Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis)

MỞ ĐẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Trâu là một loài động vật có vai trò kinh tế quan trọng ở một số nước châu Á và
Địa Trung Hải, trong đó châu Á chiếm 95% sản phẩm từ trâu trên thế giới. Tuy nhiên so
với một số ngành chăn nuôi khác như bò, lợn, gà thì chăn nuôi trâu vẫn chưa được quan
tâm phát triển đúng mức. Tại Việt Nam, số lượng trâu đang có xu hướng giảm dần
(Bảng 1 - Phụ lục). Chính vì thế việc nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật công nghệ sinh
sản trên trâu nhằm nâng cao hiệu quả sinh sản của trâu là cần thiết. Nguồn trứng trâu sử
dụng cho các nghiên cứu về công nghệ sinh sản ở trâu thường khá ít và thụ động. Việc
tạo ra một nguồn trứng trâu có chất lượng tốt và chủ động là một giải pháp mà các nhà
khoa học trên thế giới đang nghiên cứu và quan tâm. Bảo quản lạnh tế bào trứng được
xem là một giải pháp hiệu quả cho vấn đề này. So với bảo quản lạnh tinh và phôi thì quá
trình bảo quản lạnh tế bào trứng kém hiệu quả hơn do sự khác nhau về cấu trúc tế bào.
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả bảo quản lạnh tế bào trứng như: chất bảo vệ
lạnh, phương pháp đông lạnh, giai đoạn thành thục và chất lượng của trứng. Tại Việt
Nam, trước đây có rất ít các nghiên cứu cơ bản về trâu, nhưng hiện nay do sự suy giảm
về số lượng cũng như chất lượng đàn trâu nên các nhà khoa học đã quan tâm đến vấn đề
ứng dụng công nghệ sinh học nhằm nâng cao khả năng sinh sản của đàn trâu. Luận án
này được thực hiện trong điều kiện bảo quản lạnh tế bào trứng là một lĩnh vực nghiên
cứu còn rất mới và ít được quan tâm ở Việt Nam, đặc biệt là đông lạnh tế bào trứng trâu.
2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
- Đánh giá được ảnh hưởng của một số chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả bảo quản lạnh tế
bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis).
- Đánh giá được ảnh hưởng của một số phương pháp đông lạnh đến hiệu quả đông lạnh
tế bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis).
- Đánh giá được ảnh hưởng của giai đoạn nuôi thành thục in vitro đến hiệu quả đông
lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis).
3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
A. Ý nghĩa khoa học
- Lựa chọn được chất bảo vệ lạnh, phương pháp đông lạnh hiệu quả đối với quá trình
bảo quản lạnh tế bào trứng trâu.

- Xác định được giai đoạn nuôi thành thục in vitro mang lại hiệu quả cao cho quá trình
đông lạnh tế bào trứng.
- Bước đầu tạo được phôi trâu in vitro từ tế bào trứng trâu sau đông lạnh-giải đông và
tinh trùng đông lạnh.
- Đưa ra được phương pháp bảo quản lạnh thành công tế bào trứng trâu đầm lầy
(Bubalus bubalis) tại Việt Nam.
1
B. Ý nghĩa thực tế
- Sự thành công trong việc bảo quản lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis)
đã mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học lạnh đối với việc bảo tồn các
loài động vật nuôi có giá trị kinh tế cao, các loại động vật nuôi quý hiếm tại Việt Nam
dưới dạng tế bào trứng đông lạnh.
- Nguồn tế bào trứng trâu đông lạnh là nguồn nguyên liệu sử dụng cho các nghiên cứu
khác về trâu như: tạo phôi trâu in vitro; tạo phôi trâu nhân bản bằng cấy chuyển gen, cấy
chuyển nhân.
4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
- Lần đầu tiên tại Việt Nam đưa ra phương pháp đông lạnh thành công tế bào trứng trâu
đầm lầy (Bubalus bubalis).
- Lần đầu tiên tại Việt Nam tạo được phôi trâu in vitro từ tế bào trứng trâu (Bubalus
bubalis) sau đông lạnh-giải đông.
- Các kết quả nghiên cứu của luận án này có thể ứng dụng cho các phòng thí nghiệm về
Công nghệ sinh sản trên toàn quốc.
5. BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN
Luận án bao gồm 145 trang. Trong đó bao gồm: Mở đầu 4 trang; tổng quan 43
trang; vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 9 trang, kết quả và thảo luận 57
trang, kết luận và đề nghị 2 trang; các công trình đã công bố của luận án: 1 trang; tài liệu
tham khảo 29 trang; phụ lục 2 trang.
Chương I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC
Tổng quan tài liệu đề cấp đến 8 vấn đề chủ yếu sau:

1. Tế bào trứng trâu: cấu tạo tế bào trứng trâu; thu và phân loại chất lượng trứng trâu.
2. Môi trường nuôi thành thục in vitro tế bào trứng.
3. Quá trình thành thục nhân của tế bào trứng.
4. Chất bảo vệ lạnh sử dụng trong quá trình đông lạnh – giải đông tế bào trứng: các dạng
chất bảo vệ lạnh, cơ chế hoạt động của chất bảo vệ lạnh, ảnh hưởng của nồng độ chất
bảo vệ lạnh đến tế bào trứng, ảnh hưởng của thời gian và cách thức tiếp xúc với chất bảo
vệ lạnh đến tế bào trứng, quá trình giải đông và pha loãng.
5. Phương pháp đông lạnh sử dụng trong quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng: đông lạnh
chậm, thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống, đông lạnh cực nhanh.
6. Ảnh hưởng của giai đoạn phát triển đến hiệu quả bảo quản lạnh tế bào trứng: bảo
quản lạnh tế bào trứng ở giai đoạn túi mầm hoặc chưa thành thục, bảo quản lạnh tế bào
trứng ở giai đoạn thành thục nhân (MII).
7. Một số dạng tổn thương lạnh của tế bào trứng trong quá trình bảo quản lạnh.
8. Đánh giá chất lượng tế bào trứng sau bảo quản lạnh: đánh giá dựa vào quan sát hình
thái và nhuộm tế bào, đánh giá dựa vào khả năng phát triển tiếp theo của tế bào trứng.
2
Chương II
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu
- Sử dụng tế bào trứng trâu có nguồn gốc từ buồng trứng lò mổ.
- Sử dụng một số hóa chất của Sigma dùng cho đông lạnh tế bào trứng, nuôi thành thục
in vitro tế bào trứng và tạo phôi trâu in vitro.
- Sử dụng các thiết bị của Phòng TNTĐ – Viện Chăn nuôi, hệ thống kính hiển vi huỳnh
quang của Bộ môn tế bào, mô phôi; Khoa Sinh học – Trường ĐH KHTN Hà Nội.
2.2. Nội dung nghiên cứu
1. Nghiên cứu số lượng, chất lượng tế bào trứng trâu thu từ buồng trứng ở lò mổ.
2. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục đến hiệu quả tạo phôi in vitro
từ tế bào trứng trâu.
3. Nghiên cứu giai đoạn phát triển của nhân tế bào trứng trâu tại các thời gian nuôi thành
thục in vitro khác nhau.

4. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu.
5. Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào
trứng trâu.
6. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi in vitro đến hiệu quả đông lạnh trứng trâu.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp thu buồng trứng trâu
Buồng trứng trâu thu từ lò mổ, được để trong dung dịch bảo quản buồng trứng,
nhiệt độ 30 – 32
o
C, đưa về phòng thí nghiệm trong vòng 2-3 giờ. Rửa buồng trứng trâu
trong dung dịch bảo quản buồng trứng vài lần ở nhiệt độ 30 – 32
o
C trước khi sử dụng.
2.3.2. Phương pháp thu tế bào trứng trâu từ buồng trứng lò mổ
Sử dụng phương pháp chọc hút để thu tế bào trứng trâu từ buồng trứng lò mổ.
2.3.3. Phân loại tế bào trứng
Phân loại tế bào trứng theo mô tả của Goodhand và cs. (2000).
2.3.4. Phương pháp nhuộm nhân xác định giai đoạn phát triển của nhân trứng trâu
Loại bỏ lớp tế bào nang của tế bào trứng, cố định bằng Paraformaldehit 4% ở
nhiệt độ phòng; tiếp theo rửa lại bằng PBS ba lần, ủ với RNAse nồng độ 10ug/ml trong
20 phút ở 37
o
C hoặc nhiệt độ phòng, rửa lại bằng PBS và nhuộm với PI trong 15-20 phút
tại nhiệt độ phòng, trong tối). Rửa lượng PI dư thừa bằng PBS. Quan sát, kiểm tra và xác
định giai đoạn phát triển nhân tế bào trứng dưới kính hiển vi huỳnh quang.
2.3.5. Phương pháp nuôi thành thục in vitro tế bào trứng trâu
Tế bào trứng trâu được nuôi thành thục theo mô tả của Chauhan và cs. (1998a).
2.3.6. Phương pháp đánh giá tế bào trứng trâu thành thục sau nuôi in vitro
Sử dụng cả hai phương pháp: quan sát hình thái và nhuộm nhân tế bào để đánh giá
tế bào trứng thành thục sau nuôi in vitro. Với phương pháp quan sát hình thái, tế bào

