3.6: Đồ thị đường chuẩn của Enrofloxacin (trái) và Flumequin (phải)… …… 38
Hình 3.7: sắc ký đồ của norfloxacin khi xử lí mẫu qua cột SPE HLB …………… 40
Hình 3.8: Sắc ký đồ của mẫu thực tế có (hoặc không có) norfloxacin……………… 45











1

ĐẶT VẤN ĐỀ

An toàn vệ sinh thực phẩm luôn được đặt lên hàng đầu trong công tác bảo vệ

sức khoẻ con người. Trong chăn nuôi hiện nay, vấn đề sử dụng thuốc kháng sinh
(trong thức ăn, điều trị bệnh gia súc, gia cầm) là rất phổ biến và được coi là một tiến
bộ của công nghệ sinh học. Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc kháng sinh nói chung
và nhóm Fluoroquinolon nói riêng có thể làm nguồn thực phẩm cung cấp cho con
người còn chứa một lượng nhỏ chất kháng sinh, người sử dụng loại thực phẩm này
trong thời gian dài có thể gây nguy hại cho sức khoẻ.
Trong tiến trình gia nhập WTO, thị trường hàng hoá của Việt nam được mở
rộng, đặc biệt trong lĩnh vực xuất khẩu các mặt hàng nông sản, thuỷ sản. Tuy nhiên,
do việc kiểm soát dư lượng hoá chất kháng sinh có hại đến sức khoẻ người tiêu
dùng chưa được thực hiện nghiêm túc nên một số lô hàng bị thị trường xuất nhập
khẩu phát hiện kháng sinh có hại vẫn còn cao. Tình trạng trên không chỉ gây thiệt
hại lớn về kinh tế cho các doanh nghiệp mà còn ảnh hưởng nghiêm trọng đến uy tín
chất lượng hàng Việt nam trên thị trường thế giới và sức khỏe người tiêu dùng.
Quinolon có phổ tác dụng diệt khuẩn rộng, hiệu quả cao nên chúng được sử
dụng rộng rãi để chữa bệnh cho người, gia cầm và thủy sản trong công nghiệp.
Trong quá trình nuôi dưỡng, nếu không tuân thủ về thời gian dùng thuốc và thời
gian sản xuất hoặc chế biến thì sẽ dẫn đến lượng Quinolon còn lại trong thịt gia cầm
hay thủy sản. Điều này sẽ gây rất nhiều mối nguy hiểm. Đặc biệt là gây ra hiện
tượng kháng thuốc của một số vi khuẩn như: Salmonella, Campylobacter spp,
Escherichia coli, Hậu quả là giảm hiệu quả của Quinolon đối với các chủng vi
khuẩn trên, gây khó khăn và tốn kém trong điều trị cho con người.
Để bảo vệ quyền lợi của người tiêu dùng, ở châu Âu, tổ chức EU đã thiết lập
giới hạn lớn nhất (MRLs) đối với dư lượng thuốc trong nguồn thực phẩm khi cung
cấp cho con người vào năm 1990. Theo sự kiểm tra và định hướng của các chuyên
gia phòng thí nghiệm, EU đã công bố “Council directive 96/23/EC in 1996” [23] ,
trong đó quy định rõ hàm lượng kháng sinh theo từng loại thực phẩm và từng loại
thuốc, ví dụ như với enrofloxacin trong cơ, gan, thận của bò, lợn, gia cầm (gà, vịt)
là 30µg/kg; trong sữa bò là 100 µg/kg; Ở châu Mỹ, Hoa kỳ và các nước Bắc Mỹ đã
2

cấm sử dụng kháng sinh họ Fluoroquinolon. Bộ Thủy sản đã ra quyết định số
07/2005/QD-BTS ban hành ngày 24/02/2005 quy định danh mục 17 loại kháng sinh
cấm sử dụng và danh mục 34 loại hạn chế sử dụng trong đó có nhóm Quinolon [10]
và Quyết định số 26/2005/QD-BTS ban hành ngày 18/8/2005 bổ sung nhóm
Quinolon vào danh mục cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản xuất khẩu
vào thị trường Bắc Mỹ và Hoa Kỳ [11].
Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài: “Xây dựng quy trình xác định dư lượng một
số chất nhóm Quinolon trong thực phẩm bằng kỹ thuật LC-MS/MS”, với 2 mục tiêu
chính như sau:
1. Xây dựng quy trình xác định dư lượng ciprofloxacin, enrofloxacin, norfloxacin ,
flumequin trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép 2 lần khổi phổ LC-MS/MS.
2. Ứng dụng quy trình đã xây dựng để sơ bộ khảo sát dư lượng Quinolon trong một
số loại thực phẩm (Thịt, cá) trên thị trường Hà Nội.













3

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Vài nét về Quinolon [5]

1.1.1. Cấu tạo chung
Đôi khi ở vị trí 8 là N. Vậy đa số chúng là dẫn chất của acid 1,4-dihydro-4-
oxo-quinolein-3-carboxylic.



