Đánh giá khả năng sống sót của lactobacillus acidophilus trong quá trình tạo pellet probiotic

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI







TÔ NGỌC SẮC

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SỐNG SÓT
CỦA Lactobacillus acidophilus TRONG
QUÁ TRÌNH TẠO PELLET
PROBIOTIC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ



HÀ NỘI – 2014


BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TÔ NGỌC SẮC

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SỐNG SÓT
CỦA Lactobacillus acidophilus TRONG
QUÁ TRÌNH TẠO PELLET
PROBIOTIC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
TS. Đàm Thanh Xuân
Nơi thực hiện:
BM Công nghiệp dược



HÀ NỘI – 2014


LỜI CẢM ƠN
Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành
đến cô giáo, TS. Đàm Thanh Xuân, người thầy đã tận tình hướng dẫn em trong
suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến DS. Lê Ngọc Khánh, cùng các thầy
cô giáo trong Bộ môn Công nghiệp Dược, những người đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến
quý báu và hỗ trợ tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành khóa luận này.

Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị kỹ thuật
viên trong bộ môn Công nghiệp Dược.
Em cũng xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường và các thầy cô
giáo trong trường đã dạy dỗ và dìu dắt em trong năm năm học tại trường.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ, khích lệ và hết
lòng giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn!!!
Hà Nội, tháng 5 năm 2012
Sinh viên


Tô Ngọc Sắc












MỤC LỤC
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 2

1.1.

Đại cương về probiotics 2

1.2.

Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotics trên thế giới và Việt Nam 3

1.3.

Lactobacillus acidophilus 5

1.3.1.

Đặc điểm hình thái, sinh lí, điều kiện nuôi cấy 5

1.3.2.

Tác dụng của Lactobacillus acidophilus với sức khỏe 6

1.3.3.

Một số chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus trên thị trường 8

1.4.

Kỹ thuật sản xuất pellet bằng phương pháp đùn – tạo cầu 9

1.4.1.

Định nghĩa pellet 9

1.4.2.

Ưu – nhược điểm của pellet 9

1.4.3.

Thành phần của pellet 10

1.4.4.

Các phương pháp bào chế pellet 11

CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1.

Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu 14

2.1.1.

Nguyên vật liệu 14

2.1.2.

Môi trường sử dụng trong nghiên cứu 14

2.1.3.

Thiết bị 15

2.2.

Nội dung nghiên cứu 16



2.2.1.

Tạo pellet probiotics chứa Lactobacillus acidophilus 16

2.2.2.

Đánh giá ảnh hưởng của một số giai đoạn trong quá trình tạo pellet
đến sự sống sót của vi sinh vật và theo dõi độ ổn định của pellet probiotics 16

2.2.3.

Nghiên cứu cải thiện số lượng vi sinh vật trong pellet sản phẩm 16

2.3.

Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1.

Phương pháp nhân giống 16

2.3.2.

Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 16

2.3.3.

Phương pháp đông khô 17

2.3.4.

Phương pháp bào chế pellet 17

2.3.5.

Phương pháp làm khô và bảo quản pellet 19

2.3.6.

Phương pháp xác định hàm ẩm pellet 19

2.3.7.

Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật theo phương pháp pha
loãng liên tục 19

2.3.8.

Phương pháp đánh giá sơ bộ một số chỉ tiêu chất lượng của pellet 20

CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1.

Tạo pellet probiotics chứa Lactobacillus acidophilus 21

3.1.1.

Khảo sát nồng độ tá dược dính HPMC E6 22

3.1.2.

Khảo sát thời gian ủ 24

3.1.3.

Khảo sát phương pháp làm khô 25

3.1.4.

Khảo sát thời gian làm khô bằng máy sấy tầng sôi 27

3.1.5.

Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của pellet 28

3.2.

Đánh giá ảnh hưởng của một số giai đoạn trong quá trình tạo pellet
đến sự sống sót của vi sinh vật và theo dõi độ ổn định của pellet probiotics. 29

3.2.1.

Đánh giá ảnh hưởng của một số giai đoạn trong quá trình tạo pellet
đến sự sống sót của vi sinh vật 30



3.2.2.

Theo dõi độ ổn định của pellet trong quá trình bảo quản 33

3.3.

Nghiên cứu cải thiện số lượng vi sinh vật trong pellet sản phẩm 35

3.3.1.

Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu chứa vi sinh vật trong công
thức bào chế pellet đến số lượng vi sinh vật thu được trong pellet sản phẩm 35

3.3.2.

