Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số chất phân lập từ hoa cây gạo

BỘYTẾ
TRƯÒTVG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
• • • •
NGUYỄN THỊ NGUYÊN
NGHIÊN CÚtJ XÂY DựNG PHƯƠNG
PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT số
• • •
CHẤT PHÂN LẬP TỪ HOA CÂY GẠO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ
• • •
Giáo viên hưÓTig dẫn:
PGS. TS. Thái Nguyễn Hùng Thu
Noi thực hiện:
Bộ môn Hóa Phân Tích
Trung tâm kiểm nghiệm Dược phẩm
và Mỹ phẩm Hà Nội
HÀ NÔI - 2013
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài ''Nghiên cứu xây dựng
phương pháp xác định hàm lượng một số chất phân lập được từ hoa cây Gạo”,
tôi đã nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình, chu đáo của các thầy cô, bạn bè và
gia đình. Nhờ có sự giúp đỡ quý báu đó đã giúp tôi hoàn thành khóa luận này.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, đầu tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn
chân thành tới PGS. TS. Thái Nguyễn Hùng Thu, người thầy đã trực tiếp hướng
dẫn, tạo điều kiện thuận lợi, dành nhiều thời gian và công sức giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình thực hiện luận văn.
Đồng thời, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Thái An - Bộ
môn Dược Liệu, NCS. Hồ Thị Thanh Huyền và DS. Phạm Lê Minh đã luôn quan
tâm, động viên, giúp đỡ, cho tôi những ý kiến đóng góp quý báu.
Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo Tnrờng Đại học Dược Hà
Nội, các thầy cô giáo trực tiếp tham gia giảng dạy, các anh chị kỹ thuật viên đã

truyền cho tôi những kiến thức thực sự bổ ích trong suốt quá trình học tập tại
tmờng.
Và cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh động
viên, khích lệ và tạo điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu hoàn
thành luận văn, để tôi có được kết quả ngày hôm nay.
Tôi xin chân thành cảm cm !
Hà Nội ngày 14 tháng 5 năm 2013
Sinh viên
Nguyễn Thị Nguyên
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỰC CÁC HÌNH ẢNH, Đồ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
PHẦN I-TỔ NG QUAN 2
1.1. TỐNG QUAN VỀ CÂY GẠO 2
1.1.1. Đặc điểm thực v ật 2
1.1.2. Phân bố 2
1.1.3. Bộ phận dùng, thu hái và chế biến
3
1.1.4. Thành phần hóa học của hoa Gạo
.
3
1.1.5. Tác dụng sinh học của hoa Gạo 3
1.1.6. Tính vị, công năng, chủ trị theo y học dân gian 4
1.2. VÀI NÉT VỀ HAI CHẤT PHÂN LẬP Đ ược TỪ HOA CÂY GẠO 5
1.2.1. Aurantiamid acetat 5
1.2.1.1. Nguồn gốc: 5
1.2.1.2. Tính chất 5
1.2.1.3. Tác dụng 6

1.2.2. Ergosterol peroxid 6
1.2.2.1. Nguồn gốc 6
1.2.2.2. Tính chất 6
1.2.2.3. Tác dụng 7
1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC 7
1.3.1. Nguyên tắc của quá trình sắc ký 7
1.3.2. Các thông số đặc trưng trong HPLC 9
1.3.3. ứng dụng của HPLC trong kiểm nghiệm dược liệu 12
1.3.3.1. Định tính dược liệu
12
1.3.3.2. Định lượng 12
1.4. VÀI NÉT VỀ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỒ (LC-MS)

14
1.4.1. Khối phổ 14
1.4.1.1. Nguồn ion (lon source)
14
1.4.1.2. Thiết bị phân tích khối phổ (Mass Analyzer) 15
1.4.1.3. Detector 15
1.4.2. Một số kỹ thuật LC-MS 16
1.4.3. ứng dụng của phân tích khối phổ trong định tính các chất

16
PHẦN II - ĐỐI TƯỢNG VÀ PÍĨƯƠNG PHÁP NGHIÊN C Ú tJ

17
2.1. ĐỐI TƯỢNG, HÓA CHẤT, THIỂT B Ị 17
2.1.1. Đối tượng 17
2.1.2. Hóa chất và thiết b ị 17
2.1.2.1. Hóa chất 17

2.1.2.2. Thiết b ị 17
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN c ứ u 18
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
18
2.3.1. Xử lý và chuẩn bị mẫu thử 18
2.3.2. Chuẩn bị dung dịch đối chiếu gốc (chuẩn gốc) 20
2.3.3. Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký 20
2.3.4. Thẩm định phương pháp phân tích 21
2.3.4.I. Độ phù họp của hệ thống sắc ký 21
2.3A.2. Tính đặc hiệu 21
2.3.4.3. Khoảng nồng độ tuyến tính, đường chuẩn 21
2.3.4.4. Độ lặp lại của phương pháp 22
2.3.4.5.ĐỘ đúng 22
2.3.4.6. Giói hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

22
2.3.5. Phương pháp xử lý kết quả 23
2.3.4.6. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 23
2.3.5. Phương pháp xử lý kết qu ả 23
PHẦN III - THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24
3.1. XỬ LÝ VÀ CHUẨN BỊ MẪU THỬ 24
3.1.1. Hàm ẩm của dược liệu 24
3.1.2. Hiệu suất chiết 24
3.2. KHẢO SÁT XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN SẮC K Ý 25
3.3. XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC HỢP CHẤT NGHIÊN C Ú tJ