Hình 1.1 Cấu trúc cơ bản của nhóm quinolon
1.1.2. Phân loại
- Quinolon thế hệ I: Gồm các chất không gắn F (trừ flumequin), hiện nay hầu như
chỉ dùng acid nalidixic.
- Quinolon thế hệ II: Được dùng từ năm 1985, gồm các chất có gắn F (ít nhất là ở vị
trí 6) hay các fluoroquinolon có phổ rộng trên cả vi khuẩn gram (-) và gram (+), với
hoạt tính mạnh:
+ Tác dụng trên cả vi khuẩn gram (-) đã kháng acid nalidixic, trực khuẩn mủ xanh,
nhiều vi khuẩn gram (-) khó trị khác.
+ Trên các vi khuẩn gram (+) thì đặc biệt là tụ cầu vàng, S.epidermitis đã kháng
gentamycin, liên cầu, cầu khuẩn ruột (Enterococus) và các vi khuẩn kỵ khí.
+ Trên các vi khuẩn phát triển trong tế bào, và một số loại vi khuẩn đặc biệt nguy
hiểm (như Legionella, Chlamydia, Ureoplasma, Mycoplasma, các vi khuẩn kháng
alcol )
1.1.3. Cơ chế tác dụng
Theo một hoặc hai cơ chế sau và đều cho tác dụng diệt khuẩn:
- Ức chế ADN-gyrase, là enzym tham gia vào quá trình tổng hợp acid nhân.
- Tạo phức với kim loại hóa trị hai của các protein chứa các kim loại này, đồng thời
phức đó ion hóa thành ion phức có hoạt tính cao với các enzym chuyển hóa
1.1.4. Tác dụng phụ
Tác dụng phụ của thuốc chủ yếu là lên dạ dày - ruột, thần kinh trung ương và da.
- Tiêu hóa: Buồn nôn, nôn, ỉa chảy, đau bụng, rối loạn tiêu hoá
N
O

COOH
R
R
2
R
1
1
2
3
4
5
6
7
8
4

- Da: Nổi ban, ngứa, viêm tĩnh mạch nông.
- Cơ xương: Ðau ở các khớp, sưng khớp. Ðau cơ, viêm gân (gân gót) và mô bao
quanh. Có một vài trường hợp bị đứt gân, đặc biệt là ở người cao tuổi khi dùng phối
hợp với corticosteroid.
- Thần kinh trung ương: Cơn co giật, lú lẫn, rối loạn tâm thần, hoang tưởng, mất
ngủ, trầm cảm, loạn cảm ngoại vi, rối loạn thị giác kể cả ảo giác, rối loạn thính giác,
ù tai, rối loạn vị giác và khứu giác, tăng áp lực nội sọ.
- Da: Hội chứng da - niêm mạc, viêm mạch, hội chứng Lyell, ban đỏ da thành nốt,
ban đỏ đa dạng tiết dịch.
- Gan: Ðã có báo cáo về một vài trường hợp bị hoại tử tế bào gan, viêm gan, vàng
da ứ mật.
- Tiết niệu - sinh dục: Có tinh thể niệu khi nước tiểu kiềm tính, đái ra máu, suy thận
cấp, viêm thận kẽ.
- Khác: Nhạy cảm với ánh sáng khi phơi nắng, phù thanh quản hoặc phù phổi, khó

thở, co thắt phế quản.
1.1.5. Đặc tính của các quinolon nghiên cứu
Ciprofloxacin
Tên gọi: 1-Cyclopropyl-6-fluoro-1,4-dihydro-4-oxo-7-(1-piperazinyl)-3-quinolinecarboxylic
acid
Công thức hóa học: C
17
H
18
FN
3
O
3
Trọng lượng phân tử: 331.35 g/mol
Nhiệt độ nóng chảy: 318-320
0
C

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Ciprofloxacin
Tính chất: là bột kết tinh màu vàng nhạt, tan một phần trong nước, tan rất ít trong ethanol,
methylen chlorid. Tan tốt trong dung dịch acid acetic loãng, có hai giá trị pKa là 6.0 và 8.8
Enrofloxacin
Enrofloxacin là kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolone, loại PQ, có thể chống vi
khuẩn gram dương và gram âm.
N
O
COOH
F
HN
N

5

Tên gọi: acid 1-Cyclopropyl-7-(4-ethyl-1-piperazinyl)-6-fluoro-1,4-dihydro-4-oxo-
3-quinolinecarboxylic.
Công thức hóa học: C
19
H
22
FN
3
O
3

Trọng lượng phân tử: 359.4 g/mol
Nhiệt độ nóng chảy: 219-221
0
C

Hình 1.3. Công thức cấu tạo của Enrofloxacin
Tính chất: là tinh thể màu vàng nhạt, tan nhẹ một phần trong nước ở pH = 7,
có hai giá trị pKa: khoảng 5 và 8-9
Norfloxacin
Tên gọi: acid 1-ethyl-6-fluoro-4-oxo-7-(piperazin-1-yl)-1,4-dihydroquinolin-3-carboxylic
Công thức hóa học C
16
H
18
FN
3
O