Khảo sát số lượng vi sinh vật trong pellet tạo thành khi thay đổi
nguyên liệu chứa vi sinh vật trong công thức bào chế 37

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ATCC (American Type Culture Collection) Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ
CT Công thức
Cfu (Colony – Forming Units) Số đơn vị khuẩn lạc
FAO (Food and Agriculture Organization) Tổ chức Nông lương thế giới
HPMC Hydroxypropyl methyl cellulose
IDF (International Dairy Federation) Liên đoàn bơ sữa thế giới
LAB (lactic acid bateria) Nhóm vi khuẩn lactic
MT Môi trường

MRS (de Man, Rogosa, Sharpe) Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
SSG Natri starch glycolat
VSV Vi sinh vật
WHO (World Health Organization) Tổ chức Y tế thế giới















DANH MỤC CÁC BẢNG
STT Tên bảng Trang
1.1 Một số tá dược dùng trong công thức bào chế pellet 10
2.1 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu 14
2.2 Các tá dược sử dụng trong nghiên cứu 14
2.3 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu 15
2.4 Công thức bào chế pellet probiotics (mẻ 50g) 18
3.1 Công thức bào chế pellet probiotics (mẻ 50g) 21
3.2 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch tá dược dính tới quá trình
tạo pellet
22

3.3 Ảnh hưởng của thời gian ủ tới chất lượng pellet 24
3.4 Hàm ẩm pellet tạo thành sau khi làm khô bằng 2 phương
pháp sấy trong 45 phút ở nhiệt độ 37
o
C
26
3.5 Ảnh hưởng của thời gian làm khô bằng máy sấy tầng sôi đến
hàm ẩm pellet
27
3.6 Số lượng vi sinh vật (cfu/g) và hàm ẩm trong quá trình tạo
pellet bằng phương pháp đùn – tạo cầu
31
3.7 Số lượng vi sinh vật (cfu/g) và hàm ẩm của pellet trong thời
gian bảo quản
34
3.8 Số lượng VSV trong pellet sử dụng công thức 2 trong thời
gian bảo quản
36
3.9 Số lượng vi sinh vật trong bột đông khô vi sinh vật với sữa
gầy và trong pellet tạo thành
38
3.10 Số lượng vi sinh vật trong pellet sử dụng công thức 3 trong
thời gian bảo quản
38





DANH MỤC CÁC HÌNH

STT

Tên hình Trang
1.1 Hình ảnh Lactobacillus acidophilus trên kính hiển vi điện tử 5
1.2 Sơ đồ các bước sản xuất pellet bằng phương pháp đùn – tạo cầu 11
2.1 Sơ đồ quy trình bào chế pellet 18
3.1 Sợi đùn trong quá trình đùn khi sử dụng dd HPMC E6 3% 23
3.2 Sợi đùn trong quá trình đùn khi sử dụng dd HPMC E6 5% 23
3.3 Hình ảnh pellet được tạo thành sau khi làm khô 29
3.4 Biến thiên hàm lượng vi sinh vật (cfu/g) trong pellet và hàm ẩm
pellet trong quá trình tạo pellet
31
3.5 Biến thiên hàm lượng vi sinh vật (cfu/g) và hàm ẩm pellet trong
thời gian bảo quản
34
3.6 Biến thiên số lượng vi sinh vật (cfu/g) theo thời gian bảo quản
của mẫu pellet sử dụng công thức 2
36
3.7 Biến thiên số lượng vi sinh vật (cfu/g) theo thời gian bảo quản
của mẫu pellet sử dụng công thức 3
38





1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Thời gian gần đây các dạng thuốc probiotics đang rất được quan tâm nghiên

cứu và phát triển bởi nhiều lợi ích mà nó mang lại cho sức khỏe của con người.
Trong đó, Lactobacillus acidophilus là một trong những chủng vi sinh vật
probiotics phổ biến nhất hiện nay bởi nhiều lợi ích mà nó mang lại như: chống
nhiễm trùng đường tiêu hóa, cải thiện khả năng dung nạp lactose, tăng cường miễn
dịch L. acidophilus xuất hiện từ rất sớm trong những thực phẩm truyền thống như
sữa tươi, sữa chua, cũng như các sản phẩm bổ sung dinh dưỡng [23].
Ở Việt Nam, việc phát triển các sản phẩm probiotics đang trong giai đoạn
đầu. Dạng bào chế probiotics thông dụng hiện nay là bột và cốm. Việc đảm bảo độ
sống sót của vi sinh vật và bảo vệ vi sinh vật khi sử dụng qua đường uống là vấn đề
lớn còn còn mắc phải, do khi sử dụng theo đường uống thuốc phải chịu tác động
của các yếu tố như: pH acid, enzym tiêu hóa, acid mật…[23] là các yếu tố làm suy
giảm số lượng sống sót của vi sinh vật đi rất nhiều. Trên thế giới, các nước đã và
đang tập trung nghiên cứu phát triển nhiều loại chế phẩm probiotics dạng pellet, bởi
dạng pellet có nhiều ưu điểm lớn như: rút ngắn thời gian lưu thuốc ở dạ dày, ít bị rã
ở dạ dày; mặt khác do pellet hình cầu, bề mặt nhẵn thuận tiện cho quá trình bao
màng nhằm mục đích bảo vệ vi sinh vật, bao tan trong ruột… [2], [3].
Từ các lí do trên chúng tôi thực hiện đề tài “Đánh giá khả năng sống sót
của Lactobacillus acidophilus trong quá trình tạo pellet probiotics” nhằm 3 mục
tiêu sau:
1. Tạo pellet probiotics chứa Lactobacillus acidophilus bằng phương pháp đùn
– tạo cầu.
2. Đánh giá ảnh hưởng của quá trình tạo pellet bằng phương pháp đùn - tạo
cầu và ảnh hưởng của quá trình bảo quản đến sự sống sót của vi sinh vật.
3. Nghiên cứu cải thiện số lượng vi sinh vật trong pellet probiotics.