trứng được kiểm tra hình thái dưới kính hiển vi soi nổi. Trứng có khả năng thành thục là
3
trứng có các lớp tế bào nang bao xung quanh giãn nở, khối tế bào chất đồng đều chặt
chẽ.
2.3.7. Phương pháp tạo phôi trâu in vitro
2.3.7.1. Hoạt hóa tinh trùng
Quá trình hoạt hóa tinh trùng được thực hiện theo mô tả của Chauhan và cs.
(1998a) với dung dịch gốc BO (Brackett và Oliphant, 1975).
2.3.7.2. Thụ tinh in vitro tế bào trứng trâu
Tế bào trứng đã thành thục được chuyển vào giọt thụ tinh có chứa tinh trùng đã
được hoạt hóa và được giữ 18 giờ ở điều kiện 38,5
o
C; 5% CO
2
; độ ẩm không khí bão
hòa để tế bào trứng hoàn thành quá trình thụ tinh.
2.3.7.3. Nuôi phôi in vitro
Trứng trâu sau thụ tinh in vitro sẽ được loại bỏ lớp tế bào nang bao xung quanh và
chuyển vào giọt nuôi chứa môi trường nuôi phôi in vitro. Các giọt môi trường nuôi này
sẽ được phủ dầu khoáng và giữ ở điều kiện 38,5
o
C; 5% CO
2
; độ ẩm không khí bão hòa.
Kiểm tra, xác định tỷ lệ phân chia (thụ tinh) ở ngày thứ 2 sau thụ tinh, tỷ lệ phôi dâu,
nang ở ngày thứ 8-9 sau thụ tinh.
2.3.8. Phương pháp đông lạnh tế bào trứng
2.3.8.1. Phương pháp thủy tinh hóa tế bào trứng trong cọng rạ truyền thống
Các tế bào trứng trâu để trong dung dịch trước cân bằng một thời gian trước khi
chuyển sang dung dịch đông lạnh. Tiếp theo khoảng 5-6 tế bào trứng sẽ được nạp vào

cọng rạ 0,25ml, hàn kín đầu và để trên hơi nitơ lỏng. Sau 2 phút các cọng rạ này sẽ được
nhúng ngập trực tiếp vào trong nitơ lỏng để bảo quản lâu dài.
2.3.8.2. Phương pháp thủy tinh hóa tế bào trứng trong cọng rạ hở
Trứng trâu được để trong dung dịch pES một thời gian; sau đó chuyển sang môi
trường VS, và nạp vào cọng rạ hở bằng lực mao dẫn. Các cọng rạ này sẽ được nhúng
ngập trực tiếp vào trong nitơ lỏng mà không cần hàn kín. Để không bị nổi trong nitơ
lỏng, các cọng rạ hở thường được cho vào trong cọng rạ 0,5ml không hàn kín.
2.3.8.3. Phương pháp thủy tinh hóa tế bào trứng bằng vi giọt
Trong phương pháp thủy tinh hóa bằng vi giọt, trứng trâu cũng trải qua quá trình
cân bằng trong dung dịch pES và dung dịch VS tương tự như phương pháp thủy tinh hóa
trong cọng rạ truyền thống và cọng rạ hở. Tế bào trứng được hút bằng pipet pasteur (3-5
tế bào trứng/giọt) và thả trực tiếp vào trong nitơ lỏng. Các giọt dung dịch đông đặc có
chứa mẫu sẽ được chuyển vào trong ống chịu lạnh và bảo quản trong nitơ lỏng.
2.3.9. Phương pháp giải đông tế bào trứng sau bảo quản lạnh
Tế bào trứng được giải đông ở 37
o
C, sau đó chuyển sang môi trường giải đông để
loại bỏ hoàn toàn chất bảo vệ lạnh ra khỏi tế bào trứng. Tiếp theo các tế bào trứng sẽ
được rửa 2-3 lần trong môi trường nuôi thành thục để loại bỏ hoàn toàn chất bảo vệ lạnh
cũng như môi trường giải đông.
4
2.3.10. Phương pháp đánh giá hình thái tế bào trứng trâu sau đông lạnh-giải đông
Trứng trâu thu được sau đông lạnh - giải đông sẽ được kiểm tra hình thái dưới
kính hiển vi soi nổi. Trứng có hình thái bình thường nếu có hình cầu cân đối, không méo
mó, lớp tế bào nang vẫn còn liên kết chặt chẽ với tế bào trứng, màng tế bào chất không
bị tổn thương (không bị phồng lên hoặc xẹp xuống); tế bào chất không bị mất hoặc thoái
hóa; màng sáng không bị đứt gãy. Trứng có hình thái không bình thường khi xuất hiện
các biểu hiện như có hình dạng méo mó, lớp tế bào nang bao xung quanh bị tan rã, màng
tế bào chất và màng sáng bị tổn thương, tế bào chất bị thoái hóa.
2.4. Thiết kế thí nghiệm

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu số lượng và chất lượng trứng trâu thu từ buồng trứng lò mổ
(sử dụng cho nội dung nghiên cứu 1)
- Trứng trâu sau khi thu từ buồng trứng lò mổ được phân loại dựa vào quan sát hình thái.
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục đến hiệu quả tạo
phôi in vitro của trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 2)
Tế bào trứng trâu sau phân loại được nuôi thành thục in vitro trong 6 môi trường:
TCM 199 + 10% FCS, TCM 199 + 5μg/ml FSH, TCM 199 + 10% FCS + 5μg/ml FSH,
Ham’s F-10 + 10% FCS, Ham’s F-10 + 5μg/ml FSH, Ham’s F-10 + 10% FCS + 5μg/ml
FSH. Sau nuôi thành thục, các tế bào trứng được thụ tinh in vitro và tạo phôi in vitro.
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu giai đoạn phát triển của nhân tế bào trứng trâu tại các thời
gian nuôi in vitro khác nhau (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 3 và 6)
Xác định giai đoạn phát triển chủ yếu của nhân tế bào trứng trâu tại các thời gian
nuôi in vitro khác nhau (0 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ) bằng phương pháp nhuộm
nhân, kiểm tra dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của dạng chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông
lạnh tế bào trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 4)
Các chất bảo vệ lạnh (Ethylene glycol; Dimethylsulfoxide; 1,2 – Propanediol;
Glycerol) được sử dụng kết hợp hoặc riêng lẻ ở cùng nồng độ 6M. Sử dụng phương
pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống. Dung dịch giải đông là: TCM 199.
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông
lạnh tế bào trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 4)
Từ kết quả của thí nghiệm 4, lựa chọn dạng chất bảo vệ lạnh thích hợp sử dụng
cho thí nghiệm 5. Sử dụng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống, tiếp
xúc 2 bước (thời gian tiếp xúc ở bước 1: 1 phút, bước 2: 30 giây). Dung dịch đông lạnh
là: TCM 199 + 0,4% BSA + 0,5M sucrose + dạng chất bảo vệ lạnh đã lựa chọn ở thí
nghiệm 4 với các nồng độ 2M, 4M, 6M và 8M. Dung dịch giải đông là TCM 199.
Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh đến
hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 4)
Từ kết quả của thí nghiệm 5, dạng chất bảo vệ lạnh với nồng độ thích hợp sẽ được
sử dụng cho thí nghiệm 6. Dung dịch đông lạnh là: TCM 199 + 0,4% BSA + 0,5M

