Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây thổ hoàng liên thalictrum foliolosum DC

TRƯỜ
NG Đ
NGUY
NGHIÊN CỨ
U Đ
THÀNH PHẦ
N HÓA H
HOÀNG LIÊN
FOLIOLOSUM
KHÓA LU


BỘ Y TẾ
NG Đ
ẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



NGUY
ỄN THỊ LƯƠNG



U Đ
ẶC ĐIỂM THỰ
C V
N HÓA H
ỌC CỦ
A CÂY TH
HOÀNG LIÊN

-
THALICTRUM
FOLIOLOSUM
DC.


KHÓA LU
ẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC S
Ĩ





HÀ NỘI - 2015

C V
ẬT VÀ
A CÂY TH
Ổ
THALICTRUM
Ĩ



BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ LƯƠNG



NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ
THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY THỔ
HOÀNG LIÊN -THALICTRUM
FOLIOLOSUM DC.


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ



N
gười hướng dẫn:
TS.Hoàng Quỳnh Hoa
Nơi thực hiện:
Bộ môn Thực Vật


HÀ NỘI - 2015





LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành
tới TS. Hoàng Quỳnh Hoa, người Thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và

tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Người không
ngại vất vả giúp tôi vượt qua những ngày khó khăn nhất để tôi trưởng thành hơn.
Tôi xin bày tỏ lòng chân thành cảm ơn tới:
- PGS. TS. Trần Văn Ơn, PGS. TS. Nguyễn Thu Hằng, ThS. Nghiêm Đức Trọng,
ThS. Nguyễn Hương Giang, DS. Chu Thị Thoa và tập thể giảng viên, kỹ thuật viên Bộ
môn Thực vật đã hết lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận.
- DS. Nguyễn Thị Thùy Linh, DS. Phạm Thị Linh Giang, DS. Tạ Khắc Công,
DS. Vũ Lê Thu và các anh chị đã tham gia nghiên cứu và làm khóa luận tại bộ môn, đã
giúp đỡ, chỉ bảo cho tôi rất nhiều kinh nghiệm trong quá trình nghiên cứu khoa học tại
bộ môn.
- Các bộ môn Dược Cổ Truyền. Dược liệu. Hóa sinh, Hóa phân tích, Hóa vô cơ,
Bào chế… đã tạo điều kiện cho tôi được thực hiện đề tài.
- Các bạn Bùi Thanh Loan, Nguyễn Thị Ngọc Huyền, Lương Thị Lan, Nguyễn
Đoàn Thoan, Nguyễn Thanh Tùng đã chia sẻ cùng tôi những lúc khó khăn.
- Bạn Lê Tùng Sơn đã luôn góp ý giúp tôi hoàn thiện mình hơn.
- Các bạn khóa 65 và khoá 66 cùng nghiên cứu và làm đề tài tại bộ môn đã
động viên tôi trong thời gian nghiên cứu khoa học tại bộ môn.
- Em Nguyễn Đình Tuấn luôn nhắc nhở và cổ vũ tôi.
Tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất tới những người thân, anh chị, bạn bè
thân của tôi vẫn luôn bên tôi, hỏi thăm quan quan tâm tôi.
Và tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban giám hiệu, các
thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dìu dắt tôi trong suốt 5
năm học qua để tôi có được ngày hôm nay.
Hà Nội, 14 tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Nguyễn Thị Lương


DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Br
Berberin
Dd
Dung dịch
HPLC
High Performance Liquid Chromatography
HPTLC
High Performance Thin Layer Chromatigraphy
IR
Infrared Radiation
MS
Mass spectrometry
NMR
Nuclear magnetic resonance
P. t. l
Phân tử lượng
SKLM
Sắc ký lớp mỏng
STT
Số thứ tự
TLC
Thin Layer Chromatography
TN
Thí nghiệm
TT
Thuốc Thử
UV
Ultraviolet

DANH MỤC CÁC BẢNG
STT

Bảng Tên bảng
Trang
1
Bảng 2.1.
Các dãy nồng độ của dung dịch mẫu chuẩn
18
2
Bảng 3.1.
Kết quả định tính các nhóm hợp chất trong dược
liệu bằng phản ứng hoá học
25
3
Bảng 3.2.
Khoảng nồng độ lựa chọn
29
4
Bảng 3.3.
Khảo sát độ pha loãng

31
5
Bảng 3.4.
Nồng độ Berberin chuẩn và diện tích pic đáp ứng
33
6
Bảng 3.5.
Giá trị R
f
và diện tích pic của các vết 34
7
Bảng 3.6.
Kết quả bán định lượng Berberin bằng HPTLC 35













DANH MỤC CÁC HÌNH

STT Hình Tên hình Trang
1

Hình 2.1. Hình ảnh hệ thống máy sắc ký HPTLC 12
2
Hình 2.2.
Sơ đồ định tính các nhóm hợp chất bằng phản
ứng hóa học
15
3
Hình 3.1. Ảnh mẫu nghiên cứu 21
4
Hình 3.2. Vi phẫu rễ Thổ hoàng liên 23
5
Hình 3.3. Đặc điểm bột dược liệu 24
6
Hình 3.4.
Các hình ảnh sắc ký đồ dung dịch alcaloid với
các hệ dung môi khác nhau ở bước sóng 366 nm
27
7
Hình 3.5.
Hình ảnh sắc ký đồ dung dịch alcaloid toàn phần
ở hệ IV
28
8
Hình 3.6. Đường chuẩn dãy 1 29
9
Hình 3.7. Đường chuẩn dãy 2 30
10
Hình 3.8. Đường chuẩn dãy 3 30
11
Hình 3.9. Đồ thị khảo sát độ pha loãng 31

