Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng ức chế enzym alpha glucosidase của phân đoạn dịch chiết n hexan từ rễ củ thổ phục linh (smilax glabra wall ex roxb )

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


NGUYỄN THỊ LAN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ
HỌC VÀ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM
α-GLUCOSIDASE CỦA PHÂN ĐOẠN
DỊCH CHIẾT n-HEXAN TỪ RỄ CỦ
THỔ PHỤC LINH (Smilax glabra Wall. ex
Roxb.)
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ



Hà Nội 2015
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ LAN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ
TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE
CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT n-HEXAN TỪ
RỄ CỦ THỔ PHỤC LINH (Smilax glabra Wall. ex
Roxb.)
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. TS. Đào Thị Thanh Hiền

2. TS. Nguyễn Tiến Đạt
Nơi thực hiện:
Viện Hoá sinh biển- Viện
Hàn lâm khoa học Việt Nam


Hà Nội 2015


Lời cám ơn
Lời đầu tiên cho em xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới TS.Đào Thị
Thanh Hiền- giảng viên bộ môn Dược học cổ truyền Trường Đại
học Dược Hà Nội, TS.Nguyễn Tiến Đạt- Trưởng phòng Hoạt chất
sinh học, Viện Hoá sinh biển, là những người thầy đã tận tình chỉ
bảo, tạo điều kiện và hướng dẫn em thực hiện đề tài này.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban giám hiệu nhà trường cùng
toàn thể các thầy cô trong trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy
bảo, cho em những kiến thức quý báu trong 5 năm qua.
Xin chân thành cám ơn các anh chị làm việc tại phòng Hoạt chất
sinh học, Viện Hoá sinh biển đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện
thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực hiện khoá luận.
Hà Nội ngày 14 tháng 5 năm 2015

SV. Nguyễn Thị Lan


Mục lục

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1. TỔNG QUAN 3

1.1.

Tổng quan về Thổ phục linh 3

1.1.1.

Vị trí, phân loại chi smilax 3

1.1.2.

Đặc điểm thực vật và phân bố của thổ phục linh (Smilax glabra) 3

1.1.3.

Thành phần hóa học 4

1.1.4.

Công dụng của vị thuốc 9

1.1.5.

Một số sản phẩm chứa Thổ phục linh trên thị trường 12

1.2.

Tổng quan về enzym α –glucosidase 13

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1.

Nguyên vật liệu và thiết bị 15

2.1.1.

Nguyên liệu 15

2.1.2.

Hóa chất, thuốc thử 15

2.1.3.

Dụng cụ, thiết bị 16

2.2.

Nội dung nghiên cứu 17

2.2.1.

Nghiên cứu về thành phần hoá học có trong phân đoạn dịch chiết n-
hexan từ rễ củ Thổ phục linh 17

2.2.2.

Thử hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase (thử in vitro) 17

2.3.

Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1.

Phương pháp chiết 17

2.3.2.

Các phương pháp sắc ký 17

2.3.3.

Các phương pháp phân tích cấu trúc bằng phổ 18

2.3.4.

Phương pháp thử hoạt tính ức chế α-glucosidase 18

2.3.5.

Phương pháp xử lí số liệu 18

Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20


3.1.

Phân lập các hợp chất 20

3.2.

Xác định cấu trúc 21

3.3.

Thử hoạt tính ức chế α-glucosidase 25

3.3.1.

Quá trình tiến hành 25

3.3.2.

Kết quả 25

BÀN LUẬN 29

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 31

1.

Kết luận 31

2.