26
3.4. ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHẤT NGHIÊN CÚXl TRONG HOA GẠO

27

3.5. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP 29
3.5.1. Khảo sát sự phù họp của hệ thống sắc ký

29
3.5.2. Khảo sát tính đặc hiệu 30
3.5.3. Khảo sát độ lặp lại 31
3.5.4. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính
31
3.5.5. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 33
3.5.6. Khảo sát độ đúng 34
3.6. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐÊ ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT TRONG
HOA GẠO 35
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 36
KỂTLƯẬN 36
ĐỀ XUẤT 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
STT
Chữ viết tắt
Chữ đầy đủ
1 ALT
Alanine transaminase
2
AST
Aspartate transaminase
3 DDVN
Dược điển Việt Nam
4
DPPH

l,l-diphenyl-2-picryhydrazyl
5
ESI
lon hóa bằng phun điện tử (Electron spraỵ ionization)
6
HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
7 IFN -ỵ
Interferon- y
8 IL
Interleukin
9
LC-MS
Sắc ký lỏng ghép khối phổ (Liquid Chromatography - Mass
Spectrometry)
10 LOD
Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)
11
LOQ
Giới hạn định lưọng (Limit of Quantification)
12
MeCN
Acetonitril
13 MeOH
Methanol
14 PHA
Phytohemagglutinin
15 RSD
Độ lệch chuân tưomg đôi (Relative Standard Deviation)
16 S/N

Tín hiệu/nhiễu đưỏng nền (Signal/Noise)
17 SD
Độ lệch chuân (Standard Deviation)
18 STT
So thứ tự
19 TNF
Tumour necrosis factor
20
tR
Thời gian lưu
21
UV-VIS
Tử ngoại khả kiến (Ultraviolet visible)
DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Ký hiệu
Tên bảng
Trang
1
Bảng 3.1
Ket quả xác định độ ẩm bột hoa Gạo
24
2
Bảng 3.2
Ket quả khảo sát tính thích họp
29
3
Bảng 3.3
Ket quả khảo sát độ lặp lại
31

4
Bảng 3.4
Kết quả khảo sát độ tuyến tính của aurantiamid acetat
32
5
Bảng 3.5
Ket quả khảo sát độ tuyến tính của ergosterol peroxid
32
6
Bảng 3.6
Kết quả khảo sát độ đúng với aurantiamid acetat
34
7
Bảng 3.7
Kêt quả khảo sát độ đúng với ergosterol peroxid
34
8
Bảng 3.8
Ket quả xác định hàm lưọng từng chất trong mẫu hoa
Gạo nghiên cứu
35
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ Đồ THỊ
STT Kí hiệu
Tên hình
Trang
1
Hình 1.1
Hình ảnh cây Gạo
2
2 Hình 1.2

Công thức cấu tạo của aurantiamid acetat
5
3 Hình 1.3
Hình ảnh tinh thê aurantiamid acetat
5
4 Hình 1.4
Công thức cấu tạo của ergosterol peroxid
6
5
Hình 1.5
Hình ảnh tinh thế ergosterol peroxid
7
6 Hình 1.6
Mô hình cẩu tạo máy HPLC
8
7 Hình 1.7
Sơ đồ bộ tứ cực chập ba
15
8 Hình 3.1
Sắc ký đồ hỗn họp chất nghiên cứu aurantiamid acetat và
ergosterol peroxỉd
26
9
Hình 3.2
Sắc ký đồ của mẫu thử chuẩn bị tử hoa Gạo
26
10
Hình 3.3
Sắc kỷ đồ của auratiamid acetat phân lập từ hoa cây Gạo
27

11
Hình 3.4
Sắc ký đồ của ergosterol peroxid phân lập từ hoa cây Gạo
27
12
Hình 3.5
Phô khổi lượng ứng với pic của aurantiamid acetat trên
sắc ký đồ của mẫu thử hoa Gạo và hỗn họp chất đối chiếu
28
13 Hình 3.6
Phổ khối lượng ứng với pic của ergosterol peroxid trên
sắc ký đồ của mẫu thử hoa Gạo và hỗn họp chất đối chiểu
28
14
Hình 3.7
Sắc ký đồ của mâu trắng (pha động)
30
15 Hình 3.8
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic
và nồng độ của aurantiamid acetat
32
16 Hình 3.9
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic
và nồng độ của ergosterol peroxid
33
- 1 -
ĐẶT VẤN ĐỀ
Như chúng ta đã biết, cây Gạo còn có tên gọi khác là Mộc miên, Gòn rừng, cổ
bối là một loài rất gần gũi và quen thuộc với mỗi người dân Việt Nam đặc biệt là
người dân miền Bắc. Cây Gạo phân bố nhiều ở các tỉnh từ Quảng Bình trở ra, được