2

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN

1.1. Đại cương về probiotics
Thuật ngữ probiotics có nguồn gốc từ Hy Lạp. Theo nghĩa gốc, “biotic” hay
“biosis” từ chữ “life” là đời sống, và “pro” là thân thiện, nên probiotics có thể hiểu
theo nghĩa là cái gì đó thân thiện với đời sống con người. Hiểu sát nghĩa hơn, đó là
chất bổ sung dinh dưỡng chứa những vi khuẩn hay vi nấm có ích [28], [36].
Khái niệm probiotics đầu tiên xuất phát từ nhà khoa học Eli Metchnikoff,
trong cuốn sách “Kéo dài sự sống” của ông đưa ra năm 1908. Ông cho rằng những
người nông dân Bulgary sống lâu là vì họ thường xuyên sử dụng sữa chua có chứa
vi sinh khuẩn lactic, các vi khuẩn này có lợi cho vi sinh vật đường ruột [37].
Theo Parker (1974), Probiotics là những vi sinh vật như vi khuẩn hay nấm
men mà có thể thêm vào thực phẩm với mục đích điều chỉnh quần thể sinh vật
đường ruột của sinh vật chủ. Van De Kerkove (1979), Barrows và Deam (1985),
Lestradet (1995) cùng cho rằng probiotics được sử dụng như một liệu pháp trong
việc chữa trị bệnh tiêu chảy hay như là cách phòng bệnh ở người và động vật để
giảm đến mức tổi thiểu sự phát tán của vi sinh vật đường ruột, sự kháng lại liệu
pháp sinh học và sự di căn của chứng viêm dạ dày ruột. Đến năm 1989, theo Fuller
thì probiotics cũng được nhận thấy là có những ảnh hưởng có lợi trên sức khỏe của
sinh vật chủ. Năm 1992, Havenaar đã mở rộng định nghĩa về probiotics: probiotics
được định nghĩa như là sự nuôi cấy riêng lẻ hay hỗn hợp các vi sinh vật sống mà có
ảnh hưởng có lợi cho sinh vật chủ bằng cách cải thiện những đặc tính của vi sinh
vật bản địa [38].
Năm 2002, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và tổ chức Nông lương thế giới
(FAO) đã đưa ra định nghĩa ngắn gọn và hoàn chỉnh nhất về Probiotics ở thời điểm
hiện tại như sau: “Probiotics là những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể với
một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ” [36], [38]. Tuy
nhiên, không phải tất cả những vi sinh vật sống nào cũng là probiotics. Theo đánh
giá của tổ chức FAO và WHO, tiêu chuẩn quan trọng nhất để chọn chủng khuẩn
probiotics sử dụng dưới dạng thực phẩm là chủng khuẩn đó phải có khả năng sống
3

sót qua hệ tiêu hóa và phải có khả năng phát triển trong ruột. Do trong quá trình sử
dụng vi khuẩn probiotics phải đối mặt với nhiều điều kiện bất lợi của đường tiêu
hóa nên để đem lại tác dụng bất cứ sản phẩm chứa probiotics nào cũng phải chứa ít
nhất 10
6
cfu/ml tế bào vi sinh vật sống cho đến ngày hết hạn sử dụng vì liều điều trị
tối thiểu mỗi ngày được đề xuất là từ 10
8
÷ 10
9
tế bào [17], [33].
1.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotics trên thế giới và Việt Nam
Việc sử dụng thực phẩm có chứa các vi sinh vật có lợi cho cơ thể đã được
biết đến từ lâu, tuy nhiên việc nghiên cứu hệ vi sinh vật đường ruột và sử dụng
probiotics mới thực sự phát triển từ những năm 80 của thế kỉ 20. Năm 1998,
Apajalahti và cộng sự đã thực hiện những nghiên cứu về đặc điểm phân loại và
quần thể vi sinh vật đường ruột ở người và động vật [13].
Netherwood và cộng sự (1999) [31]; Gong và cộng sự (2002) [20]; Zhu và
cộng sự (2002) [40] đã sử dụng kỹ thuật gen để nghiên cứu sự thay đổi cấu trúc
quần thể và đặc điểm sinh học của hệ vi sinh vật đường ruột ở động vật dưới tác
động của probiotics. Tuy nhiên, cho đến nay những nhân tố nào góp phần tạo nên
một hệ vi sinh vật cân bằng hoặc làm rối loạn sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường
ruột cũng chưa được hiểu biết đầy đủ.
Probiotics đem lại nhiều tác dụng có lợi cho cơ thể vật chủ, nhưng hiểu biết
của con người về cơ chế tác động của probiotics còn rất hạn chế. Có một số tác giả
cho rằng hiệu quả của probiotics trong việc ức chế sự phát triển của các vi khuẩn
gây bệnh trong đường tiêu hóa của động vật có ý nghĩa rất quan trọng. Sự kìm hãm
được thực hiện theo những cách sau: cạnh tranh chất dinh dưỡng, sản xuất độc tố và
các sản phẩm trao đổi (các acid béo bay hơi, các chất giống kháng sinh…), cạnh
tranh vị trí bám dính ở niêm mạc ruột và kích thích hệ thống miễn dịch ruột [19],