12
Hình 3.10.
Kết quả chồng pic của mẫu trắng (1), mẫu thử
(2), mẫu chuẩn (3).
32
13
Hình 3.11. Mối liên hệ giữa nồng độ và diện tích pic 33
14
Hình 4.1.
Hình ảnh Thalictrum foliolosum DC. (A; C; E)
và Thalictrum ichangensis Lecoyer ex Oliv. (B;
D; C)
36






MỤC LỤC
TÊN MỤC Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2

1.1. VỀ THỰC VẬT 2

1.1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm của chi Thalictrum L. 2

1.1.2. Loài Thalictrum foliolosum DC. 3

1.2. VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 4

1.3. BỘ PHẬN DÙNG 5

1.4. TÁC DỤNG DƯỢC LÝ 5

1.4.1. Tác dụng kháng khuẩn – kháng viêm 5

1.4.2. Tác dụng hạ nhiệt 6

1.4.3. Độc tính cấp 6

1.5. CÔNG DỤNG 6

1.6. VÀI NÉT VỀ BERBERIN 6

1.6.1. Công thức hoá học và nguồn gốc của berberin 6

1.6.2. Tác dụng sinh học của berberin 7

1.6.3. Chỉ định của berberin 8

1.6.4. Chống chị định 8

1.6.5. Dạng thuốc và hàm lượng 8

1.6.6. Định lượng Berberin 8

1.7. ỨNG DỤNG CỦA HPTLC TRONG NGHIÊN CỨU DƯỢC LIỆU 9

1.7.1. Định tính 9



1.7.2. Định lượng 10

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 12

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 12

2.1.2. Hóa chất 12

2.1.3. Máy móc và dụng cụ nghiên cứu 12

2.2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.2.1. Nội dung nghiên cứu 13

2.2.2. Phương pháp nghiên cứu 13

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 21

3.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 21

3.1.1. Đặc điểm hình thái thực vật 21

3.1.2. Đặc điểm cấu tạo giải phẫu 22

3.1.3. Đặc điểm bột Thổ hoàng liên 23

3.2. ĐỊNH TÍNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC 24

3.2.1. Định tính sơ bộ bằng phản ứng hóa học 24

3.2.2. Định tính Berberin và Palmatin bắng sắc ký lớp mỏng 26

3.3. BÁN ĐỊNH LƯỢNG BERBERIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPTLC 28

3.3.1. Chiết alcaloid toàn phần: 28

3.3.2. Khảo sát lựa chọn dãy nồng độ berberin chuẩn 28

3.3.3. Khảo sát lựa chọn độ pha loãng cho dung dich thử 31

3.3.4. Lựa chọn các điều kiện triển khai HPTLC 31

3.3.5 Thẩm định phương pháp bán định lượng 31

3.3.6. Kết quả bán định lượng Berberin bằng phương pháp HPTLC 34

BÀN LUẬN 36

4.1. VỀ THỰC VẬT 36

4.2. VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 37



4.2.1. Về định tính các nhóm chất chính 37

4.2.2. Về định tính alcaloid 37

4.3. VỀ BÁN ĐỊNH LƯỢNG BERBERIN BĂNG PHƯƠNG PHÁP HPTLC . 37

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1



ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay,Berberin được biết đến là một alcaloid có nhiều tác dụng chữa bệnh
như: Bệnh đường tiêu hóa (tiêu chảy, viêm dạ dày ruột),tiểu đường, bệnh tim mạch
(tăng lipid máu, hạ huyết áp), các tình trạng viêm, điều trị ung thư
,[24],[25],[29],[31], [36].Các tác dụng này đã được nghiên cứu, chứng minh và được
ứng dụng rộng rãi trên lâm sàng.
Berberin được tìm thấy trong 150 loài thuộc 23 chi và 7 họ thực vật khác nhau.
Ở Việt Nam, các họ thường chứa berberin làhọ Hoàng liên (Ranunculaceae), họ
Hoàng liên gai (Berberidaceae), họ Tiết dê (Menispermaceae), họ Cam (Ruta-
ceae)[17], họ Thuốc phiện (Papaveracae)[8]. Với nhiều tác dụng của Berberin, các
nguồn dược liệu chứa Berberin đã được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều trong y học

cổ truyền và y học hiện đại.
Thổ hoàng liên -Thalictrum foliolosum DC. thuộc họ Hoàng liên- Ranuncula-
ceae được xếp vào diện những cây thuốc quý hiếm có hàm lượng berberin cao[1].Do
nạn phá rừng làm nương rẫy và thường xuyên bị khai thác quá mức làm thuốc nên
hiện nayThổ hoàng liên đã được xếp vào diện những cây thuốc có nguy cơ bị tuyệt
chủng.Những nghiên cứu về Thổ hoàng liên chỉ tập trung chủ yếu vào bảo tồn và
nhân giống[16].
Trong khuôn khổ đề tài cấp Nhà nước về đa dạng di truyền các dược liệu chứa
Berberin ở Việt Nam, đề tài "Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học
của cây Thổ hoàng liên - Thalictrum foliolosum DC.”thu hái tại Sơn Lađược thực
hiện với 3 mục tiêu:
1. Nghiên cứu đặc điểm thực vậtvà giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu.
2. Định tính thành phần alcaloid chính trong dược liệu bằng phản ứng hóa học và sắc ký
lớp mỏng.
3. Bán định lượng Berberin trong cây Thổ hoàng liênThalictrum foliolosum bằng
phương pháp HPTLC.