5
sucrose + dạng chất bảo vệ lạnh với nồng độ đã lựa chọn ở thí nghiệm 5. Dung dịch giải
đông là: TCM 199. Sử dụng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống, tiếp
xúc 2 bước. Thời gian tiếp xúc ở bước 2 bằng ½ bước 1. Thời gian tiếp xúc ở bước 2
trong thí nghiệm này là 30 giây, 1 phút, 2 phút, 3 phút.
Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc thêm sucrose trong quá trình giải đông
đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 4)
Từ kết quả của thí nghiệm 6, dạng chất bảo vệ lạnh ở nồng độ, thời gian tiếp xúc
thích hợp sẽ được sử dụng cho thí nghiệm 7. Dung dịch đông lạnh là: TCM 199 + 0,4%
BSA + 0,5M sucrose + dạng chất bảo vệ lạnh với nồng độ đã được lựa chọn ở thí
nghiệm 5. Dung dịch giải đông gồm hai dạng: dạng I là TCM 199; dạng II là hai dung
dịch V1 (TCM 199 + 0,5M sucrose) và V2 (TCM 199 + 0,25M sucrose). Đối với dung
dịch giải đông dạng I, tế bào trứng sau giải đông được để 5 phút trong dung dịch giải
đông. Còn đối với dạng II: tế bào trứng sau giải đông được chuyển lần lượt vào dung
dịch V1 và V2 mỗi lần 5 phút.
Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến hiệu quả đông
lạnh tế bào trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 5)
Sử dụng 3 phương pháp phổ biến bảo quản lạnh tế bào trứng hiện nay là: thủy tinh
hóa trong cọng rạ truyền thống, thủy tinh hóa trong cọng rạ hở, thủy tinh hóa vi giọt.
Nghiên cứu này sẽ xác định phương pháp thích hợp nhất với trứng trâu (trong điều kiện
tại Việt Nam) khi sử dụng dạng chất bảo vệ lạnh ở nồng độ, thời gian tiếp xúc và dung
dịch giải đông thích hợp đã lựa chọn được từ các thí nghiệm 4, 5, 6 và 7.
Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi in vitro đến hiệu quả đông lạnh
tế bào trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 6)
Dạng chất bảo vệ lạnh ở nồng độ, thời gian tiếp xúc, dung dịch giải đông và
phương pháp đông lạnh thích hợp đã xác định ở các thí nghiệm trước sẽ áp dụng trong
thí nghiệm này. Các tế bào trứng trâu sẽ được đông lạnh ở các thời điểm nuôi in vitro
khác nhau (0 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ).
2.5. Phân tích số liệu và xử lý thống kê
Số liệu của tất cả các nội dung nghiên cứu trong luận án này được xử lý thống kê

bằng phần mềm Microsoft Excell 2007, sự khác nhau có ý nghĩa được kiểm tra bằng χ
2
sử dụng hàm CHITEST, sự sai khác có ý nghĩa với P< 0,05.
2.6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm của luận án được tiến hành từ năm 2010 đến năm 2013 tại:
- Phòng TNTĐ Công nghệ tế bào động vật – Viện Chăn nuôi.
- Bộ môn Sinh học Tế bào, Khoa Sinh học – Trường ĐHKHTN, ĐHQG Hà Nội.
6
Chương III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả thu tế bào trứng trâu từ buồng trứng ở lò mổ
Bảng 2: Chất lượng tế bào trứng trâu thu từ buồng trứng lò mổ
Số
buồng
trứng
Số tế
bào
trứng
thu
được
Số tế bào trứng
thu được/buồng
trứng
(M ± SE)
Số tế bào
trứng
loại A, B
Số tế bào trứng
loại A, B/buồng
trứng

(M ± SE)
Số tế bào
trứng
loại C, D
Số tế bào trứng
loại C, D/buồng
trứng
(M ± SE)
565 2770 4,9 ± 0.36 1130 2 ± 0,2 1640 2,9 ± 0,33
Kết quả bảng 2 cho thấy trung bình thu được 4,9 tế bào trứng/buồng trứng trâu,
trong đó 2 tế bào trứng tốt/buồng trứng. Kết quả này là thấp hơn so với một số gia súc
khác như bò, lợn. Nguyên nhân là do: bản thân buồng trứng trâu có số lượng nang trứng
nguyên thủy ít, tỷ lệ nang trứng nhỏ và kém chất lượng trên buồng trứng trâu cũng
chiếm một tỷ lệ lớn (82 - 92%), tỷ lệ nang thoái hóa ở buồng trứng trâu cũng cao (70,6 -
82%), chất lượng trâu ở lò mổ, mùa thu buồng trứng, số lượng buồng trứng, kích thước
và giai đoạn của chu kỳ buồng trứng và kỹ thuật thao tác của kỹ thuật viên.
3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục đến hiệu quả tạo phôi in vitro của
tế bào trứng trâu
3.2.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi đến sự thành thục in vitro tế bào trứng trâu
Kết quả của nghiên cứu này cho thấy không có sự khác nhau (P>0,05) khi so sánh
tỷ lệ thành thục giữa TCM 199 và Ham’s F-10 khi bổ sung riêng lẻ FCS và FSH (Bảng
3). Tuy nhiên trong nghiên cứu của chúng tôi, khi bổ sung kết hợp cả FSH và FCS vào
môi trường Ham’s F-10 và TCM 199 thì môi trường Ham’s F-10 cho tỷ lệ thành thục
cao hơn so với TCM 199 (tương ứng là 74,64% và 63,28%; P<0,05). Thậm chí theo kết
quả ở bảng 3, khi nuôi tế bào trứng trâu trong môi trường Ham’s F-10 có bổ sung kết
hợp FCS và FSH cho tỷ lệ tế bào trứng trâu thành thục sau nuôi cao nhất (74,64%;
P<0,05). Kết quả của nghiên cứu này cho thấy Ham’s F-10 nâng cao được hiệu quả nuôi
thành thục in vitro tế bào trứng trâu hơn TCM 199.
3.2.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục đến khả năng tạo phôi in vitro của
tế bào trứng trâu

Kết quả của nghiên cứu này cho thấy việc bổ sung riêng lẻ FSH vào môi trường
TCM 199 và Ham’s F-10 cho tỷ lệ phân chia; tạo phôi dâu, phôi nang cao hơn so với
việc bổ sung riêng lẻ FCS vào hai môi trường này (Bảng 4). Hiệu quả của việc tạo phôi
trâu in vitro được nâng cao khi bổ sung kết hợp cả FSH và FCS vào môi trường Ham’s
7
F-10 và TCM 199. Tỷ lệ phân chia (tương ứng 78,26% và 65%); tạo phôi dâu, phôi nang
(tương ứng 29,35% và 18,75%) trong môi trường nuôi có bổ sung kết hợp FSH và FCS
cao hơn so với việc bổ sung riêng lẻ FSH, FCS (P<0,05; Bảng 4).
Kết quả thể hiện ở bảng 4 cho thấy tỷ lệ phân chia; tạo phôi dâu, phôi nang của tế
bào trứng trâu được thành thục trong môi trường Ham’s F-10 + FCS + FSH là cao hơn
so với các môi trường còn lại (tương ứng là 78,26%; 29,35%; P<0,05). Kết quả của
chúng tôi cho thấy việc sử dụng môi trường Ham’s F-10 trong quá trình nuôi thành thục
in vitro tế bào trứng trâu mang lại hiệu quả tạo phôi trâu in vitro cao hơn so với môi
trường TCM 199 ở cùng điều kiện. Kết quả của mục 3.2.1 và 3.2.2 đã chỉ ra rằng tế bào
trứng trâu được nuôi thành thục in vitro trong môi trường Ham’s F-10 có bổ sung kết
hợp FCS và FSH cho tỷ lệ thành thục, phân chia và tạo phôi hiệu quả hơn các môi
trường còn lại. Với kết quả đó chúng tôi sử dụng môi trường nuôi thành thục in vitro
Ham’s F-10 có bổ sung kết hợp FCS và FSH cho các thí nghiệm nuôi thành thục in vitro
tế bào trứng trâu trong luận án này.
Bảng 3: Tỷ lệ thành thục của tế bào trứng trâu sau khi nuôi in vitro trong một số
môi trường nuôi khác nhau
Môi trường
Số tế bào
trứng nuôi
thành thục
Tế bào trứng thành thục
Số tế bào
trứng
% (M ± SE)
TCM 199 + FCS 203 102 50,24

c
± 1,38
TCM 199 + FSH 200 103 51,5
c
± 1,47
TCM 199 + FCS + FSH 207 131 63,28
b
± 1,72
Ham F10 + FCS 213 108 50,7
c
± 1,39
Ham
,
s F10 + FSH 209 112 53,6
c
± 1,28
Ham
,
s F10 + FCS + FSH 209 156 74,64
a
± 1,76
Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái khác nhau là sai khác có ý nghĩa
(P<0,05)
8
Bảng 4: Khả năng tạo phôi in vitro của tế bào trứng trâu sau khi nuôi in vitro trong
một số môi trường nuôi thành thục khác nhau
Môi trường
Số tế bào trứng
thụ tinh
Tế bào trứng

phân chia
Phôi dâu, phôi nang
Số tế bào
trứng
% (M ± SE)
Số phôi dâu,
phôi nang
% (M ± SE)
TCM 199 + FCS 123 51 41,46
c
± 1,36 10 8,13
c
± 1,55
TCM 199 + FSH 129 67 51,94
c
± 1,47 11 8,53
c
± 1,75
TCM 199 + FCS + FSH 160 104 65
b
± 0,9 30 18,75
b
± 0,93
Ham F10 + FCS 127 65 51,18
c
± 1,34 11 8,66
c
± 1,19
Ham F10 + FSH 138 94 68,12
b