[32].
Trong thời gian gần đây đã có sự gia tăng mạnh mẽ về số lượng các sản
phẩm y tế chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc từ probiotics. Probiotics ngày càng
được bào chế dưới nhiều dạng chế phẩm khác nhau sử dụng theo đường uống như
bột, cốm, viên nang… hay sử dụng trong các sản phẩm cho đường dùng khác như
4

viên đặt, kem bôi da. Tuy nhiên, nhiều báo cáo chỉ ra rằng số lượng các vi khuẩn
probiotics trong các chế phẩm này rất nghèo nàn. Để cải thiện số lượng vi khuẩn
sống sót trong suốt quá trình bảo quản và trong môi trường có độ pH thấp trong cơ
thể, trên thị trường đã có các sản phẩm probiotics được bao tới thế hệ 1,2,3…[6].
Thế hệ 1
Không bao như cốm, pellet… (Non – Coated)

Thế hệ 2
Bao tan trong ruột (Enteric – Coated)

Thế hệ 3
Vi nang hóa (Micro – Encapsulated)

Thế hệ 4
Bao hai lớp (Dual – Coated)
Đa phần các sản phẩm probiotics sử dụng theo đường uống, chúng phải chịu
tác dụng của dịch vị, cũng như của acid mật vì thế vi sinh vật bị chết rất nhiều và
không đến ruột được hoặc đến ruột với số lượng rất ít không đủ gây tác dụng. Việc
đảm bảo khả năng sống sót của vi sinh vật probiotics trong sản xuất, bảo quản, lưu
hành, và tỉ lệ sống sót cao khi đến ruột không đơn giản; do vậy đã có nhiều hướng
nghiên cứu khác nhau như cải tiến phương pháp đông khô tạo bột, áp dụng phương
pháp lên men 2 bước, phương pháp vi nang hóa, phương pháp sử dụng kết hợp với
tá dược bảo vệ [18].

5

Một số cơ sở có sản xuất nguyên liệu probiotics ở nước ta là công ty trách
nhiệm hữu hạn một thành viên Pasteur Đà Lạt, công ty trách nhiệm hữu hạn một
thành viên vaccin và sinh phẩm Nha Trang, với một số chế phẩm hay gặp trên thị
trường như Enzym biosub, Biosubtyl DL, Viabiovit, Vivac bio, Healthy liver với
chủng vi sinh vật Bacillus subtilis. Mới đây, đã xuất hiện thêm công ty cổ
phần ANABIO Research & Development, có nhà máy sản xuất nguyên liệu
probiotics hiện đại không kém so với các nước trên thế giới. Ngoài chủng vi sinh
vật Bacillus subtilis, ANABIO còn có thêm nguyên liệu chứa các chủng vi sinh vật
lactic. Do vậy, thị trường chế phẩm probiotics không chỉ lớn về số lượng mà còn đa
dạng về chủng loại vi sinh vật, đồng thời giá thành sản phẩm các chế phẩm
probiotics đã được hạ nhiều lần. Tuy nhiên, sản phẩm ở đây vẫn chủ yếu thuộc thế
hệ 1 nên khả năng bảo vệ vi sinh vật vẫn còn rất thấp.
1.3. Lactobacillus acidophilus
1.3.1. Đặc điểm hình thái, sinh lí, điều kiện nuôi cấy
Mô tả nguyên thủy về loài dựa trên các chủng được phân lập từ đường tiêu
hóa của con người và động vật, khoang miệng và âm đạo người, cũng có thể tìm
thấy ở các sản phẩm bơ sữa. Vào thời điểm mô tả đầu tiên, chủng là loài hỗn tạp do
gồm một số chủng sau này được phân loại lại như các loài đặc biệt như L. johnsonii
[9].

Hình 1.1. Hình ảnh Lactobacillus acidophilus trên kính hiển vi điện tử
6

Lactobacillus acidophilus là đại diện chính của nhóm vi khuẩn sinh acid
lactic (LAB), là trực khuẩn Gram dương, hình que hay hình cầu, kích thước 0,6 –
0,9 × 1,5 – 6,0 µm, mọc đơn, đôi hoặc tạo thành chuỗi ngắn. L. acidophilus không
có lông roi, không di động, không sinh bào tử, không ưa muối, ưa acid, catalase âm
tính, kị khí tùy tiện. L. acidophilus phát triển tốt trong điều kiện sức căng bề mặt