2



CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. VỀ THỰC VẬT
1.1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm của chi ThalictrumL.
1.1.1.1. Vị trí phân loại
Theo một số tài liệu phân loại, chi Thalictrum được xếp vào vị trí phân loại như
sau:
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngoc Lan (Magoliopsida)
Phân lớp Hoàng liên (Ranunculidae)

Bộ Hoàng liên (Ranuculales)
Họ Hoàng liên (Ranuculaceae)
Chi Thailictrum L.[5],[37].
Thalictrum L. là một chi lớn, gồm khoảng 200 loài, phân bố ở vùng ôn đới Bắc
bán cầu, một số phân bố ở Nam Mỹ, Nam Phi hoặc vùng nhiệt đới núi cao châu Á. Ở
Trung Quốc có 70 loài, Đài Loan 6 loài, Ấn Độ gần 50 loài. Riêng Việt Nam, theo các
tài liệu ghi nhận có 2 loài, đó là T. foliosum DC. và T. ichangense Lecoy ex
Oliv.[9],[14],[22],[37].
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Thalictrum L.
Cây cỏ sống nhiều năm. Thân rễ hoá gỗ có thịt màu vàng hoặc rễ củ. Lá mọc ở
gốc hoặc trên cành, lá có cuống hoặc không cuống, lá mọc ở thân thường so le,lá kép
hình lông chim, ít khi lá đơn, lá chét hình tim, hình trứng hoặc hình mác, mép nguyên
hoặc khía răng. Cụm hoa ở đầu cành hay nách lá, cụm hoa xim hoặc chùm, nhiều hoa
nhỏ,lá bắc 2, 3 hoặc 6 – 9. Hoa thường lưỡng tính. Đài 4 – 10, màu xanh vàng hoặc
tím, hình mác hoặc hình thìa, không tồn tại cùng quả; không có tràng; bộ nhị nhiều; bộ
nhuỵ gồm 4 – 6 hoặc nhiều lá noãn, 1 noãn. Quả đóng [5], [37].
3



1.1.2. Loài Thalictrum foliolosum DC.
1.1.2.1. Khóa phân loại xác định loài Thalictrum foliolosum DC. theo Thực vật chí
Trung Quốc
Thực vật chí Trung Quốc đã xác định Thalictrumfoliosum DC. dựa trên khoá
như sau [37]:
1.b Lá kép lông chim hoặc chụm 3 (gân)
2.b Hoa luôn luôn lưỡng tính, không bao giờ đơn tính,núm nhụy không bao
giờ hình roi, hiếm khi dài hơn bầu nhụy
3.b Lá chét hình trứng, dạng trứng ngược, hoặc hình cầu, thường có dạng thùy
4.b Lá chét không hình khiên, cuống nhỏ đính vào gốc

5.b Hoa từ lác đác đến nhiều, cuối cụm hoa
6.b Cụm hoa xim, luôn có lá trên thân cây
7.b Cây nhẵn nhụi
30.b Lá thường có hoặc khuyết, lá trên thân kép hình lông chim 2-4; cụm hoa
từ ít đến nhiều hoa; đài hoa hồng, xanh hoặc trắng
31.b Vòi nhụy thẳng đứng, không có túi, đầu nhụy dễ thấy hoặc hiếm khi
không thấy
46.b Đầu nhụy dày hơn vói nhụy, thường có cánh
48.b Lá trên thân ở xa trung tâm không có chồi ở nách
49.b Chỉ nhị dài nhọn hoặc chỉ hơi mở rộng ở biên
65.b Đầu nhụy có cánh
69.b Lá chét có dạng thùy hoặc mép lá có răng cưa
70.b Đầu nhụy không thon dài, có cánh rộng
71.b Lá chét dài hơn 6mm
72.b Cụm hoa không trải rộng, tụ lại; đỉnh bao phấn nhọn
73.b Cụm hoa chùy giống cành hoa; quả đóng nhỏ hơn 4mm
74.b Lá trên thân và nhánh cụm hoa trải rộng
75.b Đầu nhụy gần có cánh, dài nhọn hoặc gần tam giác
78.b Gân xa trục ở lá chét vươn lên, chỉ nhị hình sợi tơ
4