3
Trọng lượng phân tử: 319,3


Hình 1.4. Công thức cấu tạo của Norfloxacin

Tính chất : Bột kết tinh màu trắng hoặc vàng nhạt, dễ hút ẩm, nhạy cảm với ánh
sáng. Rất khó tan trong nước, khó tan trong aceton và ethanol 96%.
Flumequin
Tên gọi: acid 9-Fluoro-5-methyl-1-oxo-6,
7-dihydro-1H,5H-benzoquinolizin-2-carboxylic
Công thức hóa học: C
14
H
12
FNO
3

Trọng lượng phân tử: 261,3 Hình 1.5. Công thức cấu tạo của Flumequin
Tính chất: Bột trắng, không tan trong nước, ít tan trong methylen chlorid, rất
ít tan trong methanol, dễ tan trong kiềm
1.2. Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao và chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký
[2], [7]
Quá trình tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố
của các chất tan giữa hai pha khác nhau (pha động, pha tĩnh). Dung dịch các chất
N
O
COOHF
N
N

H
3
C
N
O
F
COOH
CH
3
H
6

phân tích khi vào cột sẽ được hấp thụ hay liên kết với pha tĩnh tùy thuộc vào bản
chất của cột và của chất cần phân tích. Khi pha động dịch chuyển với một tốc độ
nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra khỏi cột. Tùy theo
bản chất của pha tĩnh, bản chất của chất tan, bản chất của dung môi mà quá trình
rửa giải tách được các chất ra khỏi nhau. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát
hiện bởi detector và được chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng được đưa
ra máy in hoặc hiển thị trên màn hình. Nếu ghi quá trình tách sắc ký của hỗn hợp
nhiều thành phần, ta sẽ có một sắc đồ gồm nhiều pic. Quá trình tách sắc ký tốt thì
hỗn hợp có bao nhiêu thành phần thì sẽ có bấy nhiêu pic riêng biệt trên sắc đồ.
1.2.1. Kết nối sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với phổ khối lượng (MS)
Trong nhiều quá trình phân tích, các hợp chất quan tâm thường nằm trong
một hỗn hợp phức tạp, và vai trò của kỹ thuật sắc ký là thiết lập sự tách các thành
phần của hỗn hợp, cho phép định tính hoặc định lượng chúng. Về mặt định tính,
nhược điểm chính của kỹ thuật sắc ký trong quá trình tách là không có khả năng
cung cấp thông tin về định tính một cách rõ ràng cho các hợp phần mẫu, thậm chí cả
trong trường hợp chúng được tách hoàn toàn khỏi nhau. Việc định tính được dựa
trên cơ sở so sánh các đặc tính lưu giữ, mà đơn giản nhất là thời gian lưu của một
chất chưa biết với các chất so sánh được xác định trong cùng một điều kiện thí

nghiệm. Tuy nhiên, trên thực tế rất nhiều trường hợp thậm chí có cùng các đặc tính
lưu giữ của cấu tử chưa biết và vật liệu so sánh, trong giới hạn sai số thực nghiệm,
định tính, người phân tích cũng không thể kết luận một cách tuyệt đối hai hợp chất
này là giống nhau. Mặc dù các điều kiện sắc ký tương đối mở rộng cho các nhà
phân tích, nhưng không phải lúc nào cũng có thể thực hiện được quá trình tách tất
cả các cấu tử của một hỗn hợp mẫu và điều này có thể ảnh hưởng đến độ đúng, độ
chính xác trong quá trình phân tích định lượng của các chất cần quan tâm.
Khả năng của thiết bị sắc ký - khối phổ trên thực tế phụ thuộc vào phổ khối
lượng của nhiều chất mà các chất này đã có đầy đủ các phổ (thư viện phổ). Điều này
cho phép việc nhận dạng chúng một cách dễ dàng với độ tin cậy cao, mặc dù nhiều
khi không hoàn toàn như vậy. Nếu chất phân tích nằm trong một phần của hỗn hợp
7

thì phổ khối lượng nhận được sẽ chứa các ion từ tất cả các chất có mặt. Trong
trường hợp đặc biệt, nếu chất phân tích là một hỗn hợp của các thành phần lượng
nhỏ thì việc nhận dạng sẽ trở nên khó khăn và dường như không thể. Sự kết hợp khả
năng tách của phương pháp sắc ký cho phép các chất tinh khiết được đưa vào máy
phổ khối. Khả năng nhận dạng của máy phổ khối rất rõ ràng, vì thế có thuận lợi và
đặc biệt cho các chất tương tự nhau hoặc giống hệt nhau về các đặc trưng lưu,
nhưng có phổ khối lượng hoàn toàn khác nhau và có thể phân biệt được các chất
này. Ngoài ra, phổ khối lượng còn cho phép định lượng với độ chính xác phụ thuộc
vào mức độ phức tạp của hỗn hợp mẫu và bản chất của mỗi thành phần trong hỗn
hợp. Công việc này nếu chỉ riêng phép sắc ký thôi thì không thể thực hiện được.
Phương pháp sắc ký
- Là phương pháp tách dành cho hỗn hợp mẫu.
- Nhận dạng các mẫu dựa trên thời gian lưu.
- Cho phép phân tích định tính và định lượng.
- Phân lập và tinh chế chất.
Phương pháp phổ khối lượng
- Là phương pháp nhận dạng các lượng mẫu nhỏ.