Đề xuất 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

PHỤ LỤC 35




DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ĐTĐ Đái tháo đường
NMR Nuclear magnetic resonance
H-NMR Hidro Nuclear magnetic resonance
C-NMR Carbon Nuclear magnetic resonance
Rha Rhamnosyl
Glc Glucosyl
DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)
PEESG Phenolic-Enriched Extracts of Smilax glabra
IL-6 Interleukin-6
TNF-α Tumor necrosis factor alpha
SG Smilax glabra
MIC Minimum inhibitory concentration
p-NPG
p- nitrophenyl-


- D- glucopyranoside
DMSO Dimethy sulfoxid
IC
50
Inhibitory concentration 50%
SKLM Sắc ký lớp mỏng
CC Colounm chromatography




DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng1.1 Các hợp chất acylsucrose Trang5
Bảng 1.2 Các hợp chất flavanon Trang 7
Bảng 2.1 Một số hợp chất tự nhiên ức chế enzym α-
glucosidase
Trang 14
Bảng 3.1 Kết quả tỷ lệ phần trăm ức chế enzym α-glucosidase
của cao chiết và chất sạch ở nồng độ 100 µg/mL
Trang 26
Bảng 3.2 Giá trị IC
50
của acid betulinic và acarbose (µg/mL) Trang 26
Bảng 3.3 Kết quả tính ức chế enzym α-glucosidase khi dùng
kết hợp acarbose và acid betulinic (tỷ lệ 1/1)
Trang 27


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 3.1 Phổ
1
HNMR của hợp chất
(1)
Trang22
Hình 3.2 Phổ
13
CNMR của hợp chất
(1)
Trang 23
Hình 3.3 Phổ DEPT của hợp chất
(1)
Trang 24
Hình 3.4 Đồ thịtỷ lệ phần trăm ức chếα-glucosidase của cao
chiết và chất sạch ở nồng độ 100 µg/mL
Trang27
Hình 3.5 Đồ thịtỷ lệ phần trăm ức chế enzym α-glucosidase khi
dùng đơn độc và dùng kết hợp acarbose và acid
betulinic

Trang28
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Đái tháo đường (ĐTĐ) là một nhóm các rối loạn chuyển hoá, đặc trưng
bởi đường huyết tăng cao, liên quan đến sự bất thường về carbohydrate, lipid
và protein. Bệnh gây ra các biến chứng mạn tính trên nhiều cơ quan như: biến
chứng mạch máu nhỏ, biến chứng mạch máu lớn, rối loạn thần kinh, biến
chứng trên thận, trên mắt Đây cũng là một trong những nguyên nhân hàng

đầu dẫn tới tử vong, tổ chức Y tế thế giới dự báo đái tháo đường sẽ trở thành
nguyên nhân tử vong đứng hàng thứ 7 trên thế giới vào năm 2030
.
Hiện nay, mục
tiêu điều trị ĐTĐ chủ yếu là để duy trì mức đường huyết ổn định và đề phòng
biến chứng.
Trong phác đồ điều trị tiểu đường hiện nay, acarbose (thuốc nhóm ức chế α-
glucosidase) là một trong những nhóm thuốc được dùng phối hợp với metformin
khi thất bại với liệu pháp đơn trị liệu bằng thuốc không insulin. Đây là nhóm
thuốc có nhiều ưu điểm như: làm giảm đường huyết sau ăn, không gây tụt đường
huyết và không làm tăng tiết insulin[1]. Tuy nhiên, giá thành cho việc điều trị lâu
dài tương đối cao; thuốc cũng có nhiều tác dụng không mong muốn như đầy hơi,
trướng bụng, đau bụng, tiêu chảy, có thể gây rối loạn chức năng gan, ngứa, phát
ban…Chính vì thế, việc nghiên cứu tìm kiếm các thuốc mới từ dược liệu có tác
dụng hạ đường huyết hiệu quả, an toàn, giá rẻ, ít tác dụng phụ đang là vấn đề
được các nhà khoa học trong nước và trên thế giới quan tâm.
Thổ phục linh được trồng ở nhiều nơi trên khắp Việt Nam, là vị thuốc khá
phổ biến trong dân gian. Từ xưa, nhân dân ta đã sử dụng Thổ phục linh để chữa
đau nhức xương khớp, ăn uống không tiêu, đau dạ dày, mụn nhọt,…Các nghiên
cứu hiện đại về Thổ phục linh cũng đã chỉ ra được nhiều tác dụng sinh học đáng
kể của vị thuốc này như: chống viêm, chống oxy hoá, kháng khuẩn, hạ đường
huyết…
2