79.b Quả đóng không cuống, thân hơi bị lén; lá chét xa trục không vụn khi khô
T. foliolosum
1.1.2.2. Đặc điểm thực vật loài Thalictrum foliosumDC.
Cây thảo sống nhiều năm, cao 50 – 150cm, phân nhánh ở phần trên, không
lông[4],[10].Thân hình trụ, có đốt, nhẵn[1].
Rễ dài 3 – 15 cm, đường kính 0,1 – 0,4 cm, mặt ngoài màu nâu nhạt, có các
nếp nhăn dọc, cong queo, có nhiều đốt khúc khuỷu, xung quanh thân rễ có nhiều rễ

non, rễ chùm nhiều, cứng [1],[6],[15].
Lá 3 lần kép, cuống chung dài 15cm, lá chét bậc ba dài 1– 2,5cm, rộng 0,5 –
1,5cm, không lông, mép trên có răng to[10].Lá kép 3 lần lông chim, dài 28 cm, cuống
chung dài 10 – 20cm, có bẹ. Lá chét mỏng, gần hình tròn hoặc hình trứng, mép khía
tai bèo, kích thước 1 – 1,5 x 0,5 – 1,2 cm[1],[4].
Cụm hoa là chuỳ rộng, phân nhánh nhiều, nụ to 6 – 7mm; lá đài màu trắng và
thường là vàng nhạt hoặc có sọc tía, hình bầu dục, dài 3 – 4,5mm; nhị nhiều, dài 6 –
7mm. Lá noãn 4 – 6[1],[4].
Quả đóng nhỏ, hình thoi, hơi dẹp, dài 3mm, có mỏ, thuôn, nhọn 2 đầu có các
đường vân dọc theo sườn rõ[4],[10].
1.1.2.3. Phân bố
Trên thế giới, Thalictrumfoliosum DC. xuất hiện ở Afghanistan [1], Ấn Độ,
Nêpan, Trung Quốc[1],[4]. Ở Trung quốc, loài này gặp ở các khu vực Tứ Xuyên, Tây
Tạng và Vân Nam với độ cao 1500 – 3200 m[4].
Trong nước, loài Thalictrumfoliosum DC. được phân bố ở Lai Châu (Phong
Thổ, Sìn Hồ), Điện Biên (Tủa Chùa), Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang (Đồng Văn), Vĩnh
Phúc, Sơn la[4],[15],[22].
1.2. VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC
Các nghiên cứu đều cho thấy thành phần chính trong thân rễThổ hoàng liên
làBerberin, palmatin, atrorrhizin và thalictrin[1],[4],[10],[15].
Dược điển Việt Nam có quy định dược liệu Thổ hoàng liên (Thalictrum
foliolosum DC.) phải chứa ít nhất 1% berberin (tính theo dược liệu khô kiệt)[6].
5



Theo S.K Chattopadhyay và cộng sự, từ Thalictrum foliolosum DC. đã phân lập
được mười một alcaloid bao gồm là protoberberin thalifendin, palmatin, berberin, co-
lumbamin, jatrorrhizin, thalidastin, dehydrodiscretamin, benzylisoquinolines rugosion,
tem–betarine, aporphin xanthoplanin và magnoflorin[34].

Theo Harish C.Andolavà cộng sự, các hợp chất đã được tìm thấy ở Thalictrum
foliolosum là N,O,O – trimethylsparsiflorin, 1 hợp chất alcaloid aporphin mới,
thalicarpin bậc 3, thailidasin, thalrugosidin, reticulin, alcaloid magnoflorine bậc 4,
berberinvà palmatin[33].
Theo từ điển cây thuốc Ấn Độ có hơn 60 hợp chất isoquinoline và diterpenoid
alkaloid đã được phân lậptừ cây Thổ hoàng liên [28].
1.3. BỘ PHẬN DÙNG
Rễ và thân rễ thường thu hái vào các tháng 6, 7, 8 là tốt nhất. Vào mùa đông
cây lụi đi, khí hậu lại rét nên khó tìm thấy. Thân rễ đào được lúc trời khô ráo rữa sạch
đất cát, cắt bỏ rễ con và gốc thân rồi phơi hay sấy khô [10], [15],[16].
1.4.TÁC DỤNG DƯỢC LÝ
1.4.1.Tác dụng kháng khuẩn – kháng viêm
Cao khô chiết từ rễ Thổ hoàng liên bằng methanol được thử tác dụng kháng
khuẩn với các chủng vi khuẩn thử là Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus và Streptococcus faecalis.Kết quả
cho thấy: Cao thuốc liều 3000µg có tác dụng tương tự gentamycin 10 μg ; tác dụng
kém hơn Neomycin30 μg trên K. pneumoniae và S. faecalis, nhưng lại tác dụng mạnh
hơn Neomycin 30 μgtrên 3 vi khuẩn còn lại.Liều 2000 μg có tác dụng kém. Liều 1000
μg gần như không có tác dụng. Các nồng độ trên không có tác dụng trên nấm[16].
Dịch chiết Thalictrum foliolosumDC. trong methanol, chloroform, hexane thu
thập từ Nainital, Kumaun Himalaya, Ấn Độ được thử hoạt tính kháng khuẩn với năm
vi khuẩn gây bệnh (vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Bacillussubtilis, Erwinia
chrysanthemi, Escherichia coli và Xanthomonas phaseoli) bằng cách sử dụng phương
pháp đĩa thạch khuếch tán. Kết quả cho thấy dịch chiết methanol và hexane có hoạt
tính cao nhất với tất cả các tác nhân gây bệnh được thử nghiệm tiếp theo là dịch chiết
6



chloroform. Dịch chiết nước hầu như không có tác dụng ức chế trên các vi khuẩn thử