± 1,12 25 18,12
b
± 1,41
Ham F10 + FCS + FSH 184 144 78,26
a
± 1,79 54 29,35
a
± 1,25
Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái khác nhau là sai khác có ý nghĩa
(P<0,05)
3.3. Trạng thái của nhân tế bào trứng trâu đầm lầy tại các thời gian nuôi in vitro
khác nhau
Kết quả nghiên cứu của luận án này cho thấy khi nhuộm nhân các tế bào trứng
trâu loại A, B ngay sau khi thu từ buồng trứng lò mổ (tương ứng với thời gian nuôi in
vitro 0 giờ) để kiểm tra, tất cả các tế bào trứng đều có nhân ở giai đoạn túi mầm (GV)
(100%). Theo kết quả thu được trong nghiên cứu này thì tại thời điểm nuôi thành thục
9
12 giờ và 18 giờ, nhân tế bào trứng trâu chủ yếu tồn tại tương ứng ở kỳ giữa I (95,43%)
và kỳ cuối I (64,57%). Đến thời điểm nuôi thành thục 24 giờ: 74,88% tế bào trứng có
nhân đạt tới trạng thái thành thục và thể cực thứ nhất đã hình thành xong.
Bảng 5: Trạng thái nhân tế bào trứng trâu ở các thời điểm nuôi khác nhau
Thời
gian
nuôi
in
vitro
Số tế
bào
trứng
nuôi in

vitro
Số tế bào trứng trâu ở các giai đoạn phát triển nhân tại các thời điểm nuôi khác nhau
% (M ±S E)
Túi mầm
Tiền
kỳ
giữa I
Kỳ giữa I Kỳ sau I Kỳ cuối I Thành thục
Thoái
hóa
0 giờ 221
221
(100 ± 0)
6 giờ 218
216
1 1
(99,08 ± 0,79)
12 giờ 219 1 5
209
1 3
(95,43 ± 1,13)
18 giờ 223 1 6 11
59 144
2
(26,46 ± 1,12) (64,57 ± 1,41)
24 giờ 219 1 6 9
18 17 164
4
(8,22 ± 0,48) (7,76 ± 0,55) (74,88 ± 1,4)
Sau 6 giờ nuôi thành thục in vitro tỷ lệ tế bào trứng có nhân ở giai đoạn GV vẫn

rất cao (99,08%). Điều này cho thấy đối với tế bào trứng trâu thời gian tồn tại của nhân
ở giai đoạn túi mầm là khá dài.
Kết quả ở bảng 5 cho thấy tại mỗi thời điểm nuôi thành thục in vitro khác nhau,
nhân tế bào trứng trâu tồn tại ở các trạng thái khác nhau, và đó có thể là nguyên nhân
khiến tế bào trứng sẽ có mức độ chịu đựng những tổn thương lạnh khác nhau ở mỗi giai
đoạn nuôi thành thục in vitro.
3.4. Ảnh hưởng của chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu
3.4.1. Ảnh hưởng của dạng chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh trứng trâu
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy EG là chất bảo vệ lạnh có ảnh hưởng
tốt hơn so với DMSO, PROH, Gly kể cả khi sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp trong quá
10
trình đông lạnh – giải đông đối với tế bào trứng trâu đầm lầy chưa thành thục. Tỷ lệ tế
bào trứng có hình dạng bình thường thu được sau đông lạnh – giải đông, tỷ lệ thành thục
in vitro trở lại của các tế bào trứng này cao nhất là ở nhóm EG (70,04%; 19,07%; P
<0,05) và thấp nhất là ở nhóm EG + Gly (44,81%; 4,63; P<0,05) (Bảng 6).
Bảng 6: Khả năng sống và sự thành thục in vitro của tế bào trứng trâu đầm lầy sau
đông lạnh – giải đông trong các dạng chất bảo vệ lạnh khác nhau
Chất bảo vệ
lạnh
Số tế bào
trứng
đông
lạnh
Tế bào trứng có hình thái bình
thường sau đông lạnh – giải đông
Tế bào trứng thành thục
%
Số tế bào
trứng
% (M ± SE)

Số tế bào
trứng
% (M ± SE)
EG 247 173 70,04
a
± 0,46 33 19,07
a
± 1,05
DMSO 244 134 54,91
bcd
± 0,49 11 8,21
b
± 0,59
PROH 238 143 60,08
b
± 0,44 12 8,4
b
± 0,54
Gly 240 117 48,75
ce
± 0,35 8 6,84
b
± 1,14
EG + DMSO 240 138 57,5
bc
± 0,71 13 9,86
b
± 0,82
EG + PROH 239 143 59,83
bd

± 0,46 12 8,4
b
± 0,57
EG + Gly 241 108 44,81
ef
± 0,45 5 4,63
b
± 1,39
DMSO + PROH 245 121 49,39
cf
± 1,01 9 7,44
b
± 0,89
DMSO + Gly 247 142 57,49
bcd
± 0,57 14 9,42
b
± 0,69
PROH + Gly 246 127 51,63
bcdf
± 0,61 12 9,45
b
± 0,69
Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột không có chữ cái giống nhau là sai khác có ý
nghĩa (P<0,05)
Bảng 6 cho thấy tỷ lệ thành thục in vitro của các nhóm kết hợp dao động từ 4,63%
- 9,86%; cao nhất là ở nhóm EG + DMSO và thấp nhất ở nhóm EG + Gly, tuy nhiên sự
11
khác nhau này là không có ý nghĩa (P<0,05). Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy
sự kết hợp giữa DMSO với EG hoặc PROH, EG với Gly không có hiệu quả đối với sự

thành thục nhân của tế bào trứng trâu chưa thành thục sau đông lạnh – giải đông.
3.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng
trâu
Bảng 7: Sự thành thục in vitro của tế bào trứng trâu đầm lầy sau đông lạnh – giải
đông ở các nồng độ EG khác nhau
Chất bảo
vệ lạnh
Số tế bào
trứng
đông
lạnh
Tế bào trứng có hình thái
bình thường sau đông lạnh-
giải đông
Tế bào trứng
thành thục
Số tế
bào
trứng
% (M ± SE)
Số tế
bào
trứng
% (M ± SE)
EG 2M 244 117 47,95
c
± 0,29 7 5,98
b
± 0,67
EG 4M 241 145 60,17

b
± 0,37 12 8,28
b
± 0,95
EG 6M 247 173 70,04
a
± 0,46 33 19,07
a
± 1,05
EG 8M 246 98 39,84
c
± 0,31 6 6,12
b
± 0,26
Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái khác nhau là sai khác có ý nghĩa
(P<0,05)
Dựa vào kết quả của mục 3.4.1, trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng chất bảo
vệ lạnh là Ethylene glycol để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ chất bảo vệ lạnh đến hiệu
quả đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy Bubalus bubalis. Kết quả thể hiện ở bảng 7.
Nồng độ chất bảo vệ lạnh sử dụng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu
quả đông lạnh tế bào trứng. Tỷ lệ tế bào trứng trâu có hình thái bình thường thu được
sau đông lạnh – giải đông cao nhất là ở nhóm EG 6M (70,04%; P<0,05); thấp nhất là ở
nhóm EG 8M (39, 84%; P<0,05). Tỷ lệ tế bào trứng thành thục in vitro trở lại sau đông
lạnh – giải đông cao nhất là ở nhóm EG 6M (19,07%; P<0,05) và thấp nhất là ở nhóm
EG 2M (5,98%; P<0,05). Kết quả trên cho thấy nếu nồng độ chất bảo vệ lạnh không
thích hợp, cho dù là sử dụng phương pháp thủy tinh hóa thì hiệu quả đông lạnh vẫn kém.
12
Mặc dù trong nghiên cứu của chúng tôi có sự khác nhau về tỷ lệ thành thục in
vitro giữa các nhóm EG 2M, EG 4M, EG 8M (tương ứng: 5,98%; 8, 28% và 6,12%)
nhưng sự khác nhau là không có ý nghĩa (P>0,05). Kết quả ở bảng 7 cho thấy nồng độ