Để góp phần nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của Thổ phục linh, chúng
tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu về thành phần hoá học và tác dụng ức chế
enzym α-glucosidase của phân đoạn dịch chiết n-hexan từ rễ củ Thổ phục
linh (Smilax glabra Wall. ex Roxb.)” với mục tiêu sau:
1. Nghiên cứu thành phần hoá học có trong phân đoạn dịch chiết n-hexan rễ
củ Thổ phục linh (Smilax glabra Wall. ex Roxb.)

2. Đánh giá hoạt tính ức chế enzymα-glucosidase của các chất phân lập
được.

3

Chương 1.TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan vềThổ phục linh
1.1.1. Vị trí, phân loại chi smilax
Theo hệ thống phân loại thực vật Takhtajan 1987[2], vị trí phân loại của
chi Smilax là:
Giới thực vật: Plantae
Ngành Ngọc lan: Magnoliophyta
Lớp Hành: Liliopsida
Phân lớp Hành: Liliidae
Bộ Khúc khắc: Smilacales
Họ Khúc khắc: Smilacaceae
Chi: Smilax
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của thổ phục linh (Smilax glabra)
Tên khoa học:Smilax glabra Roxb. (Smilax hookeri Kunth), họ Khúc khắc
(Smilacaceae)[5].
Tên khác: củ khúc khắc, củ kim cang [5].
Thổ phục linh ( Rhizoma Smilacis) là thân rễ phơi hay sấy khô của cây
thuộc chi Smilax, trong đó có Smilax glabra[5].
1.1.2.1. Đặc điểm thực vật:
Thổ phục linh hay cây khúc khắc (Smilax glabra) là một loại cây sống lâu
năm, dài 4-5m, có nhiều cành nhỏ, gầy, không gai, thường có tua cuốn dài. Lá
hình trái xoan thuôn, phía dưới tròn, dài 5-13 cm, rộng 3-7cm, chắc cứng, hơi
mỏng, có 3 gân nhỏ từ gốc và nhiều gân con. Hoa mọc thành tán chừng 20-30
hoa. Cuống chung chỉ ngắn chừng 2mm, cuống riêng dài hơn, chừng 10mm
hay hơn. Quả mọng, hình cầu, đường kính 6-7mm, hơi 3 cạnh, có 3 hạt[5].

1.1.2.2. Sinh thái và phân bố:
4

- Sinh thái: Mọc trong rừng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trong các trảng
cây bụi, trên đất có đá và có đá hoa cương, từ 3000 đến 5000m. Ra hoa tháng
5-7, có quả tháng 8-12 [3].
- Phân bố:
Mọc hoang khắp nước ta [5]: Lạng Sơn, Quảng Ninh, Thái Nguyên,
Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Bắc Giang, Hà Nội, Hòa Bình, Hải Dương, Hà Nam,
Ninh Bình, Nghệ An, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Kon Tum,
Lâm Đồng, Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận[3].
Thế giới: Ấn Độ, Mianma, Trung Quốc, Lào, Campuchia, Thái Lan.
1.1.3. Thành phần hóa học
Lá và ngọn non chứa nước, protein, glucid, xơ, tro, carotene, vitamin C[3].
Trong thân rễ có nhiều tinh bột và có β-sitosterol, stigmasterol, smilax
saponin, tigogenin [3].
Thành phần hóa học chính: flavonoid, phenyl propanoid, acid phenolic
[16].
1.1.3.1 Các hợp chất acylsucroses[4]
Khung cấu trúc các hợp chất acylsuroses có trong Smilax glabra:

HO
O O
O
OR
2
O
O
R
3

O
OR
5
R
6
O
HO
OR
1
OR
4
O


5

Bảng 1.1. Các hợp chất acylsucroses

Tên chất
Nhóm thế
R1 R2 R3 R4 R5 R6
3’,6’-Bis-O-(4-
hydroxy-3-
methoxy-
Ecinnamoyl),
2,4,6-tri-Ac
OH
O
O