nghiệm[35].
1.4.2. Tác dụng hạ nhiệt
Dịch nước của thân rễ Thalictrum foliolosumđược thử tác dụng hạ nhiệt ở
chuột bạch đã được gây sốt với liều lượng 300, 400, và 500 mg / Kg và được so sánh
với thuốc Paracetamol chuẩn(150mg / kg ). Kết quả các dịch chiết nước của thân rễ
cho thấy khả năng hạ nhiệt đáng kể sau 2 giờ với liều 300 & 400 mg / Kg cơ thể trong
khi liều lượng 500mg / kg đã có hiệu quả trong vòng một giờ so với
Paracetamol[15],[26].
1.4.3. Độc tính cấp
Theo Đỗ Tất Lợi,cao khô chiết bằng ethanol 50% của rễ Thổ hoàng liên thử
trên chuột nhắt trắng tiêm màng bụng có LD 50 =125mg/kg[16].
1.5. CÔNG DỤNG
Rễ Thổ hoàng liên có vị rất đắng, tính hàn, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc,
khu phong[10],[16].
Thổ hoàng liên thường dùng để chữa lỵ, giải nhiệt, đổ máu cam, mất ngủ(Viện
dược liệu). Dùng ngoài để chữa đau mắtvà mụn nhọt [10], trị đau mắt nhặm, viêm ruột
, tiêu chảy, viêm gan, vàng da, tim nhiệt, phổi nhiệt sốt cao [15].
Ở Trung Quốc Thổ hoàng liên được dùng để trị sởi đậu khó mọc[10].
Ở Ấn Độ rễ dùng chữa chứng khó tiêu do mất trương lực cơ và giúp khôi phục
sau những cơn đau cấp tính và dùng đắp trị đau mắt[10].
1.6. VÀI NÉT VỀ BERBERIN
1.6.1. Công thức hoá học và nguồn gốc của berberin
Berberin là một alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin (5,6 dihydro-8,9-
dimethoxy-1,3-dioxa-6a-azoniaindeno (5,6-a) anthracen)
Công thức phân tử C
20
H
18
NO
4

Cl. 2H
2
O P.t.l: 407,9




Berberin đư
ợc phát hiện trong 150 lo
thuộc 23 chi và 7 họ
.Trong đó
Hoàng Liên Gai (
Berberidaceae
họ Thuốc phiện
(Papaveracae)
Berberin thư
ờng có lẫn tạp chất al
Đ
ộ tan của một số muối B
Stt

Muối
1 Br. iodat
2 Br. clohydrat
3 Br. citrat
4 Br. photphat

1.6.2. Tác dụng sinh họ
c c
Berberin có tác d

ụ
khuẩn), thể protozoal
, vi n
sinh trùng số
t rét, kí sinh trùng đư
Berberin
có tác d
hưởng tới sự phát triển
bình th
Berberin cótác d
ụng chống ung th
đường, chống viêm, ch
ống oxy
7




ợc phát hiện trong 150 lo
ài thu
ộc nhiều họ thực vật kh
.Trong đó
Việt Nam các họ
Hoàng Liên (Ranunculaceae), h
Berberidaceae
), họ Tiết D
ê (Menispermaceae), h
(Papaveracae)
chứa berberin[8], [17].
ờng có lẫn tạp chất alcaloid khác như: palmatin, jatrorrhizin

ộ tan của một số muối B
erberin (Hồ Đắc Trinh - 1983)
Độ tan Stt Muối
1 : 2130 5 Br. acetat
1: 500 6 Br. sulfat
1 : 125 7 Br. sulfat acid
1 : 15
c c
ủa berberin
ụ
ng kháng vi trùng như: vi khuẩn (
shigella
, vi n
ấm, candida, virus, nấ
m men, ký sinh trùng gây b
t rét, kí sinh trùng đư
ờng ruột).
có tác d
ụng kìm khuẩn tả và E.coli, đặc biệ
t khi dùng
bình th
ường của hệ vi khuẩn có ích ở ruột[
30
ụng chống ung th
ư, h
ạ glucose máu, chống trầm cảm
ống oxy
hóa[29],[31],[36].
Berberin
ộc nhiều họ thực vật kh

ác nhau
Hoàng Liên (Ranunculaceae), h
ọ
ê (Menispermaceae), h
ọ Cam (Rutaceae),
caloid khác như: palmatin, jatrorrhizin
[7].
Độ tan
1 : 20
1 : 30
1 : 100

shigella
, tụ cầu và liên cầu
m men, ký sinh trùng gây b
ệnh (ký
t khi dùng
không ảnh
30
],[23].
ạ glucose máu, chống trầm cảm
, đái tháo
8



1.6.3. Chỉ định của berberin
Berberin thường được dùng trong các bệnh hội chứng lỵ, viêm ruột, tiêu chảy,
viêm ống mật và đặc biệt là bệnh sỏi mật, vàng da, sốt rét, mụn nhọt.Ngoài ra, berberin
còn được dùng để điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích bên ngoài (do nắng,

