Ứng dụng phương pháp đẩy qua màng trong nghiên cứu tạo liposom doxorubicin kích cỡ nano

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
HỒ TRỌNG TOÀN
ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐẨY
QUA MÀNG TRONG NGHIÊN CỨU
TẠO LIPOSOM-DOXORUBICIN
KÍCHCỠ NANO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ
HÀ NỘI - 2013
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
HỒ TRỌNG TOÀN
ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐẨY
QUA MÀNG TRONG NGHIÊN CỨU
TẠO LIPOSOM-DOXORUBICIN
KÍCH CỠ NANO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ
Người hướng dẫn:
1.TS. Nguyễn Thị Lập
2.ThS. Bùi Bá Minh
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Hóa sinh
2. Bộ môn Bào chế
3. Viện Công nghệ sinh học
HÀ NỘI - 2013
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin biết bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
TS. Nguyễn Thị Lập
Cô đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực
hiện đề tài này. Cô đã luôn động viên và chỉ cho tôi hướng giải quyết vấn đề, để tôi có thể hoàn
thành các mục tiêu của đề tài.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Bùi Bá Minh, thầy đã cho tôi những lời
khuyên bổ ích trong quá trình nghiên cứu.
Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Lê Quang Huấn, ThS. Lê Thị Thùy Dương cùng các cán bộ
công tác tại phòng Công nghệ tế bào động vật – Viện công nghệ sinh học, những người đã nhiệt
tình giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành khóa luận.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô và các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa sinh, Bào chế -
Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè, những người đã luôn động viên giúp đỡ tôi
hoàn thành tốt đề tài của mình.
Hà Nội, 21/05/2013
Sinh viên
Hồ Trọng Toàn
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………… 1
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN………………………………………………… 2
1.1 Đại cương về liposom 2
1.2 Nguyên liệu 3
1.2.1 Doxorubicin hydroclorid………………………………………………… 3
1.2.2 Phospholipid …………………………………………………………… 5
1.2.3 Cholesterol……………………………………………………………………… 6
1.2.4 Các thành phần khác …………………………………………………………… 7
1.3 Các phương pháp chế tạo liposom……………………………………………… 7
1.3.1 Phương pháp Bangham………………………………………………………… 7
1.3.2 Phương pháp bốc hơi pha đảo (REV)…………………………………………….9
1.4 Các phương pháp làm nhỏ kích thước và đồng nhất hóa tiểu phân
liposom 9
1.4.1 Tầm quan trọng của việc làm nhỏ kích thước tiểu phân………………………….9

1.4.2 Phương pháp siêu âm……………………………………………………………10
1.4.3 Phương pháp đẩy qua màng (Membrane extrusion)…………………… 11
1.5 Các phương pháp liposom hóa doxorubicin………………………………… 15
1.5.1 Cơ chế thụ động…………………………………………………………………15
1.5.2 Cơ chế chủ động……………………………………………………… 15
CHƯƠNG II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………… 18
2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị………………………………………………… 18
2.1.1 Nguyên liệu…………………………………………………………………… 18
2.1.2 Hóa chất…………………………………………………………………………18
2.1.3 Thiết bị thí nghiệm………………………………………………………………18
2.2 Nội dung nghiên cứu…………………………………………………… 18
2.2.1 Chế tạo liposom DOX kích cỡ nano…………………………………… 18
2.2.2 So sánh đặc điểm và tính chất của các tiểu phân liposom thu được sau đồng nhất hóa bằng
phương pháp đẩy qua màng với phương pháp siêu âm 19
2.3 Phương pháp nghiên cứu……………………………………………………… 19
2.3.1 Phương pháp chế tạo liposom DOX…………………………………………… 19
2.3.2 Phương pháp đánh giá liposom tạo thành……………………………… 23
CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN …………………………………… 26
3.1 Kết quả……………………………………………………………………………26
3.1.1 Nghiên cứu ứng dụng phương pháp đẩy qua màng trong giảm kích thước và đồng nhất hóa
tiểu phân liposom……………………………………………………………26
3.1.2 Hiệu suất liposom hóa doxorubicin…………………………………… 34
3.2 Bàn luận 37
3.2.1 Chế tạo liposom không mang dược chất……………………………………… 37
3.2.2 Giảm kích thước và đồng nhất hóa tiểu phân liposom ……………………… 38
3.2.2 Liposom hóa DOX và loại DOX tự do bên ngoài liposom…………………… 41
Kết luận và đề xuất………………………………………………………… 43
Tài liệu tham khảo
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DSPC 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine

DPPC 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
DMPC 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine
EPC Egg phosphatidylcholin
HEPC Hydrogenated Egg phosphatidylcholin
SPC Soy phosphatidylcholin
HSPC Hydrogenated soy phosphatidylcholin
LUV Large unilamellar vesicle
MLV Multilamellar large vesicle
PBS Phosphate buffered saline
PDI Polydispersity index
PEG Polyethylene glycol
PEG-PE Polyethylene glycol - phosphatidylethanolamin
RES Reticulo endothelial system
REV Rehydration evaporation vesicle
TEM Transmission electron microscopy
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Nguyên liệu chế tạo liposom DOX
Bảng 3.1 Các thông số đánh giá tiểu phân liposom thu được sau các lần đẩy qua màng
400nm
Bảng 3.2 Các thông số đánh giá tiểu phân liposom thu được sau các lần đẩy qua màng
80nm
Bảng 3.3 Kích thước tiểu phân, chỉ số đa phân tán của hệliposom sau giảm kích thước và
đồng nhất hóa theo hai phương pháp: đẩy qua màng và siêu âm đầu dò
Bảng 3.4 Phân bố kích thước tiểu phân theo thể tích
Bảng 3.5 Mật độ quang của dung dịch DOX ở các nồng độ khác nhau
Bảng 3.6 Kết quả định lượng DOX
Bảng 3.7 Hiệu suất liposom hóa DOX thu được từ 2 phương pháp đồng nhất hóa và giảm
kích thước tiểu phân lên hiệu suất liposom hóa DOX : đẩy qua màng và siêu âm
đầu dò
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cấu tạo liposom
Hình 1.2 Cơ chế hình thành liposom theo phương pháp Bangham
Hình 1.3 Cơ chế giảm kích thước liposom trong phương pháp đẩy qua màng
Hình 1.4 Ảnh hưởng của số lần đẩy qua màng lên kích thước tiểu phân liposom
Hình 1.5 Thể tích lõi nước trong liposom thu được sau đồng nhất hóa theo 2 phương
pháp: kết hợp đông chảy và đẩy qua màng ; đẩy qua màng
Hình 1.6 Cơ chế liposom hóa DOX bằng kỹ thuật gradient amoni
Hình 2.1 Sơ đồ chế tạo liposom DOX
Hình 3.1 Đồ thị biến thiên PDI theo số lần đẩy qua màng 400nm
Hình 3.2 Biểu đồ phân bố kích thước theo % thể tích qua các lần đẩy của các phân tử kích
thước nhỏ
Hình 3.3 Biểu đồ phân bố kích thướctheo % thể tích qua các lần đẩy của các phân tử kích
thước lớn
Hình 3.4 Đồ thị biến thiên PDI theo số lần đẩy qua màng 80nm
Hình 3.5 Kích thước tiểu phân liposom qua các lần đẩy qua màng 80nm
Hình 3.6 Ảnh chụp TEM liposom (độ phóng đại 20000 lần)
Hình 3.7 Mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ DOX
ĐẶT VẤN ĐỀ
Liposom là một trong những hệ mang thuốc mới đang nhận được nhiều sự quan tâm của
các nhà khoa học trên thế giới nhờ có nhiều ưu điểm về khả năng mang thuốc, kiểm soát giải
phóng và khả năng đưa thuốc tới đích tác dụng.
Nhằm bắt kịp các tiến bộ của khoa học công nghệ trong lĩnh vực y dược học trên thế giới,
trong những năm gần đây, trường đại học Dược Hà Nội đã tiến hành nhiều đề tài khoa học để
đánh giá khả năng sử dụng liposom trong vận chuyển thuốc. Trong đó liposom doxorubicin được
nghiên cứu nhiều nhất và đã thu được một số kết quả đáng khích lệ. Tuy nhiên quy trình chế tạo
liposom vẫn chưa hoàn thiện, đặc biệt là trong giai đoạn giảm kích thước và đồng nhất hóa
liposom.
Đề tài “Ứng dụng phương pháp đẩy qua màng trong nghiên cứu tạo liposom-doxorubicin
kích cỡ nano” được tiến hành nhằm áp dụng một phương pháp mới- phương pháp đẩy qua màng
vào giai đoạn giảm kích thước tiểu phân, với mục đích hoàn thiện hơn nữa quy trình chế tạo

liposom.
Đề tài được thực hiện với 2 mục tiêu :
 Nghiên cứu ứng dụng phương pháp đẩy qua màng để giảm kích thước tiểu
phân liposom
 So sánh ưu nhược điểm của phương pháp đẩy qua màng với phương pháp
siêu âm được sử dụng ở các nghiên cứu trước đó.
CHƯƠNG I : TỔNG QUAN
1.1 Đại cương về liposom
Liposom có cấu tạo bao gồm một nhân nước ở giữa được bao bọc bởi một hay nhiều lớp
phospholipid kép, có kích thước thay đổi từ hàng chục đến hàng ngàn nanomet [5]. Cấu tạo
liposom được minh họa trên hình 1.1. Liposom cấu tạo chính từ 2 thành phần: phospholipid (PL)
và cholesterol.
Hình 1.1 Cấu tạo liposom
Trong dược học, liposom được ứng dụng làm hệ mang thuốc vì có rất nhiều ưu điểm.
Liposom có khả năng mang thuốc rất đa dạng có thể là phân tử thuốc, protein, nucleotid, thậm
chí cả plasmid [26].
1.2 Nguyên liệu
1.2.1 Doxorubicin hydroclorid (DOX)
1.2.1.1 Công thức
Công thức phân tử : C
27
H
29
NO
11
.HCl
Khối lượng phân tử : 579.99
Tên khoa học: 8-Hydroxyacetyl (8S,10S)-10-[(3-amino-2,3,6-trideoxy-αl-lyxohexopyranosyl)
oxy]-6,8,11-trihydroxy-1-methoxy-7,8,9,10-tetrahydronaphthacene-5,12-dione [18].
1.2.1.2 Tính chất

- Dạng bột vô định hình hoặc tinh thể, màu đỏ cam, hút ẩm. Nhiệt độ nóng chảy 204
o
C. Tan
trong nước, NaCl 0.9%, methyl alcol, thực tế không tan trong cloroform, ether và các dung môi
hữu cơ khác. Dung dịch 5mg/ml trong nước có pH 4.0 - 5.5 [29].
- DOX có 3 hằng số phân li: pK
a1
8.15; pK
a2
10.16; pK
a3
13.2 [7].
- DOX như là 1 chất chỉ thị màu, màu vàng cam ở pH 7, màu tím ở pH 11, màu xanh ở pH 13
[7].
- Hai tính chất có thể ảnh hưởng trong quá trình chế tạo :
Không bền với ánh sáng ở nồng độ thấp : Tuy nhiên ở nồng độ điều trị thì DOX được
cho là không bị phân hủy đáng kể bởi ánh sáng. Dung dịch DOX trong NaCl 0.9 % có thể ổn
định trong 24 ngày khi bảo quản trong lọ PVC ở 25
0
C và lâu hơn nếu bảo quản trong xylanh
làm bằng polypropylene ở 4
0
C [4].
Các phân tử DOX có xu hướng tự kiên kết với nhau (dime hóa ), điều nay phụ thuộc vào
nồng độ, phương pháp hòa tan, môi trường đệm sử dụng [7].
- Phổ hấp thụ có khoảng bước sóng 220-550nm có 2 đỉnh cực đại rõ ở 234, 252nm và 4 cực đại
yếu ở 288, 475, 495 và 530nm [10].
1.2.1.3 Định lượng
Phương pháp đo quang phổ hấp thụ :
Đo độ hấp thụ quang ở bước bước sóng 480nm hoặc 495nm bằng máy quang phổ UV-