O


H

O


H

O

3’,6’-Bis-O-(4-
hydroxy-3-
methoxy-
Ecinnamoyl), 1’-
O-(4-hydroxyE-
cinnamoyl),
2,6-di-Ac
OH
O
O

OH
O



O

H


H


O

3’,6’-Bis-O-(4-
hydroxy-3-
methoxy-
Ecinnamoyl), 1’-
O-(4-hydroxyE-
cinnamoyl),
OH 2,4,6-tri-Ac
OH
O
O

OH
O



O

O




H


O

6

1’,3’,6’-TrisO-(4-
hydroxy-
3-methoxy-
Ecinnamoyl),
OH 2,6-di-Ac
OH
O
O

OH
O
O


O

H

H

O

1’,3’,6’-TrisO-(4-
hydroxy-
3-methoxycinna
moyl) (E,E,E-),
OH 2,4,6-tri-Ac
OH
O
O

OH
O
O



O



O



H

O


1.1.3.2 Các hợp chất flavonoid[16]
OHO
OH
OH
O
OHO
OH
OH
OH
OH
O
Apigenin
Quercetin
OHO
OH
OH
OH
O
OHO
OH
OH
OH
O
OH
OH

Luteolin Myricetin
7

OR
2
O
OH O
R
1
R
3
OH

Khung flavanon
Bảng 1.2. Các hợp chất flavanon
Tên chất Vị trí nhóm thế Cấu hình

R1 R2 R3
Taxifolin OH H OH 2R, 3R
Naringenin H H H 2S
Dihydrokaempferol OH H H 2R,3R
Sakuranetin H CH
3
H 2S
Isoastilbin ORha H OH 2R, 3S
Astilbin ORha H OH 2R, 3R
Neoastilbi ORha H OH 2S, 3S
Neoisoastilbin ORha H OH 2S, 3R
Engeletin ORha H H 2R, 3R

Arthromerin B OGlc H H 2R, 3R





8

1.1.3.3 Các hợp chất Steroid [4,16]
HO
RO
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19

20
21
22
23
24
25
26
27
28
29

StigmasterolR

-sitosterol H

-sitosterol-glucosid Gluc
1.1.3.4 Các hợp chất phenolic [16]
O
HO
O
OH
OH
OH
O
OH
HOOC
O
OH

Acid 5-O-caffeoylshikimic Acid

3-O-p-coumaroylshikimic
O OH
O
OH
HO
O

(2S)-1,2-O-di-trans-p-coumaroylglycerol
O
OH
OH
HO
O
O
O
OH
OH
HO

Juncusyl ester B
1-O-p-coumaroylglycerol

9

1.1.4. Công dụng của vị thuốc
Thổ phục linh vị ngọt, nhạt, tính bình [2,5], quy vào kinh can và vị[5].
Tác dụng: khử phong thấp, lợi gân cốt, giải độc do thủy ngân. Chữa đau
xương, ác sang, ung thũng [5].
Bộ phận dùng: Thân rễ- Rhizoma Smilacis Glabrae. Người ta thường thu
hái thân rễ tươi quanh năm, tốt nhất vào mùa hạ, cắt bỏ rễ con và gai, phơi