thấp và có khả năng kháng lysozym [12].
Loài lên men đồng hình chuyển đường hexose gần như hoàn toàn thành acid
lactic (cả hai dạng đồng phân D và L), tạo thành acid nhưng không sinh khí từ
glucose, sucrose và lactose. Tạo acid từ glucose, fructose, galactose, mannose,
maltose, lactose và sucrose. Một vài chủng lên men raffinose và trehalose và lên
men dextrin yếu. Loài này không lên men các đường xylose, arabinose, rhamnose,
glycerol, mannitol, sorbitol, dulcitol và inositol [12].
L. acidophilus là vi khuẩn vi hiếu khí, do đó môi trường nuôi cấy thường là
kị khí hoặc là giảm áp oxy với 5-10% CO
2
. L. acidophilus có thể sinh trưởng ở
nhiệt độ cao (ở 45
o
C), tuy nhiên nhiệt độ phát triển tối ưu là 37
o
C, không phát triển
trong khoảng 20-22
o
C. Là đại diện chính của nhóm vi khuẩn sinh acid lactic, nó có
khả năng chịu được điều kiện acid trong khoảng pH 5-6 trong thời gian 24 – 36h
[12].
1.3.2. Tác dụng của Lactobacillus acidophilus với sức khỏe
a. Cải thiện chức năng miễn dịch
Chức năng ngăn cản và loại trừ kháng nguyên ngoại lai đi qua thành ruột
được chỉ huy bởi hệ thống miễn dịch ruột – chính là các mô bạch huyết ở ruột. Các
vi khuẩn sinh acid lactic có thể tăng các đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu như
chức năng thực bào, các tế bào NK – natural killer cells và các đáp ứng miễn dịch
đặc hiệu (hoạt động sản xuất kháng thể, cytokinase, tăng sinh các tế bào lympho,…)
của vật chủ. Sự gia tăng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu (hoạt động thực bào của
bạch cầu hạt) đã được ghi nhận ở những người tình nguyện sau khi sử dụng hỗn hợp

probiotics gồm L. acidophilus và Bifidobacterium bifidum [23].
7

b. Củng cố hàng rào miễn dịch và không miễn dịch chống lại các nhiễm
khuẩn đường ruột
Lactobacillus acidophilus có tác dụng đối kháng lại sự phát triển của các vi
khuẩn gây bệnh đường ruột như Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium,
Yersinia enterocolitica và Clostridium perfringens thông qua cơ chế kháng vi sinh
vật, bằng cách cạnh tranh chất dinh dưỡng, năng lượng cũng như vị trí bám lên
niêm mạc ruột của các vi khuẩn gây bệnh và sinh ra các chất có tác dụng kháng
khuẩn làm cho vi khuẩn có hại không phát triển được như: các barteriocine (như:
nisin, lactobrevin, acidophilin, acidolin, lactobacillin, lactocidin và lactolin), acid
lactic, acid acetic, hydrogen peroxide, carbon dioxide, diacetyl… [23].
c. Phòng ngừa bệnh tiêu chảy
Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy probiotics có tác dụng điều trị trong các
trường hợp tiêu chảy do sử dụng kháng sinh ở người lớn, tiêu chảy khi đi du lịch,
cũng như tiêu chảy ở trẻ em do rotavirus. Khi sữa có chứa L. acidophilus, S.
thermophilus và B. longum được dùng cho những bệnh nhân lão suy bị tiêu chảy do
thường xuyên dùng thuốc xổ, tần suất tiêu chảy của người bệnh đã giảm xuống,
đồng thời tình trạng bệnh tiêu chảy cũng được cải thiện [12], [23].
d. Ngăn ngừa ung thư ruột kết
Những thử nghiệm in-vitro và in-vivo gần đây đã chỉ ra rằng vi khuẩn
probiotics có thể làm giảm nguy cơ, tỷ lệ và số lượng các khối u đại tràng, gan và
bàng quang. Hiệu quả bảo vệ chống lại sự phát triển ung thư có thể do liên kết của
chất gây đột biến với vi khuẩn đường ruột, hoặc do khả năng ức chế sự tăng trưởng
của vi khuẩn chuyển đổi procarcinogens thành chất gây ung thư, do đó làm giảm
lượng chất gây ung thư trong ruột, hoặc chỉ đơn thuần là ức chế sự phát triển của
các khối u bằng cách tăng cường hệ thống miễn dịch của vật chủ… [23].
e. Ngăn ngừa cholesterol máu cao
8