VIS [16, 19, 30].
1.2.1.4 Dược động học, dược lực học , chỉ định và độc tính
Dược động học
Sau khi tiêm tĩnh mạch, doxorubicin nhanh chóng phân bố đến phổi, gan, tim, lách, thận.
Doxorubicin bị chuyển hóa nhanh ở gạn tạo thành doxorubicinol. Sau khi tiêm tĩnh mạch thuốc
thải trừ qua 3 giai đoạn với các thời điểm 12 phút, 3,3 giờ, 30 giờ tương ứng với nồng độ thuốc
trong máu giảm đi một nửa.
Có sự khác biệt quan trọng giữa dược động học của liposom-DOX với DOX dạng tự do.
DOX khi gắn với liposom đã PEG hóa giảm được tỷ lệ bị tóm bắt bởi đại thực bào dẫn đến kéo
dài thời gian tồn tại trong vòng tuần hoàn và cũng ít phân bố tới các mô lành. Liposom-DOX đã
PEG hóa thải trừ qua 2 pha và thời gian thải trừ kéo dài hơn, với các thời điểm 5 giờ, 55-75 giờ
Dạng liposom DOX không PEG hóa cũng cho thấy nồng độ đỉnh DOX toàn phần trong
huyết tương cao hơn hẳn so với dạng tự do [1, 18].
Cơ chế tác dụng:
DOX gắn vào DNA làm ức chế các enzym cần thiết để sao chép và phiên mã DNA. DOX
gây gián đoạn mạnh chu kỳ phát triển tế bào ở giai đoạn phân bào S và giai đoạn gián phân
Chỉ định :
Có khả năng diệt nhiều loại tế bào ung thư, được chỉ định trong nhiều thể ung thư như :
ung thư vú, u xương ác tính (sarcom xương) và u xương …
Độc tính :
Thuốc có nhiều tác dụng không mong muốn trong đó có một số tác dụng không mong
muốn nghiêm trọng trên hệ tạo máu, hệ tuần hoàn đặc biệt là trên tim. Độc tính của thuốc phụ
thuộc vào liều và thời gian sử dụng [1].
1.2.2 Phospholipid
Tính chất quan trọng ảnh hưởng chế tạo :
Dễ bị oxy hóa
Ngay cả khi không có mặt của các tác nhân, chuỗi acid béo của phospholipid cũng có thể
dễ dàng bị oxy hóa. Quá trình này xảy ra theo cơ chế gốc tự do. Khởi đầu của quá trình này là
sự tách ra của 1 nguyên tử hydro từ chuỗi lipid do các tác nhân như ion kim loại, bức xạ, sóng
siêu âm…Sự oxy hóa khi có mặt của oxy diễn ra mạnh hơn mà kết quả có thể tạo ra aldehyd, đứt

chuỗi hydrocarbon,tạo ra dạng peroxid. Các phân tử phospholid mức độ bão hòa thấp, nhiều nối
đôi thì khả năng bị oxy hóa cao, điển hình các phospholipid tự nhiên. Khả năng bị oxy hóa tỷ lệ
nghịch với mức độ bão hòa của chuỗi acid béo và tỷ lệ thuận với chỉ số iod [30].
Dễ bị thủy phân
Khi phân tán trong pha nước, phospholipid có thể bị thủy phân thành các acid béo tự do
và 1-acyl và 2-acyl lysophospholipid. Các liên kết ester giữa nhóm OH của glycerol với acid béo
nhạy cảm và dễ bị thủy phân hơn so với liên kết ester của gốc phosphat. Sự thủy phân được xúc
tác bởi acid và bazơ. Sự thủy phân xảy ra tối thiểu khi pH bề mặt liposom là 6.5. Điện thế bề
mặt liposom ảnh hưởng đến pH bề mặt qua đó ảnh hưởng đến sự thủy phân lớp phospholipd
kép. Ảnh hưởng của pH bề mặt thể hiện rõ hơn ở nhiệt độ thấp, cụ thể là ở 4
0
C, pH 4 thì tốc độ
thủy phân tăng dần theo thứ tự DSPC< DPPC< EPC ≈ DMPC. Tuy nhiên ở nhiệt độ 20
o
C, 30
o
C không có sự khác biệt trong tốc độ thủy phân.
Sự thủy phân phospholipid ở lớp màng kép có thể gây nên những thay đổi :
- Giảm tính thấm của lớp màng kép với các phân tử tan trong nước từ đó ảnh hưởng đến việc
đưa dược chất vào trong liposom
- Quá trình thủy phân diễn ra đến một tỷ lệ nhất định, phospholipid có thể chuyển từ dạng màng
kép sang dạng micelle. Ảnh hưởng đến tính chất chuyển pha của màng.
- Khi tỷ lệ phospholipid bị thủy phân trên 40% sẽ dẫn đến tăng kích thước liposom, mở rộng
đường phân bố kích thước [30].
Nhiệt độ chuyển pha
Nhiệt độ chuyển pha Tc (gel-to-liquid crystalline phase transition): là nhiệt độ mà ở đó
màng phospholipid chuyển từ pha gel hoặc tinh thể sắp xếp có trật tự sang pha tinh thể lỏng. Pha
tinh thể lỏnglà pha chuyển tiếp giữa 2 pha tinh thể và pha lỏng với những tính chất đặc biệt. Các
phân tử trong pha này vừa có tính trật tự và định hướng vị trí của pha tinh thể rắn vừa có tính
hỗn loạn của pha lỏng. Tc của phospholipid phụ thuộc vào nhóm gắn vào đầu phosphat và độ

