Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng bảo vệ gan của cây khúng khéng (hovenia dulcis thumb ) ở cao bằng trên mô hình gây tổn thương gan chuột nhắt trắng bằng paracetamol

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



BÙI THỊ KHÁNH LINH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CÂY
KHÚNG KHÉNG (Hovenia dulcis Thunb.)
Ở CAO BẰNG TRÊN MÔ HÌNH GÂY
TỔN THƯƠNG GAN CHUỘT NHẮT
TRẮNG BẰNG PARACETAMOL

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ



HÀ NỘI – 2015

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI THỊ KHÁNH LINH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CÂY
KHÚNG KHÉNG (Hovenia dulcis Thunb.)
Ở CAO BẰNG TRÊN MÔ HÌNH GÂY
TỔN THƯƠNG GAN CHUỘT NHẮT
TRẮNG BẰNG PARACETAMOL

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ

Người hướng dẫn :
1. TS. Bùi Hồng Cường
2. DS. Trần Thị Phương Liên
Nơi thực hiện :
1. Bộ môn Dược học cổ truyền
2. Viện Dược liệu

HÀ NỘI - 2015
LỜI CẢM ƠN
Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành
nhất tới Thầy TS. Bùi Hồng Cường và DS. Trần Thị Phương Liên – người đã
trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cũng như
động viên, hỗ trợ tôi về mọi mặt từ những bước đầu tiên cho đến khi hoàn thiện
khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Phương Thiện Thương, TS. Phạm Thị
Nguyệt Hằng, DS. Phạm Huy Bách cùng các anh chị cán bộ của Khoa Hóa phân
tích - Tiêu chuẩn, Khoa Dược lý Sinh hóa Viện Dược liệu đã nhiệt tình giúp đỡ
tôi trong thời gian làm thực nghiệm nghiên cứu của đề tài này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn toàn thể các Thầy Cô giáo và các anh chị kỹ
thuật viên Bộ môn Dược học cổ truyền, Trường đại học Dược Hà Nội đã luôn
hỗ trợ kịp thời và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu tại
bộ môn.
Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể
các Thầy Cô giáo Trường đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và các bạn yêu quý của tôi đã luôn
động viên, khích lệ và nhắc nhở, luôn sát cánh bên tôi, là động lực lớn giúp tôi vượt

qua mọi khó khăn.
Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân còn có hạn,
khóa luận này còn có nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy
cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2015.
Tác giả Khóa luận

Bùi Thị Khánh Linh
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2
1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CHI HOVENIA VÀ CÂY KHÚNG KHÉNG
(Hovenia dulcis Thunb.) 2
1.1.1 Vị trí phân loại chi Hovenia 2
1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Hovenia 2
1.1.3 Phân loại chi Hovenia 3
1.1.4 Đặc điểm thực vật và phân bố, sinh thái của cây Khúng khéng
(Hovenia dulcis Thunb.) 3
1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI TRONG CHI
HOVENIA 4
1.2.1 Thành phần hóa học của Hovenia dulcis 4
1.2.1 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học các loài cùng chi Hovenia 7
1.3 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI TRONG CHI
HOVENIA 7
1.3.1 Tác dụng sinh học của Hovenia dulcis 7
1.3.2 Tác dụng sinh học của Hovenia acerba và Hovenia trichocarpa 11

1.4 CÔNG DỤNG THEO DÂN GIAN, Y HỌC CỔ TRUYỀN CỦA
KHÚNG KHÉNG (Hovenia dulcis Thunb.) 11
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU 13
2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 13
2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 14
2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 15
2.3.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học: 15
2.3.2 Nghiên cứu về tác dụng sinh học: 15
2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
2.4.1 Nghiên cứu thành phần hóa học bằng phản ứng hóa học. 15
2.4.2 Nghiên cứu thành phần hóa học bằng SKLM 16
2.4.3 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây tổn thương gan
chuột nhắt trắng bằng Paracetamol. 16
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19
3.1 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC 19
3.1.1 Định tính sơ bộ các nhóm chất trong dược liệu bằng phản ứng hóa
học…… 19
3.1.2 Định tính các nhóm chất đặc trưng bằng sắc kí lớp mỏng 30
3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN TRÊN MÔ
HÌNH GÂY TỔN THƯƠNG GAN CHUỘT NHẮT TRẮNG BẰNG
PARACETAMOL 35
3.2.1 Ảnh hưởng của cắn chiết Khúng khéng lên trọng lượng gan chuột bị
gây độc bằng PAR (bảng 3.5) 38
3.2.2 Ảnh hưởng của cắn chiết Khúng khéng lên hoạt độ ALT trong huyết
thanh chuột bị gây độc bằng PAR (bảng 3.6) 38
3.2.3 Ảnh hưởng của cắn chiết Khúng khéng lên hoạt độ AST trong huyết
thanh chuột bị gây độc bằng PAR (bảng 3.7) 39
3.2.4 Ảnh hưởng của cắn chiết Khúng khéng lên hàm lượng MDA gan chuột
bị gây độc bằng PAR 40

3.3 BÀN LUẬN 41
3.3.1 Về thành phần hóa học 41
3.3.2 Về tác dụng bảo vệ gan 42
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ADH Alcohol dehydrogenase
ALT Alanin amino transferase
AST Aspartat amino transferase
BuOH, Bu n - buthanol
dd dung dịch
EtOAc, Et Ethyl acetat
EtOH, C Ethanol
Hx n – hexan
HD Hovenia dulcis
HDT Hovenia dulcis Thunb.
KK Khúng khéng
KKC Cắn chiết Ethanol toàn phần của Khúng khéng
KKE Cắn chiết phân đoạn Ethyl acetat của Khúng khéng
MDA Malonyl dialdehyd
MeOH Methanol
MYR Myricetin
NAPQI N-acetyl parabenzoquinon-imin
OD Optical density (Mật độ quang)
PAR Paracetamol
R
f
Retension factor
SD Standard deviation (Độ lệch chuẩn)