chất bảo vệ lạnh sử dụng trong quá trình đông lạnh cho hiệu quả cao nhất là 6M, các
nồng độ còn lại đều cho tỷ lệ thấp hơn. Theo kết quả đạt được trong nghiên cứu này
nhận thấy có sự giới hạn về nồng độ chất bảo vệ lạnh được sử dụng và nồng độ 8M là
giới hạn cuối cùng.
Kết quả thể hiện ở bảng 7 cho thấy, tại nồng độ 8M tỷ lệ tế bào trứng có hình thái
bình thường và thành thục in vitro trở lại sau đông lạnh – giải đông giảm đáng kể, vì vậy
không nên sử dụng nồng độ cao hơn nồng độ này trong bảo quản lạnh tế bào trứng trâu.
Nồng độ chất bảo vệ lạnh cao sẽ ảnh hưởng bất lợi đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng.
Nguyên nhân lý giải cho điều này là do chất bảo vệ lạnh ngoài vai trò tích cực bảo vệ tế
bào trong quá trình đông lạnh thì nó còn có những độc tố có thể gây ảnh hưởng đến tế
bào. Khi nồng độ chất bảo vệ lạnh cao sẽ làm tăng áp suất thẩm thấu và độc tố của chất
bảo vệ lạnh, do đó sẽ gây tổn thương đến tế bào trứng khi chúng được tiếp xúc
3.4.3. Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh
tế bào trứng trâu
Dựa vào kết quả của mục 3.4.2, trong thí nghiệm này sử dụng EG ở nồng độ 6M
để đánh giá ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông
lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy Bubalus bubalis (Bảng 8).
Bảng 8: Sự thành thục in vitro của tế bào trứng trâu đầm lầy sau đông lạnh – giải
đông ở các thời gian tiếp xúc khác nhau (tiếp xúc 2 bước)
Thời gian tiếp xúc ở
bước cuối cùng
Số tế bào trứng có hình
thái bình thường sau
đông lạnh-giải đông
Tế bào trứng thành thục
Số tế bào trứng % (M ± SE)
30 giây 173 33 19,07
bc
± 1,05
1 phút 209 64 30,62

ab
± 0,45
2 phút 128 26 20,31
bc
± 0,39
3 phút 89 9 10,11
c
± 1,26
Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái khác nhau là sai khác có ý nghĩa
(P<0,05)
13
Tỷ lệ tế bào trứng thành thục in vitro trở lại được tính dựa trên số tế bào trứng
thành thục/số tế bào trứng có hình thái bình thường sau đông lạnh – giải đông. Kết quả
nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tỷ lệ tế bào trứng có khả năng sống và thành thục in
vitro trở lại bị ảnh hưởng bởi các mức thời gian tiếp xúc khác nhau. Theo kết quả của
nghiên cứu này thì tỷ lệ tế bào trứng thành thục in vitro trở lại sau đông lạnh – giải đông
cao nhất ở nhóm tiếp xúc 1 phút (30,62%; P<0,05), thấp nhất là ở nhóm 3 phút (10,11%;
P<0,05). Sự khác nhau về tỷ lệ thành thục giữa hai nhóm tiếp xúc 30 giây và tiếp xúc 2
phút là không có ý nghĩa (tương ứng: 19,07% và 20,31%; P>0,05). Tỷ lệ tế bào trứng
thành thục in vitro trở lại giảm dần và khác nhau có ý nghĩa theo thời gian tiếp xúc từ
mức thời gian 1 phút (P<0,05).
Trong quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng thời gian tế bào trứng tiếp xúc với chất
bảo vệ lạnh là yếu tố rất quan trọng đảm bảo cho sự thành công của quá trình này. Khi
thời gian tiếp xúc quá dài sẽ làm cho tế bào trứng chịu nhiều ảnh hưởng bất lợi từ độc tố
của chất bảo vệ lạnh dẫn đến những tổn thương không thể hồi phục. Nhưng nếu thời
gian tiếp xúc quá ngắn, tế bào trứng không loại bỏ được hết nước nội bào thì sẽ dẫn đến
sự hình thành tinh thể đá trong quá trình đông lạnh, do đó sẽ làm tổn thương tế bào trứng
và làm giảm hiệu quả của quá trình đông lạnh-giải đông.
3.4.4. Ảnh hưởng của sucrose trong quá trình giải đông đến hiệu quả đông lạnh tế
bào trứng trâu

Từ kết quả của mục 3.4.1; 3.4.2 và 3.4.3; thí nghiệm này được tiến hành nhằm
đánh giá ảnh hưởng của việc thêm sucrose trong quá trình giải đông đến hiệu quả đông
lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy Bubalus bubalis dựa trên cơ sở sử dụng chất bảo vệ lạnh
thấm màng EG ở nồng độ 6M, tiếp xúc 2 bước với thời gian tiếp xúc ở bước cuối cùng
là 1 phút. Kết quả thể hiện ở bảng 9.
Tỷ lệ tế bào trứng thành thục in vitro trở lại được tính dựa trên số tế bào trứng
thành thục/số tế bào trứng có hình thái bình thường sau đông lạnh – giải đông. Sự thành
công của quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng trâu không chỉ phụ thuộc vào quá trình
đông lạnh mà còn phụ thuộc vào quá trình giải đông.
Kết quả nghiên cứu thể hiện ở bảng 9 cho thấy việc sử dụng sucrose như là chất
bảo vệ lạnh không thấm màng trong quá trình giải đông có hiệu quả hơn khi không sử
dụng sucrose. Tỷ lệ tế bào trứng trâu chưa thành thục có khả năng sống và thành thục in
vitro trở lại sau đông lạnh giải đông của nhóm có sucrose là cao hơn nhóm không
sucrose (tương ứng: 40,63% và 30,62%; P<0,05). Sucrose là chất bảo vệ lạnh không
thấm màng thường được sử dụng trong quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng hoặc phôi.
Trong môi trường đông lạnh hoặc giải đông chúng hỗ trợ cho sự ổn định cấu trúc màng
tế bào. Trong quá trình thủy tinh hóa, succrose có bản chất là đại phân tử nên chúng có
thể tạo nên gradien nồng độ thông qua màng tế bào; nhờ đó giúp cho quá trình khử nước
nội bào của tế bào xảy ra hoàn thiện hơn. Thêm vào đó sucrose hoạt động giống như
đệm thẩm thấu để giảm shock thẩm thấu và những ảnh hưởng bất lợi của chất bảo vệ
14
lạnh đến tế bào trứng trong quá trình giải đông, qua đó giúp cho quá trình đông lạnh –
giải đông đạt được sự thành công.
Bảng 9: Sự thành thục in vitro của tế bào trứng trâu chưa thành thục khi giải đông
trong dung dịch có hoặc không có Sucrose
Giải đông
Số tế bào trứng
không đông lạnh
nuôi thành thục
Số tế bào trứng

có hình thái bình
thường sau đông
lạnh-giải đông
Tế bào trứng thành thục
Số tế bào
trứng
% (M ± SE)
Không sucrose 209 64 30,62
c
± 0,45
Có sucrose 192 78 40,63
b
± 0,44
Đối chứng
(Tế bào trứng không
đông lạnh)
209 156 74,64
a
± 1,76
Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái khác nhau là sai khác có ý nghĩa
(P<0,05)
Quá trình giải đông là một phần đảm bảo cho sự thành công của quy trình thủy
tinh hóa, trong đó chất bảo vệ lạnh không thấm màng đóng vai trò rất quan trọng trong
quá trình giải đông. Trong suốt quá trình giải đông, nước được tạo ra bởi sự tan chảy của
đá một cách nhanh chóng dẫn đến sự giảm áp suất thẩm thấu nội bào. Shock thẩm thấu
có thể xảy ra nếu chất bảo vệ lạnh trong nội bào không thể khuếch tán ra ngoài một cách
nhanh chóng đủ để ngăn chặn sự tràn vào của nước tự do, dẫn đến sự gẫy vỡ tế bào. Sự
có mặt của các chất bảo vệ lạnh không thấm màng trong dung dịch giải đông sẽ nâng
cao được hiệu quả của quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng và phôi. Thêm vào đó việc
cho tế bào trứng trâu sau giải đông vào dung dịch có nồng độ sucrose ban đầu cao, tiếp