dài và độ bão hòa của hai chuỗi hydrocarbon đầu không no. Với các nhóm gắn vào đầu phosphat
khác nhau thì có Tc khác nhau ví dụ: dipalmitolphospholipid có nhóm gắn cholin Tc=41.4
o
C,
với nhóm gắn là ethanolamine Tc=64
o
C. Cùng 1 nhóm gắn đầu phosphat, chuỗi hyđrocarbon
đầu không no càng dài, mức độ bão hòa càng cao thì Tc càng tăng. Với chuỗi hydrocarbon
không no, nối đôi ở cấu hình transcó Tc cao hơn cấu hình cis. Lớp phospholipid kép ở pha tinh
thể lỏng có những tính chất đặc biệt về khả năng thấm, tính linh động của màng, đây là tính chất
quan trọng sử dụng trong chế tạo liposom [28, 30].
1.2.3 Cholesterol
Cholesterol là thành phần thường được thêm vào trong công thức liposom để điểu chỉnh
tính lỏng, kiểm soát tốc độ giải phóng của các chất thân nước đã vi liposom hóa, tăng độ ổn định
trong môi trường in vitro, in vivo. Cholesterol cũng ảnh hưởng đến nhiệt độ chuyển pha của lớp
màng kép. Ảnh hưởng này phụ thuộc vào nồng độ. Katrin K.Halling và cộng sự đã nghiên cứu
ảnh hưởng của cholesterol lên sự chuyển pha của DPPC thấy rằng: cholesterol có nồng độ từ 5-
15% mol trong công thức làm giảm Tc của DPPC, và nồng độ chiếm 25-35% mol sẽ làm tăng
nhiệt độ chuyển pha của DPPC. Khi nồng độ Cholesterol lớn hơn 50% mol sẽ làm mất nhiệt độ
chuyển pha của DPPC [13].
1.2.4 Các thành phần khác
- Để tăng thời gian tuần hoàn sinh học của liposom, người ta gắn thêm PEG lên bề mặt liposom.
PEG có vai trò ngăn cản sự gắn của các protein huyết thanh lên bề mặt liposom do đó làm chậm
quá trình opsonin hóa, giảm quá trình tóm bắt và đào thải liposom [3, 30].
- Dùng các chất tích điện, tạo ra lực đẩy tĩnh điện giữa các lớp vỏ của liposom dẫn đến tăng thể
tích khoang nước, tăng khả năng nạp các dược chất thân nước. Điện tích trên bề mặt màng cũng
giúp chống lại hiện tượng kết tụ tiểu phân, giúp hệ ổn định hơn [2, 5].
- Một hợp chất quan trọng thường được thêm vào là tocopherol. Nó hoạt động như một chất
chống oxy hóa thông qua cơ chế ngăn chặn sự hình thành peroxyd, tăng tuổi thọ liposom [2].
1.3 Các phương pháp chế tạo liposom

1.3.1 Phương pháp Bangham
Bangham giới thiệu vào năm 1965: hòa tan phospholipid và các thành phần tạo vỏ
liposom vào dung môi hữu cơ thích hợp thường sử dụng cloroform, methanol. Bốc hơi dung môi
dưới áp suất giảm trong bình cất quay, lipid sẽ tạo thành màng mỏng bám trên thành bình cất.
Hydrat hóa lớp film lipid tạo liposom. Cơ chế tạo liposom theo phương pháp Bangham được thể
hiện trên hình 1.2
Hình 1.2 Cơ chế hình thành liposom theo phương pháp Bangham
Dược chất được phối hợp vào liposom trong quá trình chế tạo: dược chất thân nước thì
hòa tan vào pha nước, dược chất thân dầu thì cho vào dung dịch phospholipid. Như vậy, trong
liposom, dược chất tan trong nước sẽ nằm trong khoang nước, còn dược chất tan trong dầu sẽ
nằm ở lớp vỏ [5].
Năm 2010 Felicitas Lewrick và Regine Peschka Süss [16] đã tiến hành nghiên cứu và chế
tạo liposom DOX bằng phương pháp Bangham với một số cải tiến. Công thức liposom bao gồm
SPC và cholesterol theo tỷ lệ mol 7:3. Hỗn hợp trên được hòa tan trong dicloromthan, cất quay
trong 1giờ thu lớp film lipid. Hydrat hóa bằng dung dịch amonisulfat 250mM pH 6.5 sao cho
nồng độ lipid là 20mM. Hỗn dịch liposom thu được sau hydrat hóa được đẩy qua màng
polycarbonat dưới áp suất 12 bar. Sau khi đẩy qua màng có kích thước lỗ 200nm 7 lần và 11 lần
qua màng 80nm, thu được hệ liposom có kích thước 105 ± 10 nm, PDI bé hơn 0.08.
1.3.2 Phương pháp bốc hơi pha đảo (REV)
Phương pháp được Szoka và Papahadjopoulos giới thiệu 1978, bằng việc tạo ra REV
liposom có khoang nước lớn và hiệu suất liposom hóa cao [30].
Nội dung phương pháp :
Hòa tan phospholipid và các thành phần tạo vỏ trong dung môi hữu cơ, diethyl ether và
isopropyl ether là các dung môi thường được lựa chọn. Một số lipid kém tan trong ether có thể
sử dụng thêm cloroform và ethanol để tăng độ tan. Cho pha nước vào và tác động bằng siêu âm
để tạo nhũ tương mịn N/D. Quá trình siêu âm có vai trò quyết định đến kích thước, độ đồng nhất
của nhũ tương liposom. Cần kiểm soát yếu tố nhiệt độ và thời gian trong quá trình siêu âm. Sau
siêu âm, để nhũ tương ổn định, cất quay loại dung môi hữu cơ dưới áp suất giảm [5, 26, 30].
REV liposom có thể tạo thành từ nhiều loại lipid, hỗn hợp lipid khác nhau, có thể tích lõi
nước lớn gấp 4 lần MLV tạo từ phương pháp Bangham. Tuy nhiên nhược điểm của phương