trồng nhiều không chỉ đế lấy bóng mát mà còn là nguồn dược liệu quý sẵn có. Theo
kinh nghiệm dân gian, người dân đã quen thu hái nhiều bộ phận khác nhau từ cây
Gạo để phòng và chữa bệnh, trong đó hoa Gạo được sử dụng cho người thiếu máu
nhược sắc, rong kinh, đa kinh, chảy máu dạ dày, mất máu sau mổ, giúp ăn ngủ tốt,
tăng cân [4], [5], [9].
Trên thế giới, nhiều nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu hóa thực vật cũng
như thử tác dụng sinh học của hoa Gạo và cho kết quả rất đáng ngạc nhiên về tiềm
năng chữa các bệnh “thời đại” như tác dụng bảo vệ tim mạch [40], hạ huyết áp [33],
bảo vệ gan [30] ở Việt Nam, NCS. Hồ Thị Thanh Huyền là người đầu tiên nghiên
cứu toàn diện về hoa cũng như tất cả các bộ phận của cây Gạo, đã nhận biết, chiết
xuất và phân lập được một số thành phần từ hoa Gạo là aurantiamid acetat,
ergosterol peroxid. Tuy nhiên, hiện nay chưa có tài liệu nào trên thế giới cũng như
tại Việt Nam công bố hàm lượng các thành phần hoạt chất trong hoa Gạo.
Đe làm rõ hơn về hàm lượng các họfp chất phân lập được có trong hoa Gạo, đề
tài '"Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số chất phân
lập được từ hoa cây Gạo'' đã được thực hiện với mục tiêu sau:
1. Xây dựng và thẩm định quy trình định tính và định lượng đồng thời
aurantiamid acetat và ergosterol peroxid trong hoa Gạo bằng phương pháp HPLC
để góp phần vào việc tiêu chuẩn hóa chất lượng vị thuốc hoa Gạo.
2. ưng dụng phươiig pháp đê sơ bộ xác định hàm lưọng aumntiamid acetat và
ergosterol peroxid trong một mẫu hoa Gạo thu hái được.
- 2 -
Hĩnh 1.1. Hình ảnh cây Gạo
PHẦN I - TỎNG QUAN
1.1. TÓNG QUAN VỀ CÂY GẠO
1.1.1. Đặc điểm thực vật
- Cây Gạo còn gọi là Gòn rừng, Gạo
rừng, Mộc miên thụ, Mạy mìn, Mạy nghịu,
Bông Gạo, Anh hùng thụ, Hồng miên, cổ
bối [8], [13],

- Tên khoa học: Bombax malabaricum
DC. Thuộc họ Gạo (Bombacaceae) [8], [13].
- Cây Gạo có thể cao tód 15 m hoặc hơn,
thân gỗ sần sùi, có bạnh vè to ở gốc và có gai
hình nón. Cành hình trụ, mọc ngang, lá mọc
so le, kép chân vịt, gồm 5-7 lá chét hình mác,
gốc thuôn, dài 9-15 cm, rộng 4-5 cm [8]. [13].
- Hoa có màu đỏ, mọc thành chùm đầu cành. Đài dày, màu nâu xám, hình
chuông bọc lấy nụ hoa, khi hoa nở võ thành 3-5 mảnh có răng tù và ngắn. Tràng 5
cánh nạc, rời nhau, mặt ngoài phủ lông nhung. Nhị rất nhiều hợp thành 5 bó, ngắn
hơn cánh hoa. Bầu thượng, hình nón, có lông màu trắng nhạt, bầu 5 ô, một vòi
mang 5 đầu nhụy [13].
- Quả nang 5 cạnh, hình thoi, dài 8-15 cm, khi chín nứt thành 5 mảnh [13], Hạt
hình trứng, màu nâu [5].
1.1.2. Phân bố
- Trên thế giói, cây Gạo phân bố ở nhiều châu lục như châu úc, châu Mỹ, châu
Á Đặc biệt cây sống rất phổ biến ở các vùng nhiệt đới Châu Á như: Bhutan,
Campuchia, Ấn Độ, Indonesia, Lào, Malaysia, Myanmar, Nepal, Philippines, Sri
Lanka, Thái Lan, Việt Nam [5], [18].
- ở Việt Nam, cây Gạo được trồng chủ yếu ở các tỉnh từ Quảng Bình trở ra. Cây
thường mọc tự nhiên ở đất trống ven rừng, đồi và nhất là dọc theo các bờ sông suối.
Cây hay được trồng ở đình chùa, ven đường, hay đầu làng để lấy bóng mát [13].
- 3 -
1.1.3. Bộ phận dùng, thu hái và chế biến [5], [8], [13],
Toàn cây được sử dụng cho các mục đích khác nhau:
- Vỏ thân: thu hái quanh năm, tốt nhất vào mùa xuân. Có thể dùng tươi hoặc rửa
sạch, phơi khô để dùng.
- Rễ: thu hái vào mùa xuân hay mùa thu, rửa sạch, thái nhỏ, phơi khô.
- Hoa: hái vào mùa xuân, có thể dùng tươi hoặc phơi khô.
- Gôm, gỗ, nhựa, hạt, quả, bông: thu hái, chế biến phù họp với mục đích sử dụng