theo là chuyển sang dung dịch có chứa nồng độ sucrose thấp hơn là cần thiết. Bằng cách
này các tế bào trứng được chuyển trực tiếp từ dung dịch có chứa các chất bảo vệ lạnh
vào dung dịch sucrose đẳng trương với các chất bảo vệ lạnh. Nhờ vào tính không thấm
màng của mình, sucrose hỗ trợ quá trình loại bỏ hoàn toàn chất bảo vệ lạnh thấm màng
ra khỏi tế bào trứng, đồng thời giúp cho tế bào trứng không bị tổn thương về mặt cấu
trúc (co rút hoặc sưng phồng) trong quá trình giải đông.
15
Mặc dù có sự cải thiện về tỷ lệ thành thục khi sử dụng chất bảo vệ lạnh không
thấm màng trong quá trình giải đông nhưng kết quả vẫn thấp hơn so với đối chứng
(tương ứng 40,63% so với 74,64%; P<0,05). Nguyên nhân có thể là do trong nghiên cứu
này chúng tôi sử dụng tế bào trứng chưa thành thục, sự thành thục trở lại của tế bào
trứng sau đông lạnh giải đông bị ảnh hưởng bởi quá trình đông lạnh – giải đông.
Kết quả được nêu ra ở mục 3.4.1; 3.4.2; 3.4.3; 3.4.4 của nghiên cứu này cho thấy
chất bảo vệ lạnh thấm màng Ethylene glycol có hiệu quả tốt hơn trong quá trình bảo
quản lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy. Việc sử dụng riêng lẻ Ethylene glycol ở nồng độ
6M và cách thức tiếp xúc 2 bước, thời gian tiếp xúc ở bước cuối cùng là 1 phút, kết hợp
cùng với sucorose trong quá trình giải đông sẽ mang lại hiệu quả bảo quản lạnh tốt cho
tế bào trứng trâu đầm lầy trong nghiên cứu này.
3.5. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng
trâu
3.5.1. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến số lượng tế bào trứng trâu thu
được sau đông lạnh –giải đông
Tỷ lệ tế bào trứng thu được sau đông lạnh-giải đông trong nghiên cứu của chúng
tôi ở mỗi nhóm thí nghiệm dao động từ 84,66% đến 93,75% (Bảng 10).
Bảng 10: Số lượng tế bào trứng trâu thu được sau đông lạnh- giải đông
Phương pháp
Số tế bào trứng
đông lạnh
Tế bào trứng thu được sau đông lạnh-
giải đông

Số tế bào trứng % (M ± SE)
Cọng rạ truyền thống 378 320 84,66
b
± 2,84
Cọng rạ hở 368 345 93,75
a
± 1,44
Vi giọt 372 336 90,32
a
± 2,32
Ghi chú: Các giá trị có chữ cái khác nhau trong cùng một cột là sai khác có ýnghĩa
(P<0,05)
Có nhiều nguyên nhân như: tế bào trứng bị dính vào cọng rạ vì bề mặt cọng rạ rạn
hoặc ghồ ghề (hiện tượng này thường xảy ra trong quá trình giải đông) hoặc tế bào trứng
bị tan rã trong quá trình đông lạnh. Tỷ lệ tế bào trứng thu được sau đông lạnh-giải đông
ở nhóm cọng rạ truyền thống là thấp nhất so với nhóm cọng rạ hở và vi giọt (tương ứng
84,66%; so với 93,75% và 90,32%; P<0,05); sự khác nhau giữa nhóm cọng rạ hở và vi
giọt là không có ý nghĩa.
16
Cọng rạ truyền thống dễ bị nổ, vỡ hoặc rạn nứt do sự thay đổi áp suất khi chúng
được nhúng ngập trong nitơ lỏng hoặc bể ấm (giải đông). Nguyên nhân có thể là do
thành cọng rạ dày nên cọng rạ dễ bị vỡ và mất mẫu trong quá trình đông lạnh – giải
đông. Sự thay đổi áp suất trong cọng rạ khi được nhúng ngập trong nitơ lỏng trong quá
trình đông lạnh hoặc khi đưa vào bể ấm 37
o
C trong quá trình giải đông có thể làm cho
cọng rạ bị nứt hoặc vỡ. Để hạn chế được điều này, trong phương pháp thủy tinh hóa
bằng cọng rạ truyền thống, cọng rạ trước khi được nhúng ngập thẳng trong nitơ lỏng sẽ
được để trên hơi nitơ lỏng ; hoặc trong quá trình giải đông trước khi chuyển cọng rạ vào
bể ấm 37

o
C cọng rạ sẽ được để trong không khí 5-10 giây. Tuy nhiên do sự thay đổi
nhiệt độ của hơi nitơ lỏng và không khí xung quanh mà vẫn xảy ra hiện tượng nổ, vỡ
hoặc rạn nứt cọng rạ trong quá trình giải đông. Kết quả ở bảng 10 cho thấy tỷ lệ thu hồi
tế bào trứng sau đông lạnh – giải đông ở nhóm cọng rạ hở là cao hơn so với nhóm cọng
rạ truyền thống và vi giọt.
3.5.2. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến chất lượng tế bào trứng trâu thu
được sau đông lạnh – giải đông
Kết quả của nghiên cứu này được thể hiện ở bảng 11.
Bảng 11: Chất lượng tế bào trứng trâu thu được sau đông lạnh-giải đông
Phương pháp
Số tbt thu
được sau
ĐL - GĐ
Tế bào trứng có hình
thái bình thường thu
được sau ĐL - GĐ
Tế bào trứng có hình thái
không bình thường thu
được sau ĐL - GĐ
Số tế bào
trứng
% (M ± SE)
Số tế bào
trứng
% (M ± SE)
Cọng rạ truyền thống 320 265 82,81
b
± 2,48 55 17,19
a

± 2,48
Cọng rạ hở 345 315 91,3
a
± 1,73 30 8,7
b
± 1,73
Vi giọt 336 302 89,88
a
± 2,73 34 10,12
b
± 2,73
Ghi chú: Các giá trị có chữ cái khác nhau trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa
(P<0,05). Tế bào trứng: tbt. Đông lạnh-giải đông: ĐL-GĐ
Kết quả ở bảng 11 cho thấy, tỷ lệ tế bào trứng có hình thái bình thường thu được
sau đông lạnh-giải đông dao động từ 82,81% đến 91,3% tùy thuộc vào phương pháp
đông lạnh. Tỷ lệ tế bào trứng thu được có hình thái bình thường ở nhóm cọng rạ hở và vi
giọt đều cao hơn (P<0,05) so với cọng rạ truyền thống cho thấy phương pháp thủy tinh
hóa sử dụng cọng rạ hở và vi giọt có hiệu quả hơn so với phương pháp sử dụng cọng rạ
17
truyền thống. Mặc dù cả ba phương pháp này đều sử dụng một loại môi trường pES, VS
với cùng một nồng độ chất bảo vệ lạnh nhưng chất lượng tế bào trứng thu được sau đông
lạnh – giải đông ở nhóm cọng rạ truyền thống vẫn kém hơn nhóm cọng rạ hở và vi giọt.
Nguyên nhân của sự khác biệt này có thể là do trong phương pháp thủy tinh hóa bằng
cọng rạ hở và vi giọt, vật chứa mẫu có cấu tạo ưu thế hơn nên đã làm tăng tốc độ đông
lạnh-giải đông, nhờ đó tế bào trứng vượt qua được vùng nhiệt độ nguy hiểm, giảm thiểu
những tác động nguy hiểm do độc tố của chất bảo vệ lạnh và áp suất thẩm thấu gây ra.
Cọng rạ truyền thống có thành cọng rạ dày vì vậy nó tạo ra lớp cách nhiệt giữa
môi trường chứa tế bào trứng và nitơ lỏng nên làm giảm tốc độ đông lạnh, quá trình thủy
tinh hóa có thể không hoàn toàn nên ảnh hưởng đến chất lượng của tế bào trứng sau
đông lạnh – giải đông. Trong phương pháp cọng rạ hở đường kính và độ dày của thành