pháp là dược chất bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như nhiệt, siêu âm và phơi nhiễm lâu với dung
môi hữu cơ có thể ảnh hưởng đến độ ổn định, ví dụ: protein có nguy cơ biến tính do nhiệt và
dung môi hữu cơ [26, 30].
Pleumchitt và cộng sự đã tiến hành chế tạo liposom chứa amphotericin B từ
phosphatidylcholin và cholesterol tỷ lệ mol 1:1 bằng phương pháp bốc hơi pha đảo. Tỷ lệ thuốc
nạp bằng 2% mol lipid, hiệu suất liposom hóa xấp xỉ 95%, kích thước tiểu phân 1307-1451nm
[25].
1.4 Các phương pháp làm nhỏ kích thước và đồng nhất hóa tiểu phân liposom
1.4.1 Tầm quan trọng của việc làm nhỏ kích thước tiểu phân
Kích thước tiểu phân là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu lực phân phối thuốc
đến khối u. Kích thước tiểu phân ảnh hưởng đến: thời gian thuốc lưu thông trong máu, sự giải
phóng thuốc ra khỏi liposom, sự tích lũy liposom ở khối u. Kích thước tiểu phân còn ảnh hưởng
đến tác dụng điểu trị cũng như độc tính của hệ liposomthuốc [22]. Xu hướng chung của các
liposom có công thức và tỷ lệ các thành phần cấu tạo tương tự nhau là: khi tăng kích thước tiểu
phân thì đồng nghĩa với việc tăng tốc độ liposom bị tóm bắt bởi hệ lưới nội mô (RES). Theo
nghiên cứu của Senior và cộng sự đã chế tạo liposom từ hỗn hợp DSPCvà cholesterol theo tỷ lệ
mol 3:2, liposom được đẩy qua màng có kích thước lỗ 400nm có tốc độ thải trừ nhanh gấp 7.5
lần so với liposom được đẩy qua màng có kích thước lỗ 200nm. Đồng thời liposom được đẩy
qua màng có kích thước lỗ 200nm có tốc độ thải trừ nhanh gấp 5 lần so với SUVs cùng công
thức. Theo Woodle và các cộng sự, khi tăng kích thước tiểu phân liposom từ 100nm lên 200nm
tốc độ thải trừ tăng 54% [12]. Tuy nhiên không phải kích thước liposom càng nhỏ càng tốt mà
liposom có khoảng kích thước phù hợp. Một nghiên cứu về ảnh hưởng của kích thước lên khả
năng tuần hoàn của liposom có thành phần EPC/cholesterol /PEG-PE cho thấy: liposom có kích
thước từ 150-200nm tồn tại lâu hơn trong tuần hoàn, trong khi các liposom có kích thước lớn
hơn 300nm hoặc nhỏ hơn 70nm nhanh chóng bị tóm bắt và tích lũy ở gan và lách.
Mặt khác các phương pháp chế tạo liposom đều tạo ra một hỗn hợp MLVs, có kích thước
lớn, đa lớp, có phân bố kích thước rộng vì vậy việc giảm kích thước và đồng nhất hóa liposom là
bước bắt buộc. Các phương pháp thường được sử dụng để đồng nhất hóa và làm nhỏ kích thước:
siêu âm, đẩy qua màng, đồng nhất hóa dưới áp suất cao và đông chảy [31]. Trong nghiên cứu
này chúng tôi sử dụng 2 phương pháp : siêu âm và đẩy qua màng trong chế tạo liposom.

1.4.2 Phương pháp siêu âm
Siêu âm là một trong những phương pháp đầu tiên, đơn giản và phổ biến nhất để bào chế
SUVs. Trong phương pháp này hệ phân tán liposom MLVs được cung cấp một năng lượng lớn
từ sóng siêu âm và chuyển thành SUVs. Mẫu đem đi siêu âm không cần phải ủ ấm lên trên nhiệt
độ chuyển pha vì nhiệt lượng sinh ra từ quá trình siêu âm là rất lớn. Có 2 kỹ thuật siêu âm: siêu
âm đầu dò và bể siêu âm [9, 30].
Siêu âm là một phương pháp đơn giản nhưng có nhiều nhược điểm :
 Tạo ra các liposom có thể tích khoang nước bé dẫn đến hiệu lực nạp thuốc thấp
 Nhiệt lượng lớn sinh ra trong quá trình siêu âm dẫn đến việc khó kiểm soát được nhiệt độ
của hệ có thể dẫn đến sự biến tính của phospholipid và các chất đã nang hoá do quá nhiệt.
 Mẫu sau khi siêu âm có nguy cơ nhiễm bẩn kim loại từ đầu ống siêu âm.
 Liposom tạo ra là hỗn hợp của SUVs, MLV, LUVs với chỉ số đa phân tán (PDI) cao [9].
1.4.2.1 Kỹ thuật siêu âm đầu dò :
Đầu siêu âm ngập trực tiếp vào trong hỗn dịch liposom, điều chỉnh cho đầu siêu âm
không chạm vào cạnh đáy bình. Trong quá trình siêu âm nhiệt lượng sinh ra rất lớn, vì vậy cần
ngâm mẫu trong nước đá để kiểm soát nhiệt độ. Phương pháp này thích hợp cho lượng mẫu nhỏ
và qui mô chế tạo phòng thí nghiệm. Kết quả thực nghiệm cho thấy nếu siêu âm liên tục trong
1giờ, hơn 5% lipid bị thủy phân [9, 30].
1.4.2.2 Bể siêu âm
Dụng cụ sử dụng đựng mẫu là bình nón đáy phẳng. Trong phương pháp này việc kiểm
soát nhiệt độ dễ dàng hơn, hạn chế được nguy cơ biến tính lipid và dược chất. Mẫu siêu âm có
thể lớn. Tuy nhiên sóng siêu âm phải đi qua môi trường nước, môi trường thủy tinh rồi truyền
tới tiểu phân liposom nên năng lượng giảm đi nhiều dẫn đến thời gian siêu âm kéo dài, mức độ
đồng nhất không cao [3, 9].
1.4.3 Phương pháp đẩy qua màng (Membrane extrusion)
Thập niên 70 của thế kỷ 20, trước khi phương pháp đẩy qua màng được áp dụng, việc chế
tạo LUVs là quá trình phức tạp, tốn thời gian. Kỹ thuật được sử dụng là siêu âm và vi dòng chảy
còn nhiều nhược điểm. Năm 1980, Sozka cùng các đồng sự lần đầu tiên áp dụng kỹ thuật đẩy
qua màng trong chế tạo liposom. Từ đó kỹ thuật đẩy qua màng trở thành một trong những kỹ
thuật tốt nhất trong chế tạo liposom LUVs [21].