như làm bông, nệm, gối.
1.1.4. Thành phần hóa học của hoa Gạo
- Trong hoa Gạo chứa nhiều acid amin, đường, pectin, saponin, flavonoid, tanin,
nhiều nguyên tố vi lượng [4], Theo [13] nụ hoa và đài (tính theo dược liệu tươi)
chứa protein thô theo thứ tự lần lượt là 1,38 mg% và 1,56 mg%, carbohydrat 1L95
mg% và 13,87 mg%, chất vô cơ 1,09 mg% và 1,00 mg%, Ca 92,25 mg% và 95
mg%, p 49 mg% và 41 mg%, Mg 54 mg% và 24,64 mg%.
- Từ dịch chiết methanol của hoa khô B.malaharicum, một số tác giả ở Trường
Đại học Dược Hà Nội đã phân lập được hai chất là aurantiamid acetat và ergosterol
peroxid [7].
1.1.5. Tác dụng sinh học của hoa Gạo
Kết quả của nhiều công trình nghiên cứu cho thấy hoa Gạo có nhiều tác dụng
dược lý quan trọng:
• Tác dụng chống oxy hóa
Năm 2009, bằng phương pháp dùng DPPH, peroxynitrit; Vieira và các cộng sự
đã chứng minh tác dụng chống oxy hóa của cắn methanol chiết xuất từ hoa Gạo
[41].
Năm 2011, cũng bằng phương pháp dùng DPPH, các nhà khoa học khác cũng
chỉ ra tác dụng chống oxy hóa của cắn hoa Gạo với một số hệ dung môi khác nhau
như nước, ethanol 50%, aceton 80%, n-hexan. Các kết quả nghiên cứu còn chỉ ra
rằng các cắn chiết xuất được có khả năng chống oxy hóa vượt trội hơn acid ascorbic
hay gallic [18], [42],
- 4 -
• Tác dụng bảo vệ gan
Năm 2010, Ravi V. chứng minh được cắn methanol của hoa Gạo có tác dụng cải
thiện sự nhiễm độc gan gây ra bởi các thuốc kháng lao [30],
Theo [32], cắn thu được khi chiết xuất hoa Gạo bằng methanol 70% có tác dụng
làm giảm nồng độ men gan do paracetamol gây ra trên chuột. Với liều 250 mg/kg
và 500 mg/kg trọng lượng cơ thể, mức độ giảm ALT là 26,4% và 27,8%, mức độ
giảm AST là 13,7% và 17,0%.

• Tác dụng hạ huyết áp
Trên tim mạch, năm 2003, Saleem R. công bố cắn methanol của hoa Gạo với
liều 30 mg/kg có tác dụng giảm hơn 50% huyết áp động mạch trong khoảng 1-3
phút trên chuột [33].
• Tác dụng bảo vệ tim mạch
Theo [40], dịch chiết nước hoa Gạo có tác dụng chống lại nhồi máu cơ tim do
adriamycin gây ra trên chuột.
• Một số tác dụng dược lý khác
Năm 2011, Said A. chứng minh khi dùng cắn methanol với liều 250 mg/kg và
500 mg/kg có tác dụng giảm đau ngoại vi ở chuột. Đồng thời, tác giả còn công bố
các tác dụng chống viêm, chống ung thư, kháng khuẩn, chống kí sinh trùng sốt rét
của hoa Gạo [32],
1.1.6. Tính vị, công năng, chủ trị theo y học dân gian
Theo [13], [14], hoa Gạo có vị ngọt, tính mát và có tác dụng thanh nhiệt, lợi tiểu.
Hoa Gạo được dùng trị viêm ruột, lỵ, làm trà uống vào mùa hè. Nước hoa Gạo
được xem như có tác dụng bổ âm, dùng chữa thiếu máu do suy nhược hay các
nguyên nhân khác (rong kinh, đa kinh, chảy máu dạ dày - tá tràng, mất máu do mổ)
và trong cả trường hợp suy tủy [5],
Chữa tiêu chảy, kiết lỵ; Hoa Gạo sao vàng 20-30 g, sắc lấy nước uống, chia 2
lần hoặc có thể thêm rau má 20-30 g, sắc uống ngày 1 thang, chia 2 lần [4], [9].
Khoa tiêu hóa và huyết học bệnh viện Trung ương quân đội 108 đã dùng 100
mL nước sắc cao lỏng 2:1 của hoa Gạo khô cho bệnh nhân thiếu máu nhược sắc do
- 5 -
rong kinh, đa kinh, chảy máu dạ dày - tá tràng, mất máu sau mổ đạt kết quả tót.
1.2. VÀI NÉT VỀ HAI CHẤT PHÂN LẬP Được TỪ HOA CÂY GẠO
1.2.1. Aurantỉamid acetat
1.2.1.1. Nguồn gốc
- Aurantiamid acetat là hợp chất đã được tìm thấy từ nhiều loài khác nhau: nó có
thể phân lập được từ các loài Acantophora spicifera, Aspergillus penicỉlloides [20],
từ thảo dược Brillantaisia lamium [38]. Phân lập từ vỏ cây Albizia adianthifolia