cọng rạ hở được giảm đi đáng kể so với cọng rạ truyền thống (tương ứng từ 1,7mm
xuống 0,8mm và từ 0,15mm xuống 0,07mm). Còn trong phương pháp vi giọt vật chứa
mẫu là dạng vi giọt chỉ gồm dung dịch VS và tế bào trứng; giữa dung dịch chứa mẫu và
nitơ lỏng không có lớp cách nhiệt do chúng được tiếp xúc trực tiếp; do đó tốc độ đông
lạnh-giải đông ở hai phương pháp này được gia tăng đáng kể so với phương pháp thủy
tinh hóa bằng cọng rạ truyền thống.
3.5.3. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến khả năng phát triển in vitro tiếp
theo của tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông
Tế bào trứng trâu có hình thái bình thường sau đông lạnh-giải đông được đánh giá
khả năng sống và phát triển thông qua quá trình nuôi thành thục in vitro, khả năng tạo
phôi sau khi được tiến hành thụ tinh trong ống nghiệm (Bảng 12). Trong nghiên cứu
này, chỉ sử dụng những tế bào trứng sau đông lạnh – giải đông có khả năng thành thục
(đủ tiêu chuẩn thụ tinh) để đánh giá khả năng tạo phôi tiếp theo. Trứng đủ tiêu chuẩn thụ
tinh là trứng sau nuôi thành thục có lớp tế bào nang giãn nở, khối tế bào chất đồng đều.
Tỷ lệ tế bào trứng đủ tiêu chuẩn thụ tinh (30,94%), phân chia (18,29%) và tạo
phôi dâu, phôi nang (2,44%) của tế bào trứng trâu chưa thành thục sau đông lạnh-giải
đông ở nhóm cọng rạ truyền thống vẫn thấp hơn so với hai nhóm còn lại (P<0,05). Mặc
dù sự khác nhau về tỷ lệ phân chia giữa nhóm thủy tinh hóa bằng cọng rạ hở và vi giọt
trong nghiên cứu của chúng tôi là không có ý nghĩa (tương ứng là 37,98% và 30,83%;
P>0,05); nhưng sự khác nhau trong việc tạo phôi dâu, nang là có ý nghĩa (tương ứng là
10,08% so với 3,31%; P<0,05).
Trong nghiên cứu này tỷ lệ tế bào trứng đủ tiêu chuẩn thụ tinh, phân chia cũng
như tỷ lệ tạo phôi dâu, phôi nang của tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông ở nhóm
thủy tinh hóa bằng cọng rạ hở là cao hơn so với hai nhóm còn lại có thể là do ở trong
phương pháp cọng rạ hở lượng thể tích được giảm thiểu đáng kể (1-2μl so với 15-20μl
đối với vi giọt và 150μl đối với cọng rạ truyền thống). Việc giảm thể tích dung dịch thủy
tinh hóa chứa mẫu đông lạnh làm tăng tốc độ đông lạnh-giải đông; nhờ đó làm giảm đi
những ảnh hưởng bất lợi cho tế bào trứng.
18
Bảng 12: Khả năng phát triển in vitro tiếp theo của tế bào trứng trâu sau đông lạnh-giải đông

Phương pháp
Số tế bào trứng
có hình thái bình
thường sau ĐL –
GĐ được nuôi
in vitro
Tế bào trứng đủ tiêu chuẩn
dùng cho thụ tinh
Tế bào trứng phân chia Phôi dâu, phôi nang
Số tế bào
trứng
% (M ± SE)
Số tế bào
trứng
% (M ± SE)
Số phôi dâu,
phôi nang
% (M ± SE)
Cọng rạ truyền thống 265 82 30,94
c
± 2,68 15 18,29
c
± 3,26 2 2,44
c
± 4,6
Cọng rạ hở 315 129 40,95
b
± 1,33 49 37,98
b
± 2,52 12 10,08

b
± 3,9
Vi giọt 302 120 39,73
b
± 1,7 37 30,83
b
± 2,06 4 3,31
c
± 3,56
Đối chứng
(Tế bào trứng không
đông lạnh)
351 263 74,93
a
± 1,54 205 77,95
a
± 2,24 78 29,66
a
± 1,66
Ghi chú: Các giá trị có chữ cái khác nhau trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa (P<0,05)
19
Khả năng phân chia, tạo phôi của tế bào trứng trâu chưa thành thục sau đông lạnh-
giải đông ở phương pháp vi giọt vẫn kém hơn so với phương pháp cọng rạ hở. Nguyên
nhân có thể là do lượng thể tích dung dịch chứa mẫu trong phương pháp thủy tinh hóa vi
giọt vẫn lớn hơn so với cọng rạ hở (15-20µl so với 1-2µl). Thêm vào đó khi giọt dung
dịch VS có chứa tế bào trứng được thả thẳng vào trong nitơ lỏng sẽ hình thành xung
quanh nó một lớp áo khoác hơi. Giải thích cho hiện tượng này khá đơn giản: điểm sôi
của nitơ lỏng là -196
o
C, chính vì thế bất kỳ một vật gì ấm hơn nó và liên kết với nó sẽ

gây ra hiện tượng sôi và bốc hơi mạnh trên bề mặt của nó, do đó sẽ hình thành xung
quanh vi giọt một lớp áo khoác hơi bao xung quanh nó. Dạng áo khoác hơi này không
chỉ có chức năng như một lớp cách nhiệt mà còn làm chậm quá trình chìm xuống nitơ
lỏng của giọt dung dịch VS này, do đó nó cũng làm giảm tốc độ đông lạnh và ảnh hưởng
đến hiệu quả đông lạnh.
Theo kết quả thể hiện ở bảng 12, mặc dù phương pháp thủy tinh hóa bằng cọng rạ
hở cho hiệu quả cao hơn so với phương pháp cọng rạ truyền thống và vi giọt nhưng tỷ lệ
trứng đủ tiêu chuẩn thụ tinh, phân chia, tạo phôi của nhóm cọng rạ hở vẫn thấp hơn so
với đối chứng (tương ứng là 74,93%; 77,95%; 29,66%; P<0,05). Nguyên nhân có thể là
do tế bào trứng mà chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này là các tế bào trứng ở giai
đoạn chưa thành thục.
Dựa trên kết quả của mục 3.5.1; 3.5.2; 3.5.3 cho thấy khi đông lạnh tế bào trứng
trâu đầm lầy Bubalus bubalis bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ hở mang lại
hiệu quả tốt hơn so với phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống và vi giọt.
Thủy tinh hóa bằng cọng rạ hở là một phương pháp đông lạnh đơn giản, hiệu quả trong
quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng trâu mà không ảnh hưởng tiêu cực đến tỷ lệ tạo
phôi dâu, phôi nang của tế bào trứng trâu đầm lầy sau đông lạnh – giải đông.
3.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi in vitro tế bào trứng đến hiệu quả đông lạnh tế
bào trứng trâu
3.6.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi in vitro tế bào trứng đến chất lượng tế bào trứng
trâu sau đông lạnh – giải đông
Trong nghiên cứu của chúng tôi tỷ lệ tế bào trứng có hình thái bình thường thu
được sau đông lạnh-giải đông dao động từ 91,3% đến 98,31% tùy thuộc vào giai đoạn
nuôi thành thục (Bảng 13).
Kết quả trong nghiên cứu này cho thấy không có sự khác nhau giữa các nhóm 0
giờ, 6 giờ, 12 giờ (tương ứng 91,3%; 92,28%, 91,87%, P>0,05) và giữa nhóm 18giờ, 24
giờ (97,72%, 98,31%, P>0,05) về tỷ lệ tế bào trứng có hình thái bình thường thu được
sau đông lạnh – giải đông. Tỷ lệ tế bào trứng trâu có hình thái bình thường sau đông
lạnh – giải đông ở nhóm 24 giờ trong nghiên cứu này là cao hơn so với các nhóm còn lại
(P<0,05).

20
Bảng 13: Tế bào trứng trâu đầm lầy có hình thái bình thường sau đông lạnh – giải
đông ở các thời gian nuôi in vitro khác nhau
Thời gian
nuôi in
vitro
Sô tế bào trứng
thu được sau đông
lạnh-giải đông
Tế bào trứng bị tổn thương sau
đông lạnh-giải đông
Tế bào trứng có hình thái bình
thường sau đông lạnh-giải đông
Số tế bào trứng % (M ± SE) Số tế bào trứng % (M ± SE)
0 giờ 345 30 8,7
a
± 1,73 315 91,3
b
± 1,73
6 giờ 337 26 7,72
a
± 1,24 311 92,28
b
± 1,24
12 giờ 332 27 8,13
a
± 1,16 305 91,87
b
± 1,16
18 giờ 351 8 2,28

b
± 0,23 343 97,72
a
± 0,23
24 giờ 354 6 1,69
b
± 0,29 348 98,31
a
± 0,29
Ghi chú: Các giá trị có chữ cái khác nhau trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa
(P<0,05)
3.6.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi in vitro tế bào trứng đến khả năng thành thục in
vitro của tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông
Kết quả thể hiện ở bảng 14 cho thấy giữa các nhóm thủy tinh hóa thì nhóm nuôi
18 giờ có tỷ lệ thành thục cao hơn so với các nhóm còn lại (P<0,05). Tỷ lệ tế bào trứng
đạt tới giai đoạn thành thục nhân (MII) của nhóm đối chứng là cao hơn so với các nhóm
thủy tinh hóa (P<0,05), tuy nhiên giữa nhóm 18 giờ (69,97%) và đối chứng (74,93%) là
không khác nhau (P>0,05).
Nguyên nhân có thể là do ở giai đoạn nuôi 18 giờ tế bào trứng có nhân chủ yếu ở
giai đoạn kỳ cuối I và giai đoạn này diễn ra rất nhanh để tế bào trứng hoàn thành xong
quá trình thành thục nhân của mình. Vì vậy trứng ở nhóm 18h sau đông lạnh – giải đông
có khả năng hoàn thiện quá trình thành thục nhân tốt hơn so với các nhóm khác.
3.6.3. Khả năng phát triển in vitro tiếp theo của tế bào trứng trâu (được thủy tinh hóa
tại một số thời điểm nuôi khác nhau) sau đông lạnh - giải đông
Tế bào trứng được bảo quản lạnh thành công tức là tế bào trứng có khả năng phát
triển sau đông lạnh – giải đông như tế bào trứng không đông lạnh. Tỷ lệ phân chia của
nhóm 24 giờ là cao hơn so với các nhóm còn lại (64,67%; P<0,05). Mặc dù nhóm 18 giờ
có tỷ lệ thành thục không khác nhau so với đối chứng (P>0,05) nhưng tỷ lệ phân chia
21
của nhóm 18 giờ vẫn thấp hơn so với nhóm 24 giờ (53,73% so với 64,67%; P<0,05).