gió, lạnh, bụi, khói…), điều trị các bệnh đường sinh dục gây ra bởi Leishmania,
Trichomonas.
1.6.4. Chống chị định
Berberin gây ra co bóp tử cung nên chống chỉ định cho phụ nữ có thai.
Người dị ứng với berberin (rất hiếm gặp).
1.6.5. Dạng thuốc và hàm lượng
Berbein được sử dụng dưới các dạng bào chế sau: Dạng viên nén, viên bao,
viên nang với hàm lượng 10mg, hoặc 50-100mg/viên, thuốc nhỏ mắt,…
1.6.6. Định lượng Berberin
Nhiều phương phápđã sử dụng để xác định hàm lượng Berberin như phương
pháp thể tích (5/13); phương pháp đo quang; phương pháp cân; phương pháp HPLC và
phương pháp HPTLC.Phương pháp HPTLC được sử dụng trong phạm vi đề tài để
đánh giá hàm lượng berberin trong dược liệu.
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là hình thức phát triển nhất của kỹ
thuật SKLM. Thuật ngữ HPTLC bao gồm hệ thống triển khai sắc ký bán tự động :
Máy chấm mẫu tự động (Linomat 5, Nanomat 4, ATS 4), thiết bị triển khai sắc ký
(ADC2), thiết bị soi và chụp ảnh bản mỏng (TLC Visualizer), máy quét vết (TLC
Scanner 3,4) và bản mỏng hiệu năng cao HPTLC [38].
Ưu điểm của phương pháp này so với SKLM thông thường là
 Khả năng phân tách tốt hơn. Ưu điểm này chủ yếu nhờ bản mỏng hiệu năng
cao có kích thước hạt nhỏ hơn, hạt đồng đều hơn, do đó khả năng hấp phụ
của bản mỏng cũng tốt hơn.
 Lượng chất đưa lên bản mỏng ít hơn: với thiết bị tiêm mẫu chính xác và bản
mỏng có khả năng hấp phụ tốt, lượng chất cần cho phân tích là nhỏ hơn.
 Thời gian triển khai ngắn hơn.
9



 Độ lặp lại tốt hơn do gắn với hệ thống máy chấm sắc ký tự động, buồng triển

khai sắc ký, máy quét, chụp ảnh và phần mềm xử lý hình ảnh, số liệu. Các
yếu tố về môi trường, nguyên nhân ảnh hưởng lớn tới kết quả phân tích, được
kiểm soát và hạn chế tới tối đa các thay đổi.
Với những ưu điểm trên HPTLC ngày càng đươc ứng dụng nhiều trong định
tính, định lượng.
1.7. ỨNG DỤNG CỦA HPTLC TRONG NGHIÊN CỨU DƯỢC LIỆU
1.7.1. Định tính
Chứng thực độ tinh khiết của một hợp chất phân lập được: Chấm tương đối đậm
mẫu thử trên ít nhất 3 bản mỏng khác nhau, khai triển với ít nhất 3 hệ dung môi khác
nhau. Nếu cả 3 sắc ký đồ đều cho một vết gọn trong một vùng R
f
= 0,30 – 0,75 thì có
thể sơ bộ kết luận rằng mẫu thử là một chất tinh khiết. Việc khẳng định sự tinh khiết
của mẫu thử sẽ được kiểm tra bằng phương pháp phổ học khác (UV, IR, NMR, MS)
[2].
So sánh với một chất chuẩn: Thực hiện ít nhất trên 3 bản mỏng khác nhau, khai
triển với ít nhất 3 hệ dung môi khác nhau. Trên mỗi bản mỏng chấm ít nhất 3 vết: vết I
(mẫu thử), vết II (mẫu thử + mẫu chuẩn), vết III (mẫu chuẩn). Nếu trên cả 3 sắc ký đồ
mẫu thử và mẫu chuẩn đều đồng nhất (về trị số R
f
, về hình dạng vết, về màu sắc vết
trước và sau khi hiện màu) thì có thể sơ bộ kết luận mẫu thử và mẫu chuẩn là đồng
nhất [2].
Kiểm nghiệm dược liệu: Cùng với một quy trình chiết xuất như nhau, dịch chiết
của mẫu thử dược liệu được chấm song song với dịch chiết của mẫu dược liệu chuẩn
(thực hiện trên 3 bản mỏng khác nhau, không cần chấm trùng). Sau đó so sánh các vết
cùng trên 1 bản mỏng về số vết, R
f
của các vết, hình dạng các vết, màu sắc các vết, tỷ
lệ tương đối giữa các vết… của mẫu dược liệu thử và dược liệu chuẩn [2].

Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu: Bằng một chiết xuất nhất định,
trong các điều kiện sắc ký nhất định, sắc ký đồ của dịch chiết dược liệu là không đổi
về số vết, về trị số R
f
của các vết, hình dạng các vết, màu sắc các vết, tỷ lệ tương đối
10