SKLM Sắc ký lớp mỏng
TLC Thin - layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng)
TT Thuốc thử
UV Ultra violet (Tia cực tím)
γ-GT Gamma glutamyl transferase


DANH MỤC CÁC BẢNG

STT

Tên bảng Trang

1 Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất trong Khúng khéng
(Hovenia dulcis)
28
2 Bảng 3.2: Kết quả SKLM cắn phân đoạn n-hexan 32
3 Bảng 3.3. Kết quả SKLM cắn phân đoạn ethyl acetat 33
4 Bảng 3.4: Kết quả SKLM cắn phân đoạn n-buthanol 35
5 Bảng 3.5: Trọng lượng gan chuột ở các lô nghiên cứu 38
6 Bảng 3.6: Hoạt độ ALT trong huyết thanh chuột ở các lô nghiên cứu 38
7 Bảng 3.7: Hoạt độ AST trong huyết thanh chuột ở các lô nghiên cứu 39
8 Bảng 3.8: Hàm lượng MDA trong gan chuột ở các lô nghiên cứu 41

DANH MỤC CÁC HÌNH

STT

Tên hình Trang

1 Hình 1.1: Một số flavonoid phân lập từ cây Khúng khéng 5
2 Hình 1.2: Một số saponin phân lập được từ Khúng khéng 6
3 Hình 2.1: Một số hình ảnh mẫu nghiên cứu thu hái tại Cao Bằng 13
4 Hình 2.2: Nguyên tắc định lượng MDA dịch đồng thể gan 17
5 Hình 3.1: Sơ đồ chiết các phân đoạn Khúng khéng 30
6 Hình 3.2: Sắc ký đồ SKLM cắn Ethanol toàn phần (C) và cắn phân
đoạn n-hexan (Hx) của Khúng khéng
31
7 Hình 3.3: Sắc ký đồ SKLM cắn Ethanol toàn phần (C) và cắn phân
đoạn ethyl acetat (Et) của Khúng khéng
33
8 Hình 3.4: Sắc ký đồ SKLM cắn Ethanol toàn phần (C) và cắn phân
đoạn n-buthanol (Bu) của Khúng khéng
34
9 Hình 3.5: Sơ đồ chuẩn bị mẫu thử tác dụng bảo vệ gan của Khúng
khéng
37


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Khúng khéng - còn gọi là chỉ cụ, vạn thọ, kê trảo [7], [11] có tên khoa học
Hovenia dulcis Thunb., họ Táo ta (Rhamnaceae), là một loài cây được trồng và mọc
hoang rải rác tại các tỉnh phía Bắc, chủ yếu ở Cao Bằng và Lạng Sơn.Trên thế giới
đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của
Khúng khéng. Trong đó nổi bật là tác dụng bảo vệ gan trước các tác nhân gây độc
như CCl
4
, D-Galactosamine/Lipopolysaccharide và rượu trong các mô hình gây độc

gan cấp hoặc mạn [14], [17], [19], [23], [24], [27], [28], [46]. Tại Việt Nam, từ lâu
nhân dân ta cũng đã biết sử dụng Khúng khéng để giải độc rượu, giảm các cảm giác
bồn chồn, buồn nôn và nôn sau khi uống rượu [7], [11]. Tuy nhiên, các nghiên cứu
về Khúng khéng ở Việt Nam chỉ mới dừng lại ở mức độ sàng lọc, chưa thực sự đầy
đủ và chuyên sâu. Do vậy, với mục đích bổ sung tư liệu cho việc nghiên cứu và sử
dụng cây Khúng khéng từ nguồn dược liệu trong nước một cách khoa học hơn,
nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng cây cỏ làm thuốc trong dân gian cũng như phục vụ
cho công tác tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm dược liệu sau này, đề tài “Nghiên cứu
thành phần hóa học và tác dụng bảo vệ gan của cây Khúng khéng (Hovenia sp.)
ở Cao Bằng trên mô hình gây tổn thương gan chuột nhắt trắng bằng
Paracetamol” được tiến hành với những mục tiêu cụ thể như sau:
- Định tính thành phần hóa học trong cuống mang quả và quả Khúng khéng
bằng các phản ứng hóa học và sắc kí lớp mỏng.
- Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của cắn chiết ethanol toàn phần và cắn phân
đoạn ethyl acetat của Khúng khéng trên mô hình gây tổn thương gan chuột
nhắt trắng bằng Paracetamol .

