Đánh giá một số phương pháp bảo quản lạc nhân nhằm giảm nhiễm độc tố vi nấm aflatoxin

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



LÊ XUÂN TÌNH

ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP
BẢO QUẢN LẠC NHÂN NHẰM GIẢM
NHIỄM ĐỘC TỐ VI NẤM AFLATOXIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ








HÀ NỘI 2015






BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


LÊ XUÂN TÌNH

ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP
BẢO QUẢN LẠC NHÂN NHẰM GIẢM
NHIỄM ĐỘC TỐ VI NẤM AFLATOXIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn :
1. ThS. Lê Thị Phương Thảo
2. ThS. Đặng Thị Ngọc Lan
Nơi thực hiện :
Viện Kiểm nghiệm ATVSTP Quốc gia






HÀ NỘI 2015





LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới ThS. Lê Thị

Phương Thảo, ThS. Đặng Thị Ngọc Lan đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá
trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa phân tích và Độc
chất – Trường Đại học Dược Hà Nội, ban lãnh đạo cùng toàn thể cán bộ nhân viên
Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian nghiên cứu để thực hiện đề tài.
Tôi gửi lời cảm ơn các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội đã quan tâm dìu
dắt và truyền thụ kiến thức cho tôi trong năm năm học vừa qua. Cảm ơn bạn bè thân
thiết luôn sát cánh, nhiệt tình chia sẻ giúp đỡ tôi suốt quá trình học tập và thực hiện
khóa luận.
Cuối cùng, với tất cả lòng biết ơn sâu nặng, tôi xin dành cho bố mẹ, anh chị
những người đã chăm sóc, cổ vũ động viên yêu thương và cảm thông sâu sắc.
Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2015
Sinh viên
Lê Xuân Tình



MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT i
DANH MỤC CÁC BẢNG ii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ iii
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Tổng quan về độc tố vi nấm aflatoxin 2
1.1.1. Chủng nấm sinh độc tố và điều kiện phát sinh độc tố aflatoxin 2
1.1.2. Cấu tạo và tính chất hóa lý của aflatoxin 3
1.1.3. Độc tính aflatoxin 4
1.1.4. Một số phương pháp xác định aflatoxin. 6

1.2. Thực trạng sản xuất, sử dụng lạc và quy định giới hạn nhiễm aflatoxin
trong lạc tại Việt Nam 9
1.2.1. Thực trạng sản xuất và sử dụng lạc tại Việt Nam 9
1.2.2. Thực trạng nhiễm aflatoxin trong lạc tại Việt Nam 10
1.2.3. Giới hạn ô nhiễm aflatoxin trong lạc 11
1.3. Một số nghiên cứu bảo quản lạc nhằm giảm nhiễm aflatoxin 11
1.3.1. Thế giới 11
1.3.2. Việt Nam 13
1.4. Công nghệ bảo quản 13
1.4.1. Bảo quản bằng bao bì 13
1.4.2. Bảo quản bằng điều biến khí quyển 15
Chương II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 16
2.1.1. Thiết bị, dụng cụ 16
2.1.2. Hóa chất, thuốc thử 17
2.2. Đối tượng và nội dung nghiên cứu 17
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu 17


2.2.2. Nội dung nghiên cứu 17
2.3. Phương pháp nghiên cứu 20
2.3.1. Phương pháp bảo quản 20
2.3.2. Phương pháp kiểm nghiệm 20
Chương III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN…………………………………………… 24
3.1. Xác định độ ẩm và mức độ nhiễm độc tố vi nấm aflatoxin của lạc nhân
trước khi bảo quản………………………………………………………… ……24
3.1.1. Xác định độ ẩm của lạc nhân trước khi bảo quản 24
3.1.2. Mức độ nhiễm độc tố vi nấm aflatoxin 25
3.2. Định kỳ đánh giá sự thay đổi độ ẩm và mức độ nhiễm aflatoxin trong các
mẫu lạc nhân sau bảo quản bằng các giải pháp 25

3.2.1. Sự thay đổi độ ẩm 25
3.2.2. Xác định hàm lượng AF 30
3.3. Bàn luận 33
3.3.1. Về việc lựa chọn lạc nhân trước khi bảo quản 33
3.3.2. Về chất liệu bảo quản lạc nhân 34
3.3.3. Về thay đổi điều kiện môi trường bảo quản lạc nhân 34
3.3.4. So sánh phương pháp bảo quản truyền thống với phương pháp mới 35
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36
KẾT LUẬN
KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC




DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Tiếng Việt
Tiếng Anh
AF
Aflatoxin

A. favus

Aspergillus flavus
AFB1
Aflatoxin B
1

AFB2
Aflatoxin B
2

AFG1
Aflatoxin G
1

AFG2
Aflatoxin G
2

AFM1
Aflatoxin M
1

AFM2
Aflatoxin M
2

A. parasticus

Aspergillus parasticus
BNNPTNT
Bộ Nông nghiệp và Phát triển
nông thôn

BYT
Bộ Y Tế

DON
Deoxynivalenol

ELISA

Enzyme-linked immunosorbent
assay
FAO
Tổ chức Nông lương thế giới
Food and Agriculture
Organization of the United
Nations
FBs
Fumonisins

HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
High performance liquid
chromatography
IARC
Cơ quan Nghiên cứu Ung thư
Quốc tế
The International Agency for
Research on Cancer
ICRISAT
Viện Nghiên cứu cây trồng
vùng bán khô hạn nhiệt đới
quốc tế
The International Crops Research