- Cung cấp phổ khối lượng của các hỗn hợp phức tạp.
Sự kết hợp của HPLC và phổ khối lượng vì thế cho phép nhận dạng rõ ràng và xác định
số lượng của các hợp chất mà phương pháp sắc ký không phân tích đầy đủ được.
1.2.2. Sơ đồ thiết bị sắc ký lỏng - khối phổ
Một máy sắc ký lỏng khối phổ bao gồm 3 bộ phận chính (hình 1.1).
- Thiết bị sắc ký lỏng (LC, Liquid Chromatography): thông thường sử dụng máy
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC, High Performance Liquid Chromatography),
hiện đại hơn là máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC – Ultra Performance Liquid
Chromatography)
- Bộ kết nối (Interface): có nhiệm vụ loại dung môi rửa giải và đưa mẫu chất vào
buồng ion hoá của máy phổ khối. Đây là bộ phận rất quan trọng và là chìa khoá của
phương pháp LC-MS.
8

- Thiết bị phổ khối lượng (MS, Mass Spectrometry).








Hình 1.6. Sơ đồ hệ thống máy sắc ký lỏng khối phổ
Bộ phận kết nối (interface) ở đây đóng vai trò quan trọng vì nó là kỹ thuật
chìa khoá của một máy sắc ký lỏng - khối phổ. Chức năng của bộ kết nối là loại
dung môi rửa giải và đưa mẫu chất vào buồng ion hóa của máy khối phổ. Bộ kết
nối bao gồm nhiều loại khác nhau và ra đời ở các thời điểm khác nhau như:
- Bộ kết nối băng chuyền (Moving Belt Interface): 1977.
- Bộ kết nối nạp chất lỏng trực tiếp (DLI, Direct Liquid Introduction Interface):

1980
- Bộ kết nối phun nhiệt (Thermospray Interface): 1983
- Bộ kết nối bắn phá nguyên tử nhanh dòng liên tục (CF-FBA, Continuous Flow
Fast Atom Bombardment Interface): 1985/1986.
- Bộ kết nối ion hoá hoá học áp suất khí quyển (APCI, Atmospheric-Pressure
Chemical Ionization Interface): 1986.
- Bộ kết nối ion hóa phun điện (ESI, Electrospray Ionization Interface): 1988.
1.2.3. Phương pháp phổ khối lượng (MS)
Phương pháp phổ khối lượng là một trong những phương pháp phân tích
công cụ quan trọng. Phổ khối lượng cung cấp các thông tin về phân tích định tính,
định lượng các nguyên tố, thành phần và cấu trúc của các hợp chất vô cơ và hữu cơ.
a. Nguyên tắc chung của phương pháp
Cơ sở của phương pháp phổ khối lượng đối với các hợp chất hữu cơ là sự
bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hoà thành ion phân tử mang điện tích
Dung
môi
Bơm cao áp
C
ộ
t s
ắ
c ký

Bộ tiêm
mẫu
Bộ kết
nối
Nguồn
ion
Bộ phân

tích khối
Bộ phát
hiện
Bơm chân không


S
ắ
c ký l
ỏ
ng

B
ộ
k
ế
t n
ố
i

Kh
ố
i ph
ổ

Máy tính đi
ề
u khi
ể
n và phân tích s

ố
li
ệ
u

9

dương hoặc phá vỡ thành các mảnh ion, các gốc theo sơ đồ sau bằng các phần tử
mang năng lượng cao:

Sự hình thành các ion mang điện tích +1 chiếm hơn 95%, còn lại các ion
mang điện tích +2 hoặc ion âm (-). Năng lượng bắn phá các phân tử thành ion phân
tử khoảng 10 ev. Nhưng với năng lượng cao thì ion phân tử có thể phá vỡ thành
mảnh ion dương (+), hoặc các ion gốc, các gốc hoặc các phân tử trung hoà nhỏ hơn:

Sự phá vỡ này phụ thuộc vào cấu tạo chất, phương pháp bắn phá và năng
lượng bắnphá. Quá trình này gọi là quá trình ion hóa.
Ion phân tử và các ion mảnh là các phần tử có khối lượng. Nếu gọi khối
lượng của một ion là m và điện tích của nó là e thì tỷ số z=m/e được gọi là số khối.
Hiển nhiên các ion có khối lượng là m, 2m, 3m… và điện tích tương ứng bằng e, 2e,
3e, … có số khối z bằng nhau. Ion phân tử có số khối ký hiệu là M+
b. Thiết bị khối phổ
Thiết bị phổ khối đầu tiên được chế tạo bởi J. Thomspon (1912) và F. W.
Aston (1919). Thiết bị hoàn thiện được chế tạo năm 1932.
10