[39], hoặc từ vỏ cây Pỉerreodendron kerstingii, một loài thực vật thuộc họ
Simaroubaceae [35],
- Năm 2012, lần đầu tiên ở Việt Nam, một số tác giả trường Đại học Dược Hà
Nội đã phân lập được aurantiamid acetat từ hoa cây Gạo [7].
L2.L2. Tính chất
- Công thức hóa học: C2 7H28N2 O4 (M = 444).
H
Hình 1.2. Công thức cẩu tạo của aurantiamid acetat
- Tên khoa học: N-benzoyl-1-phenylalanyl-l-pheylalaninol acetate.
- Tính chất vật lý: [36]
Aurantiamid acetat là chất bột màu trắng, tinh thể
không màu, hình kim, tan tốt trong methanol, aceton,
ethyl acetat.
Nhiệt độ nóng chảy 185°C-186°C.
{C(\d ~ 63,1 . Hình 1.3. Hình ảnh tinh thể
Imax(EtOH): 206 and 227 nm. aurantiamid acetat
- 6 -
1.2.1.3. Tác dụng
- Theo Jean De Dieu Tamokou và cộng sự, aurantiamid acetat có tác dụng kháng
khuẩn, tăng tác dụng của kháng sinh, ức chế sự phát triển của một số nấm và vi
khuân như
Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Salmonella typhi,
Candida albicans và Candida tropicaỉis [38], tác dụng oxi hóa và kháng khuẩn này
cũng được nhiều nghiên cứu khác đề cập tới [39].
- Theo [26], aurantiamid acetat ức chế sản xuất TNF-a và IL-2 nên có tác dụng
chống viêm, giảm tình trạng viêm trong các bệnh như viêm khớp dạng thấp, vảy
nến, lupus ban đỏ hệ thống Với liều 10 mg/kg, aurantiamid acetat có tác dụng
chống viêm trên mô hình gây viêm khóp ở chuột [20], điều này phù họp với kết quả
nghiên cứu chống viêm trong hoa Gạo đã được trình bày ở trên.
1.2.2. Ergosterol peroxid

1.2.2.1. Nguồn gốc
- Hợp chất ergosterol peroxid đã từng được phân lập từ nhiều nguồn nguyên liệu
khác nhau như: từ các loài nấm Lactarium volemus [21], Daedalea quercina [22],
Aspergillus sp [19], [29], Sarcodon aspratus [32],
- Phân lập từ Trùng thảo Cordyceps cicadae [28], Cordyceps sinensis [16], [34],
- Năm 2012, làn đầu tiên ở Việt Nam, một số tác giả Trường Đại học Dược Hà
Nội đã phân lập được ergosterol peroxid từ hoa cây Gạo [7].
1.2.2.2. Tính chất [29]
- Công thức phân tử: C 2 8 H 4 4 O 3 (M = 428)
- 7 -
Hình 1.5. Hình ảnh tinh
thê ergosterol peroxid.
- Tên khoa học: 5a,8a-epidioxyergosta-6,22-dien-3P-ol
- Tính chất vật lý [3\\
Bột kết tinh màu trắng, tinh thể không màu, hình kim,
tan trong methanol, aceton, ethyl acetat.
Nhiệt độ nóng chảy 175"- 177°c.
[a]ỉ,°=-81,5".
ESI-MS m/z: 429 [M+H]^.
Cực đại hấp thụ ở 237 nm.
I.2.2.3. Tác dụng
- Các nghiên cứu cho thấy ergosterol peroxid có tác dụng ức chế sự phát triển
của một số tế bào ung thư, đặc biệt ung thư tuyến tiền liệt, ung thư tuyển vú [10],
ung thư trực tràng và ung thư tuyến ruột kết [16], [31].
- Chống oxi hóa và kháng kí sinh trùng sốt rét [27], [44].
- Ergosterol peroxid có tác dụng ức chế miễn dịch, chống dị ứng bằng cách ức
chế sự tăng sinh tế bào lympho T ở những tế bào đã bị kích hoạt bởi PHA (là lectin
ở thực vật, có tác dụng kích thích sự phân bào, được dùng trong y học để kích thích
sự phân chia tế bào lympho T ở ngưòd) [43].
- Một nghiên cứu khác chứng minh ergosterol peroxid có tác dụng ức chế sự

phát triển của vi khuẩn Escherichia coli. Staphylococcus aureus, sau khi so sánh các
ống nghiệm đã được ủ ở 36°c trong vòng 18 giờ của nồng độ khác nhau của chất
này với sự phát triển của chủng vi sinh vật, sự tăng trưởng của vi sinh vật bị giảm
đáng kể [15].
=> Những tác dụng trên cũng giải thích phần nào tác dụng sinh học của hoa Gạo
đã trình bày ở phần 1.1.5.
1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC [1], [3], [6], [11], [12], [23],
1.3.1. Nguyên tắc của quá trình sắc ký [1], [3], [6], [11], [12], [23],
Khái niệm HPLC
HPLC là kỹ thuật phân tích dựa trên cở sở của sự phân tách các chất trên một
pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao.
- 8 -
sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ tùy vào loại
pha tĩnh sử dụng.
Nguyên tẳc
Mầu phân tích được hòa tan trong pha động. Pha tĩnh được cố định trong cột
hay trên bề mặt chất rắn. Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua cột
theo pha động vói tốc độ khác nhau tùy thuộc vào tương tác giữa pha tĩnh, pha động
và chất tan. Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau tùy thuộc vào ái lực của chất phân tích
với hai pha dẫn đển sự tách, các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành các
dải, làm cở sở cho phân tích định tính và định lượng, sự tách này đạt được là do quá
trình phân bố, hấp phụ, trao đổi ion
Các chất sau khi được rửa giải ra khỏi cột được nhận biết bởi bộ phận phát hiện
gọi là detector. Tùy theo bản chất của các chất mà sử dụng detector thích hợp.
Detector hay được sử dụng nhất là detector uv. Đường cong rửa giải sau một quá
trình sắc ký được gọi là sắc ký đồ, có chức năng đánh giá quá trình rửa giải trong
cột có tốt hay không.
Cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao như hình 1.6 bao gồm:
1-Bình chứa dung môi pha động.
2-BỘ phận khử khí.