Nguyên lý: Mẫu liposom MLVs đươc đẩy bằng áp suất cao qua màng có kích thước lỗ xác định.
Đẩy nhiều lần qua mỗi màng và các màng có kích thước lỗ giảm dần đểthu được SUVs hoặc
LUVs có kích thước mong muốn. Cơ chế chi tiết của quá trình hình thành SUVs, LUVs từ
MLVs trong quá trình đẩy qua màng vẫn còn chưa sáng tỏ, tuy nhiên chắc chắn có sự nén, vỡ
của các liposom đa lớp kích thước lớn và sự tái lập lại để tạo ra các liposom nhỏ đơn, ít lớp hơn
thể hiện trên hình 1.5 [21].
Hình 1.3 Cơ chế giảm kích thước liposom trong phương pháp đẩy qua màng
Liposom được đẩy dưới áp suất khí trơ thường sử dụng là nitơ. Màng có nhiều chất liệu
khác nhau thường được cung cấp bởi chính nhà sản xuất thiết bị để đồng bộ. Tuy nhiên màng
hay được sử dụng là màng polycarbonat đã được thực tế chứng minh là trơ về mặt hóa học, bền
và hiệu quả [21].
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ của quá trình đẩy qua màng như nhiệt độ, áp suất,
kích thước lỗ, mật độ lỗ trên màng. Trước khi tiến hành đẩy qua màng, toàn bộ thiết bị và cả
mẫu liposom được làm nóng trong bể điều nhiệt lên trên nhiệt độ chuyển pha Tc của lipid. Nếu
toàn bộ hệ không được làm nóng lên trên nhiệt độ chuyển pha của lipid thì quá trình đẩy qua
màng xảy ra với tốc độ rất chậm, phải sự dụng áp suất cao và có nguy cơ tắc màng.
Nayar và các cộng sự trong nghiên cứu của mình đã tiến hành chế tạo liposom
DSPC/Cholesterol theo tỷ lệ mol 55:45 và nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình đẩy
qua màng. Quá trình đẩy qua màng tiến hành ở áp suất 34.5 MPa, và hệ phân tán được đẩy qua
màng polycarbonat có kích thước lỗ 100 nm và tiến hành ở 2 nhiệt độ :T
1
< Tc và T
2
> Tc với
Tc=55
o
C. Kết quả cho thấy, khi tiến hành đẩy ở T
1
=40
o

C tốc độ chảy rất chậm 0.06 mL/phút.
Trong khi đó với T
2
= 65
o
C, tốc độ dòng không phụ thuộc vào nhiệt độ, vận tốc dòng chảy gấp
200 so với khi tiến hành với T
1
=40
o
C[23].
Số lần đẩy
Kích
thước
tiểu
phân
(nm)
Hình 1.4 Ảnh hưởng của số lần đẩy qua màng lên kích thước tiểu phân liposom
Đồ thị ở hình 1.6 trích từ nghiên cứu cả Barbara Mui and Michael J.Hope (2007) cho
thấy ảnh hưởng của số lần đẩy lên kích thước tiểu phân liposom: mẫu liposom được đẩy qua
màng có kích thước lỗ 100nm, qua đồ thị ta thấy số lần đẩy tăng lên thì kích thước tiểu phân
giảm đi và về gần với kích thước lỗ [21].
Phương pháp đẩy qua màng có nhiều ưu điểm nổi bật so với các phương khác:
Có thể tiến hành với lượng mẫu lớn, chạy với tốc độ nhanh có thể áp dụng ở quy mô công
nghiệp. Quá trình chạy có thể kiểm soát được nhiệt độ, giảm thiểu nguy cơ biến tính lipid và
dược chất do quá nhiệt.
Trong nghiên cứu của Mohan Kale và các cộng sự: tiến hành chế tạo liposom PEG-
DSPE-2000/HSPC/cholesterol bằng phương pháp Bangham và đồng nhất hóa bằng 2 phương
pháp :đẩy qua màng và đồng nhất hóa dưới áp suất cao, nạp DOX vào liposom bằng kỹ thuật
gradient amoni. Họ đã so sánh các tính chất của liposom thuđược sau đồng nhất hóa theo 2