1.2.4. Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký
Trong các mẫu sinh học, mẫu môi trường thường có thành phần rất phức tạp,
hàm lượng chất cần phân tích khá thấp nên không tương thích cho việc phân tích

trực tiếp trên hệ sắc ký. Do vậy, trước khi phân tích mẫu chúng ta cần phải tách, làm
giàu các hợp phần của mẫu cần phân tích. Có rất nhiều phương pháp xử lý mẫu như:
lọc, bay hơi, làm khô, ly tâm, chiết lỏng-lỏng, sắc ký cột, chiết Soxhlet, SPE, xung
siêu âm, vi sóng nhưng tất cả các phương pháp này đều phải đáp ứng được các
tiêu chí:
- Làm sạch mẫu một cách chọn lọc.
- Tăng nồng độ lên nhiều lần.
- Lượng mẫu không cần nhiều.
- Lượng dung môi cần ít.
- Độ thu hồi cao, không gây nhiễu.
- Đơn giản, nhanh, giá thành thấp.
Dựa trên các mối liên hệ giữa độ chọn lọc, độc tính dung môi, giá thành, thời
gian mà chúng ta chọn phương pháp chiết mẫu sao cho hiệu quả nhất.
a. Chiết lỏng - lỏng
Phương pháp chiết lỏng - lỏng là phương pháp làm sạch mẫu thông dụng,
dụng cụ thiết bị khá đơn giản nhưng hiệu quả chiết khá cao. Quá trình chiết lỏng -
lỏng dựa trên định luật phân bố Nernst: bất cứ một hợp phần trung tính nào cũng sẽ
phân bố giữa hai dung môi không trộn lẫn với tỷ số nồng độ trong hai pha là một
hằng số.
11

[
]
[ ]
n
hc
A
A
A
K =

K
A
: hằng số phân bố
[A
hc
]: nồng độ của chất A trong pha hữu cơ.
[A
n
]: nồng độ của chất A trong pha nước.
b. Chiết pha rắn SPE
Ngày nay, để làm sạch mẫu trong kỹ thuật sắc ký người ta thường sử dụng
phương pháp chiết pha rắn SPE (chiếm hơn 50% các phương pháp làm sạch mẫu).
Phương pháp chiết pha rắn ứng dụng cho nhiều nền mẫu (matrix) như các loại
mẫu môi trường, các loại mẫu dược phẩm, mẫu sinh hóa, mẫu hữu cơ và mẫu thực
phẩm. Có 6 bước chính trong quá trình chiết pha rắn:
Bước 1. Chuẩn bị dịch mẫu: Mẫu phải ở dạng dung dịch và tương tác được
với chất hấp phụ. Dịch mẫu khi cần thiết phải được lọc hoặc ly tâm trước khi cho
vào cột SPE để tránh làm tắc cột.
Bước 2. Hoạt hóa cột: làm ướt pha rắn, tạo môi trường thích hợp cho việc
hấp phụ chất phân tích. Thể tích dung môi cần sử dụng khoảng 1mL/100mg chất
hấp phụ. Nếu thể tích dung môi sử dụng ít hơn thể tích quy định này sẽ làm tăng
nguy cơ pha rắn không được solvat hóa hoàn toàn, kết quả độ thu hồi của mẫu
thấp.
Bước 3. Cân bằng cột: Trước khi cho mẫu vào, cột phải có điều kiện tương
đương với điều kiện chạy của mẫu (ví dụ: pH) bằng cách cho thêm dung môi có
điều kiện tương đương dung môi chứa mẫu.
Bước 4. Nạp mẫu: mẫu được cho qua cột SPE. Tốc độ dòng chảy của mẫu
qua cột khoảng 3ml/phút.
Bước 5. Rửa pha rắn: dùng dung môi thích hợp để loại các tạp chất ra khỏi

cột nhưng vẫn giữ lại được chất cần phân tích.
Bước 6. Rửa giải: sử dụng dung môi thích hợp để tách chất cần phân tích ra
khỏi cột, tốc độ dòng chảy khi rửa giải không được quá nhanh. Tốc độ này phụ
thuộc vào đường kính cột và khối lượng chất hấp phụ, người ta thường rửa với tốc
độ khoảng 1ml/phút.
12