Institute for the Semi-Arid-
Tropics
KPH
Không phát hiện



KQĐ
Không quy định

LC
Sắc ký lỏng
Liquid chromatography
ML
Giới hạn tối đa
Maximum limit
MS
Khối phổ
Mass spectrometry
NIV
Nivalenol

OTA
Ochratoxin A

PAT
Patulin

QCVN
Quy chuẩn Việt Nam

TCVN
Tiêu chuẩn Việt Nam

TLC
Sắc ký lớp mỏng
Thin layer chromatography
UHPLC-
MS/MS
Sắc ký siêu hiệu năng hai lần
khối phổ

USDA
Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ
United States Department of
Agriculture
UV
Detector tử ngoại
Ultra violet
ZEA
Zeralenone





DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng
Nội dung
Trang

Bảng 1.1.
Một số tính chất vật lý của aflatoxin
4
Bảng 1.2.
Sản lượng lạc của Việt Nam
10
Bảng 1.3.
Giới hạn ô nhiễm aflatoxin trong hạt lạc (sau khi đã tách vỏ)
11
Bảng 2.1.
Đóng gói lạc với các vật liệu bao gói và môi trường khí quyển
thay đổi
19
Bảng 2.2.
Mã hóa mẫu lạc nhân trong các điều kiện bảo quản
19
Bảng 2.3.
Phương pháp kiểm nghiệm lạc nhân
20
Bảng 2.4.
Chương trình gradient phân tích aflatoxin
22
Bảng 2.5.
Điều kiện khối phổ thiết bị MS ABI 5500 QQQ
23
Bảng 3.1.
Độ ẩm của mẫu lạc nhân trước khi bảo quản
24
Bảng 3.2.
Độ ẩm của lạc nhân sau 1 tháng bảo quản

25
Bảng 3.3.
Độ ẩm của lạc nhân sau 2 tháng bảo quản
26
Bảng 3.4.
Độ ẩm của lạc nhân sau 3 tháng bảo quản
26
Bảng 3.5.
Độ ẩm của lạc nhân sau 4 tháng bảo quản
27
Bảng 3.6.
Độ ẩm của lạc nhân trong suốt quá trình bảo quản
27
Bảng 3.7.
Sự biến thiên độ ẩm của lạc nhân ở điều kiện bảo quản khác
nhau giữa các tháng
27
Bảng 3.8.
Kết quả aflatoxin trong các mẫu lạc nhân
30
Bảng 3.9.
So sánh phương pháp bảo quản lạc nhân
35
Bảng 4.1.
Hàm lượng AF trong lạc nhân bảo quản bằng các giải pháp
37

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình
Nội dung
Trang
Hình 1.1.
So sánh điều kiện cho sự phát triển và sản xuất aflatoxin bởi A.
flavus và A. parasiticus. Tối ưu cho tăng trưởng (—) và cho sản
xuất aflatoxin ( )
2
Hình 1.2.
Cấu trúc hóa học của một số aflatoxin
3
Hình 1.3.
Mô hình đơn giản hệ thống LC-MS
8
Hình 1.4.
Sơ đồ cấu trúc của máy khối phổ MS
9
Hình 1.5.
Sơ đồ chiến lược quản lý aflatoxin trong lạc trước và sau thu
hoạch
12
Hình 3.1.
Sự thay đổi độ ẩm của lạc nhân đã được lựa chọn và lạc nhân
chưa được chọn lựa cùng bảo quản trong bao đay điều kiện môi
trường không khí thường
28

Hình 3.2.
Sự thay đổi độ ẩm của lạc nhân trong các điều kiện bảo quản
khác nhau tại các thời điểm khác nhau
29
Hình 3.3.
Hàm lượng AF trong các mẫu lạc nhân
32



1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày, có nguồn gốc từ
Nam Mỹ được trồng rộng rãi trên khắp đất nước Việt Nam cho năng suất và hiệu
quả kinh tế cao. Hạt lạc là nguồn cung cấp năng lượng (573 kcal/100g), bổ sung
đạm và chất béo quan trọng cho con người do có chứa 27,5% protein, 44,5% lipit,
15,5% glucid, các nguyên tố vi lượng (kali, phospho, magie, mangan, sắt, natri,
kẽm, đồng), các vitamin (PP, E, B
5
, B
1
, B
2
, B
6
, folat), các axit amin [11]. Do có giá
trị dinh dưỡng cao, từ lâu loài người đã sử dụng lạc như một nguồn thực phẩm và
nguyên liệu cho công nghiệp dầu, magarin, kẹo bánh, nước chấm
Việt Nam có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm là điều kiện thuận lợi cho nấm mốc

phát triển, trong đó có nhiều loài sinh độc tố vi nấm. Trong khi lạc là cơ chất thích
hợp đối với nấm mốc sinh độc tố aflatoxin (AF), chất được Cơ quan Nghiên cứu
Ung thư quốc tế (IARC) phân loại thuộc nhóm có độc tính cao gây ung thư [23]. Do
đó, việc nghiên cứu các giải pháp can thiệp nhằm giảm thiểu nguy cơ ô nhiễm
aflatoxin trong lạc và sản phẩm từ lạc là cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao nhằm
bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.
Trên thế giới đã có các nghiên cứu về giải pháp nhằm hạn chế sự phát triển
của nấm mốc sinh aflatoxin và biện pháp làm giảm hàm lượng aflatoxin trong thực
phẩm. Đối với lạc sau thu hoạch, một số nghiên cứu có dùng hóa chất, hoạt chất từ
thực vật hoặc vi sinh vật, tuy nhiên, các biện pháp này còn hạn chế do ảnh hưởng
đến cảm quan và an toàn thực phẩm của lạc. Lạc trong quá trình bảo quản vẫn tiếp
tục hô hấp, sinh hơi nước tạo môi trường ẩm thuận lợi cho nấm mốc phát triển,
trong đó có nấm sinh độc tố aflatoxin. Do vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề
tài: “Đánh giá một số phương pháp bảo quản lạc nhân nhằm giảm nhiễm độc tố
vi nấm aflatoxin” với mục tiêu của đề tài là:
1. Xác định độ ẩm và mức độ nhiễm độc tố vi nấm aflatoxin của lạc nhân
trước khi bảo quản.
2. Định kỳ đánh giá sự thay đổi độ ẩm và mức độ nhiễm aflatoxin trong các
mẫu lạc nhân sau bảo quản bằng các biện pháp bảo quản khác nhau.
2