3-Bơm cao áp.
4-BỘ phận tiêm mẫu (bằng
tay hay Autosample).
5-Cột sắc ký (Pha tĩnh) (để
ngoài môi trường hay trong
bộ điều nhiệt).
6-Detector (nhận tín hiệu).
7-Hệ thống máy tính gắn Hình 1.6. Mô hình cấu tạo máy HPLC.
phàn mềm nhận tín hiệu và xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống HPLC.
8-In dữ liệu.
1.3.2. Các thông số đặc trung trong HPLC
a. Hệ số phân bố (K)
Hệ số phân bố K của chất phân tích đặc trưng cho tốc độ di chuyển của chất đó
qua pha tĩnh và được xác định theo công thức:
c .
- 9 -
K =
Cm
trong đó: Cs và Cm là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động.
K tùy thuộc bản chất pha tĩnh, pha động và chất hòa tan. K nhỏ: chất di chuyển
nhanh; K lớn; chất di chuyển chậm. Thông thường K > 1 để chất có ái lực với pha
tĩnh, nếu không thì nó sẽ di chuyển nhanh quá làm cho khó tách.
- Nếu Ka = Kb thì quá trình sắc ký sẽ không tách được hai chất A và B ra khỏi
nhau.
- Ka Kg càng nhiều thì khả năng tách hai chất A và B trong quá trình sắc ký
càng lớn.
b. Thòi gian lưu (íịị) (Retention time)
Là thời gian cần thiết để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu vào hệ thống sắc
ký đến khi xuất hiện đỉnh của pic, tR là một hằng số đối với một chất nhất định. So
sánh thòd gian lưu của mẫu thử và mẫu chuẩn, ta có thể định tính được chất đó.

*> Thời gian chết (ím)
Là thời gian cần thiết để rửa giải một chất không bị lưu giữ.
*t* Thời gian lưu hiệu chỉnh (I’r)
Là hiệu số giữa thòd gian lưu và thời gian chết.
t ’ R — ĨR -
- 10-
c. Hệ số dung lượng k ’(Capacity factor)
Là đại lượng đặc tmng cho tốc độ di chuyển của một chất qua cột.
ýt'= _Ị_rJz1ềl
Qm
trong đó; Qs, Qm là lượng chất tan trong pha tĩnh, pha động.
Vs,Vm là thể tích pha tĩnh, pha động.
- Neu k’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và khả năng tách kém.
- Nếu k’ lớn thì pic bị doãng, độ nhạy kém.
- Trong thực tế k’ nằm trong khoảng 1< k’< 8 là tốt hơn cả.
d. Hệ số chọn lọc ịa) (Selective factor)
Là đại lượng đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất.
^ ~^m
A O r ) A ~ ^ M
Qui ước: B là chất bị lưu giữ mạnh hơn chất A nên a > 1.
a càng lớn, khả năng tách càng cao, 2;iá trị tối ưu là 1,5-2.
e. Độ phân giải (Rs) (Resolution)
Là đại lượng đăc trưng cho mức độ tách của hai chất ra khỏi nhau trên cùng một
điều kiện sắc ký;
~ ^ RA ) _ ~^Rạ )
trong đó:
+ ÍRA írb: thời gian lưu của 2 pic liền kề của 2 chất tan A và B (phút).
+ Wa, Wb: độ rộng đo ở các đáy pic của chất A và B (phút).
+ Wi/2A, Wi/2b’. độ rộng đáy pic ở nửa chiều cao pic của chất A và B (phút).
+ Các giá trị ÍRA, tRB Wa, Wb Wi/2 a, W]/2b phải tính theo cùng một đơn vị.

+ Yêu cầu Rs > 1, giá trị tối ưu là Rs = 1,5; Rs > 1,5 là không cần thiết, vì nó kéo
dài thời gian phân tích.
- 1 1 -
f. Hệ số bất đối (AF)
Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, được tính theo công thức;
AF =
_ ” l/20_
2a
trong đó:
+ Wị/2o: chiều rộng pic được đo ở 1/20 chiều cao pic.
+ a: Khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía
truớc của pic ở 1/20 chiều cao pic.
Trong phép định lượng yêu cầu: 0,9< AF<2.
g. Số đĩa lý thuyết (N) và chiều cao đĩa lý thuyết (H)
Số đĩa lý thuyết biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định.
Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký như là một lớp pha tĩnh có chiều cao là H, lớp
này có tính chất động, tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân
bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha
tĩnh và trong pha động.
Số đĩa lý thuyết được tính theo công thức sau:
N = Ỉ6
= 5,54
1/2
trong đó; + W: chiều rộng đo ở đáy pic.
+ Wi/2 : chiều rộng của pic đo ở Yi chiều cao của đỉnh.
Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là phù họp, tối thiểu là 1000.
Nếu gọi L là chiều dài cột sắc ký thì chiều cao của đĩa lý thuyết tính theo công
thức: H - — .
N
- 12-