giữa các vết… Sắc ký đồ được coi là tài liệu không thể thiếu trong công tác xây dựng
tiêu chuẩn kiểm nghiệm các dược liệu[2].
Theo kết quả thống kê trong tài liệu, SKLM là một trong các tiêu chuẩn định
tính có mặt trong hầu hết các chuyên luận dược liệu trong Dược điển. Dược điển thảo
dược Hoa Kỳ có 31 chuyên luận, Dược điển Trung Quốc (2010) có 873 chuyên luận
và con số này trong Dược điển Việt Nam IV là 168. Hình ảnh sắc ký đồ SKLM cho
các vết đặc trưng của dược liệu. Ứng dụng này giúp xây dựng “dấu vân tay” hóa học
của từng dược liệu và từ đó xác định tính đúng của dược liệu, phát hiện sự nhầm lẫn,
giả mạo, đánh giá chất lượng dược liệu.
1.7.2. Định lượng
Dựa trên diện tích hoặc dựa trên cường độ màu (khi phun thuốc thử hoặc khi
soi UV) của các vết xuất hiện trên bản mỏng (đặc biệt là bản mỏng hiệu năng cao), nếu
có mẫu chuẩn tương ứng, có thể bán định lượng một chất (hay một nhóm chất) có
trong mẫu thử. HPTLC được ứng dụng trong bán định lượng bằng phương pháp so
sánh. Một số dung dịch chuẩn đối chiếu có nồng độ khác nhau được pha sẵn. Dựa vào
mối liên hệ giữa nồng độ chất chuẩn đã biết và diện tích pic đáp ứng của chất đó trên
sắc ký đồ để từ đó xây dựng đường chuẩn định lượng. Đo tín hiệu đáp ứng diện tích
pic của chất cần phân tích trong mẫu thử và nội suy nồng độ từ đường chuẩn đã xây
dựng ở trên [2].
Trên thế giới, nhiều lĩnh vực đã ứng dụng HPTLC trong bán định lượng như:
nghiên cứu lâm sàng, thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, công nghiệp, pháp y, môi

trường [11]. Trong nghiên cứu dược liệu, theo xu hướng phát triển các sản phẩm chăm
sóc sức khỏe trên thị trường có nguồn gốc thực vật, định lượng hoạt chất trong dược
liệu bằng HPTLC là một nội dung nghiên cứu được quan tâm phát triển. Năm 2010,
nghiên cứu định lượng berberin bằng HPTLC được tiến hành ở Ấn Độ. Kết quả hàm
lượng berberin là khoảng 4.0%. Thẩm định độ chính xác và độ lặp lại của phương
pháp cho RSD lần lượt là 3.0% và 2.7%[27]. Cũng ứng dụng quy trình trên, năm 2012,
Nguyễn Thị Thu Hằng cũng đã định lượng berberin trong thân và rễ của 1 số cây loài
11



Berberis. bằng phương pháp HPTLC. Kết quả hàm lượng berberin trong mẫu rễ là
3.98% và trong mẫu thân là khoảng 1.6% đến 3.1% [13].

12



CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Thân rễ Thổ hoàng liên thu hái tại xã Co Mạ, huyện Thuận Châu, tỉnh Sơn La
vào thời gian 11/04/2012.
Mẫu nghiên cứu hình thái và giải phẫu được làm tiêu bản cây khô và lưu tại
phòng tiêu bản, Trường Đại học Dược Hà Nội. Mã số tiêu bản là: HNIP/18125/15.
Mẫu nghiên cứu về hoá học được phơi khô, sấy ở 55
o
C – 60
o
C cho tới khi đạt

hàm ẩm ≤ 8%, bảo quản nơi khô ráo thoáng mát.
2.1.2. Hóa chất
Methanol, acid clohydric, ethylacetat, butanol, acid acetic, nước và các thuốc
thử.
Chất chuẩn Berberin chlorid (Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương) hàm lượng
83,7 %, Palmartin chlorid với hàm lượng 96,24%.
2.1.3. Máy móc và dụng cụ nghiên cứu
- Hệ thống máy sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Camag bao gồm máy Linomat 5,
ADC2, TLC Visualizer, phần mềm winCATS, phần mềm VideoScan.

Hình 2.1. Hình ảnh hệ thống máy sắc ký HPTLC
- Tủ sấy WiseVen ® WOF.
- Máy đo hàm ẩm Precisa HA60.
- Cân phân tích Shimadzu (AY220).
- Kính hiển vi màn hình Nikon SMZ 745T.
- Kính lúp soi nổi màn hình Nikon ECLIPSE.
- Bản mỏng HPTLC Silica gel 60 F
254
(Merk) dành cho HPTLC và TLC.
- Bình chiết hồi lưu.
13



- Bình triển khai sắc ký.
- Nồi đun cách thủy.
- Các dụng cụ thủy tinh: cốc có mỏ 50,100 và 200 ml; bình định mức 5, 10, 25,
50,100 ml; pipet 1, 2, 5, 10 ml; đũa thủy tinh; phễu thủy tinh.
2.2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1.Nội dung nghiên cứu

2.2.1.1. Mô tả đặc điểm hình thái và giải phẫu thực vật

Mô tả đặc điểm hình thái mẫu nghiên cứu

Làm vi phẫu rễ, quan sát, mô tả đặc điểm qua kính hiển vi màn hình.

Làm tiêu bản giọt ép soi bột và xác định đặc điểm bột dược liệu qua kính hiển
vi kính hiển vi màn hình Nikon SMZ 745T.
2.2.1.2. Định tính thành phần hóa học

Định tính các nhóm hợp chất chính trong dược liệu bằng phản ứng hóa học.

Định tính berberin và palmatin bằng sắc ký lớp mỏng

Chiết xuất alcaloid toàn phần.

Tiến hành sắc ký lớp mỏng.

Phát hiện vết bằng thiết bị UV-Visualizer và sử lý kết quả bằng phần mềm win-
cat.
2.2.1.3.Bán định lượng Berberin trong cây Thổ hoàng liên -Thalictrum foliolosum
bằng phương pháp HPTLC

Chiết xuất alcaloid toàn phần trong dược liệu.

Khảo sát lựa chọn dãy nồng độ chuẩn.