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về độc tố vi nấm aflatoxin
Theo số liệu thống kê của tổ chức Nông lương thế giới (FAO), ước tính có
khoảng 25% tổng số lượng ngũ cốc nhiễm độc tố vi nấm mycotoxin sản sinh chủ
yếu bởi chi nấm Aspergillus, Penicillium, Alternaria, Fusarium và Claviceps [21].
Trong số các độc tố vi nấm, aflatoxin được xem như độc tố chính được phát hiện
sớm nhất và được nghiên cứu đầy đủ nhất về mọi phương diện.
1.1.1. Chủng nấm sinh độc tố và điều kiện phát sinh độc tố aflatoxin
1.1.1.1. Chủng nấm sinh độc tố

Aflatoxin được sinh ra chủ yếu bởi hai chủng nấm thuộc loài Aspergillus phân
nhóm Flavi: Aspergillus flavus và Aspergillus parasticus. Trong đó, Aspergillus
flavus là loài nấm gây nhiễm độc phổ biến hơn trong nông nghiệp. Aspergillus
parasiticus sống thích nghi trong môi trường đất có vùng phân bố hạn chế hơn [21].
Aspergillus bombycis, Aspergillus ochraceoroseus, Aspergillus nomius và
Aspergillus pseudotamarii cũng là loài sản xuất aflatoxin nhưng ít gặp hơn [17, 23].
1.1.1.2. Điều kiện phát sinh độc tố
Các điều kiện thuận lợi cho sự nảy mầm và phát triển aflatoxin bởi loài A.
flavus và A. parasitcus qua khảo sát trong ống nghiệm được thể hiện trong hình 1.1.

Hình 1.1: So sánh điều kiện cho sự phát triển và sản xuất aflatoxin bởi A. flavus và
A. parasiticus. Tối ưu cho tăng trưởng (—) và cho sản xuất aflatoxin ( )
Ho
ạt độ nước
Nhiệt độ (ºC)
3

Theo đó, điều kiện tối ưu có sản xuất aflatoxin bởi hai loài này là 33ºC và hoạt
độ nước là 0,99, trong khi điều kiện tối ưu cho tăng trưởng và phát triển là 35ºC và
hoạt độ nước là 0,95 [25].
Aflatoxin có thể phát triển trong các sản phẩm nông nghiệp ở cả giai đoạn
trước và sau thu hoạch nhưng việc ô nhiễm với hàm lượng cao thường liên quan tới
hư hỏng sau thu hoạch, bảo quản ở điều kiện độ ẩm và nhiệt độ cao làm cho nấm
mốc phát triển nhanh. Các sản phẩm thường có nguy cơ bị nhiễm aflatoxin cao nhất
là ngô, lạc và hạt bông [25].
1.1.2. Cấu tạo và tính chất hóa lý của aflatoxin
 Cấu tạo
Các aflatoxin được sinh ra trong tự nhiên chủ yếu gồm 4 loại, kí hiệu AFB1,
AFB2, AFG1, AFG2. Bốn chất được phân biệt trên cơ sở màu phát quang của
chúng dưới tia cực tím (màu xanh – Blue hay màu xanh lá cây – Green) và chuyển

động tương đối của chúng trong sắc ký lớp mỏng. AFM1 và AFM2 là dẫn xuất của
AFB1 và AFB2 tìm thấy trong sữa, thận và gan động vật.

Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của một số aflatoxin
4

 Tính chất hóa lý
Bảng 1.1. Một số tính chất vật lý của aflatoxin [13]
Aflatoxin
Công thức phân tử
Trọng lượng
phân tử
Nhiệt độ
nóng chảy
[α]
D
23
B
1

B
2

G
1

G
2

C

17
H
12
O
6

C
17
H
14
O
6

C
17
H
12
O
7

C
17
H
14
O
7

312
314
328

330
268-269*
286-289*
244-246*
237-240*
–559
–492
–533
–473
* bị phân hủy
1.1.3. Độc tính aflatoxin
 Tác động sinh học (Phụ lục 3)
AFB1 được coi là chất có độc tính mạnh nhất trong các aflatoxin. Hấp thu qua
đường tiêu hóa là giai đoạn đầu tiên của sự xâm nhập AFB1 vào cơ thể với 3 kiểu
hấp thu qua niêm mạc ruột: khuếch tán, hòa tan trong lipid và vận chuyển nhờ
protein mang. Sau đó, AFB1 được vận chuyển trong hệ tuần hoàn nhờ liên kết với
các tế bào máu hoặc protein huyết tương. Sau khi vào gan qua hệ thống tĩnh mạch
cửa, AFB1 tập trung chủ yếu ở gan. Tại đây, AFB1 có sự chuyển hóa phức tạp làm
rối loạn hoạt động bình thường của tế bào.
AFB1 được chuyển hóa chủ yếu qua gan tạo thành AFB1-8,9-exo-epoxide và
8,9-endo-epoxide. Exo-epoxide liên kết với DNA thành sản phẩm cộng 8,9-
dihydro-8-(N7-guanyl)-9-hydroxy AFB1 (AFB1-N7-gua) chiếm ưu thế. AFB1-N7-
gua có thể được chuyển thành 2 thương tổn thứ cấp là vị trí apurinic và 1 vòng ổn
định hơn được mở từ sản phẩm cộng AFB1-FAPY; sau này trong invivo sẽ xuất
hiện bền vững hơn AFB1-N7-gua. Tại gan, aflatoxin được chuyển hóa bởi nhóm
enzyme cytochrome P450 chủ yếu là CYP3A4, 3A5, 3A7, 1A2.
AFM1 là dẫn xuất hydroxyl hóa bậc một của AFB1 được tạo thành trong gan
qua enzyme chuyển hóa cytochrome P450. Động vật có vú ăn thức ăn bị nhiễm
AFB1 bài tiết một lượng chất chuyển hóa được hydroxyl hóa ở vị trí số 4 thành
AFM1 vào trong sữa [21].