L. acidophilus có tác dụng phân giải các acid mật thành các acid tự do. Các
acid tự do này được đào thải khỏi đường tiêu hóa nhanh hơn nhiều so với các acid
mật dạng kết hợp khiến nồng độ acid mật giảm xuống, đòi hỏi cơ thể phải tổng hợp
mới acid mật từ cholesterol, gây ra tác dụng giảm nồng độ cholesterol toàn phần
trong cơ thể [11], [22], [39].
f. Cải thiện khả năng dung nạp lactose
L. acidophilus có khả năng sản sinh ra β-D-galactosidase có tác dụng hỗ trợ
tiêu hóa và cải thiện khả năng dung nạp lactose. Tác dụng này đã được chứng minh
khi sữa chua được tiệt trùng và làm đông đã làm mất hoạt tính của β-D-
galactosidase [23].
1.3.3. Một số chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus trên thị trường
 Abiiogran
 Nơi sản xuất: DaeHan NewPharm Co.
 Thành phần: Lactobacillus acidophilus: 75mg ( 1×10
8
vi khuẩn sống). Mã
ATC: A07FA01.
 Tá dược: Lactose, corn starch, hydroxypropylcellulose.
 Dạng bào chế và hàm lượng: Dạng cốm hạt, hộp 10 gói, 1g/gói.
 Lactomin plus
 Thành phần: Hỗn hợp vi khuẩn lactic dạng vi nang gồm: Lactobacillus
acidophilus, Bifidobacterium longum, Streptococcus faecalis (1.10
8
cfu/g):
300mg
 Tá dược: Bột Vegetable cream, fructo-oligosaccharid, bột hương yaourt.
 Nhà sản xuất: Novarex / Me-Auspharm JV.
 Pro-X10
 Thành phần: Vi nang probiotics chứa: 8.10

9
CFU (Bifidobacterium breve,
Bifidobacterium lactis, L. acidophilus, L. plantarum, L. rhamnosus);
Lactobacillus salivarius 2.10
9
CFU; Bacillus subtilis 4.10
9
CFU;
Saccharomyces boulardii 4.10
9
CFU, Actazin : 250mg.
 Nhà sản xuất: Biotrust.
9

1.4. Kỹ thuật sản xuất pellet bằng phương pháp đùn – tạo cầu
1.4.1. Định nghĩa pellet
Pellet là những “hạt thuốc nhỏ” có dạng hình cầu hoặc gần như cầu, thường
có đường kính từ 0,25mm đến 1,5mm; được hình thành do quá trình liên kết của các
tiểu phân dược chất với các tá dược khác nhau. Pellet có thể là một dạng bào chế
hoàn chỉnh hoặc là những “chế phẩm trung gian” được đóng vào nang cứng, dập
thành viên mới hoặc bao màng bảo vệ rồi đóng nang,… tạo thành các chế phẩm
hoàn chỉnh [2], [3], [34].
1.4.2. Ưu – nhược điểm của pellet
 Ưu điểm
Pellet dễ dàng phân tán đều khắp trong dạ dày, hạn chế được tác dụng kích
ứng tại chỗ của dược chất, giảm bớt nguy cơ gây tổn thương niêm mạc dạ dày. Do
có kích thước nhỏ nên các pellet dễ dàng đi qua môn vị xuống ruột non, giảm thời
gian lưu thuốc ở dạ dày, tạo điều kiện cho quá trình hấp thu dược chất xảy ra nhanh
hơn và triệt để hơn, làm tăng sinh khả dụng của thuốc. Sử dụng viên nén hoặc nang
thuốc bào chế từ pellet bao tan ở ruột sẽ khắc phục được hiện tượng dồn liều hoặc

viên không rã như đã từng gặp ở viên nén bao tan trong ruột [2], [3].
Việc bao màng cho pellet thuận lợi hơn nhiều so với bao màng viên nén hay
bao hạt (do pellet có hình cầu, bề mặt trơn nhẵn). Pellet có độ trơn chảy tốt nên dễ
dàng thu được viên nén hay nang thuốc có khối lượng hay hàm lượng dược chất có
độ đồng nhất và độ lặp lại cao [2], [3].
Nhờ công nghệ pellet mà các dược chất tương kị nhau vẫn có thể kết hợp
trong cùng một viên nén hoặc nang thuốc. Ngoài ra còn có thể bào chế các chế
phẩm thuốc có tác dụng kéo dài từ pellet [2], [3].
 Nhược điểm
Quy trình bào chế thường kéo dài và chi phí khá cao. Thời gian để hoàn
thành một pellet có thể kéo dài nhiều giờ hay nhiều ngày phụ thuộc vào loại thiết bị
và phương pháp bào chế được áp dụng [3].
10

Trong quá trình bào chế có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng của
pellet thu được. Do vậy đòi hỏi phải có quá trình nghiên cứu đầy đủ mới có thể bào
chế được pellet có chất lượng như mong muốn [3].
1.4.3. Thành phần của pellet
Các tá dược thường dùng trong pellet gồm [2], [3]:
Bảng 1.1. Một số tá dược dùng trong công thức bào chế pellet
Nhóm
tá dược
Vai trò Một số tá dược điển hình
Tá dược
tạo cầu
Giúp pellet tạo được hình cầu hoàn
chỉnh
Cellulose vi tinh thể (avicel pH
101, avicel pH 102),
carboxymethyl cellulose,…