2

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CHI HOVENIA VÀ CÂY KHÚNG KHÉNG
(Hovenia dulcis Thunb.)
1.1.1 Vị trí phân loại chi Hovenia
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan [2], vị trí của chi Hovenia như sau:
Ngành (Division): Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)
Lớp (Class): Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)
Lớp phụ (Subclass): Phân lớp Hoa hồng (Rosidae)
Bộ (Order): Bộ Táo ta (Rhamnales)
Họ (Family) : Họ Táo ta (Rhamnaceae)
Chi (Genus): Hovenia

1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Hovenia
Cây rụng lá hoặc hiếm khi cây bụi, cao tới 25m. Cành non có nhiều lông
hoặc có lông măng. Lá thay liên tiếp, cuống lá dài, 3 gân, gân chính với gân bên 4-8
đôi, phiến lá không cân, mép răng cưa.
Hoa trắng hoặc màu vàng - xanh, lưỡng tính, mẫu 5, cụm hoa chuỳ mọc ở kẽ
lá hoặc cuối cành. Đài ống hình bán cầu, thuỳ hình tam giác, hướng trục có sống rõ
ràng. Cánh hoa hình elip hoặc hình trứng, hơi dính nhau ở đáy, hiếm khi có khía ở
đỉnh, thường bao bọc hoàn toàn nhị hoa, có mở rộng khi nở. Nhị hoa được bao bọc
bởi cánh hoa, chỉ nhị hình mũi mác, bao phấn đính lưng. Đĩa gần tròn, dày, nhiều
thịt, thường có nhiều lông tơ, hiếm khi nhẵn, làm đầy ống đài. Bầu nhuỵ ở thấp hơn
bên dưới 1 nửa, gần như hoàn toàn chìm trong đĩa, bầu 3 ngăn, mỗi ngăn 1 noãn,
kiểu 2 hoặc 3 miếng, chẻ nhánh sâu.
Quả hạch gần hình cầu, nhẵn hoặc nhiều lông, đế với ống đài không rụng,
đỉnh mới, vỏ quả giữa như da, thường tách từ màng vỏ quả trong; khi chín những
nhánh con mang quả trở nên nạc và nhiều nước. Hạt 3, màu hơi nâu hoặc hơi đen,
bóng, dẹt hoặc hình cầu, thường có vết lõm [20].
3

1.1.3 Phân loại chi Hovenia
Theo phân loại của Nguyên Tiến Bân và các cộng sự chi Hovenia chỉ có 01
loài là Hovenia dulcis Thunb. [1].
Tuy nhiên theo Thực vật chí Trung Quốc [20], chi Hovenia gồm có 3 loài như
sau:
- Hovenia dulcis Thunb.
- Hovenia acerba
- Hovenia trichocarpa
1.1.4 Đặc điểm thực vật và phân bố, sinh thái của cây Khúng khéng (Hovenia
dulcis Thunb.)
1.1.4.1 Đặc điểm thực vật
Cây gỗ to hoặc hiếm khi cây bụi, cao từ 7 - 10m hoặc hơn [9], [10]. Vỏ thân,

cành màu nâu xám hoặc đen - tím, nhẵn [11], [20]. Cành non màu nâu hồng, có
lông nhỏ và nốt sần. Lá mọc so le, cuống lá dài 3 - 5cm, nhẵn. Phiến lá hình trứng,
dài 10 - 15cm, rộng 5 - 9cm [9], cả hai bề mặt lá nhẵn hoặc có lông bột trên các gân
ở mặt dưới. Gốc lá tròn, đầu lá nhọn, mép lá khía răng cưa không đều. 3 gân tỏa ra
từ gốc lá [10], 5 - 6 cặp gân phụ khác [9]. Mặt trên lục sẫm, mặt dưới nhạt [11].
Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành xim ngắn hơn lá. Hoa màu trắng
hoặc lục nhạt, đường kính 6-8mm, cuống hoa nhỏ và nhẵn [10]. Đài hoa hình chén
khía 5 răng nhỏ kích thước 2,2 - 2,5 × 1,6 - 2 mm, nhẵn. Tràng 5 cánh nhọn, hình
thìa hoặc hình trứng, kích thước 2,4 - 2,6 x 1,8 - 2,1 mm [20]. Đĩa có lông thưa thớt.
Nhị 5 xếp xen kẽ với cánh hoa. Bầu nhụy hình cầu, nhẵn, đường kính 2 - 2,2 mm,
bầu có đầu nhụy chia 3 [11].
Quả hạch có 3 hạt, gần hình cầu, nhẵn, khi chín có màu đen hoặc nâu xám,
đường kính 6,5 - 7,5 mm. Khi chín, cuống quả và những nhánh con mang quả trở
nên mọng nước, màu hồng, nhiều thịt và có vị ngọt, ăn được [10], [11]. Hạt tròn,
dẹt, có màu nâu bóng, đường kính 5 - 5,5 mm [11], [20].
Mùa hoa: tháng 5 - 6, mùa quả: tháng 8 - 10 [11].
4

1.1.4.2 Phân bố, sinh thái
Cây Khúng khéng (Hovenia dulcis Thunb.) phân bố ở vùng ôn đới ấm và cận
nhiệt đới Đông - Bắc Á bao gồm Trung Quốc, Nhật Bản và Triều Tiên. Ngoài ra
còn gặp ở Nga và cận Himalaya của Ấn Độ. Cây thường mọc trong các thung lũng,
gần bờ suối trên các loại đất còn tương đối màu mỡ. Ở Việt Nam, Khúng khéng là
cây nhập nội, được trồng rải rác các tỉnh Lạng Sơn và Cao Bằng [7], [10], [11].
Cây ưa sáng, thường có ở vườn hoặc bờ mương rẫy, ra hoa quả nhiều. Xung
quanh gốc cây mẹ thường thấy cây con mọc từ hạt. Có thể trồng Khúng khéng bằng
hạt hoặc bằng cây mọc từ chồi rễ [7], [11].
1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI TRONG CHI HOVENIA
1.2.1 Thành phần hóa học của Hovenia dulcis
Nghiên cứu bộ phận dùng gồm cuống mang quả, quả và hạt của Hovenia