5

 Độc tính
Aflatoxin có thể gây ngộ độc cấp tính, xảy ra khi AF xâm nhập vào cơ thể qua
đường ăn uống ở liều lượng cao trong thời gian ngắn. Điều này diễn ra ở một vài
nước đang phát triển ví dụ như ở Kenya năm 2004 đã xảy ra sự bùng nổ nghiêm
trọng độc tính cấp của độc tố afatoxin với 317 ca được phát hiện trong đó 125 ca tử
vong (chiếm 39.4%). Trong ca này, ngô được cung cấp cho người sử dụng bị nhiễm
aflatoxin nồng độ dao động từ 20 đến 8000µg/kg. Độc tính cấp trên người đặc trưng
bởi tình trạng nôn, đau bụng, phù phổi hoặc não, gan nhiễm mỡ. Các triệu chứng
khác bao gồm chán ăn, trầm cảm, vàng da, tiêu chảy và nhạy cảm với ánh sáng [21].
Tuy nhiên, AF gây ra ngộ độc mãn tính nguy hiểm hơn, ngay ở liều lượng
thấp khi tiếp xúc trong thời gian dài. Các aflatoxin được IARC xếp vào nhóm 1
(Phụ lục 2). Mặt khác, có bằng chứng đầy đủ trên động vật thử nghiệm về khả năng
gây ung thư của AFM1 (tiềm năng gây ung thư ước tính thấp hơn xấp xỉ 10 lần so
với AFB1), đang được xếp vào nhóm có khả năng gây ung thư cho người (nhóm
2B) (Phụ lục 2).
Đối với con người, sự tiêu thụ lâu dài thực phẩm bị nhiễm aflatoxin có liên
quan đến các bệnh khác nhau sau [21]:
- Ung thư gan. Có bằng chứng chứng minh sự kết hợp giữa tác động của AF
và bệnh viêm gan virus B và/hoặc C là nguyên nhân gây ra ung thư tế bào biểu mô
gan.
- Ảnh hưởng đến chức năng sinh sản. Aflatoxin gây ảnh hưởng xấu lên chức
năng sinh sản của nam giới, là nguyên nhân của chứng tinh hoàn chậm phát triển,
thoái hóa tinh hoàn, giảm lượng tinh trùng, thay đổi hình thái, giảm kích thước và
trọng lượng tinh hoàn, khả năng phân bào giảm, giảm tỷ lệ phần trăm tinh trùng
sống sót, tinh trùng bất thường gia tăng, sự thoái hóa của tế bào biểu mô và giảm
nồng độ testosterone trong huyết tương.
- Tác động lên hệ thống miễn dịch. Aflatoxin hoạt động như những kháng
nguyên, làm suy giảm khả năng chống nhiễm trùng thứ phát do nấm, ký sinh trùng

và vi khuẩn gây ra. Hoạt động của tế bào lympho B hoặc T bị suy giảm, chức năng
6

thực bào của đại thực bào và bạch cầu trung tính bị suy yếu. Sự tổng hợp các
cytokines chống nhiễm trùng bị thay đổi, tế bào trung gian ly giải NK bị ức chế,
kích hoạt gây ra các nhiễm trùng mãn tính, giảm khả năng miễn dịch khi tiêm chủng
vaccin và làm giảm chức năng miễn dịch trong động vật đang phát triển
- Bệnh lý não với thoái hóa mỡ của nội tạng gần giống với hội chứng Reye.
Vai trò của aflatoxin trong sự phát triển của hội chứng Reye (thoái hóa mỡ, gan và
thận to ra và nhợt nhạt, phù nề và đột quỵ) chưa bao giờ được chứng minh một cách
rõ ràng mặc dù aflatoxin được phát hiện là thường có trong gan của những đứa trẻ
bị chết bởi chứng bệnh này và do đó vấn đề này vẫn còn đang được thảo luận thêm.
- Xơ hóa nhu mô phổi. Người ta cho rằng aflatoxin qua đường hô hấp có thể
gây nguy hiểm.
1.1.4. Một số phương pháp xác định aflatoxin.
1.1.4.1. Phương pháp ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
Shi Chun Pei, Yuan Yuan Zhang, Sergei A. Eremin, Won Jong Lee (2009)
[22] đã dùng phương pháp cạnh tranh gián tiếp ELISA, sử dụng kháng thể đơn dòng
để đo AFM1 trong sữa và sản phẩm của sữa. Giới hạn phát hiện nồng độ của AFM1
là 0,04ng/mL. Mức độ nhiễm AFM1 được đo trong 12 mẫu sữa nguyên liệu, 15
mẫu sữa bột, 104 mẫu sữa nước và bốn mẫu phomat được lấy từ các siêu thị khác
nhau ở Đông Bắc của Trung Quốc.
Kỹ thuật này có ưu điểm: nhanh, đơn giản, tiết kiệm dung môi, đặc hiệu và
khá nhạy cảm nhưng dễ cho kết quả dương tính và âm tính giả. Phân tích ELISA
thuận tiện cho việc xác định đồng thời các chất ô nhiễm trong một số lượng lớn các
mẫu với chi phí thấp và thời gian ngắn. Tuy nhiên, nó không thích hợp để định
lượng các chất ô nhiễm vì nó có thể bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng của nhiều mẫu và có
khả năng để đánh giá quá cao các chất gây ô nhiễm ở nồng độ rất thấp.
1.1.4.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
Jorg Stroka, Robert van Otterdijk, Elke Anklam (2000) [16] đã sử dụng