Tá dược
độn
Còn gọi là tá dược pha loãng, được
thêm vào để đảm bảo khối lượng
cần thiết của pellet hoặc để cải
thiện tính chất cơ lí của dược chất,
giúp cho quá trình tạo pellet được
thuận lợi
Lactose, manitol, tinh bột,
cellulose vi tinh thể, calci
sulfat, calci dibasic
phosphat,…
Tá dược
dính
Là tác nhân liên kết các tiểu phân
tạo độ bền cơ học thích hợp
Hydroxypropyl methyl
cellulose, hydroxypropyl
cellulose, methyl cellulose,
gelatin,…
Tá dược
trơn
Làm giảm ma sát giữa các tiểu
phân với nhau và giữa các tiểu phân
với bề mặt của thiết bị tạo pellet
Aerosil, magnesi stearat,
talc,…
Tá dược
rã
Làm cho pellet rã nhanh và mịn,

giải phóng tối đa bề mặt tiếp xúc
ban đầu của tiểu phân dược chất
với môi trường hòa tan
Natri starch glycolat, natri
crosscarmellose,
crosspovidone,…
11

Tá dược đưa vào giúp cho pellet có độ bền cơ học thích hợp, không bị vụn
bở trong quá trình sản xuất, đảm bảo độ đồng nhất về hình dạng, tính chất bề mặt,
kích thước và tốc độ giải phóng dược chất.
1.4.4. Các phương pháp bào chế pellet
Để bào chế pellet có nhiều phương pháp khác nhau, mỗi phương pháp đều có
thiết bị chuyên dụng riêng và cho pellet có đặc tính khác nhau. Các phương pháp
bào chế pellet bao gồm [3]:
 Phương pháp đùn – tạo cầu
 Phương pháp bồi dần
 Phương pháp phun sấy
 Phương pháp phun đông tụ
Phương pháp đùn – tạo cầu
Đùn – tạo cầu là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp
sản xuất thuốc do có ưu thế về năng suất và chất lượng pellet thu được. Quá trình
tạo pellet bao gồm các bước sau:

Hình 1.2: Sơ đồ các bước sản xuất pellet bằng phương pháp đùn – tạo cầu
Tạo khối ẩm
Đùn
Vo tạo cầu
Làm khô
Trộn bột khô
12

 Trộn bột khô: Dược chất và các tá dược sau khi qua bước nghiền mịn thành
bột có kích thước tiểu phân xác định được trộn bột khô tạo khối bột phân tán đồng
nhất [3], [25].
 Tạo khối ẩm: Thêm tá dược dính lỏng vào hỗn hợp bột và nhào trộn thành
một khối ẩm có độ dẻo thích hợp cho quá trình đùn. Sau khi nhào ẩm xong, ủ khối
bột ẩm để pha lỏng phân bố cân bằng trong toàn bộ khối ẩm, cũng như các thành
phần tạo cầu có thể trương nở, giúp khối bột có đủ độ dẻo cần thiết trong quá trình
tạo cầu sau khi đùn [3], [29].
Tá dược dính và dung môi có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng hình thành liên
kết giữa các tiểu phân dược chất và tá dược. Nếu lượng dược chất quá ít, liên kết
không hình thành sẽ không tạo được pellet; ngược lại, tá dược dính quá nhiều sẽ
khiến pellet có hình dùi trống, không tạo được hình cầu hoàn chỉnh [24].
Độ ẩm của khối bột là một yếu tố quan trọng trong quá trình tạo pellet. Quá
trình đùn yêu cầu khối bột phải đủ dẻo để hình thành sợi đùn, nhưng nếu quá dẻo sẽ
khiến khối bột bị dính lại với nhau trong quá trình đùn và vo [3], [21].
 Đùn: Khối ẩm được đùn qua sàng máy đùn tạo thành các sợi hình trụ có
đường kính đồng nhất. Các sợi đùn phải đủ dẻo để có thể biến dạng, nhưng cũng
không quá dẻo khiến cho các tiểu phân dính vào nhau trong quá trình vo tạo cầu [3],
[35].
Tốc độ đùn quá cao sẽ cho sợi đùn có bề mặt thô ráp, sinh ra nhiều bột mịn
và pellet tạo thành sẽ không đồng đều về kích thước, tỉ lệ vụn nát cao [3], [35].

Kích thước mắt sàng sẽ quyết định đường kính pellet tạo thành. Tùy theo
mục đích sử dụng pellet để chọn mắt sàng có kích thước phù hợp.
 Vo tạo cầu: Trong quá trình tạo cầu, các sợi sẽ được cắt thành các tiểu phân
hình ống có chiều dài tương đương với đường kính, sau đó được làm tròn bằng lực
ma sát, tạo thành các tiểu phân hình cầu. Thời gian tạo pellet thường kéo dài từ 2 –
10 phút với tốc độ quay của đĩa khoảng 200 – 400 vòng/phút [3].
Tốc độ tạo cầu lớn sẽ tạo nhiều bột mịn nếu sợi không đủ ẩm; ngược lại, nếu
sợi đủ ẩm, số lượng các tiểu phân mịn giảm, đồng thời đường kính trung bình của
13

pellet sẽ tăng lên. Thời gian tạo cầu tăng sẽ thu được pellet có kích thước đồng nhất,
chắc, tỉ trọng lớn hơn, pellet có dạng cầu hoàn chỉnh hơn. Khối lượng một mẻ tạo
cầu tăng sẽ làm tăng độ cứng và giảm độ cầu của sản phẩm [3].
 Làm khô: Pellet sao khi được tạo thành sẽ được đem đi làm khô nhằm đạt
được độ ẩm mong muốn cho pellet với nhiều phương pháp làm khô khác nhau như:
đông khô, sấy bằng tủ sấy hoặc thiết bị sấy tầng sôi [4].