phương pháp. Kết quả cho thấy, phương pháp đẩy qua màng cho mẫu liposom có độ đồng đều
cao hơn thể hiện qua chỉ số PDI thấp hơn hẳn, ổn định hơn thể hiện qua thế Zeta lớn hơn, khả
năng nạp thuốc cao hơn [14].
Từ khi ra đời từ đầu thập niên 80 đến nay, phương pháp đẩy qua màng đã được áp dụng
rộng rãi và có nhiều cải tiến.
Kích thước lỗ màng
Thể
tích
khoang
nước
(µl/µmol PL)
Hình 1.5 Thể tích lõi nước trong liposom thu được sau đồng nhất hóa theo 2 phương pháp:
kết hợp đông chảy và đẩy qua màng( ) ; đẩy qua màng( )
Năm 1985, Hope, Cullis và các cộng sự đã nghiên cứu và chế tạo thành công liposom có
kích thước khoảng 90nm, độ đồng nhất cao, hiệu lực nạp thuốc lớn bằng cách đẩy nhiều lần qua
màng có kích thước lỗ 100nm [20].
Năm 1986, Hope, Cullis và các đồng sự tiếp tục nghiên cứu kết hợp đông chảy và đẩy qua màng
trong quá trình giảm và đồng nhất kích thước tiểu phân. Các ông đã tiến hành làm đông mẫu
liposom MLVs trong nitơ lỏng và làm chảy trong bể 40
o
C, chu trình lặp lại 5 lần; sau đó tiếp tục
đẩy mẫu nhiều lần qua màng có kích thước lỗ nằm trong khoảng 30-400nm và tiến hành so sánh
với phương pháp đẩy qua màng và thu được những kết quả khả quan. Với màng có kích thước lỗ
100nm kích thước liposom thu được 103 ± 20 nm, với màng 200 nm kích thước liposom là 151±
36 nm [20].
Đồ thị trên hình 1.7 rút ra từ nghiên cứu Hope, Cullis và các đồng sự [20] cho thấy
liposom được đồng nhất hóa theo phương pháp đông chảy kết hợp đẩy qua màng có thể tích
khoang nước lớn hơn khi sử dụng riêng phương pháp đẩy qua màng dù đẩy qua màng cùng kích
thước lỗ. Nghiên cứu cũng cho thấy hiệu suất nạp thuốc của liposom khi sử dụng kết hợp hai
phương pháp tốt hơn liposom chỉ sử dụng phương pháp đẩy qua màng để đồng nhất hóa. Nghiên

cứu chỉ ra rằng tỷ lệ liposom đơn lớp thu được khi phối hợp hai phương pháp cao hơn khi chỉ sử
dụng phương pháp đẩy qua màng, tỷ lệ này lên tới 90% ở mẫu liposom thu được sau khi đẩy
nhiều lần qua màng có kích thước lỗ 200nm [20].
1.5 Các phương pháp liposom hóa doxorubicin
Dược chất có thể đưa vào trong liposom theo cơ chế thụ động hoặc chủ động.
1.5.1 Cơ chế thụ động
Quá trình đưa thuốc vào liposom diễn ra đồng thời với quá trình hình thành liposom.
Theo đó dược chất thân nước sẽ thêm vào pha nước, dược chất thân dầu sẽ thêm vào pha dung
môi hữu cơ, sau đó sẽ tiến hành chế tạo liposom bằng phương pháp thích hợp. Đưa dược chất
vào liposom theo cơ chế thụ động có liposom trong quá trình làm nhỏ và đồng nhất kích thước.
1.5.2 Cơ chế chủ động
Theo cơ chế chủ động, sẽ tiến hành 3 bước theo thứ tự sau:
 Chế tạo liposom bằng phương pháp thích hợp
 Làm giảm kích thước liposom đến kích thước và độ đồng nhất thích hợp
 Đưa dược chất vào liposom
Dược chất được đưa vào liposom bằng cách tạo ra chênh lệch năng lượng hai bên màng
liposom, sự chênh lệch này sẽ tạo động lực để kéo dược chất từ môi trường vào bên trong.
Đối với doxorubicin, có 2 phương pháp thường được sử dụng:
 Kỹ thuật tạo gradient pH trực tiếp hoặc gián tiếp qua gradient ion
 Kỹ thuật tạo gradient amoni
1.5.2.1 Kỹ thuật gradient amoni
Hình 1.6 Cơ chế liposom hóa DOX bằng kỹ thuật gradient amoni
Liposom có môi trường bên trong là amoni sulfat 250 mM. Môi trường bên ngoài liposom
đã được loại sạch ion amoni theo phương pháp thích hợp để tạo ra chênh lệch nồng độ amoni hai
bên màng. Cơ chế liposom hóa DOX bằng kỹ thuật gradient amoni thể hiện trên hình 1.8. Ở bên
trong liposom, NH
4
+
điện ly ra NH
3

và H
+
. Ion NH
3
có khả năng thấm tốt qua màng lipi kép, sẽ
khuếch tán ra bên ngoài. Ở ngoài màng NH
3
kết hợp với H
+
tạo NH
4
+
. Quá trình khuếch tán này
kết thúc khi cân bằng nồng độ amoni 2 bên màng. Khi phối hợp liposom với DOX, dạng không
ion hóa sẽ khuếch tán qua màng vào bên trong. Ở đây, dược chất sẽ kết hợp với ion SO
4
2-
để tạo
ra dạng kết tủa không thấm ra ngoài được. Do bị kết tủa lại nên chênh lệch nồng độ DOX 2 bên
mang lại tiếp tục được duy trì, kết quả là cứ mỗi phân tử NH
3
đi ra sẽ tạo động lực cho 1 phân tử
DOX đi vào trong liposom [4, 10].
XueMing Li và các cộng sự đã tiến hành chế tạo stealth liposom- dạng liposom có thời
gian bán thải kéo dài. Tỷ lệ mol các thành phần liposom DSPC : cholesterol : DSPE–PEG2000–
COOH (6:3:0.6 ). Hòa tan hỗn hợp trên vào hỗn hợp dung môi cloroform : methanol (2:1 v/v),
cất quay ở 53
o
C để tạo lớp màng lipid mỏng. Hydrat bằng dung dịch amoni sulfat 250mM để
nồng độ lipid phân tán là 10mg/ml. Hệ phân tán liposom được đẩy qua màng polycarbonat có