phương pháp TLC một chiều để xác định AF trong các loại thực phẩm khác nhau
bằng việc sử dụng dung môi chlor. Sử dụng cột ái lực miễn dịch để làm sạch sau khi
7

được chiết với methanol. Các giới hạn định lượng được tìm thấy là thấp hơn so với
giới hạn quy định hiện hành về kiểm soát AF bên ngoài và trong cộng đồng Châu
Âu.
Phương pháp TLC là một phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, không cần đầu
tư lớn. Nó thay thế cho phương pháp HPLC hiện đại nếu không có thiết bị HPLC,
tuy nhiên không thể phát hiện và xác định được AF khi ở nồng độ thấp.
1.1.4.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
TCVN [4, 5] và nhiều tác giả trên thế giới sử dụng HPLC có dẫn xuất sau cột
và làm sạch bằng cột ái lực miễn dịch hoặc làm sạch bằng chiết pha rắn với detector
huỳnh quang và detector UV để xác định các mycotoxin trong các loại ngũ cốc khác
nhau. Cụ thể:
TCVN 7930:2008 [5] Thực phẩm. Xác định AFB1 và AF tổng trong ngũ cốc,
quả có vỏ và sản phẩm của chúng.
Theo Zhaohui Fu, Xueiang Huang, Shungeng Min (2008) [26] đã phát triển
phương pháp sử dụng HPLC với detector UV để xác định aflatoxin B1, B2, G1, G2
trong ngô và lạc. Trong phương pháp này, aflatoxin được chiết với hỗn hợp của
acetonitril trong H
2
O (86:14) và sau đó làm sạch bằng cột ái lực miễn dịch.
Phương pháp HPLC là một phương pháp thông dụng để xác định các hợp chất
hữu cơ. Tuy nhiên, phương pháp có độ nhạy không cao khi sử dụng detector UV,
còn khi sử dụng detector huỳnh quang, phương pháp có độ nhạy tốt hơn nhưng chỉ
có thể nhận biệt chất phân tích thông qua thời gian lưu. Đối với những nền mẫu
phức tạp như thực phẩm, rất khó có thể khẳng định chất cần phân tích bằng phương
pháp này.
1.1.4.4. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

Baifen Huang, Zheng Han, Zengxuan Cai, Youngjiang Wu, Yiping Ren
(2010) [10] sử dụng phương pháp UHPLC-MS/MS để xác định đồng thời các độc
tố aflatoxin B1, B2, G1, G2, M1, M2 trong lạc và các sản phẩm của chúng. Mẫu
được chiết xuất bằng dung dịch acetonitril 84% và làm sạch bằng cách qua cột chiết
pha rắn. Các hợp chất tách ra đã được phát hiện với khối phổ tứ cực 2 lần Water
8

Micromass Quattro Ultima. Phương pháp này có độ tuyến tính R
2
≥0,9990, độ thu
hồi trung bình (74,7 – 86,8%) và độ chính xác (độ lệch chuẩn tương đối ≤ 10,9%).
Nó đã được chứng minh là một phương pháp thích hợp để xác định đồng thời sáu
AF trong lạc và các sản phẩm của chúng.
Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ đặc biệt là phương pháp sắc ký lỏng hai lần
khối phổ, là một kỹ thuật mới được phát triển trong những năm gần đây. Phương
pháp này có nhiều ưu điểm như độ chọn lọc cao, giới hạn phát hiện thấp, thời gian
phân tích nhanh, có thể định lượng đồng thời các chất có thời gian lưu giống nhau
mà phương pháp sắc kí lỏng thông thường không làm được.
Với những ưu điểm của phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ chúng tôi
đã chọn để phân tích độc tố aflatoxin trong lạc nhân để đánh giá một số biện pháp
bảo quản lạc nhân nhằm giảm nhiễm AF.
 Kỹ thuật sắc ký lỏng kết hợp với khối phổ
Mô hình đơn giản của hệ thống LC-MS như ở hình 1.3.

Hình 1.3: Mô hình đơn giản hệ thống LC-MS
- Sắc ký lỏng (LC)
Sắc ký là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha
động là chất lỏng. Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch.
Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động
và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí

hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha
động khác nhau. Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi
nhau. Trong HPLC, pha tĩnh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất
phân tích, đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 3 – 7µm. Pha
động đóng góp một phần rất quan trọng trong việc tách các chất phân tích trong quá
Sắc ký lỏng
Ion hóa
Bộ phân
tích khối
Detector/ Lưu
giữ số liệu
9

trình sắc ký nhất định. Mỗi loại sắc ký đều có pha động rửa giải riêng cho nó để có
được hiệu quả tách tốt.
- Khối phổ (Mass Spectrometry)
Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của
các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng
và điện tích (m/z) của chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích
của chúng như loại bỏ electron, proton hóa, Các ion tạo thành này được tách theo
tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân
tử của hợp chất.