hoặc sấy khô, hoặc có thể rửa sạch, ủ mềm 3 ngày rồi thái mỏng, phơi hay sấy
khô[3].
1.1.4.1 Công dụng và liều dùng
Dùng để tẩy độc cơ thể, bổ dạ dày, khoẻ gân cốt, làm cho ra mồ hôi, chữa
đau khớp xương. Liều dùng: 10-20 gam 1 ngày dưới dạng thuốc sắc (có thể
dùng liều cao hơn) [5].
Thường dùng chữa: Tiêu hóa không bình thường, đau bụng tiêu chảy;
viêm thận, viêm bàng quang; phong thấp, viêm khớp, đòn ngã tổn thương;
tràng nhạc, mụn nhọt độc, lở ngứa, viêm mủ da, giang mai; giải độc thủy
ngân, bạc. Liều dùng: 15-30g, dạng nước sắc, cao nước hay hoàn tán. Không
dùng nước trà để uống thuốc [3].
Ở Lào: Rễ củ dùng để ngâm rượu cùng với các dược liệu thực vật và động
vật làm thuốc tăng lực. Quả dùng làm gia vị [3].
Ở Ấn Độ: nước sắc rễ tươi dùng trị đau bệnh hoa liễu và các vết loét[3].
Nguyên liệu chế nước ngọt giải khát tại Mỹ và những nước chịu ảnh
hưởng của văn hóa, phong tục Mỹ[5].
1.1.4.2 Tác dụng sinh học của vị thuốc
Thổ phục linh là vị thuốc dược sử dụng trong cả đông y và tây y, trong tây
y thổ phục linh được dùng làm thuốc tẩy máu, ra mồ hôi, chữa bệnh giang
mai [2]. Đã có nhiều nghiên cứu về cây thổ phục linh ở trên thế giới được
công bố, cho thấy các tác dụng của thổ phục linh:
10

Dịch chiết ethanol 90
0
từ thân rễ Thổ phục linh có tác dụng hạ đường
huyết trên chuột nhắt trắng [6].
 Tiêm dưới da: liều 100, 200mg/kg cân nặng, mức hạ đường huyết
mạnh nhất vào giờ thứ 2 và kéo dài trên 6h.
 Đường uống: mức hạ đường huyết mạnh nhất ở giờ thứ 8 và duy trì

trên 10 giờ.
Thổ phục linh có khả năng chống viêm do ức chế quá trình sản xuất các
chất trung gian gây viêm như: NO, IL-6, TNF-α[12,16].
Tác dụng chống oxy hóa: Theo nghiên cứu của Chuan-li-Lu và cộng sự,
Thổ phục linh chứa phenonic, đã được chứng minh là có tác dụng chống oxy
hóa tốt hơn acid ascorbic trong thử nghiệm in vitro, có khả năng quét gốc tự
do (DPPH và ABTS). Khả năng quét gốc DPPH của dịch chiết giàu phenonic
(PEESG) của thổ phục linh không khác so với acid ascorbic, khả năng quét
gốc ABTS thì cáo hơn đáng kể so với acis ascorbic. Ở nồng độ 100µg/mL
PEESG có thể quét được tới 91,91% gốc DPPH [10].
Dịch chiết thổ phục linh làm giảm đáng kể AGEs (Advanced glycation end
products_ hình thành khi 1 phân tử đường liên kết với 1 phân tử protein hoặc
1 phân tử chất béo) là một chất gây rối loạn chức năng nội mô mạch máu,
thông qua con đường RAGE-ERK ½-NF-kB (receptor advanced glycation
end-Extracellular regulated protein kinase ½ NF-kB)[13].
Tác dụng trên tế bào ung thư: phần nổi trên bề mặt phân đoạn dịch chiết
nước của SG có khả năng thúc đẩy sự kết dính của các tế bào, ức chế ung thư
xâm lấn và di căn trên các tế bào ung thư gan (HepG2), tế bào ung thư vú
(MDA-MB-231), tế bào ung thư bàng quang (T24) khi thử in vitro; ngăn chặn
ung thư di căn trên tế bào ung thư vú khi thử trên chuột[14].
Tác dụng kháng khuẩn: Trong nghiên cứu về các hợp chất có tính kháng
khuẩn trong SG của Ming-Ying-Shang và cộng sự, 30 hợp chất chiết từ các
11

phân đoạn ethanol, ethyl acetat, n-butanol được thử hoạt tính kháng khuẩn
trên 3 vi khuẩn gram (-)(Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa PA01
and Kiebsiella pneumonia
)
, 3 vi khuẩn Gram (+) (methicillin-resistant
Staphylococcus aureus , Staphylococcus aureus ATCC6538 and Enterococcus