kích thước lỗ 400nm, 200nm, 100nm, mỗi màng 5 lần. Liposom hóa DOX bằng kỹ thuật
gradient amonisulfat. Gradien amonisulfat được tạo thành bằng phương pháp thẩm tách, sử dụng
môi trường đệm PBS pH=7.4, thẩm tách 4 lần. Tiến hành ủ thuốc ở 60
o
C trong 1 giờ, tỷ lệ
DOX/phospholipid =1/9 theo khối lượng. Loại DOX tự do bằng phương pháp thẩm tách. Hiệu
suất nạp thuốc đạt được là 96.8% [17].
1.5.2.2 Kỹ thuật gradient pH
Cơ chế nạp thuốc vào trong khoang nước của liposom theo kỹ thuật gradient pH thể hiện
trên hình 1.9. Liposom được hình thành trong môi trường pH thấp, sau đó môi trường bên ngoài
liposom được thay đổi để có pH cao hơn pH bên trong liposom (pH
trong
< pH
ngoài
). Khi phối hợp
dược chất vào nhũ tương liposom, dược chất ở dạng không ion hóa sẽ khuếch tán qua màng. Bên
trong màng ở điều kiện pH thấp các phân tử ở dạng ion hóa chiếm ưu thế và không khuếch tán
tán ngược trở lại. Chênh lệch nồng độ dược chất trong và ngoài màng tiếp tục được duy trì, tạo
động lực cho dược chất tiếp tục khuếch tán vào trong [3, 4].
CHƯƠNG II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1 Nguyên liệu
- Phospholipid lòng đỏ trứng chiết bằng phương pháp sử dụng CO2 siêu tới hạn, được hydro
hóa, sản phẩm của nghiên cứu trước đó [6].
- Cholesterol (Merck, Đức) , doxorubicin hydroclorid (Merck, Đức)
2.1.2 Hóa chất
- Cloroform, NaCl, KCl, Na
2
HPO
4

, KH
2
PO
4
(Trung quốc )
- Amonisulfat (Merck, Đức) , Triton X-100 (MP Biomedicals, Mỹ)
- NaCl 0.9% và một số hóa chất khác đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích.
2.1.3 Thiết bị thí nghiệm
- Máy cất quay ROTAVAPOR R-210, BUCHI, Thụy Sĩ
- Máy siêu âm Labosonic, Braun Biotech International, Đức
- Máy khuấy từ IKA C-MAG HS4, Đức
- Máy đo quang phổ UV-VIS U1900 HITACHI, Nhật
- Máy đo kích thước tiểu phân và thế zeta ZETASIZER ZS90
- Màng thẩm tách kích thước lỗ lọc 12000-14000 Da, Sepctrum, Mỹ
- Máy đồng nhất hóa EmulsiFlex-C5, Canada (Viện Công nghệ sinh học)
- Máy đo pH, máy vortexer, cân phân tích, tủ sấy, tủ lạnh, tủ lạnh sâu…
2.2 Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Chế tạo liposom DOX kích cỡ nano
- Nghiên cứu chế tạo liposom DOX kích thước cỡ nano, ứng dụng phương pháp đẩy qua màng
trong giảm kích thước và đồng nhất hóa tiểu phân liposom.
- Khảo sát các thông số để đánh giá tiểu phân liposom thu được :
 Ảnh hưởng của số lần đẩy qua màng lên kích thước tiểu phân của liposom
 Ảnh hưởng thời gian ủ thuốc lên hiệu suất liposom hóa DOX
2.2.2 So sánh đặc điểm và tính chất của các tiểu phân liposom thu được sau đồng nhất hóa
bằng phương pháp đẩy qua màng với phương pháp siêu âm
So sánh mẫu liposom thu được sau đồng nhất theo phương pháp đẩy qua màng với
phương pháp siêu âm đầu dò về các đặc điểm : kích thước tiểu phân, chỉ số đa phân tán (PDI),
hiệu suất liposom hóa DOX.
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp chế tạo liposom DOX

Các thành phần nguyên liệu dùng cho chế tạo liposom DOX được trình bày ở bảng 2.1
Bảng 2.1Nguyên liệu chế tạo liposom DOX
1 Phospholipid trứng 272 mg
2 Cholesterol 58 mg
3 Cloroform 10ml
4 Dung dịch amoni sulfat 250 mM 25ml
2.3.1.1 Chế tạo liposom chưa mang dược chất
Tạo lớp film lipid : Hòa tan hỗn hợp phospholipid và cholesterol tỷ lệ mol 7: 3 vào trong
10ml chloroform. Toàn bộ dung dịch được cho vào bình cầu dung tích 1000 ml, tiến hành cất
quay chân không ở 55
o
C, tốc độ quay đặt ở mức 5. Sau khi lớp màng mỏng lipid được tạo thành,
tiếp tục cất quay thêm 3 giờ để làm bay hơi hết dung môi hữu cơ.
Hydrat hóa màng mỏng lipid bằng 25ml dung dịch amonisulfat nồng độ 250 mM, ở 55
o
C,
tốc độ quay ở mức 5. Quá trình hydrat hóa được thực hiện 2 giờ để đảm bảo lớp màng lipid phân
tán hoàn toàn vào dung môi phân cực và tạo thành các liposom đa lớp.
2.3.1.2 Giảm kích thước tiểu phân và đồng nhất hóa bằng phương pháp đẩy qua màng