Hình 1.4: Sơ đồ cấu trúc của máy khối phổ MS.
Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, thiết bị
phân tích và bộ phận phát hiện (hình 1.4). Trước hết, các mẫu được ion hóa trong
nguồn ion, sau đó đưa vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z.
Sau đó các ion đi vào bộ phận phát hiện (detector), sẽ được khuếch đại và chuyển
thành tín hiệu. Các tín hiệu thu được sẽ chuyển vào máy tính để xử lí và lưu trữ.
1.2. Thực trạng sản xuất, sử dụng lạc và quy định giới hạn nhiễm

aflatoxin trong lạc tại Việt Nam
1.2.1. Thực trạng sản xuất và sử dụng lạc tại Việt Nam
 Sản xuất
Nguồn ion
Phân tích
khối
Detector
Xử lý và
lưu giữ liệu
Phổ khối
Chân không cao
Tránh ion phân tích va chạm
với ion trong không khí
10

Theo số liệu của Tổng cục Thống kê Việt Nam, diện tích gieo trồng lạc tính
đến ngày 15 tháng 3 năm 2015 đạt 127,3 nghìn hecta đạt 100,5% so với cùng kỳ
năm ngoái [28]. Điều kiện thuận lợi và những cải thiện về giống sẽ góp phần thúc
đẩy năng suất và sản lượng lạc. Tổ chức USDA dự kiến sản lượng lạc năm 2015 của
Việt Nam sẽ tăng lên 550 nghìn tấn. Khu vực trồng lạc chủ yếu tập trung ở bờ biển
Bắc Trung Bộ, khu vực miền núi và trung du Bắc Bộ và Duyên hải Nam Trung Bộ.
Bảng 1.2. Sản lượng lạc của Việt Nam
Năm
2011
2012
2013
2014*
2015*
Diện tích trồng trọt (nghìn héc-ta)
223,8

219,3
216,3
230
240
Sản lượng (tấn/héc-ta)
2,09
2,14
2,28
2.3
2,29
Tổng sản lượng (nghìn tấn)
468,7
468,4
492,6
530
550
Nguồn : Tổng cục thống kê Việt Nam, *số liệu dự báo của USDA
 Tiêu thụ
Tổ chức USDA ước tính tại Việt Nam, lượng lạc được tiêu thụ trong nước
năm 2013 là 710 nghìn tấn. Đến niên vụ 2013/2014 và 2014/2015 các con số này
lần lượt là 740 và 770 nghìn tấn. Phần lớn lạc được sản xuất trong nước cùng với
lạc nhập khẩu chủ yếu cho ngành công nghiệp sản xuất thức ăn nhẹ và bánh kẹo.
Một lượng nhỏ lạc được dành cho tiêu dùng của hộ gia đình hoặc ép lấy dầu [27].
1.2.2. Thực trạng nhiễm aflatoxin trong lạc tại Việt Nam
Ở Việt Nam có một số nghiên cứu về tình hình nhiễm mycotoxin trong thực
phẩm. Trong số các đề tài công bố gần đây như:
Virmani đã tiến hành nghiên cứu ở 7 vùng sinh thái của Việt Nam và đánh giá
mối liên quan của nguy cơ nhiễm aflatoxin tại các vùng sinh thái tại 3 giai đoạn:
(1). Giai đoạn sinh trưởng và phát triển
(2). Giai đoạn thu hoạch và làm khô

(3). Giai đoạn tàng trữ
Nhìn chung kết quả cho thấy nguy cơ nhiễm aflatoxin trong lạc trong quá trình
tàng trữ ở mức độ cao trên toàn Việt Nam [24].
11

Theo khảo sát mức độ nhiễm mycotoxin trong lạc tại tỉnh Bắc Giang của tác
giả Lê Thị Hồng Hảo [1], kết quả phân tích các mẫu lạc nhân cho thấy phát hiện có
nhiễm aflatoxin tổng số chiếm 46,7%, trong đó 6,7% trong số các mẫu nhiễm có kết
quả aflatoxin và AFB1 vượt quá ngưỡng cho phép theo QCVN 8-1:2011/BYT. Mẫu
lạc được lấy và kiểm nghiệm sau thu hoạch khoảng 2 tháng có tỉ lệ mẫu nhiễm AF ít
hơn so với nghiên cứu sau thu hoạch 6 tháng có tỉ lệ nhiễm lên đến 98%. Trong số
các mẫu nhiễm aflatoxin 100% nhiễm AFB1, chỉ duy nhất 1/14 mẫu nhiễm AFB2
chiếm tỷ lệ 3,3%. Có 2 mẫu nhiễm AFG1 chiếm tỉ lệ 6,7%, trong khi không có mẫu
nào nhiễm AFG2.
1.2.3. Giới hạn ô nhiễm aflatoxin trong lạc
Bảng 1.3. Giới hạn ô nhiễm aflatoxin trong hạt lạc (sau khi đã tách vỏ) [3]
Tên thực phẩm
ML (µg/kg)
AFB1
Aflatoxin
tổng số
AFM1
Lạc và các loại hạt có dầu khác sử dụng làm
thực phẩm hoặc làm thành phần nguyên
liệu của thực phẩm (không bao gồm lạc và
các loại hạt có dầu khác sử dụng để sản
xuất dầu thực vật)

Phải sơ chế trước khi sử dụng
8
15
KQĐ
Sử dụng trực tiếp không cần sơ chế
2
4
KQĐ
1.3. Một số nghiên cứu bảo quản lạc nhằm giảm nhiễm aflatoxin
1.3.1. Thế giới
Viện nghiên cứu quốc tế cây lương thực bán khô hạn (ICRISAT) đã ban hành
một quy trình tổng hợp nhằm quản lý nhiễm aflatoxin trong lạc trước và sau thu
hoạch.