faecalis),và một loài nấm (C. albicans).Kết quả cho thấy 3 phân đoạn trên đều
hoạt tính trên S. aureus, phân đoạnethyl acetatcó tác dụng trên C. albicans và
S.aureus với giá trị MIC là 200µg/mL. Trong 30 hợp chất được thử hoạt tính,
có 17 chất có tác dụng trên vi khuẩn Gram (+), 10 chất có tác dụng trên nấm
và 8 chất có tác dụng trên Gram (-)[16].
1.1.4.3. Một số bài thuốc dân gian chứa thổ phục linh
Viện quân y 108 dùng để chữa bệnh vẩy nến[5]:
 Thành phần: Hạ khô thảo nam (80-120g), Thổ phục linh ( 40-80g)
 Cách dùng: sắc với nước (500ml) trong 3h ở nồi hấp 150
0
C, được
300ml chia 3 hoặc 4 lần uống trong ngày (Đã điều trị 21 người khỏi hẳn,
nhưng có trường hợp ghép philatop, 3 trường hợp đỡ 70-80%, 1 trường hợp
điều trị dở dang. Thời gian điều trị trung bình là 79 ngày, ngắn nhất 23 ngày,
dài nhất 118 ngày).
Chữa viêm mủ da: Thổ phục linh (30g), Kim ngân (15g), Cam thảo (15g).
Sắc uống [3].
Chữa phong thấp, gân xương đau nhức, tê buốt:Thổ phục linh (20g), thiên
niên kiện (8g), đương quy (8g), Bạch chỉ (6g), Cốt toái bổ (10g). Sắc uống
[3].
Chữa giang mai:Thổ phục linh (40g), Hà thủ ô (16g), vỏ Núc nác (16g),
gai bồ kết đốt tồn tính (8g), ké đầu ngựa (12g). Sắc uống [3].
Chữa phong thấp khớp: Hà thủ ô đỏ (8g), Sâm bố chính (8g), Thổ phục
linh (8g), Đỗ trọng (6g), Cỏ xước (6g), Tang kí sinh (8g), Vòi voi (8g), Cây lá
lốt (6g), Mắc cỡ gai (6g), Dây đau xương (6g). Sắc uống hoặc tán bột[3].
12

1.1.5. Một số sản phẩm chứa Thổ phục linh trên thị trường
 Miễn kim khang: dùng để chữa bệnh vẩy nến

 Nghệ hoàn linh:


 Viên Good bảo sinh




Sản xuất: Công ty cổ phần dược phẩm Á Âu
 Thành phần: Sói rừng (sarcandae), L-carnitine
fumarate 50mg, Thổ phục linh (smilax), Hoàng bá
(cortex phellodendri), Nhàu (morinda citrifolia), Nhũ
hương (boswella), Bạchthược (peony alba).

Sản xuất: Công ty cổ phần Dưỡng dược Bảo
Sinh.
 Thành phần: Thổ phục linh, Thiên niên kiện,
Nghệ vàng, Hoắc hương, Dạ cẩm, Vi lượng (Sắt,
Kẽm, Calci, Kali, acid amin, Vitamin A, E…) và các
tá dược khác.
 Công dụng: Thực phẩm chức năng, giúp mau
lành các vết viêm loét hành tá tràng.

Nhà sản xuất: Công ty cổ phần Dưỡng dược Bảo
Sinh.
 Thành phần: Ba kích, Thổ phục linh, Linh chi,
Huyền sâm, Thiên môn, các vi tố dưỡng chất ( Sắt,
Kẽm, Calci, Kali, Vitamin A, D, Acid amin…) và

các tá dược khác.
 Công dụng: Hỗ trợ điều trị bệnh gout, giảm acid
uric máu; hòa tan, giảm muối arat ở các khớp. Giảm
cơn đau, sưng tấy khớp ở bàn chân và ngón tay.
Ngăn ngừa sự tái phát các cơn đau, phòng ngừa tái
phát cơn gout cấp và biến chứng của bệnh gout.