Hiệu quả bảo quản lạnh tế bào trứng ở giai đoạn chưa thành thục thấp hơn so với giai
đoạn thành thục có thể là do tế bào trứng chưa thành thục bị nhiều tổn thương lạnh hơn
trong quá trình đông lạnh – giải đông. Sự thành công của quá trình bảo quản lạnh tế bào
trứng thể hiện ở khả năng phát triển tiếp theo của tế bào trứng sau đông lạnh – giải đông.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá sự phát triển tiếp theo của các tế bào trứng
trâu đầm lầy sau đông lạnh – giải đông đến giai đoạn phôi dâu, phôi nang. Kết quả thể
hiện ở bảng 15 cho thấy sự giảm có ý nghĩa của số lượng phôi dâu, nang trong các nhóm
0 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ và 24 giờ so với đối chứng. Tỷ lệ phát triển đến phôi dâu,
phôi nang của nhóm 24 giờ (19,44%, P<0,05) là cao hơn so với các nhóm còn lại.
Kết quả ở mục 3.6.1, 3.6.2, 3.6.3 cho thấy, thời gian nuôi in vitro có ảnh hưởng
đến hiệu quả đông lạnh trứng trâu đầm lầy. Trứng trâu có thời gian nuôi in vitro 24 giờ
cho tỷ lệ sống, thành thục in vitro trở lại, tỷ lệ tạo phôi dâu, phôi nang sau đông lạnh –
giải đông cao hơn so với tế bào trứng trâu được đông lạnh ở thời gian nuôi < 24 giờ.
Bảng 14. Khả năng thành thục in vitro sau đông lạnh-giải đông của tế bào trứng
trâu được thủy tinh hóa tại một số thời điểm nuôi khác nhau
Thời gian nuôi in
vitro
Số tế bào trứng
có hình thái
bình thường sau
đông lạnh-giải
đông
Tế bào trứng thành thục Tế bào trứng không
thành thục
Số tế bào
trứng
% (M ± SE)
Số tế bào
trứng
% (M ± SE)

0h 315 129 40,95
c
± 1,33 186 59,05 ± 1,33
6h 311 127 40,84
c
± 0,9 184 59,16 ± 0,9
12h 305 166 54,43
b
± 0,71 139 45,57 ± 0,71
18h 343 240 69,97
a
± 1,27 103 30,03 ± 1,27
Đối chứng
(Tế bào trứng
không đông lạnh)
351 263 74,93
a
± 1,54 88 25,07 ± 1,54
Ghi chú: Các giá trị có chữ cái khác nhau trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa
(P<0,05)
22
Bảng 15. Khả năng phát triển in vitro tiếp theo sau đông lạnh-giải đông của tế bào
trứng trâu được thủy tinh hóa tại một số thời điểm nuôi khác nhau
Thời gian nuôi in vitro
Số tế bào
trứng
được thụ
tinh
Tế bào trứng phân chia Phôi dâu, phôi nang
Số tế bào

trứng
% (M ± SE)
Số phôi dâu,
phôi nang
% (M ± SE)
0h 336 127 37,8
d
± 0,76 13 10,24
c
± 1,57
6h 327 126 38,53
d
± 0,47 12 9,52
c
± 0,98
12h 329 132 40,12
d
± 0,65 15 11,36
c
± 1,68
18h 335 180 53,73
c
± 0,62 24 11,67
c
± 0,97
24h 334 216 64,67
b
± 0,92 42 19,44
b
± 1,14

Đối chứng
(Tế bào trứng không
đông lạnh)
263 205 77,95
a
± 2,24 78 29,66
a
± 1,66
Ghi chú: Các giá trị có chữ cái khác nhau trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa
(P<0,05)
Chương IV
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN
Các kết quả của nghiên cứu này đã khẳng định:
1. Phương pháp đông lạnh tiếp xúc 2 bước với Ethylene glycol (EG) (bước 1: 2 phút
trong EG 3M; bước 2: 1 phút trong EG 6M) kết hợp với giải đông trong môi trường có
chứa sucrose mang lại hiệu quả cao để bảo quản lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy trong
điều kiện tại Việt Nam.
2. Đông lạnh tế bào trứng trâu bằng phương pháp thủy tinh cực nhanh với cọng rạ hở
(OPS) cho tỷ lệ tế bào trứng trâu sống sau đông lạnh –giải đông cao hơn so với các
phương pháp đã thử nghiệm.
3. Đông lạnh tế bào trứng trâu ở giai đoạn nuôi thành thục in vitro 24 giờ cải thiện tỷ lệ
tế bào trứng trâu có hình thái bình thường sau đông lạnh –giải đông (98,31%); cải thiện
tỷ lệ tạo phôi dâu, phôi nang sau thụ tinh và nuôi phôi in vitro (19,44%).
23
4. Đã tạo được phôi dâu, phôi nang trâu in vitro từ tế bào trứng trâu đầm lầy sau đông
lạnh – giải đông. Đây là kết quả thành công đầu tiên tại Việt Nam tính đến thời điểm
này.
5. Đã xây dựng được phương pháp bảo quản lạnh thành công tế bào trứng trâu đầm lầy
tại Việt Nam. Đây cũng là phương pháp bảo quản lạnh tế bào trứng trâu đầu tiên được

công bố tại Việt Nam tính đến thời điểm này.
4.2. ĐỀ NGHỊ
Kết quả của nghiên cứu này là công bố đầu tiên về bảo quản lạnh tế bào trứng trâu
tại Việt Nam. Tuy nhiên để nâng cao tỷ lệ sống của tế bào trứng trâu sau đông lạnh –
giải đông, tỷ lệ tạo phôi trâu in vitro từ tế bào trứng trâu sau đông lạnh –giải đông, nhằm
mục đích bảo tồn cũng như tạo nguồn nguyên liệu cho các nghiên cứu và sản xuất phôi
trâu cần phải thực hiện thêm một số nghiên cứu khác như: nghiên cứu cải thiện môi
trường nuôi phôi in vitro, cấy truyền phôi trâu tạo ra từ tế bào trứng trâu sau đông lạnh –
giải đông, nghiên cứu tạo phôi trâu nhân bản từ tế bào trứng đông lạnh.
Các kết quả nghiên cứu của luận án có thể được dùng làm tài liệu tham khảo trong
nghiên cứu giảng dạy tại các trường Đại học hoặc được áp dụng cho các phòng thí
nghiệm về công nghệ sinh sản.
CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN
1. Nguyễn Khánh Vân, Vũ Thị Thu Hương, Nguyễn Thị Lệ Hương, Nguyễn Thị Hương,
Quản Xuân Hữu, Đào Đức Thà, Nguyễn Lai Thành. 2014. Ảnh hưởng của phương pháp
đông lạnh đến chất lượng tế bào trứng trâu chưa thành thục sau đông lạnh – giải đông.
Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi – Viện Chăn nuôi. Số 50: 92-100
2. Nguyễn Khánh Vân, Vũ Thị Thu Hương, Nguyễn Thị Lệ Hương, Nguyễn Thị Hương,
Quản Xuân Hữu, Đào Đức Thà, Nguyễn Lai Thành. 2014. Ảnh hưởng của thời gian nuôi
cấy đến kết quả bảo quản lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy. Tạp chí Khoa học Công nghệ
Chăn nuôi – Viện Chăn nuôi. Số 51: 39-47
24
25