dulcis, thấy có các thành phần sau:
- Quả chứa: lipid 74%, protein 3,07%, acid toàn phần 358,8 mg/kg, ascorbat
16,29 mg/100g, đường 28,55%, đường khử 13,96%, acid amin 2,38 mg/100g và các
nguyên tố vi lượng như Fe, Ca, Cu, Mn, P, Zn… [11].
- Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh sự hiện diện của các nhóm chất:
flavonoid [26], [41], [45]; alcaloid [31], [33]; saponin [15], [42], [43], [44].
1.2.1.1 Flavonoid
Năm 2000, trong công bố về bằng sáng chế liên quan đến cây Khúng khéng
[26], tác giả Kim H.S và Lee H.Y đã phân lập được hợp chất Hovenodulinol (I) có
cấu trúc tương tự các flavonoid khác trong Khúng khéng đã được phân lập trước đó
như Hovenitin (II), (+) Ampelopsin (III), Laricetrin (IV), Myricetin (V), (+)
Gallocatechin (VI) [11]. (hình 1.1)
Năm 2013, Wu long-huo và cộng sự đã tách được 10 hợp chất từ cây Khúng
khéng bao gồm kaempferol (VII), myricitin (VIII), dihydromyricitin (IX), 5,7-
dihydroxy-3',4',5'-methoxyflavon (X), chrysophanol (XI), ethyl caffeat (XII), 3-
hydroxy-4-methoxybenzoic acid (XIII), β-sitosterol (XIV), epicatechin (XV) và
5

vanillin (XVI). Trong đó các hợp chất X, XI, XII, XIII và XV là lần đầu phân lập
được trên loài này [41]. (hình 1.1)



Hovenodulinol (I) Hovenitin (II) (+) Ampelopsin (III)



Myricetin (V) (+) Gallocatechin (VI)

Kaempferol (VII)

Myricitin (VIII)

Epicatechin (XV)

Hình 1.1: Một số flavonoid phân lập từ cây Khúng khéng
Một số flavonoid khác được phân lập từ hạt Khúng khéng như: (2R, 3R)
5,7,4’,5’ tetrahydroxy 3’ methoxy dihydro flavonol; (2R, 3S) 5,7,3’,4’,5’
pentahydroxyhydro flavanol; (2R, 3S) 5,7,4’,5’ tetrahydroxy 3’ methoxy dihydro
flavonol [45].

6

1.2.1.2 Saponin
Lá Khúng khéng chứa các saponin triterpenoid A, B, C, D, E, F, G. Ngoài ra
còn có Jujubogenin , 20 – O – α. L – rhamnopyranosyl jujubogenin, hodulcin, acid
gymnemic và ziziphin, acid hovenic [11]. Trong đó: saponin C2, D, G là các
saponin mới, được xác định cấu trúc bằng quang phổ NMR và có tên khoa học lần
lượt là: 3-O-(2-O-α-L-rhamnopyranosyl-3-O-β-D-glucopyranosyl-α-L-
arabinopyranosyl) jujubogenin; 3-O-(2-O-α-L-rhamnopyranosyl-β-D-
glucopyranosyl)-20-O-α-L–rhamnopyranosyl jujubogenin; và 3-O-β-D-
glucopyranosyl-20-O-α-L–rhamnopyranosyl jujubogenin [42].
Năm 1995, hai chất triterpen glucosid có hoạt tính sinh vật ức chế sự giải
phóng histamin được Yosikawa, Masayuki, Ueda Tomishiko phát hiện và đặt tên là
hovenidulcinosid A1 và A2 [44]. (hình 1.3)

Hodulorid I Hovenidulciocosid A1 R=R1; A2 R=H
Hình 1.2 : Một số saponin phân lập được từ Khúng khéng
Các nghiên cứu về sau thấy 4 hợp chất loại damaran 16-17 seco là
hovenidulciocosid A1 A2 B1 B2 đã được chiết xuất và xác định cùng với hodulosid
III. Chúng đều có tác dụng ức chế sự giải phóng histamin [43].
7

Năm 2002, Atta ur Rahman đã công bố trong cây Khúng khéng có rất nhiều
saponin như jujuboside B, hoduloside I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, X, hovenoside
I, saponin C2, saponin E và saponin H. Đây là các saponin đặc trưng cho chi
Hovenia [15]. Bên cạnh các saponin này, Yoshikawa và cộng sự đã phát hiện thêm
các hodulosid V là những damaran glucosid [11].
1.2.1.3 Alcaloid
Ba alcaloid peptid bao gồm frangulanine, hovenin A, hovenin B được phân
lập từ dịch chiết methanol của vỏ rễ. Trong khi Hovenin A đã được xác định cấu
trúc là des-N-methyl-frangulanine (II) thì cấu trúc của Hovenin B chưa được làm
sáng tỏ [31].
Hạt Khúng khéng chứa alcaloid perlorin, perlolyrin, β – carbolin [7], [11],
[33].
1.2.1 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học các loài cùng chi Hovenia
Các công trình nghiên cứu đã phân lập được 25 hợp chất từ quả của Hovenia
acerba và xác định được cấu trúc của 23 hợp chất như: Hovenin A, B, C, D;
myricerin, quecertin, laricetin, kaempferol, hovenitin I, epigallocatechin… và 2
saponin triterpenoid mới như acerboside A và acerboside B [18].
Ngoài ra có 3 steroid được phân lập lần đầu tiên: beta-sitosterol, 3-beta-
hydroxy-3-deoxymoronic acid và beta-sitosteryl-3-O-beta-D-glucopyranoside [47].
Trong hạt của Hovenia trichocarpa, 2 saponin mới là dẫn xuất của
pseudojujubogenin đã được phát hiện và xác định cấu trúc [49].
1.3 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI TRONG CHI HOVENIA