1.3.3. ứng dụng của HPLC trong kiểm nghiệm dưọ’c liệu
13.3.1. Định tính dược liệu [1], [2], [6]
Dựa vào sắc ký đồ của dung dich thử và dung dịch chuẩn
- So sánh thời gian lưu, kết quả định tính sẽ dưcmg tính khi thời gian lưu ÍR của
các đỉnh quan tâm trên sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu đối chiểu phủ họp với nhau
khi tiến hành HPLC phân tích trong cùng điều kiện.
- Nếu chỉ dựa vào thời gian lưu để khằng định kết quả dưofng tính, nên tiến hành
sắc ký trên ít nhất hai điều kiện khác nhau.
- So sánh phổ (chồng phổ) UV-VIS của chất thử với chất chuẩn trên detector
DAD.
- Ngoài ra có thể kết nối HPLC - phổ IR hoặc HPLC - MS định tính dựa vào
nhóm chức (IR) hoặc số khối (MS).
- Để kết luận dương tính, kết quả phân tích HPLC của một dược liệu phải cho
thấy nó chứa các hoạt chất hay chất đánh dấu trong thành phần, khi so sánh với kết
quả HPLC trong cùng điều kiện thực nghiệm của các chất chuẩn hoạt chất hay các
chất đánh dấu tương ứng.
13.3.2. Định lượng [2]
- Tất cả các phương pháp định lượng bằng HPLC đều dựa trên nguyên tắc: nồng
độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó.
- Có 4 phương pháp định lượng được sử dụng trong sắc ký là;
• Phương pháp chuẩn ngoại.
• Phương pháp chuẩn nội.
• Phương pháp thêm chuẩn.
• Phưong pháp chuẩn hóa diện tích.
- Trong khuôn khổ của luận văn này tôi xin trình bày cụ thể về phương pháp
chuẩn ngoại.
Đây là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều
được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện, so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic
- 1 3 -
của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của

các chất trong mẫu thử.
Có thể sử dụng phương pháp chuẩn hóa 1 điểm hoặc chuẩn hóa nhiều điểm.
+ Chuẩn hóa một điểm
Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của mẫu thử. Tính nồng độ của
s
mâu thử theo công thức; Cỵ = Q —
trong đó: Cx: Nồng độ mẫu thử.
Cs: Nồng độ mẫu chuẩn
Sx(Hx): Diện tích (chiều cao) của pic chất phân tíeh trong mẫu thử.
Ss(Hs): Diện tích (chiều cao) của pic chất phân tích trong mẫu chuẩn.
+ Chuẩn hóa nhiều điểm
Cách tiến hành: Chuẩn bị 1 dãy chuẩn với các nồng độ chất chuẩn tăng dần rồi
tiến hành sắc ký. Các đáp ứng thu được là các diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi
điểm nồng độ chuẩn. Vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa diện tích s (hoặc chiều
cao H) của pic với nồng độ của chất chuẩn. Sử dụng đoạn tuyến tính của đường
chuẩn để tính toán nồng độ của chất càn xác định. Có thể tính theo 2 cách:
- Áp dữ liệu diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất thử vào đường chuẩn sẽ suy
ra được nồng độ của nó.
- Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích pic
(hoặc chiều cao) với nồng độ của chất cần xác định.
Y=a+bC
trong đó: Y là diện tích của pic, a là giao điểm của đường chuẩn với trục tung, b là
độ dốc của đưòmg chuẩn, c là nồng độ của chất thử.
Dựa vào phương trình hồi quy này ta tính được nồng độ của chất thử.
F - a
Chú Ỷ. Độ lớn của diện tích hoặc chiều cao pic mẫu thử phải nằm trong đoạn
tuyến tính của đường chuẩn.
- 14-
1.4. VÀI NÉT VỀ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHÔ (LC-MS) [1]
- LC-MS là kỹ thuật phân tích dựa trên sự kết họfp sắc ký lỏng hiệu năng cao và

phân tích khối phổ, phương pháp được hiểu là hỗn họp chất phân tích sau khi tách
ra khỏi cột sẽ đi qua một đường truyền đến đầu dò khối phổ. Cột sắc ký lỏng cho
phép tách chất cần quan tâm, khối phổ cho phép tách ion cần quan tâm và cho biết
phân tử lượng của chất phân tích. Một hệ thống LC- MS sẽ phân mảnh ion mẹ thành
các ion con và tách các ion con để định danh và định lượng.
- Một hệ LC- MS cơ bản gồm: hệ thống bơm sắc ký lỏng, bộ phận tiêm mẫu, cột
sắc ký, đầu dò khối phổ.
1.4.1. Khối phổ
- Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của
các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng
và điện tích (m/z) của chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích
của chúng như loại bỏ electron, proton hóa, Các ion tạo thành này được tách theo
tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân
tử của hợp chất.
- Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, thiết bị
phân tích và detector. Trước hết, các mẫu được ion hóa trong nguồn ion, sau đó đưa
vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z. Các tín hiệu thu được sẽ
chuyển vào máy tính để xử lý và lưu trữ.
1.4.1.1. Nguồn ion (lon source)
- Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ được dẫn tới nguồn ion để chuyển
thành dạng hơi và được ion hóa nguyên tử.
- Một số kĩ thuật ion hóa được sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ như;
+ lon hóa phun điện tử (electrospray ionization - ESI).
+ lon hóa hóa học ở áp suất Idií quyển (atmospheric-pressure chemical ionization -
APCI).
+ lon hóa bắn phá nguyên tử nhanh (fast-atom bombardment - FAB).
- 15 -
I.4.I.2. Thiết bị phân tích khối phổ (Mass Analyzer)
Tách các ion theo tỷ số m/z. Các ion được gia tốc và tách riêng nhờ tác dụng của
từ trường, điện trường để đi đến detector. Có thể phân bộ phân tích khối thành 4