12

Hình 1.5: Sơ đồ chiến lược quản lý aflatoxin trong lạc trước và sau thu hoạch [12]
Trên thế giới đã có các nghiên cứu về các giải pháp nhằm hạn chế sự phát
triển của nấm mốc sinh AF và biện pháp làm giảm hàm lượng AF trong lạc sau thu
hoạch như:
 Phân loại
Bước đầu tiên trong bảo quản lạc sau thu hoạch là sàng lọc để loại bỏ những
hạt có nguy cơ bị nhiễm độc tố vi nấm. Theo báo cáo của Dorner (2008) [15], lạc bị
nhiễm AF thường bị đổi màu, bằng cách sử dụng kỹ thuật phân loại màu điện tử
(ECS) có thể làm giảm 70% khả năng nhiễm AF.
 Kiểm soát sinh học
Chủng Bacillus megaterium phân lập ở vùng biển Hoàng Hải phía Đông
Trung Quốc được đánh giá là có khả năng kiểm soát quá trình phân hủy của hạt lạc
gây ra bởi A. flavus trong thử nghiệm in vitro và in vivo. Theo đó, dịch tế bào vi
khuẩn này làm giảm quá trình sinh tổng hợp của AF và sự biểu hiện của gen afIR và

Lựa chọn kiểm soát
Tính kháng bệnh của cây
Nhân giống truyền thống
Chuyển gen chống nấm,
kháng độc tố nấm
Biện pháp sinh học
Trichoderma,
Pseudomonads, chủng
không sinh độc tố
Tập quán trồng cây
Thời vụ, cải tạo đất
Kỹ thuật thu hoạch và sau
thu hoạch

Làm khô và lưu trữ
Chuyển giao công nghệ và vấn đề xã hội
Nghiên cứu và theo dõi khu vực
Nhận thức cộng đồng
Tác động thương mại
Hội đồng tư vấn
Tư vấn cho ngành công nghiệp
Đào tạo
Đánh giá/ Thực thi cấp khu vực
Đề ra biện pháp với từng khu vực
và xúc tiến thực hiện
Quản lý trước và sau thu hoạch
13

afIS (p<0,01) [20].
 Phương pháp hóa học
Nghiên cứu của Passone và cộng sự (2009) [18] cho thấy lạc được xử lý bằng
hỗn hợp các chất Butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene
(BHT) và propyl paraben (PP) giảm đáng kể lượng nấm sinh độc tố A. flavus
(p<0,001).
 Đóng gói điều biến khí quyển
Nghiên cứu của Hagit Navarro và cộng sự (2012) [14] cho thấy lạc được đóng
kín trong điều kiện kiểm soát khí quyển 99% CO
2
với độ ẩm 7% và 8% bảo quản
được chất lượng tốt nhất với số bào tử nấm thấp (≤9,7 ×10
1
CFU/g).
1.3.2. Việt Nam
Nghiên cứu của tác giả Nguyễn Hiền Trang (2012) về việc sử dụng chế phẩm

sinh học Trichoderma để hạn chế nấm mốc vàng A. flavus cho thấy có kết quả hàm
lượng AF trong các mẫu nghiên cứu thấp hơn ngưỡng cho phép [9].
Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Thắng (2011) [8] về ảnh hưởng của công
nghệ sau thu hoạch tới sự phát triển của nấm mốc A. flavus và khả năng sinh độc
tốaflatoxin ở lạc cho thấy lạc phơi nắng bảo quản an toàn hơn lạc sấy, lạc có độ ẩm
10 - 12% bảo quản tốt hơn so với lạc có độ ẩm 14 - 16%; Lạc bảo quản mát sau 6
tháng có hàm lượng AF thấp hơn lạc bảo quản thường, lạc bảo quản bao hai lớp có
hàm lượng AF nhiễm cao hơn lạc bảo quản bằng bồ cót và bao dứa ở cùng điều
kiện.
1.4. Công nghệ bảo quản
1.4.1. Bảo quản bằng bao bì
Bao bì chứa đựng thực phẩm không chỉ có chức năng vận chuyển, chứa đựng
mà còn là phương tiện quan trọng để giữ gìn nguyên vẹn số lượng và chất lượng sản
phẩm. Bao bì chứa đựng có thể giúp sản phẩm kéo dài thời hạn sử dụng sản phẩm,
duy trì chất lượng và an toàn thực phẩm, chống lại các yếu tác động môi trường, các
nguy cơ ô nhiễm hoá học, vật lý và sinh học. Bao bì chứa đựng thực phẩm có thể có
nguồn gốc nguyên liệu từ thuỷ tinh, kim loại, nhựa Trong bảo quản lạc các dụng
14

cụ và vật liệu chứa đựng thông thường đối với hộ dân là bao tải, bao nilon, bao tải
lót nilon hoặc với các hộ gia đình chứa ít lạc thì đựng trong chum, vại, lọ
 Màng bao PE
- Là chất trùng hợp của Etylen, được sản xuất đầu tiên ở Anh – 1933 (sử dụng
rộng rãi trong lĩnh vực bao gói vào những năm 50) và sử dụng nhiều nhất trong lĩnh
vực bao gói.
- Mạch phân tử không có cực, không có nhóm thế nên độ bền cơ học kém,
nhưng chịu được nhiệt độ thấp, không độc.
- Do PE có khoảng mềm dẻo rộng, đồng thời ở nhiệt độ cao bị nóng chảy
chậm nên khi làm kín bằng phương pháp hàn nóng tạo ra mối ghép khá bền và kín.
- PE chịu được tác động của axit hữu cơ, vô cơ (trừ loại đậm đặc khả năng