1.3.1 Tác dụng sinh học của Hovenia dulcis
1.3.1.1 Tác dụng bảo vệ gan.
Cao chiết ethanol, methanol hoặc nước của Hovenia dulcis đều được chứng
minh có tác dụng bảo vệ gan trên động vật thí nghiệm trước các tác nhân gây độc
như Carbon tetrachloride, D-Galactosamine/Lipopolysaccharide và rượu trong các
mô hình gây độc gan cấp hoặc mạn [19], [23], [24], [46]. Trong đó thành phần
8

mang lại hoạt tính được phỏng đoán là dihydromyricetin ((+) - Ampelopsin) có
nhiều trong dịch chiết methanol [23].
Năm 2006, một nghiên cứu được thực hiện tại Đại học Y Bắc Kinh cho thấy
dịch chiết nước của Hovenia dulcis làm giảm nồng độ cồn trong máu và tăng cường
hoạt tính của enzyme ADH sau khi uống rượu. Nghĩa là Hovenia dulcis có khả năng
ngăn cản sự hấp thu rượu ở đường tiêu hóa, tăng chuyển hóa rượu tại gan, phòng
chống say rượu và các tác dụng bất lợi do rượu gây ra [16].
Năm 2007, một nghiên cứu khác được thực hiện trên chuột với mục đích
đánh giá ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết ethyl acetat từ hạt của Hovenia lên hệ
thống các enzym chuyển hóa ở gan Cyt P450. Kết quả là phân đoạn dịch chiết này
có ảnh hưởng khác nhau lên một số enzym hệ Cyt P450 cụ thể là: hoạt động của
enzym khử NADPH - cyt C và erythromycin N - demethylase không bị ảnh hưởng.,
hoạt động của aminopyrine N-demethylase trong gan đã tăng lên đến 42,4%. Các
biểu hiện mARN của CYP1A1, CYP2C11 và CYP3A1 đều tăng lên rõ rệt [48].
Năm 2010, Du J. cùng cộng sự đã thực hiện nghiên cứu riêng trên hạt của
Hovenia dulcis, kết quả cũng cho thấy dịch chiết hạt Hovenia dulcis có tác dụng bảo
vệ gan do ngộ độc rượu cấp tính thông qua việc làm giảm đáng kể hoạt độ men AST
và ALT, tăng cường hoạt tính của các enzyme chống oxy hóa như: superoxide
dismutase glutathione S - transferase, glutathione tạo điều kiện cho quá trình chuyển
hóa rượu [17].
Bên cạnh đó, tác dụng bảo vệ của nước trái cây và giấm lên men từ Hovenia
dulcis chống lại những thay đổi sinh hóa mạn tính ở chuột đực gây ra do ethanol đã

được nghiên cứu. Khi sử dụng ethanol (50%, v/v, 10 mL/kg) trong 6 tuần trên chuột
thí nghiệm cho thấy tổn thương gan với sự gia tăng đáng kể (P < 0,01) các enzym
gan như AST, ALT, γ-GT trong huyết thanh và mức độ peroxid hóa lipid của gan
(LPO). Ngược lại, khi sử dụng nước hoa quả hoặc giấm lên men từ Hovenia dulcis
(10 mL/kg) cùng với ethanol cho thấy sự giảm đáng kể (P < 0,05) các enzym (AST,
ALT và γ-GT), các chỉ số gan, nồng độ triglyceride và cholesterol trong huyết
thanh, LPO gan. Những con chuột được sử dụng nước trái cây hoặc giấm lên men
9

từ Hovenia dulcis cho thấy hệ thống chống oxy hóa tốt hơn với lượng glutathione,
tổng superoxide dismutase, catalase hoạt động và glutathione peroxidase tương đối
cao. Tất cả những kết quả này được đi kèm cùng những quan sát mô học ở gan. Từ
đó, cho thấy cả nước hoa quả và dấm lên men từ Hovenia dulcis đều có tác dụng
trong việc làm giảm các tác dụng phụ của rượu [37].
Năm 2012, Minchun Wang và đồng sự cũng đã chứng minh được tác dụng
bảo vệ gan do ngộ độc rượu cấp tính của các thành phần polysaccharide - chủ yếu
gồm galactose, arabinose, rhamnose và acid galacturonic - trong cuống quả Hovenia
dulcis. Dịch chiết Hovenia dulcis làm giảm đáng kể nồng độ AST, ALT trong huyết
thanh, giảm đáng kể mức độ của MDA trong gan và phục hồi đáng kể các hoạt động
của các enzym superoxide dismutase và glutathione peroxidase ở chuột bị tổn
thương gan do rượu [38].
Mới đây nhất, năm 2015, các nghiên cứu ở Đại học Shaanxi Normal, Trung
Quốc đã được tiến hành để tìm hiểu tác dụng bảo vệ của myricetin (MYR) tinh chế
từ Hovenia dulcis Thunb. về chống rối loạn chức năng nội mô mạch máu và tổn
thương gan ở chuột sử dụng nước chứa 3% choline. MYR đã được chứng minh là
có hoạt động thu dọn các gốc DPPH˙, HO
-
, và O
2
˙ mạnh mẽ. Sử dụng liên tục MYR