Nhiều kỹ thuật xử lý mẫu có thể được sử dụng để phân tích tồn dư kháng
sinh trong các nền mẫu khác nhau. Hai kỹ thuật phổ biến được sử dụng trên thế giới
và Việt Nam là kỹ thuật chiết lỏng-lỏng và kỹ thuật chiết pha rắn. Các nền mẫu
trong nghiên cứu là các thực phẩm (chủ yếu là thịt và nội tạng động vật) và thức ăn
chăn nuôi, đây là nền mẫu khá phức tạp nên thường phải sử dụng phối hợp nhiều kỹ
thuật xử lý mẫu để đạt hiệu quả cao. Căn cứ vào các tài liệu tham khảo chúng tôi
cần phân tích và tìm ra những ưu điểm của các nghiên cứu khác nhau về các kỹ
thuật xử lý mẫu với các đối tượng khác nhau và các kỹ thuật phân tích trên các loại
hiết bị khác nhau nhằm xây dựng được quy trình kỹ thuật xác định dư lượng kháng
sinh nhóm Quinolon trong thực phẩm phù hợp với điều kiện Việt Nam.
1.3. Nghiên cứu về tồn dư quinolon trong thực phẩm
1.3.1. Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi
Trong những năm gần đây, kháng sinh được sử dụng nhiều trong lĩnh vực nông
nghiệp đặc biệt là chăn nuôi. Theo số liệu của Ghislain Follet, trong năm 1997 tổng
lượng kháng sinh dùng trong dân y và chăn nuôi ở các nước châu Âu là 10500 tấn (qui
theo mức 100% tinh khiết của các thành phần hoạt tính), trong đó 52% sử dụng trong
dân y, 33% trong điều trị thú y và 15% như chất bổ sung trong thức ăn chăn nuôi. Trong
đó, tỷ lệ các loại kháng sinh được sử dụng trong chăn nuôi: penicillin (9%); tetracycline
(66%); macrolid (12%); Aminoglycosid (4%); Fluoroquinolon (1%); Trimethomprim
/sulphamid (2%) và các kháng sinh khác (6%) [24].
Ở Việt Nam, theo nghiên cứu của một số tác giả, kháng sinh được sử dụng tràn lan
trong thức ăn cho vật nuôi và tình trạng tồn dư kháng sinh trong thịt là phổ biến. Các
nghiên cứu đều cho rằng hầu hết các cơ sở chăn nuôi sử dụng kháng sinh không hợp lý

từ đó dẫn đến tình trạng tồn dư kháng sinh trong sản phẩm cao gấp hàng chục tới hàng
ngàn lần so với tiêu chuẩn quốc tế. Hiện nay, việc kiểm soát dư lượng kháng sinh gặp rất
nhiều khó khăn do thiếu kinh phí, thiếu trang thiết bị, thiếu hiểu biết của người sử dụng.
Kết quả điều tra “Tình hình sử dụng kháng sinh và dư lượng kháng sinh trong thịt
gà tại các cơ sở chăn nuôi gà công nghiệp của thành phố Hồ Chí Minh” của Võ Thị Trà
An cho thấy có 8 loại kháng sinh được sử dụng phổ biến trong chăn nuôi gà thịt công
nghiệp trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh: colistin (15,83%), enrofloxacin, diaveridin
(7,74%), sulfadimidin (6,72%), trimethoprim (6,38%), norfloxacin (5,79%),
13

oxytetracyclin (4,93%), gentamycin (4,51%) và acid oxolinic (4%). Có 32,61% cơ sở sử
dụng kháng sinh không hợp lý, trong đó sai về liều lượng chiếm tỉ lệ cao nhất (23,3%).
Số cơ sở không ngưng thuốc đúng qui định chiếm 44,54%. Kiểm tra 70 mẫu thịt gà tại
các cơ sở sử dụng không hợp lý phát hiện 42 (60%) mẫu thịt có tồn dư với các loại kháng
sinh: enrofloxacin, norfloxacin, tylosin, tetracyclin, sulfadimidin, sulfadiazin,
sulfaquinoxalin. Có mối liên quan giữa việc ngưng thuốc không đúng qui định với tình
trạng tồn dư kháng sinh. 35,71% mẫu thịt gà có tồn dư vượt quá giới hạn từ 2 – 400 lần
so với tiêu chuẩn của Malaysia [1].
Trong các loại kháng sinh dùng cho chăn nuôi trên thị trường không ít loại không
đảm bảo hàm lượng và chất lượng nên khi sử dụng chúng sẽ có ít hiệu quả. Người chăn
nuôi thường phải dùng kết hợp nhiều loại kháng sinh khác nhau để phòng và chữa bệnh.
Do đó đã gây nên hiện tượng tồn dư kháng sinh trong sản phẩm động vật như : thịt , sữa ,
trứng Điều này gây nguy hại lớn cho sức khỏe cộng đồng. Con người sẽ bị nhiễm vi
khuẩn kháng thuốc khi ăn phải thịt nhiễm khuẩn. Đặc biệt là sự kháng thuốc của nhiều
lọai vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm.
1.3.2. Các nghiên cứu về tồn dư quinolon trong thực phẩm ở trong nước
Phạm Kim Đăng và đồng sự “ Ứng dụng phương pháp Elisa để phân tích tồn dư
kháng sinh nhóm quinolon trong Tôm tại một số ven biển khu vực phía bắc” cho thấy:
Tình hình tồn dư quinolon trong tôm đã được đánh giá thông qua việc phân tích 90 mẫu
tôm được lấy ở 4 địa phương đại diện (Hà Nội, Quảng Ninh, Nam Định, Nghệ An) bằng