ôxy hóa cao), các bazơ mạnh, cồn dưới 70º , không chịu Cl
2
, Br
2
và I
2
bị hấp thụ, ít
chịu các loại dầu, hydrocarbon, xăng, bị phồng trong môi trương toluen,
cacbontetrachlorid.
- PE thấm khí (O
2
, CO
2
, SO
2
), thấm mùi, nhưng ít thấm hơi nước.
- Khả năng bám dính các vật liệu trên bề mặt kém, do đó màng PE thường
phải được xử lý bề mặt trước khi in (bằng các tác nhân ôxy hoá hoặc hồ quang).
 Màng bao PP (polypropylen)
- Là sản phẩm của phản ứng trùng hợp propylen tạo polymer có tính bền cơ
học cao, khá cứng vững, không mềm dẻo như PE, không bị kéo giãn dài do đó được
chế tạo thành sợi. Đặc biệt khả năng bị xé rách dễ dàng khi có một vết cắt hoặc một
vết thủng nhỏ.
- Trong suốt, độ bền cơ học cao cho khả năng in ấn rõ nét.
- Chịu được nhiệt độ cao hơn 100ºC.
- Có tính chống thấm O
2
, hơi nước, dầu mỡ và các khí khác.
Nghiên cứu của Mutegi về ảnh hưởng của điều kiện bảo quản đến chất lượng
và sự ô nhiễm aflatoxin trong lạc ở Kenya cho thấy lạc bảo quản sau 6 tháng trong

bao đay bị nhiễm aflatoxin thấp hơn lạc bảo quản trong bao polyethylen và
polypropylene [11]. Trong nghiên cứu này, đề tài dùng bao đay bảo quản như mẫu
15

chứng, còn loại bao bì túi PP được sử dụng để thay đổi môi trường khí quyển trong
bao gói.
1.4.2. Bảo quản bằng điều biến khí quyển
Đóng gói trong môi trường khí điều biến (MAP – Modified Atmosphere
Packaging) là kỹ thuật mà thực phẩm chứa trong một bao gói có khí quyển trong
bao gói đó đã thay đổi hoặc thay thế các thành phần: cacbon dioxit, ôxy, nitơ, hơi
nước và các khí lượng vết. Quá trình này hạn chế hoạt động của vi sinh vật cũng
như sinh hóa. Sự điều biến này được thực hiện bằng cách bơm khí vào bao gói -
không khí thoát ra và thay thế bằng hỗn hợp khí đã được kiểm soát.
Việc biến đổi khí quyển có thể đạt được bằng cách chủ động hoặc bị động.
Biến đổi chủ động liên quan đến việc thay thế hỗn hợp khí thích hợp và kiểm soát
được. Biến đổi bị động xảy ra như kết quả của quá trình hô hấp thực phẩm và/ hoặc
sự trao đổi chất của vi sinh vật gắn liền với thực phẩm. Sự thấm khí qua màng phụ
thuộc vào bản chất của màng và nhiệt độ bảo quản, đồng thời ảnh hưởng bởi thành
phần của khí quyển tạo nên.
Trong quá trình bảo quản lạc, quá trình hô hấp vẫn tiếp tục xảy ra và sinh hơi
nước nhờ sự có mặt của ôxy, do đó ở điều kiện môi trường không khí thông thường
chính quá trình hô hấp làm tăng nhiệt độ, độ ẩm của lạc và là điều kiện thuận lợi
cho nấm mốc phát triển. Do vậy đề tài lựu chọn các biện pháp bảo quản đóng túi:
hút chân không, thay đổi môi trường khí bằng khí nitơ.



16

Chương II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Thiết bị, dụng cụ
- Bao bì: bao đay, túi PP
- Đóng gói với môi trường không khí, khí N
2
, máy đóng túi hút chân không.
- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS bao gồm: HPLC 20 AXL của
Shimadzu và khối phổ ABI 5500 QQQ của Aplied Biosystem: Bộ phận bơm dung
môi, bộ loại khí, bộ phận điều nhiệt và detector MS.
- Cột sắc ký InerSustain C18 (150mm×4,6mm, 5µm) và tiền cột.
- Cột SPE – Si.
- Cân phân tích Metter Toledo (thang đọc tới 0,1mg và 0,01mg).
- Cân kỹ thuật XT1200c chính xác 0,01g.
- Máy cô quay chân không (Eyala).
- Bộ chiết pha rắn (Sulpelco).
- Bộ thổi khô (OA-Sys).
- Máy lắc ngang IKA MLBN001.
- Máy rung siêu âm.
- Dụng cụ thủy tinh: Phễu chiết 500mL, bình định mức 1000 mL, cốc có mỏ,
ống đong 100mL, ống nghiệm thủy tinh có nắp 6mL, bình nón 250mL và 100mL,
bình cô quay 100mL và 250mL, bình nút mài 500mL, vial loại 1,8mL có nắp đậy.
- Phễu, giấy lọc, màng lọc cỡ 0,45µm.
- Pipet 1, 2, 5, 10, 50mL; pipet pasteur, micropipet 20 -200µL, 100-1000µL
và đầu côn tương ứng.
- Tủ sấy CE3G-2-Shellab TS04.
- Chén cân sứ có nắp đậy, kẹp gắp.
- Bình hút ẩm.
- Máy đồng nhất mẫu Phillip, dụng cụ cắt mẫu.