liều 400 mg/kg và 800 mg/kg ở chuột uống choline có thể làm giảm đáng kể
cholesterol huyết thanh, triglyceride, lipoprotein tỷ trọng thấp, endothelin 1,
thromboxan A
2
các loại cũng như ALT và AST, trong khi nồng độ lipoprotein tỉ
trọng cao, endothelin nitric oxide synthase, oxit nitric và prostaglandin I
2
được nâng
lên rõ rệt ở chuột (p < 0,05, p < 0,01). Đồng thời, MYR 400 mg/kg và 800 mg/kg
cũng gia tăng hoạt động tổng hợp superoxide dismutase và glutathione peroxidase
và giảm MDA gan so với những con chuột được sử dụng choline (p<0,05, p<0,01).
Những kết quả này cho thấy rằng MYR đóng vai trò bảo vệ quan trọng trong việc
chống rối loạn chức năng nội mô và tổn thương gan ở chuột có chế độ ăn nhiều
choline. Đây là báo cáo đầu tiên cho thấy rằng hàm lượng của choline cao trong chế
độ ăn uống có thể gây tổn thương gan và MYR có thể cải thiện tình trạng rối loạn
chức năng nội mô mạch máu và gan tổn thương do choline gây ra [22].
10

1.3.1.2 Tác dụng chống oxy hóa
Theo một nghiên cứu của Viện Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc:
Cắn phân đoạn ethyl acetat thu được từ dịch chiết methanol của Hovenia dulcis
Thunb. thể hiện các hoạt động bảo vệ hệ thần kinh chống lại glutamate gây độc
thần kinh ở các tế bào HT22 vùng đồi thị của chuột. Sự cách ly đường dẫn bảo vệ
hệ thần kinh bắt nguồn từ 8 hợp chất phenolic (1-8) như: vanillic axit (1), axit
ferulic (2), 3,5 - dihydroxystilbene (3), (+) - aromadendrin (4), methyl vanillate (5),
(-) - catechin (6), 2,3,4 - trihydrobenzoic acid (7) và (+) - afzelechin (8). Trong số
này, các hợp chất 6 và 8 có tác dụng bảo vệ thần kinh trên glutamate gây độc thần
kinh trong các tế bào HT22 do chúng có thể là các tác nhân dọn dẹp gốc tự do [30].
1.3.1.3 Tăng cường hoạt động thể chất, chống mệt mỏi:
Khi tiến hành nghiên cứu trên mô hình chuột đang thực hiện hoạt động bơi

người ta thấy rằng: Dịch chiết từ cuống quả Hovenia dulcis Thunb. (HDT) sử dụng
bằng đường uống làm tăng thời gian bơi đáng kể so với nhóm chuột đối chứng.
Điều này là do HDT làm giảm đáng kể nồng độ hormon stress như cortisol, hormon
kích thích thượng thận ACTH (adrenocorticotropic hormone). Nồng độ của acid
thiobarbituric đã đột ngột giảm trong cơ bắp cẳng chân ở cả liều 100 mg/kg và 200
mg/kg của HDT so với nhóm chuột đối chứng. Đồng thời HDT làm gia tăng đáng
kể các tác nhân chống oxy hóa trong gan như superoxide dismutase. Ngoài ra, HDT
làm giảm đáng kể lượng glucose máu, cholesterol toàn phần và triglyceride. Những
kết quả này gợi ý rằng HDT đã có tác dụng chống mệt mỏi, tăng cường hoạt động
thể chất đáng kể thông qua tác dụng chống căng thẳng và chống oxy hóa [32].
1.3.1.4 Tăng cường miễn dịch
Theo một nghiên cứu in vitro đánh giá hoạt động miễn dịch, các
polysaccharide trong cuống quả HDT bao gồm chủ yếu rhamnose, arabinose,
galactose và axit galacturonic làm tăng cường đáng kể hoạt động thực bào, sản xuất
oxit nitric và hoạt động acid phosphatase của các đại thực bào phúc mạc, có thể
được đánh giá như một tác nhân điều hòa miễn dịch tự nhiên tiềm năng [39].
11

1.3.1.5 Tác dụng hạ đường huyết
Theo một nghiên cứu đã được công bố trong tạp chí Dược liệu Trung Quốc
năm 2002 cho thấy: Khi sử dụng mô hình gây tiểu đường bởi alloxan và chia chuột
thành 3 nhóm. Một nhóm chỉ đơn thuần gây mô hình, một nhóm điều trị với liều
lượng khác nhau của HDT trong 7 ngày, nhóm còn lại được điều trị tích cực với
glibenclamide. Sau đó, tiến hành đo lượng đường trong máu và glycogen gan. Kết
quả là: nồng độ đường trong máu của những con chuột được điều trị bằng HDT
hoặc glibenclamide thấp hơn đáng kể so với nhóm mô hình. Nồng độ glycogen gan
ở nhóm điều trị bằng HDT liều trung bình hoặc thấp và nhóm glibenclamide được
tăng lên đáng kể. Từ đó thấy rằng HDT có tác dụng hạ đường máu và có thể trở
thành một loại thảo dược chống bệnh tiểu đường hiệu quả [25].
1.3.1.6 Tác dụng chống dị ứng

4 hợp chất saponin: hovenidulciosides A1, A2, B1, B2 được phân lập từ quả
và hạt của HDT tại Trung Quốc đã được chứng minh có tác dụng ức chế sự phóng
thích histamine từ tế bào màng bụng của chuột [43], [44].
1.3.2 Tác dụng sinh học của Hovenia acerba và Hovenia trichocarpa
2 hợp chất Saponin mới được phân lập từ hạt của Hovenia trichocarpa thể
hiện tác dụng gây độc tế bào, chống lại dòng tế bào ung thư của người trong một
thử nghiệm in vitro [49].
Các hợp chất Hovenin A - D được phân lập từ hạt của Hovenia acerba đều
thể hiện tác dụng chống viêm và tác dụng ức chế sản xuất oxit nitric [18].
1.4 CÔNG DỤNG THEO DÂN GIAN, Y HỌC CỔ TRUYỀN CỦA KHÚNG
KHÉNG (Hovenia dulcis Thunb.)
Khúng khéng có vị ngọt, hơi chát, tính bình, có công dụng trừ phiền chỉ khát,
chỉ thổ, thanh nhiệt, lợi tiểu và giải độc rượu [7]. Khúng khéng còn là vị thuốc bổ
dưỡng, trị tiêu hóa và đại tiểu tiện kém, nôn mửa, ngộ độc, miệng khô khát [11].
12