phương pháp ELISA và khẳng định bằng phương pháp Sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-
MS/MS). Kết quả phân tích đánh giá tình hình tồn dư phát hiện 5 quinolon
(enrofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin, danofloxacin và acid oxolinic) trong 9 mẫu
nhiễm (tỷ lệ nhiễm 10%) với nồng độ dao động từ 0,4 đến 145 ppb. Trong đó, có 4 mẫu
nhiễm ở nồng độ cao hơn giới hạn tồn dư cho phép theo Nghị định 2377/90 CE của Uỷ
ban Châu Âu [4].
Một số kết quả khảo sát tình hình sử dụng thuốc kháng sinh trong chăn nuôi gà và
tồn dư kháng sinh trong thịt, trứng gà trên địa bàn Hà Nội của Lê Thị Ngọc Diệp thấy
rằng: Kiểm tra tồn dư kháng sinh theo phương pháp vi sinh vật (theo Dược điển Việt
Nam 3, tập II, 1994). Mẫu dương tính là mẫu có đường kính vòng vô khuẩn > 8mm.
Kháng sinh được sử dụng trong chăn nuôi gà tại các huyện ngoại thành Hà Nội là các
nhóm beta- lactamin (46,58%), aminoglycosid (50,96%), quinolon (78,14%), macrolid
14

(86,89%), tetracycline (46,58%), sulfamid (54,92%) và polypeptide (22,27%). Các
kháng sinh khác có tỷ lệ sử dụng thấp, chiếm 10,11% [3].
Tác giả Nguyễn Thanh Nga trong nghiên cứu xác định dư lượng kháng sinh
ciprofloxacin và enrofloxacin trong thực phẩm cũng lựa chọn phương pháp
LC/MS/MS. Cột được sử dụng là cột XDB-C
18
(50mm x 4,6mm; 3,5μm;) với pha
động gồm acetonitril và acid formic 0,1%. Các điều kiện khối phổ được tối ưu hóa
như sau: Kỹ thuật ion phun hóa điện EIS với chế độ bắn ion dương, tốc độ dòng:
0,5 ml/phút, nhiệt độ cột: 30
0
C, nhiệt độ MS1 (MS1 Heater) và MS2 (MS2 Heater):
100
o
C, nhiệt độ dòng khí (gas temp): 350
o

C, tốc độ dòng khí (gas flow): 8,0l/min,
thế áp vào ống mao quản (capillary): 3840V, cường độ dòng điện của buồng
(chamber current): 1.66μA, cường độ dòng điện tại ống mao quản (capillary
current): 74nA, áp suất dòng khí N
2
cho hệ phun sương (nebulizer): 40.0psi. Giới
hạn phát hiện của ciprofloxacin và enrofloxacin tương ứng là 0.426ppb và 0,391ppb
[6].
Để đánh giá tồn dư enrofloxacin trên cá tra, tác giả Trần Minh Phú đã sử
dụng phương pháp sắc ký lỏng cao áp kết hợp với đầu dò khối phổ. Phương pháp có
giới hạn định lượng 2ppb. Các điều kiện sắc ký đã được tối ưu hóa: sử dụng cột C18
(150 mm x 3mm; 3,0μm), Pha động chạy sắc ký là acetonitril và nước được điều
chỉnh đến pH đạt 2,5 bằng axit formic. Thể tích tiêm mẫu 20μl, tốc độ dòng
500μl/phút, nhiệt độ cột: 25
0
C, nhiệt độ nguồn 450
0
C [8].
1.3.3. Các nghiên cứu về tồn dư quinolon trong thực phẩm ở ngoài nước
Trên thế giới hiện nay có rất nhiều các nghiên cứu xác định dư lượng của các
kháng sinh nói chung và quinolon nói riêng trên các nền mẫu khác nhau. Một số
phương pháp đang được sử dụng như: phương pháp miễn dịch enzym (ELISA) [4];
phương pháp vi sinh vật (test vi sinh vật học), phương pháp lý hóa. Mỗi phương
pháp có ưu nhược điểm riêng. Với nhóm quinolon, có thể nhận thấy, phương pháp
được sử dụng phổ biến hiện nay là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) do có độ
chính xác cao, phát hiện được một lượng nhỏ kháng sinh tồn dư trong thực phẩm.
Các detector được sử dụng nhiều nhất là detector UV [19], detector huỳnh
quang[19], [26], [34] và detector khối phổ [13]…[22]…[41].
15