13

1.2. Tổng quan về enzymα –glucosidase
Enzym α-glucosidase là enzym có ở biểu mô diềm bàn chải ở ruột non, là
enzym phân giải các dissaccharide và polysaccharide thành monosaccharide
[1,17], còn có những tên gọi khác như maltase,
glucoinvertase,
glucosidoinvertase,glucosidosucrase,maltase-glucoamylase
,
nitrophenyl
α
-
D
-
glucosidase,transglucosidase,
α
-glucopyranosidase,
α-D-glucosidase,
glucosidoinvertase,
α
-glucosidasehydrolase,
α
-1,4-glucosidase. Khi thức ăn

được hấp thu vào cơ thể thì các carbohydrat trong thức ăn được thủy phân
thành những phân tử đường nhỏ hơn bởi những enzym ở ruột non. Tiến
trình phân hóa này đòi hỏi tụy tạng phải tiết ra enzym
α
-amylase dùng để
phá vỡ các phân tử carbohydrat lớn thành oligosaccharid.Enzym
α
-
glucosidase ở màng ruột non lại tiếp tục phân hóa các oligosaccharid thành
các phân tử đường nhỏ hơn nữa rồi mới thẩm thấu vào máu.

Ức chế α-glucosidase làm giảm và làm chậm quá trình chuyển
disaccharide và polysaccharide thành glucose, nên làm chậm tăng glucose
máu sau ăn[1, 17].

14

Bảng 1.3. Một số hợp chất tự nhiên ức chế enzymα- glucosidase[9]
STT

Nhóm hợpchất
Tên các chất
1 Flavonoid
Quercetin 3-O-β-d-xylopyranosyl (1′′′→2″)-β-d-
galactopyranoside, Luteolin, Apigennin, Hesperetin,
(+)-catechin, Cyanidin-3-galactoside , cyanidin-3-
galactoside, 2R,3R,4R,5R)2,5-bis(hydroxymethyl)-
3,4-dihydroxypyrrolidine, 1-deoxynojirimycin …
2 Alcaloid
Piperumbellactam A , piperumbellactam

B, piperumbellactam C, acid 3,5-
dicaffeoylquinic,acid 4,5-
dicaffeoylquinic,castanospermin
3 Saponin
3b-Acetoxy-16b-hydroxybetulinic acid, acid 28-O-α-
l-arabinopyranosyl-(1→4)-α-l-arabinopyranosyl-
(1→3)-β-d-xylopyranosyl-(1→4)-α-l-
rhamnopyranosyl-(1→2)-β-d-fucopyranosyl ester, …
4 Curcuminoid
Curcumim, demethoxycurcumin,
bisdemethoxycurcumin
5 Miscellaneous
Bromophenols, 2,4,6-tribromophenol (24) and 2,4-
dibromophenol
6 Phenolics
Chebulanin (19), acid chebulagic (20), acid
chebulinic, (-)-3-O-galloylepicatechin (22), (-)-3-O-
galloylcatechin (23)
15

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
Cây Thổ phục linh tươi được thu hái vào tháng 10/2013 tại Bắc Giang và
được giám định bởi PGS.TS. Trần Huy Thái, viện Sinh thái và tài nguyên
sinh vật, xác định được tên khoa học là Smilax glabra Wall. exRoxb Mẫu
được lưu tại phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hoá sinh biển.