Khi dùng lấy 100 g dược liệu ngâm với một lít rượu 40
o
, càng lâu càng tốt.
Rượu có màu đỏ sẫm như rượu vang. Ngày uống 3 lần trước bữa ăn, mỗi lần 30 ml
[11].
Ở Trung Quốc, cuống quả được dùng để trị say rượu, phiền nhiệt, miệng
khát, nôn mửa, đại tiểu tiện bất lợi. Ngày dùng 6 g, ngâm rượu uống [7], [11]. Ở
Nhật Bản, hạt khúng khéng là thuốc bổ giải độc chữa ngộ độc rượu, tiểu tiện không
thông, cơ thể gầy yếu, khát nước khô cổ. Ngày dùng 3 - 5 g, ngâm rượu uống [11],
[10].
Ở Ấn Độ, cao chiết từ quả khúng khéng chứa kali nitrat và kali malat là
thuốc có tác dụng lợi tiểu mạnh [11].

13

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN, NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
- Đối tượng nghiên cứu: Cuống mang quả và quả của cây Khúng khéng được
thu hái tại Cao Bằng vào tháng 10 năm 2014. Mẫu nghiên cứu được làm
sạch, phơi khô, đựng trong 2 lần túi PE kín và lưu trữ tại Phòng Lưu mẫu,
Khoa Hóa phân tích – tiêu chuẩn, Viện Dược liệu.
- Mẫu thực vật được Th.S Nguyễn Quỳnh Nga và Th.S Hoàng Văn Toán - cán
bộ Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu giám định tên khoa học là
Hovenia dulcis Thunb. (Phụ lục 1).
- Mẫu thực vật được lưu tại Phòng tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu,
Viện Dược liệu với số hiệu là DL – 050515.




Hình 2.1: Một số hình ảnh mẫu nghiên cứu thu hái tại Cao Bằng

14

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
 Thiết bị dùng cho nghiên cứu:
- Cân kỹ thuật Precisa, cân phân tích, bếp đun cách thủy.
- Tủ sấy Memmert, máy xác định độ ẩm Precisa HA60
- Máy cất quay thu hồi dung môi BUCHI R-200.
- Đèn tử ngoại Vilbez lourmat (hai bước sóng 254 nm và 366 nm).
- Pipet vạch, Pipet Paster, Pipet chính xác, ống nghiệm, bình nón, bình gạn,
bình cầu, phễu, giấy lọc…
- Máy chấm sắc ký Camag Linomat 5, máy chụp sắc ký Camag Reprostar 3.

- Máy vi tính với phần mềm winCATS.
- Bản mỏng Silica gel 60 F
254
(Merck) (code: 1.05554.0001).
- Kit định lượng ALT, AST và bilirubin do hãng Human cung cấp.
- Máy định lượng sinh hoá bán tự động Human Lyzer 2000.
- Máy đo quang MINI 1240 SHIMAZU.
- Máy nghiền đồng thể.
 Hóa chất, dung môi.
- Các dung môi: ethanol (C), methanol (Me), n-hexan (Hx), ethylacetat (Et), n-
buthanol (Bu), acid formic, cloroform, toluen, ether dầu hỏa… đạt tiêu chuẩn
phân tích theo tiêu chuẩn DĐVN IV.
- Các thuốc thử dùng trong phản ứng hóa học: TT Lugol, TT Bouchardat, TT
Mayer, TT Dragendoff, TT Diazo được pha theo hướng dẫn của DĐVN IV.
- Các thuốc thử hiện màu trong sắc ký lớp mỏng, đặc hiệu cho các nhóm chất:
hỗn hợp acid boric 10% - acid oxalic 10% trong nước (tỷ lệ 2:1), anisaldehyd
trong ethanol, … pha theo các tài liệu tham khảo.
- Các thuốc thử tinh khiết dùng trong thử tác dụng bảo vệ gan: KCl, acid
tricloracetic, acid thiobarbituric, HCl 0,1N chuẩn, acid acetic, n-butanol,
CCl
4
, dầu olive
- Các thuốc dùng trong nghiên cứu:
15

o Silymarin (biệt dược Honymarin) dạng viên nén hàm lượng 70 mg
của hãng Alpha pharma (Korea).
o Paracetamol (độ tinh khiết 98%) do Viện kiểm nghiệm Thuốc Trung
ương cung cấp.
 Động vật thí nghiệm:

Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino khỏe mạnh, sử dụng cả chuột đực và
chuột cái, trọng lượng từ 20 ± 2 g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, được cung cấp bởi
Ban chăn nuôi, Học Viện Quân Y 103.
Chuột được nuôi trong điều kiện đầy đủ thức ăn và nước uống tại Phòng
chăn nuôi, Khoa Dược lý Sinh hóa, Viện Dược liệu từ trước khi nghiên cứu 5 ngày
và trong suốt thời gian nghiên cứu theo các tài liệu hướng dẫn thường quy.
2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.3.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học:
Định tính bằng phản ứng hóa học từ dịch chiết toàn phẩn của Khúng khéng
bằng các dung môi khác nhau (nước, ethanol, ether dầu hỏa, acid sulfuric).
Định tính một số nhóm chất đặc trưng bằng SKLM: sử dụng ethanol 98%
chiết xuất và phân bố dần vào các dung môi có độ phân cực tăng dần như n-hexan,
ethylacetat, n-buthanol. Khảo sát hệ dung môi pha động để định tính các nhóm chất
chính trong các phân đoạn với các thuốc thử đặc trưng.
2.3.2 Nghiên cứu về tác dụng sinh học:
Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây tổn thương gan chuột nhắt
trắng bằng Paracetamol bao gồm:
- Tác dụng chống viêm gan cấp.
- Tác dụng chống oxy hóa.
2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1 Nghiên cứu thành phần hóa học bằng phản ứng hóa học.
Chuẩn bị mẫu: Sấy khô dược liệu ở nhiệt độ 60
o
C. Tán nhỏ bằng thuyền tán
thành bột thô, bảo quản trong túi nilon kín, để ở chỗ thoáng mát, khô ráo.
16

Định tính các nhóm chất hữu cơ chính trong dược liệu Khúng khéng bằng
phản ứng hóa học đặc trưng theo các tài liệu [4], [5], [6].
2.4.2 Nghiên cứu thành phần hóa học bằng SKLM

Chiết xuất dịch chiết toàn phần bằng dung môi ethanol 98% bằng phương
pháp chiết nóng hồi lưu, thu hồi dung môi dưới áp suất giảm. Lắc phân đoạn bằng
phân bố cắn dịch chiết ethanol vào nước và chiết lỏng - lỏng với các dung môi có
độ phân cực tăng dần theo thứ tự lần lượt là n-hexan, ethyl acetat, n-butanol kết hợp
thu hồi dung môi dưới áp suất giảm.
Tiến hành thăm dò trên các hệ dung môi khác nhau để chọn ra hệ cho kết quả
tách tốt nhất đối với từng phân đoạn kết hợp quan sát ở các bước sóng UV-VIS với
thuốc thử hiện màu đặc trưng, lưu giữ bằng máy ảnh với các thông số đặc trưng.
Cách tiến hành:
 Hoạt hóa bản mỏng Silica gel 60 F
254
(Merck) ở 110
o
C trong 1 giờ.
 Bão hòa hệ dung môi khai triển trong 20-30 phút.
 Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 - 15μl các dung dịch phân tích.
 Sau khi triển khai để khô trong không khí hoặc sấy nhẹ.
 Phun các thuốc thử hiện màu đặc trưng cho các nhóm chất và sấy ở
nhiệt độ phù hợp.
 Quan sát kết hợp chụp ảnh dưới ánh sáng UV 254nm, 366nm, ánh
sáng trắng trước và sau khi phun thuốc thử.
2.4.3 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây tổn thương gan chuột
nhắt trắng bằng Paracetamol.
Mẫu thử: cắn ethanol toàn phần (KKC) và cắn phân đoạn ethyl acetat
(KKE). Các cắn được hòa vào nước cất thành các nồng độ khác nhau để phù hợp
với yêu cầu của thí nghiệm trước khi cho chuột uống.
Phương pháp thử: nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây độc
bằng paracetamol có tham khảo các tài liệu hướng dẫn [13], [21], [35], [36], [40] và
điều chỉnh phù hợp với môi trường nghiên cứu tại phòng thí nghiệm.
17

Phân chia lô thí nghiệm: Chuột thí nghiệm được chia ngẫu nhiên thành 7 lô:
 Lô 1 (chứng sinh học): uống nước cất.
 Lô 2 (mô hình): uống nước cất + uống PAR 220 mg/kg.
 Lô 3 (chứng dương): uống silymarin liều 100 mg/kg + uống PAR 220mg/kg.
 Lô 4: uống KKC liều 200 mg cao/kg + uống PAR 220 mg/kg.
 Lô 5: uống KKC liều 500 mg cao/kg + uống PAR 220 mg/kg.
 Lô 6: uống KKE liều 200 mg cao/kg + uống PAR 220 mg/kg.
 Lô 7: uống KKE liều 500 mg cao/kg + uống PAR 220 mg/kg.
Tiến hành thí nghiệm: Chuột trong các lô được uống nước cất hoặc mẫu thử
hoặc silymarin liên tục trong 8 ngày, mỗi ngày một lần vào buổi sáng. Ngày thứ 8,
sau uống nước cất hoặc mẫu thử hoặc silymarin 1 giờ và nhịn đói 16 - 18 giờ trước
đó, gây độc cho chuột ở tất cả các lô (trừ lô chứng sinh lý) bằng uống PAR liều 220
mg/kg với thể tích 0,2 ml/10g.
Phương pháp đánh giá: 24 giờ sau khi gây độc bằng PAR, lấy máu động
mạch cảnh của tất cả các chuột trong thí nghiệm bằng cách cắt cổ, ly tâm lấy huyết
thanh để định lượng enzym ALT, AST. Đồng thời lấy gan để xác định trọng lượng,
định lượng MDA dịch đồng thể để đánh giá tác dụng của mẫu thử.
Nguyên lý phương pháp xác định MDA dịch đồng thể gan: MDA (malonyl
dialdehyd) là một sản phẩm được tạo ra trong quá trình peroxy hoá lipid màng tế
bào gan. MDA phản ứng với acid thiobarbituric để tạo phức trimethine có màu hồng
và có đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 530 - 532nm.

Hình 2.2: Nguyên tắc định lượng MDA dịch đồng thể gan