Để xác định tồn dư kháng sinh cần phải trải qua quá trình tách chiết
lấy chất cần phân tích ra khỏi nền mẫu, sau đó được làm sạch và làm giầu sử dụng
bằng các kỹ thuật hiện đại để phát hiện và định lượng.
Nhiều kỹ thuật xử lý mẫu có thể được sử dụng để phân tích tồn dư kháng
sinh trong các nền mẫu khác nhau. Nguyên tắc chung của quá trình này là kết tủa
protein trong mẫu sử dụng dung môi thích hợp để chiết được chất phân tích, sau đó
được làm sạch và/hoặc làm giàu mẫu trước khi đem đi phân tích. Dung môi được sử
dụng chủ yếu là acetonitril [13], [14] [21], [30]….[41] hoặc hỗn hợp acetonitril:
acid phosphoric 0,3%, hỗn hợp acetonitril : acid formic [13]. Một số nghiên cứu
cũng sử dụng hỗn hợp acid acetic/ethanol hoặc acid formic/ethyl acetate để chiết
mẫu cho kết quả tốt. Giai đoạn này thường được kết hợp với kỹ thuật rung siêu âm,
lắc Vortex cho đồng nhất và ly tâm để phân tách lớp tốt hơn. Giai đoạn chiết được
lặp lại nhiều lần để chiết được tối đa chất phân tích. Dịch chiết được loại chất béo
bằng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng (n-hexan) hoặc làm sạch mẫu sử dụng kỹ thuật chiết
pha rắn SPE, sau đó cô cạn làm giàu mẫu, hòa cặn và đem đi phân tích [20].
Trong kỹ thuật chiết pha rắn, phân tích tồn dư kháng sinh thường sử dụng 2
loại cột chính là cột SPE Oasis HLB Waters và cột SPE C18 [14], [15]…[22],
[38]….[41]. Đây là kỹ thuật được đa số các nghiên cứu sử dụng để làm sạch mẫu,
sử dụng ít dung môi, cho hiệu quả cao. Ngoài vai trò loại các tạp chất, kỹ thuật chiết
pha rắn còn có vai trò làm giàu mẫu, tăng cường khả năng phân tích mẫu.
Sắc ký lỏng là kỹ thuật được sử dụng phổ biến để phân tích tồn dư kháng
sinh. Kỹ thuật này đều có nhiều điểm thuận lợi để xây dựng một phương pháp phân
tích đa dư lượng kháng sinh trong thực phẩm nói chung
Ngay từ khi được bắt đầu ứng dụng trong phân tích, sắc ký lỏng đã được
nghiên cứu phát triển để xác định rất nhiều hợp chất. Với khả năng kết hợp với
nhiều loại detector khác nhau nên phạm vi ứng dụng của sắc ký lỏng rất rộng rãi và
phong phú. Để xác định tồn dư kháng sinh, trong thời gian đầu, detector UV và
detector huỳnh quang được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu, đặc biệt là
detector huỳnh quang (do có độ nhạy cao). Trong nghiên cứu của Verdon sử dụng
detector huỳnh quang có LOD khoảng 4-11 mcg/kg và LOQ khoảng 13-36 mcg/kg

[41]. Thời gian gần đây, kỹ thuật khối phổ phát triển mạnh mẽ và đạt được nhiều
16

bước tiến vượt bậc. Sắc ký lỏng ghép nối với detector khối phổ có độ nhạy và tính
đặc hiệu rất cao, đáp ứng được yêu cầu ngày càng khắt khe của thế giới về phân tích
dư lượng.
Ngoài kỹ thuật sắc ký lỏng, một số tác giả cũng đã nghiên cứu phát triển
phân tích dư lượng kháng sinh sử dụng kỹ thuật: điện di mao quản (CE). Gần đây,
phương pháp CE được sử dụng do tính chất ưu việt về hiệu quả tách cao, thời gian
tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Phương pháp này được D. Barrón sử dụng với
detector PAD để phân tích flumequin và acid oxolinic. Các điều kiện điện di gồm:
dung dịch điện di là dung dịch acid phosphoric 40mM điều chỉnh pH 8,02 bằng
NaOH, thế điện di 18kV, nhiệt độ mao quản duy trì ở 25
0
C, bước sóng phát hiện là
250nm. Phương pháp có giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng cho acid oxolinic
và flumequine tương ứng là 15 và 48ppb và 10 và 30ppb [20]. Tuy nhiên do độ
nhạy không tốt và độ tin cậy không cao nên phương pháp điện di mao quản ít được
áp dụng.
1.3.4. Một số quy định về giới hạn tồn dư quinolon trong thực phẩm
EU đã ban hành quyết định số 2377/90/EC quy định qui định giới hạn cho phép
thuốc thú y trong sản phẩm động vật, theo đó các sản phẩm có nguồn gốc từ động
vật phải được kiểm soát dư lượng tuân thủ qui trình của Chỉ thị số 96/23 EC (EU,
1996). Đặc biệt các phương pháp phân tích được công nhận và áp dụng trong chiến
lược kiểm soát dư lượng phải chuẩn hoá theo quyết định số 2002/657/CE (CE,
2002). Trong đó, quy định về giới hạn tồn dư tối đa của các quinolon trong nghiên
cứu cụ thể như sau.
Bảng 1.1: Giới hạn tồn dư tối đa của các quinolone theo quyết định số
2377/90/EC của Ủy ban Châu Âu [22]
Hoạt chất

Định lượng
chất tồn dư
Loài Cơ quan
Giới hạn tồn dư
tối đa (MRL)
(µg/kg)
Danofloxacin Danofloxacin
Bò, cừu, dê,
lợn




Thịt
Mỡ
Gan
Thận
Sữa
Thịt
200
100
400
400
30
200