2.1.2. Hóa chất, thuốc thử
- Dung môi chiết: ethanol 90%.

- Dung môi chạy sắc ký: n-hexan, aceton, nước, ethylacetat, methanol
- Phát hiện vết: thuốc thử cerin sulfat, acid H
2
SO
4
10%.
- Hóa chất, thuốc thử dùng để đánh giá hoạt tính:
 p-nitrophenyl-

-D-glucopyranoside (p-NPG), hãng Sigma- Mỹ
 Acarbose (Sigma–Mỹ)
 Enzymα-glucosidase (G0660, Sigma–Mỹ)
 KH
2
PO
4
, K
2
HPO4 dùng để pha đệm phosphate (Merck, Đức)
 Nước cất 2 lần bằng máy A4000D (Bibby Scientific, Anh)
 Dimethy sulfoxid (DMSO-Merck, Đức).
16

2.1.3. Dụng cụ, thiết bị
- Dụng cụ thiết bị chiết:
 Máy siêu âm
 Phễu chiết
 Bình thuỷ tinh
 Phễu lọc
 Máy hút chân không

- Dụng cụ, thiết bị tinh chế
 Máy siêu âm(HWASHIN, Hàn Quốc)
 Máy hứng mẫu tự động (EYEL4, DC-1200)
 Máy cất quay chân không(Stuart, RE-3000DB, Mỹ)
 Bình cầu cất quay, bình tam giác, bình triển khai sắc ký, cốc thuỷ
tinh, ống đong chia vạch
 Pipet pasteur, pipet định mức 1 mL, 2 mL, 5 mL
 Máy sấy
 Bản mỏng tráng sẵn silicagel DC-Alufolien 60 F254, bản sắc ký pha
đảo RP18 (Merck, Germany RP C-18 F254)
 Cột sắc ký
 Silicagel pha thường (silica gel 240-430 mesh, Merck, Đức),
silicagel pha đảo (ODS-60-14/63, Fujisilisa, Nhật Bản.)…
- Thiết bị xác định cấu trúc: Máy cộng hưởng từ hạt nhân NMR (Bruker
AM500 FT-NMR Spectrometer)-Viện Hoá học, Viện hàn lâm khoa học
Việt Nam.
- Dụng cụ, thiết bị thử hoạt tính
 Máy đọc ELISA Bio-Rad (Laboratories, Mỹ)
 Bể ổn nhiệt, thiết lập ở 37
o
C
17

 Phiến 96 giếng (SPL Life Sciences, Hàn Quốc)
 Micropipet loại 10 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL (Isolab, Đức)
 Đầu côn 20 µL, 200 µL, 1000 µL.
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu về thành phần hoá học có trong phân đoạn dịch chiết n-
hexan từ rễ củ Thổ phục linh
2.2.2. Thử hoạt tính ức chếenzym α- glucosidase của các chất phân lập được

(thử in vitro)
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1.Phương pháp chiết
Phương pháp chiết rắn-lỏng: Sử dụng dung môi hữu cơ có diện hoà tan
rộng để chiết các chất hữu cơ có trong mẫu cần phân tích. Dùng kỹ thuật chiết
ngâm dần kết hợp với phương pháp siêu âm để rút ngắn thời gian chiết.
Phương pháp chiết lỏng-lỏng: Sử dụng để chiết cao alcol thô ban đầu chứa
các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến không phân cực thành các phân đoạn có
tính phân cực khác nhau. Sự chiết dựa trên sự hoà tan của các chất có độ phân
cực khác nhau trong các dung môi khác nhau, chất phân cực mạnh tan tốt
trong dung môi phân cực mạnh;chất kém phân cực tan tốt trong dung môi
kém phân cực.
2.3.2. Các phương pháp sắc ký
- Sắc ký cột (CC): Sau khi lựa chọn hệ dung môi thích hợp bằng sắc ký
lớp mỏng, sử dụng sắc ký cột để tách chất.
- Sắc ký lớp mỏng (TLC): Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản
mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F
254
, RP
18
F
254s
. Phát hiện vết bằng đèn tử
ngoại ở hai bước sóng 254nm và 365nm. Thuốc thử hiện màu là dung dịch
H
2
SO
4
10% được phun đều lên bản mỏng, đốt từ từ đến khi hiện màu. Sắc ký
lớp mỏng được dùng để khảo sát, lựa chọn dung môi thích hợp cho sắc ký cột.