14

CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Nguyên vật liệu
 Nguyên liệu chứa vi sinh vật
 Bột nguyên liệu chứa Lactobacillus acidophilus (Ấn Độ): của hãng Unique
Biotech Limited.
 Chủng vi sinh vật Lactobacillus acidophilus ATCC 4563 (Bộ môn Công
Nghiệp Dược – Trường đại học Dược Hà Nội).
 Nguyên liệu pha môi trường
Bảng 2.1: Các hóa chất dùng trong nghiên cứu
Tên hóa chất Nguồn gốc Tên hóa chất Nguồn gốc
Glucose Trung Quốc Sữa gầy Trung Quốc
Pepton Merk-Đức; Ấn Độ MnSO
4
.4H
2
O Trung Quốc
Cao thịt Merk- Đức Triamoni citrate Trung Quốc
Cao nấm men Merk- Đức Acetat natri Trung Quốc
K
2
HPO
4
Trung Quốc Natri clorid Trung Quốc
MgSO4.7H2O

Trung Quốc Thạch agar Việt Nam

 Tá dược sử dụng
Bảng 2.2: Các tá dược sử dụng trong nghiên cứu
Tên tá dược Nguồn gốc
Avicel PH 101 Braxin
Natri starch glycolat Trung Quốc
HPMC E6 Trung Quốc
Lactose Trung Quốc
Aerosil Trung Quốc

2.1.2. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu
15

 Môi trường MRS lỏng (MT1)
Glucose 20g Acetat natri 5g
Pepton 10g K
2
HPO
4
2g
Cao thịt 10g MgSO
4
.7H
2
O 0,2g
Cao nấm men 5g MnSO
4
.4H
2

O 0,05g
Triamoni citrate 2g Nước máy vừa đủ 1000ml
pH 6,8 ÷ 7,0
 Môi trường MRS thạch (MT2)
MT2 = MT1 + Thạch agar (20g/1000ml môi trường)
2.1.3. Thiết bị
Bảng 2.3. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
Tên thiết bị Nguồn gốc
Máy đùn – tạo cầu Trung Quốc (QZJ)
Máy sấy tầng sôi Đức (diosna)
Tủ cấy vô trùng Nhật (Sanyo)
Tủ ấm CO
2
Nhật (Sanyo)
Tủ lạnh sâu Đức
Tủ lạnh LG Hàn Quốc
Thiết bị đông khô Đức
Máy li tâm Đức
Nồi hấp tiệt khuẩn ALP - Nhật
Cân phân tích Đức (Satorious)
Cân kĩ thuật Đức (Satorious)
Máy đo hàm ẩm Mỹ (Ohaus)
Máy khuấy từ Hàn Quốc (Wisd)
Máy lắc (Vortex)
Đĩa petri, ống nghiệm, đầu côn, …
16

2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Tạo pellet probiotics chứa Lactobacillus acidophilus
 Khảo sát nồng độ tá dược dính HPMC E6.

 Khảo sát thời gian ủ.
 Khảo sát phương pháp làm khô.
 Khảo sát thời gian làm khô bằng máy sấy tầng sôi.
 Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của pellet.
2.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của một số giai đoạn trong quá trình tạo pellet đến
sự sống sót của vi sinh vật và theo dõi độ ổn định của pellet probiotics
 Đánh giá ảnh hưởng của một số giai đoạn trong quá trình tạo pellet đến sự
sống sót của vi sinh vật.
 Theo dõi độ ổn định của pellet probiotics trong quá trình bảo quản.
2.2.3. Nghiên cứu cải thiện số lượng vi sinh vật trong pellet sản phẩm
 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu chứa VSV trong công thức bào chế
pellet đến số lượng VSV thu được trong pellet sản phẩm.
 Khảo sát số lượng vi sinh vật trong pellet tạo thành khi thay đổi nguyên liệu
chứa vi sinh vật trong công thức bào chế.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp nhân giống
Pha môi trường MRS lỏng theo công thức ở mục 2.1.2. Hòa tan hết các thành
phần. Chia đều môi trường vào các ống nghiệm sạch, mỗi ống nghiệm 10 ml, nút
kín ống nghiệm rồi đem đi hấp tiệt trùng ở điều kiện 0,6 atm trong 20 phút bằng nồi
hấp tiệt trùng. Để nguội ống nghiệm rồi cấy giống vào các ống nghiệm. Ủ trong tủ
ấm ở điều kiện 37
o
C, 5% CO
2
trong 24h [10].
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào
Pha 100ml môi trường MRS lỏng theo tỉ lệ như trong công thức ở mục 2.1.2
trong cốc có mỏ. Hòa tan hết các thành phần rồi cho vào bình nón dung tích thích
hợp. Nút bông kín và hấp tiệt trùng ở điều kiện 0,6 atm trong 20 phút. Để nguội, cấy