loại:
- Bộ phân tích từ (Magnetic Analyser )
- Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole)
- Bộ phân tích thời gian bay (Time of Flight Analyser - TOP)
- Bộ phân tích cộng hưởng ion cyclotron (Ion cyclotron resonance analyser - ICR).
Trong đề tài này, tôi sử dụng máy khổi phổ có bộ phân tích khối là bộ phân tích
tứ cực chập ba.
Bộ tứ cực chập ba (Triple Quadrupole Analyser): Bộ phân tích khối gồm ba bộ
tứ cực nối tiếp nhau. Bộ Q1 và Q3 làm nhiệm vụ phân tích khối, bộ Q2 làm nhiệm
vụ va chạm ion để phân tách thành các mảnh khối nhỏ hơn, đó là ion con.
Hình 1.7. Sơ đồ bộ tứ cực chập ba.
Bộ phân tích tứ cực chập ba còn gọi là Tandem Mass Analyser. Kỹ thuật phân
tích khối phổ kiểu này là khối phổ 2 lần (MS/MS), thường được dùng để khẳng định
cấu trúc các chất hữu cơ và phân tích hỗn họp nhiều thành phần chưa được tinh chế
sạch.
1.4.1.3. Detector
Detector có nhiệm vụ chuyển các ion đến thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử
của máy khối phổ. Hiện có 2 dạng truyền thống:
+ Nhân electron (electron myltiplier).
+ Nhân quang (photomultiplier).
- 1 6 -
1.4.2. Một số kỹ thuật LC-MS
- Kỹ thuật phân tích toàn thang (FULL SCAN)
Cho đầy đủ thông tin về các chất phân tích trong mẫu ion, tuy nhiên phương
pháp này có độ nhạy không cao, nhiễu đường nền có thể lớn.
- Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion (SIM, Selected lon Monitoring)
Kỹ thuật này chỉ cho khối phổ kế nhận diện một ion và ghi sắc đồ theo thời gian,
Kỹ thật SIM nhạy hơn FULL SCAN từ 10 tới 100 lần tùy theo thiết bị.
-K ỹ thuật MS/MS
Trong kỹ thật MS/MS một ion chọn lọc ở chế độ MS lần 1 được phân tích bằng

cách sử dụng năng lượng bẻ gãy, tạo ra một hoặc vài ion con đặc trưng ở chế độ
phân tích MS lần 2. Kỹ thuật MS/MS được sử dụng để tăng độ chọn lọc và tăng độ
nhạy do làm giảm nhiễu đường nền rất đáng kể.
Trong nghiên cứu này, tôi sử dụng kỹ thuật MS/MS để định tính aurantiamid
acetat và ergosterol peroxid có trong hoa cây Gạo.
1.4.3. ứng dụng của phân tích khối phổ trong định tính các chất
- Phân tích khối phổ có thể cho rất chính xác khối lượng các ion phân tử (M
+1)'^, (M+2)’^. Đây là đặc trưng quan trọng của hợp chất hóa học. Bên cạnh đó, xem
xét thêm các pic đồng vị, tỷ số cường độ của chúng cùng với khối lượng của vài
mảnh ion có thể xác định được công thức nguyên của chất phân tích.
- Trong phân tích Dược, thường sử dụng kết nối GC-MS hoặc LC-MS. Có thể so
sánh phổ nghiên cứu với thư viện phổ có trong máy hoặc phổ nghiên cứu với chất
đối chiếu để khẳng định thành phần định tính của mẫu.
- 1 7 -
PHÀN II
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
2.1. ĐỐI TƯỢNG, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ
2.1.1. Đối tượng
Mầu nghiên cứu là hoa của cây Gạo (được làm khô tự nhiên) thu hái tại Hương
Sơn (Mỹ Đức, Hà Nội) và đã được TS. Trần Huy Thái (Viện sinh thái và tài nguyên
sinh học) giám định tên khoa học là: Bombax malabaricum DC, họ Gạo.
(Bombacaceae).
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
2.1.2.1. Hóa chất
- Dung môi loại dùng cho HPLC (Merck, Đức); Methanol, Acetonitril.
- Nước cất hai lần được lọc qua máy lọc.
- Các hợp chất đã phân lập được từ hoa Gạo là aurantiamid acetat và ergosterol
peroxid đã được tinh chế và nhận dạng cấu trúc bằng các phương pháp phổ MS và
NMR.
2.1.2.2. Thiết bị

- Máy sắc ký lỏng khối phổ Shimadzu LC/MS 8030 có kết nối thêm detector
SPD - 20A (có khả năng phân tích UV- VIS trong vùng 190 - 700 nm) của Trung
tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm và Mỹ phẩm Hà Nội.
- Cột sắc ký Zorbax C18 (250 mm; 4,6 mm, 5 í-im) kết hợp cột bảo vệ
Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl; cartridge 15x30 mm ID).
- Máy đo pH 510 CyberScan.
- Cân phân tích Mettler Toledo độ chính xác 0,01 mg.
- Cân kỹ thuật SARTOTIUS.
- Kính hiển vi LEICA CME.
- Máy xác định độ ẩm PRECISA.
- Máy cất quay BUCHI ROTA VAPOR R-200.
- Máy siêu âm Brasonic (Mỹ).
. 20 5 0