Khảo sát lựa chọn nồng độ pha loãng dịch chiết.

Lựa chọn các điều kiện triển khai HPTLC.


Thẩm định phương pháp.
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Nghiên cứu về đặc điểm thực vật

Mô tả đặc điểm hình thái bằng phương pháp mô tả phân tích [18]

Làm tiêu bản vi học bằng phương pháp cắt, tẩy nhuộm kép tiêu bản [18]
14




Làm tiêu bản giọt ép soi bột rễ để phân tích đặc điểm bột dược liệu.

Các mẫu được chụp ảnh trên kính hiển vi gắn kết camera Nikon DS Fi2
2.2.2.2. Định tính thành phần hóa học

Định tính bằng phản ứng hóa học
Định tính bằng phản ứng hóa học theo tài liệu Dược liệu học[3]
 Chuẩn bị dược liệu:
Rễ sấy khô ở 60
0
C đến độ ẩm ≤ 8 %, nghiền nhỏ thành bột bằng máy xay.
 Dụng cụ hóa chất
 Dược liệu khô: khoảng 50 g
 Dung môi: Ethanol 90% (500ml), ethanol 25% (50ml), chloroform (250ml),
ether dầu hỏa (20ml), dd H
2
SO

4
5%, dd H
2
SO
4
1N, dd NH
3
6N (20ml).
 Thuốc thử: anhydrit acetic, H
2
SO
4
đặc, bouchardat, dragendoff, mayer, Dd natri
acetat, dd FeCl
3
5%, formol, HCl đặc, gelatin, chì acetat 10%, Dd NaOH 10%,
dd NH
3
đặc, Dd H
2
SO
4
đặc, TT Diazo, TT xanhydrol, acid acetic, bột Mg, octa-
nol, acid picric, chì acetat 30%.
 Dụng cụ: máy xay, bình nón 100ml, 50ml; bình gạn 50ml, 100ml; ống nghiệm
lớn, ống nghiệm nhỏ, pipet, giấy lọc, phễu lọc, kính hiển vi, đèn tử ngoại





Sơ đồ định tính
Hình 2.2. Sơ đồ đị
nh tính các nhóm h
Ghi chú: p/ư: Ph


Định tính
Berberin
15


nh tính các nhóm h
ợp chất bằng phản
ứ
Ghi chú: p/ư: Ph
ản ứng; TT: Thuốc thử
; Dd: dung d
Berberin
và Palmatin bằng sắc ký lớp mỏng

ứ
ng hóa học
; Dd: dung d
ịch.
16



 Chiết xuất alcaloid
Cân chính xác khoảng 4,0000g bột dược liệu. Thêm 50 ml hỗn hợp methanol :

acid hydrochlorid (100:1). Đun hồi lưu cách thủy 30 phút, lọc lấy dịch chiết. Thêm 50
ml hỗn hợp dung môi methanol : acid hydrochlorid (100:1) chiết tiếp 2 lần tương tự.
Tập trung dịch chiết, cất thu hồi dung môi tới cắn. hòa tan trong nước nóng 5 lần, mỗi
lần 15 ml, lọc lấy dịch chiết. Cô cách thủy tới cắn. Hòa tan cắn trong methanol, chuyển
vào bình định mức 100 ml, thêm vừa đủ methanol tới vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc
0,45µm[13],[19],[20].
 Tiến hành sắc ký lớp mỏng
 Chuẩn bị bản mỏng:Bản mỏng TLC silica gel 60 GF
254
(Merck) hoạt hóa ở
110˚C trong 60 phút, sau đó lấy ra để nguội để triển khai sắc ký.
 Chuẩn bị pha động:
Pha động là 1 số hỗn hợp dung môi sau:
- Hệ I: N-butanol: acid acetic: nước (7,0 : 1,0 : 2,0) [19]
- Hệ II: Chloroform: methanol (9,0 : 1,0 ) [19]
- Hệ III: Propanol: nước: acid fomic (90,0 : 8,0 : 0,4) [19], [27]
- Hệ IV: Ethylacetat: n-butanol: acid acetic: nước (1,5 : 5,5 : 1,0 : 2,0)[19]
- Hệ V: Ethylacetat: n-butanol: acid acetic : nước (1,0 : 7,0: 1,0 : 2,0) [13]
- Hệ VI: Toluen: ethyacetat: methanol: n-propanol: amoniac (12,0: 6,0 : 3,0 :
3,0 :1,0)
- Hệ VII: Chloroform: butanol (1,0 : 7,0)
- Hệ VIII: Methanol: nước: amoniac (8,0 : 1,0 :1,0) [32]
- Hệ IX: Chloroform: methanol: amoniac (14,0 : 5,0 : 1,0 ) [32]
 Chuẩn bị dung dịch chuẩn: dung dịch Berberin chuẩn 0.08 % và Palmatin
chuẩn dùng để định tính alcaloid trong các mẫu nghiên cứu.
Hòa tan chính xác 0,0200 g berberin chlorid chuẩn (83,7 %), palmatin chlorid
chuẩn (96,24%) trong methanol, chuyển vào bình định mức 25ml, thêm methanol vừa
đủ tới vạch, lắc đều, lọc. Thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 0,08%.
 Chuẩn bị dịch chấm sắc ký: là dung dịch alcaloid toàn phần pha loãng 100 lần.